KR20120036516A

KR20120036516A - 브로콜리 종자 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20120036516A
Application number: KR1020100098247A
Authority: KR
Inventors: 김기호; 김영희; 한창성; 박수진; 이강혁; 이수연
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2012-04-18

Abstract

본 발명은 브로콜리 종자 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 프리라디칼 소거능, 멜라노사이트 증식억제, 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생성 억제 작용을 통해 피부미백 활성을 갖는 브로콜리 종자 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명의 브로콜리 종자 추출물과 알부틴의 혼합물은 각각을 단독으로 사용한 경우 보다 상승적 효과를 발휘하여 우수한 피부미백 효과를 나타낸다.

Description

브로콜리 종자 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 {Cosmetic compositions for skin whitening comprising broccoli seed extracts}

본 발명은 브로콜리 종자 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 프리라디칼 소거능, 멜라노사이트 증식억제, 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생성 억제 작용을 통해 피부미백 활성을 갖는 브로콜리 종자 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데 이중 멜라닌이 가장 결정적인 요소이다. 멜라닌은 피부(표피)내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되며 주변 각질세포(keratinocyte)로 전이되어 사람의 피부색을 나타낸다. 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증(vitiligo)과 같은 피부 병변이 유발된다. 반대로 과잉 생산은 중년 여성들의 주요 고민 중 하나인 기미, 주근깨를 형성하며 또한 피부암(melanoma)과도 밀접한 관계가 있다.

미백 작용을 자세히 설명하면 다음과 같다. 멜라닌은 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트라는 세포에서 티로신(Tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성되며, 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이된다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제 관련 프로테인 1(Tyrosinase-Related protein 1) 및 도파크롬 토토머라제(dopachrome tautomerase)가 있다. 티로시나제 외의 이 두 효소는 주목을 끌고 있으나 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다. 멜라닌의 생합성 첫 단계는 티로시나제에 의하여 유발된다. 티로시나제에 의해 티로신이 도파(Dopa)로 되고, 이 도파(Dopa)를 도파퀴논(Dopa-quinone)으로 만든다. 이 두 반응의 다음단계 과정들은 비효소적인 반응에 의해서도 가능한 것으로 알려져 있으며 티로시나제 단독으로도 멜라닌 생성이 가능하다고 알려져 있다.

최근에는 피부 세포내의 신호 전달물질의 발현에 따른 멜라닌 형성과정에 대한 새로운 이론이 제시되고 있다. 피부가 자외선에 노출되면 염증을 유발시키는 인터루킨-알파(Interlukin-α)가 상피(Epidermis)내에 있는 케라티노사이트(Keratinocyte)로부터 발현되고, 이 인터루킨-알파가 케라티노사이트 엔도셀린(Endothelin) 발현을 촉진시킨다. 이러한 일련의 과정이 멜라노사이트의 형성을 증가시키고 멜라노사이트를 활성화시킨다. 이렇게 형성된 멜라노사이트 내 멜라노좀에서 티로신이 티로시나제에 의해 멜라닌이 형성된다.

또한, NF-κB는 여러 가지 자극에 대해 응답적으로 활성화되어, 면역이나 증식, 염증 등에 관하여 여러 가지 유전자의 발현을 높여준다. NF-κB의 과잉 활성화가 암이나 류마티스, 건선 등과 관계있다는 것이 보고되어, 현재 세계적으로 NF-κB의 억제제 개발이 이루어지고 있다. NF-κB는 피부의 표피각화세포나 진피 섬유아세포에도 존재하고, 자외선이나 염증 등의 자극에 의해 NF-κB가 과잉으로 활성화, 전사활성이 항진하는 것으로 확인되고 있다. NF-κB의 과잉활성화는 세포에서의 염증성 사이토카인(cytokine)을 생성시키고 그 사이토카인에 의해 더욱 NF-κB의 발현이 일어난다. 또한, 세포증식인자인 bFGF(basic fibroblast growth factor)나 세포외 매트릭스 분해효소 MMP-1의 신생을 항진하여 표피각화세포의 과증식이나 각화이상에 의한 표피의 비후, 멜라노사이트의 증식에 의한 색소 침착, MMP-1의 진피 콜라겐 분해에 의한 피부 탄력의 저하 등을 일으키고 피부의 광노화와 관계가 있다. 피부의 멜라닌 세포닌 색소를 만드는 표피 멜라노사이트는 자외선이나 만성적인 염증 등으로 증가하여, 그것이 피부에 있어서 멜라닌 생성량의 증대로 이어진다.

