CN114774195A - 一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法及美白活性评价方法及应用 - Google Patents

一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法及美白活性评价方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法及美白活性评价方法及应用，该具有美白活性成分烟籽油的制备包括原料选取，将原料进行用热压榨获得烟籽初油；将烟籽初油经静置过滤后加入生物吸附剂，置于恒温摇床中振荡吸附反应6‑8h；待反应结束后，用微孔滤膜分离过滤除去生物吸附剂，获得烟籽油半成品；烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中进行三次分子蒸馏，将三次分子蒸馏后的三个馏分烟籽油合并，即获得高纯度的具有美白活性成分的烟籽油。本发明将该烟籽油经美白活性评价合格后添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将具有美白活性成分的烟籽油直接作为美白精油，发挥其美白活性。

Description

一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法及美白活性评价方 法及应用
技术领域
本发明属于烟草产品技术领域，具体涉及一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法及美白活性评价方法及应用。
背景技术
烟籽是烟草的种子，长期以来，烟籽的应用主要集中于品种选育及工商业原料生产，因此，针对烟籽的研究工作主要围绕提高种子产质量展开。而有关烟籽多功能探索、原料及产品开发前景、市场应用范围等方面的研究工作十分稀少，技术缺口明显。同时，大田生产中，烟草种子繁殖系数高，烟籽产量远远超过工商业烟叶生产原料需求，富余烟籽量很大。技术不足和库存过剩，很大程度上限制了烟籽资源的利用。近年来，针对废弃烟叶、烟杆等资源进行利用研究的报道较多，但对烟籽综合利用的研究报道确很少。
烟籽富含脂肪油，是一种很好的脂肪油原料，油脂含量高达40％～50％，从烟籽中经物理压榨出的烟籽油在油脂化学工业上有多种用途，如在制皂工业中用于制备皂类制品，在制漆工业中作为原料制备醇酸树脂漆，但是经物理压榨出的烟籽油无法进行精细应用。烟籽作为烟草产品的一种，具备巨大的科研及应用潜力，因此，开发一种烟籽油并对其功能应用进行探索十分重要。
鉴于以上情况，有必要研究一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法及美白活性评价方法及应用用于解决上述技术问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法，本发明的第二个目的在于提供烟籽油的美白活性评价方法，本发明的第三个目的在于提供具有美白活性成分烟籽油的应用。
本发明的第一个目的是这样实现的，一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料选取：采集成熟的烟草蒴果，晾晒至烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至8％～10％，备用；
(2)将步骤(1)中干燥后的饱满烟草籽经研磨后进行热压榨，获得热压榨后的烟籽初油；
(3)将步骤(2)中的烟籽初油静置18-24h后进行过滤，获得过滤后的烟籽初油；
(4)将步骤(3)中过滤后的烟籽初油中加入生物吸附剂，置于恒温摇床中振荡吸附反应6-8h；
(5)待步骤(4)反应结束后，用微孔滤膜分离过滤除去生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
(6)将步骤(5)中的烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，在85-90℃、100Pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油L1；将第一次蒸馏剩余物在95-100℃、10Pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油L2；将第二次蒸馏剩余物在115-120℃、1Pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油L3；
(7)将步骤(6)中的烟籽油L1、烟籽油L2和烟籽油L3合并，即获得具有美白活性成分的烟籽油。
优选地，步骤(2)中所述热压榨为将饱满烟草籽研磨至粒度为45-55目后，在195-205℃下进行压榨。
优选地，步骤(4)中所述生物吸附剂优选为酵母粉末，所述酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20。
优选地，步骤(5)中所述微孔滤膜的孔径为0.32μm。
优选地，步骤(6)中所述分子蒸馏仪的进料速度为50mL/h，转子转速为120r/min。
本发明的第二个目的是这样实现的，一种烟籽油的美白活性评价方法，包括以下步骤：
S1：将权利要求1-5任一项所述的具有美白活性成分的烟籽油进行GC-MS检测，检测出所述具有美白活性成分烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量；
S2：以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷对B16黑色素瘤细胞的抑制率及对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率；
S3：测定烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率及对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率；
S4：将步骤S2中熊果苷对B16黑色素瘤细胞的抑制率与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率进行对比，将步骤S2中熊果苷对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率进行对比，确定烟籽油的美白活性能力；
S5：结合步骤S4中确定的烟籽油美白活性能力、步骤S1中的烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量，对烟籽油的美白活性能力进行综合评价。
优选地，步骤S1中所述脂肪酸含量的GC-MS检测条件为：
GC检测条件：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1mL/min，不分流进样；色谱柱型号为HP-5的30m×0.32mm×0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
MS检测条件：离子源为EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
优选地，步骤S2中所述熊果苷对B16黑色素瘤细胞的抑制率的测定方法与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率的测定方法均为：将B16黑色素瘤细胞经培养后弃上清液，得细胞悬液；将细胞悬液种加入不同体积分数的烟籽油或熊果苷；培养不同时间后，加入MTT继续培养，弃上清液，加入DMSO震荡，测定490nm吸光值，根据吸光值计算细胞抑制率。
优选地，步骤S2中所述熊果苷对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率的测定方法与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率的测定方法均为：将B16黑色素瘤细胞经培养后弃上清液，