NF-κB는 염증 시에 표피 각화세포에서 과잉 발현하고 멜라닌 세포증식작용이 있는 bFGF의 표피 각화세포에서의 생성을 촉진한다. 즉, NF-κB의 작용을 억제하는 물질은, 염증이나 자외선에 의한 기미나 주근깨 등의 색소침착을 막는 효과를 나타낸다.

이미 아스코르빈산(특개평 4-9320), 하이드로퀴논(특개평 6-192062), 코직산(특개 56-7710), 알부틴(특개평 4-9315) 및 일부의 화합물들이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체레벨과 유사한 멜라노마 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 소량 함유한 화장료를 실온에서 수주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다. 식물성 천연물들은 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 성분들을 가지고 있어 미백 물질의 좋은 검색대상이 되고 있다.

브로콜리(Brassica oleracea)는 배추속에 속하는 양배추의 변종으로 교목으로서 많이 쓰이며 향기가 많이 나고 높이 50?80cm이다. 가지가 뻗고 곧추 자라며 중앙 축과 가지 끝에 녹색 꽃눈이 빽빽하게 난다. 줄기가 보다 길게 자라고 꽃봉오리는 지름 12?15cm이다. 브로콜리는 담즙의 분비를 원활하게 하여 간장의 기능을 활발하게 하는 기능이 있으며, 비타민, 카로틴, 철분 등이 풍부해 채소 중에서도 그 영양가가 월등하게 높은 것으로 알려져 있고, 브로콜리 내에 함유하고 있는 설포라판(Sulforaphane)은 항암물질(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10367-10372)과 위내에서 위암을 일으키는 헬리코박터 세균을 특이적으로 죽인다는 연구 결과가 보고되어 그 효과가 탁월하다는 것이 입증되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 7610-7615).

브로콜리에 대한 선행 특허를 보면, 브로콜리 전초 추출물 및 브로콜리 싹에 대한 항균 및 소취 효과(10-2007-0065926), 헬리코박터 파이로리균 저해능(10-0773901), 간 기능 개선, 혈중 알코올 감소효과(10-0661032)와 노화방지 효과를 가지는 것으로 보고된 바 있으나 아직까지 브로콜리 종자 추출물의 미백효과에 대해 보고된 것은 없다.

이에 본 발명자들은 브로콜리 종자 추출물이 피부미백을 위한 화장료 조성물로 탁월한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 프리라디칼 소거능, 멜라노사이트 증식억제, 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생성 억제 작용을 통해 피부미백 활성을 갖는 브로콜리 종자 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 브로콜리 종자 추출물과 함께 알부틴을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 브로콜리 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 브로콜리 종자 추출물의 우수한 미백효과에 관한 것으로, 브로콜리 또는 브로콜리 새싹이 아닌 브로콜리 종자를 이용하여 그 추출물의 제조하고 제조된 브로콜리 종자 추출물이 브로콜리 새싹 추출물에 비해 미백효과가 현저히 우수함을 본 발명자들이 처음으로 발견하였다. 본 발명의 실시예에서는, 브로콜리 새싹 추출물과 브로콜리 종자 추출물 각각을 이용하여 멜라노사이트 증식 억제 효과 및 세포내 티로시나제 활성 저해 효과를 측정함으로써 이들의 미백효과를 비교분석하였으며, 그 결과 본 발명의 브로콜리 종자 추출물이 뛰어난 미백효과를 나타내어 피부미백용 화장료에 적용될 수 있음을 증명하였다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 추출물은 브로콜리 종자를 통상적인 식물 추출방법을 이용하여 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있다.

상기 유기용매는 극성 또는 비극성 유기용매를 이용할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올, 메탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 함수에탄올, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 헥산, 및 에틸아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

상기 추출용매를 이용한 추출방법으로는 통상적인 식물추출방법 예컨대, 열수추출, 유기용매 추출 등의 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로 브로콜리 종자 또는 그 분쇄물을 상기 추출용매에 투입하고 필요에 따라 교반하면서 1-15일간 침적시키거나 40-100℃에서 2-20시간 가열하여 추출하는 것이 적당하다. 추출에 사용되는 용매의 양은 추출원료의 통상 5 내지 20배량(중량비)인 것이 바람직하다. 또한 추출물은 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 잔류분말을 얻는데 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한, 상기의 브로콜리 종자 추출물을 감압 농축하여 얻어진 잔류분말에 1-10배 부피량의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 단계적으로 처리하여 얻어진 분획들을 사용할 수도 있다. 예를 들면 상기의 브로콜리 종자 추출물을 감압 농축하여 얻어진 잔류분말을 물에 분산시킨 후 동량 또는 1-10배 부피량의 n-헥산을 처리하여 분획하고 수득한 물층은 다시 n-헥산을 처리한 동일한 방법으로 에틸아세테이트, 부탄올을 단계적으로 처리하여 분획한다. 이때 각각의 n-헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층 및 최종적으로 수득되는 물층을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축하여 얻은 잔류분말 역시 상기의 브로콜리 종자 추출물과 동일하게 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 알부틴을 더 포함할 수 있다. 알부틴은 미백효과가 있는 것으로 알려져 있는 물질로서 미백용 화장료의 원료로서 많이 사용되고 있다. 본 발명자들은 브로콜리 종자 추출물의 미백효과를 검증하는 과정에서 기존에 미백효과가 있는 것으로 알려진 알부틴을 적당한 양으로 혼합하는 경우 예상치 못한 시너지 효과가 있음을 처음으로 발견하였다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 브로콜리 종자 추출물과 알부틴의 혼합물은 각각을 단독으로 사용한 경우 보다 멜라노사이트 증식 억제 효과 및 세포내 티로시나제 활성 저해 효과에서 예상치 못한 상승적 효과를 발휘하였으며 (표 4, 5 참조), 특히 멜라닌 합성저해 효과에 있어서는 월등히 상승된 효과를 나타냄을 확인하였다 (표 6 참조).

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 90 중량%로 함유시켜 제조할 수 있으나, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 함유하는 것이 적당하다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 프리라디칼 소거, 멜라노사이트 증식억제, 티로시나아제 활성억제 및 멜라닌 합성 저해를 통하여 피부미백효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 브로콜리 종자 추출물이 이러한 작용을 통하여 피부미백 효과를 나타냄을 증명하였다 (표 3 내지 6 참조).

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 스킨, 스킨로션, 스킨소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스쳐크림, 헨드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클린져, 바디로션, 샴푸, 유액, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 및 아이새도로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것이 바람직하다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 브로콜리 종자 추출물을 포함하는 조성물은, 프리라티칼 소거효과가 있고 멜라노사이트의 증식을 억제시키며, 세포내 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생성 억제 작용을 나타내므로, 인체 부작용이 없는 천연의 피부미백용 화장료 제조에 적용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1.

브로콜리 종자를 분쇄하여 200 g을 95%(w/w%) 에탄올 1L에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 70℃에서 3시간 가열하여 추출하였다. 250메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 5~15℃에서 7일간 방치하였다. 최종 0.45 μm 필터로 여과하고 감압 농축하여 추출물 810 ml(고형분 12.7g)을 얻었다.

실시예 2~11.

하기 표 1의 용매를 사용하고 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 1에 기술하였다.

비교 실시예 1.

브로콜리 새싹 200 g을 95%(w/w%) 에탄올 1L에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 70℃에서 3시간 가열하여 추출하였다. 250메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 5~15℃에서 7일간 방치하였다. 최종 0.45 μm 필터로 여과하고 감압 농축하여 추출물 830 ml(고형분 16.2g)을 얻었다.

실험예 1. 세포독성 측정

단층 세포배양에서의 세포독성을 측정하였다. MTT 분석은 살아있는 세포의 수를 측정함으로서 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5- dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase라고도 불림)에 의해 수불용성인 파란색의 포르마잔(formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 포르마잔 유도체는 용해제(보통 dimethylsulfoxide 사용)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다.

좀 더 자세히 설명하면, 인간 섬유아세포(human fibroblasts cell line; ATCC, CRL-2310)을 1×10⁵ cells/ml의 농도로 하여 24웰 플레이트에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)를 사용하였다. 접종 24시간 후, 소혈청 2%를 함유한 DMEM를 교체하고, 시험 시료를 50 μg/ml의 농도로 10 μl 첨가한 후 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200 μl씩을 가하여 세척하고 MTT 용액을 웰당 1.0 ml씩 가하고 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 웰당 1.0 ml씩 가한 후 하룻밤 37℃에서 인큐베이션 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 본 발명에 사용된 브로콜리 종자 추출물은 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

실험예 2. 프리라디칼(free radical) 소거능 실험

프리라디칼 소거능 실험은 Park의 방법(Park, S. N, 대한화장품학회지, 23(1), pp75-132, 1997)에 따라 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)을 사용하여 수행되었다.

0.2 mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 1 ml에 상기 실시예 1 내지 11, 및 비교예 1의 시료를 각 농도별로 2 ml을 첨가하고, 상온에서 10분간 반응 시킨 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 프리라디칼 소거효과(%)를 구하였다. 이 때 블랭크(Blank)는 DPPH 대신 메탄올을 사용하며, 실험군과 동일한 농도의 브로콜리 종자 추출물 2 ml을 첨가하였다. 또한, 프리라디칼 소거능의 양성 대조군으로는 프리라디칼 소거능이 뛰어난 플라보노이드 성분을 다량 함유하고 있는 녹차 추출물과 비교하였다. 프리라디칼 소거활성 SC₅₀은 프리라디칼을 50% 소거하는데 요구되는 시료의 농도(μg/ml)로 표시하였다.

하기 표 3의 결과를 보면, 실시예 및 비교예는 녹차 추출물의 프리라디칼 소거능보다 비교하여 볼 때, 유사하거나 또는 더 낮은 농도에서 SC₅₀ 농도를 나타내어 프리라디칼 소거능이 뛰어남을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 멜라노사이트 증식억제 효과

상기 실시예 및 비교예에 대하여 NF-κB의 과잉 발현 억제에 의한 멜라노사이트 증식억제 효과를 측정하였다. 사람표피각화세포는 무혈청 배지 EpiLife-KG2를 이용하여 12웰 플레이트에 접종하고 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. p65 유전자를 발현하는 pCMV-p65 벡터를 Fugene-6 transfection 시약(Roche Diagnostics)을 이용하여 도입하고, 세포가 활성형 NF-κB를 과잉 발현되도록 하였다. 24시간 배양 후, 새 배지로 교환하고 각 실시예 1 내지 11, 비교예 1, 양성대조군으로 알부틴(arbutin), 및 알부틴과 실시예 4의 1:1 혼합물(혼합 후 최종량은 실시예와 동일)을 첨가한 후 48시간 배양한 다음 배양상층액을 회수하였다. 사람 표피 멜라노사이트는 저혈청 배지 Medium154S를 이용하여 24웰 플레이트에 접종하고 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 증식 촉진제를 첨가하지 않은 Medium154S와 회수한 배양상층액을 1:4로 혼합한 배지와 교환하고 72시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 회수하고 헤모사이토미터를 이용하여 세포수를 세었다.

결과는 하기 표 4에 나타내었다. NF-κB를 과잉 발현한 표피각화세포의 배양 상층액을 첨가하고 브로콜리 종자 추출물을 넣지 않은 대조군에서는 표피 멜라닌 세포의 증식이 촉진되었다. 브로콜리 새싹 추출물인 비교실시예 1에서는 멜라노사이트 증식이 억제되긴 하였으나(40.5%), 실시예 1의 브로콜리 종자 추출물(58.2%) 또는 양성대조군인 알부틴(52.0%)에 비해 현저히 낮은 억제효과를 나타내었다.

반면, 본 발명의 브로콜리 종자 추출물을 적용한 후 배양한 표피 각화세포의 배양상층액으로 배양한 군에서는 양성대조군인 알부틴과 유사하게 표피 멜라노사이트 증식작용이 억제되었으며, 특히 실시예 4는 비교실시예 1 보다 1.5배 정도 증가된 60.3%의 억제율을 보였다.

한편, 알부틴과 실시예 4의 혼합물을 적용한 경우는, 각각의 적용한 경우 (산술적 예상치는 (52.0+60.3)/2 = 56.25%이다)와 달리 예상보다 높은 억제율(64.2%)을 나타내었다. 이는 알부틴과 본 발명의 브로콜리 종자 추출물을 혼합하여 적용하게 되면 서로 상승적 효과(synergy effect)를 나타낼 수 있음을 의미한다.

이 결과로부터, 자외선이나 염증 반응시 NF-κB가 증가하여 표피 각화세포에서 과발현을 보임으로서 멜라노사이트 증식이 촉진되고 이에 따라 멜라닌도 다량 생성되는 것을 억제하는 효과를, 본 발명의 브로콜리 종자 추출물이 나타내어 미백효과가 있음을 확인하였다.

실험예 4. 세포내 티로시나제 활성 저해 효과

상기 실시예 및 비교예에 대하여 티로시나제의 저해활성을 측정하였다. 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다. B16 멜라노마 세포(ATCC CRL6323)를 10% 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에 1×10⁵ 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 α-MSH(melanocyte stimulating hormone; 멜라닌세포자극호르몬, 0.34 μg/mL, Sigma)가 처리된 DMEM 10% 배지로 갈아준 후 시료들을 농도별로 웰에 처리하여 3일간 배양하였다. 배지를 제거하고 세포들은 트립신을 처리하여 떼어낸 후 1.5 ml 튜브에 넣어 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 버리고 PBS로 2회 세척하였다. 세포 침전물에 1% 트리톤 X-100과 2 mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride; 단백질 분해 억제제)가 포함된 80 mM 포타슘포스페이트 완충용액(pH 6.8) 1 ml를 첨가하여 얼음 속에서 20분간 진탕혼합하여 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후 4℃, 20분, 12,000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 상층액 0.3 ml와 1.5 mM 티로신 0.3 ml를 37℃에서 3시간 반응시켰다. 강하게 진탕혼합하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상층액의 단백질 정량은 Bio-rad 단백질 정량 프로토콜에 따라 분석하였으며, 생성된 멜라닌의 흡광도를 단백질 량으로 나누어 주었다. 대조군으로 사용된 상백피 추출물은 좋은 티로시나제 활성저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다.

티로시나제 활성 억제율(%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475 nm에서 흡광도

B : 시료를 첨가한 반응용액의 475 nm에서 흡광도

상기 표 5의 티로시나제 활성 저해 실험결과에서, 브로콜리 새싹 추출물인 비교실시예 1(34.6%)은 실시예 1의 브로콜리 종자 추출물(54.2%) 또는 대조군인 상백피추출물(45.2%) 보다 낮은 저해율을 나타내었다. 반면, 본 발명의 브로콜리 종자 추출물은 상백피 추출물과 유사하거나 더 높은 저해율을 나타내었으며 실시예 4는 비교실시예 1 보다 1.5배 이상 증가된 57.3%의 저해율을 보였다. 알부틴(51.2%) 또한 이와 유사한 저해율을 나타내어, 본 발명의 브로콜리 종자 추출물, 알부틴 둘 다 상백피추출물 보다 높은 티로시나제 저해율을 나타내었다. 특히 알부틴과 실시예 4의 1:1 혼합물은 각각을 단독으로 사용한 경우 (산술적 예상치는 (54.2+54.3)/2 = 54.25% 이다)와 달리 예상보다 높은 60.7%의 저해율을 나타내었다. 이는 알부틴과 본 발명의 브로콜리 종자 추출물을 혼합하여 적용하게 되면 서로 상승적 효과(synergy effect)를 나타낼 수 있음을 의미한다.

실험예 5. B16 멜라노마를 이용한 멜라닌 생성 억제 작용 실험

상기 실시예 및 비교예에 대하여 B16 멜라노마의 멜라닌 생성 억제작용효과를 측정하였다. B16 멜라노마 세포 배양을 통하여 멜라닌 생성억제 기능을 세포 수준에서 검정하였다. B16 멜라노마 세포는 10% 소혈청을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에서 5% CO₂, 37℃의 조건에서 2일간 배양하여 1.0×10⁸ 세포/T25 플라스크가 될 때까지 배양하였다. 그 다음 농도별로 실시예, 비교예, 알부틴, 알부틴과 실시예 4의 1:1 혼합물, 및 대조군 시료를 처리한 후 5% CO₂, 37℃에서 2일간 배양하였다. 그 후 트립신을 첨가하여 세포들을 수거하여 세포의 흑화 정도를 관찰하였다. 멜라닌이 생성되어 배출된 T25 플라스크의 상층액을 취해 475 nm 에서 흡광도를 측정하여 멜라닌을 정량하고, 세포수는 수거된 세포:tryphan blue = 1:9의 비율로 혼합하여 현미경으로 관찰하여 살아있는 세포수를 세어 단위 세포당 생성된 멜라닌의 양을 정량하여 저해 효과를 나타내었다. 대조군으로 사용된 상백피 추출물은 좋은 멜라닌 합성 저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다.

상기 표 6의 멜라닌 생합성 저해 결과에서, 브로콜리 새싹 추출물인 비교실시예 1(34.6%)과 알부틴(39.3)은 실시예 1의 브로콜리 종자 추출물(51.2%) 또는 대조군인 상백피추출물(42.2%) 보다 낮은 저해효과를 나타내었다. 반면, 본 발명의 브로콜리 종자 추출물은 상백피 추출물과 유사하거나 더 높은 저해율을 나타내었으며 실시예 4는 비교실시예 1 보다 1.5배 정도 증가한 54.3%의 저해효과를 나타내었다. 그런데, 알부틴과 실시예 4의 1:1 혼합물은 각각을 단독으로 사용한 경우 (산술적 예상치는 (39.3+54.3)/2=46.8%)와 달리 예상보다 월등히 높은 61.5%의 저해율을 나타내었다. 이는 알부틴과 본 발명의 브로콜리 종자 추출물을 혼합하여 적용하게 되면 서로 상승적 효과(synergy effect)를 나타냄을 의미한다.

이상의 결과에서, 본 발명의 브로콜리 종자 추출물은 브로콜리 새싹 추출물과 비교하여 현저히 높은 미백 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 의미 있는 결과는 브로콜리 종자 추출물과 알부틴의 혼합물의 경우 산술적 예상치보다 현저히 높은 미백효과를 보였다는 것이다. 이는 본 발명의 브로콜리 종자 추출물이 피부미백용 화장료의 원료로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 기존의 미백효과가 있는 성분들과 혼합할 경우 시너지 효과를 나타내어 다양한 미백용 화장품의 제조에 적용될 수 있음을 나타낸다.

처방예 1. 유연화장수의 제조

브로콜리 종자 추출물을 함유한 화장료 중 유연화장수(스킨로션)의 제조방법은 다음과 같다. 사용된 브로콜리 종자 추출물은 실시예 4이다. 비교처방예 1은 브로콜리 종자 추출물 대신 동량의 1,3-부틸렌글리콜을 추가하여 첨가한 제형이다.

처방예 2. 로션의 제조

브로콜리 종자 추출물을 함유한 화장료 중 로션의 제조방법은 다음과 같다. 사용된 브로콜리 종자 추출물은 실시예 4이다. 비교처방예 2는 브로콜리 종자 추출물 대신 동량의 1,3-부틸렌글리콜을 추가하여 첨가한 제형이다.

처방예 3. 크림의 제조

브로콜리 종자 추출물을 함유한 화장료 중 크림의 제조방법은 다음과 같다. 사용된 브로콜리 종자 추출물은 실시예 4이다. 비교처방예 3은 브로콜리 종자 추출물 대신 동량의 글리세린을 추가하여 첨가한 제형이다.

처방예 4. 맛사지 크림의 제조

브로콜리 종자 추출물을 함유한 화장료 중 맛사지 크림의 제조방법은 다음과 같다. 사용된 브로콜리 종자 추출물은 실시예 4이다. 비교처방예 4는 브로콜리 종자 추출물 대신 동량의 바세린을 추가하여 첨가한 제형이다.

시험예 1. 미백 효과 평가

건강한 남녀 20명을 대상으로 피검자의 윗 팔뚝 부위에 직경 1.5 ㎝의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 다음, 각 피검자의 최소 홍반량(MED ; Minimal Erythema Dose)의 1.5?2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 색소 침착을 유도하고, 시험 물질들을 도포하여 두 달 후에 색차계를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 각 시험 물질들은 처방예 1, 2 및 비교처방예 1, 2를 아침과 저녁에 걸쳐 매일 2회 바르도록 하였다.

효과의 판정은 피부의 명암을 나타내는 L^* 값을 구하여 결정하였다. 일반적으로 인공적인 색소 침착을 유도하지 않은 한국인 피부의 L^* 값은 50?70의 영역에 속한다. 시험 물질들을 도포하여 효과가 있을 경우에는 L^* 값이 점차 증가하게 된다. 도포 시작 시점과 완료 시점에서의 피부색의 차이(ΔL^*)를 아래 식에 따라 계산하여 사람 피부에서의 미백 효과를 비교하였으며, 그 측정결과는 표 6에 나타내었다.

ΔL^* = 시험물질 도포 마지막 날의 L^* 값 - 시험물질 도포전의 L^* 값

상기 표 7의 측정결과에서, 브로콜리 종자 추출물을 첨가하여 제조한 처방예 1, 2의 화장료가 첨가되지 않고 제조한 비교처방예 1, 2 보다 피부 미백 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.

Claims

브로콜리 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 함수에탄올, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 헥산, 및 에틸아세테이트로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 알부틴을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 50 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 프리라디칼 소거, 멜라노사이트 증식억제, 티로시나아제 활성억제, 및 멜라닌 생성 저해를 통하여 피부미백효과를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨, 스킨로션, 스킨소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스쳐크림, 헨드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클린져, 바디로션, 샴푸, 유액, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 및 아이새도로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.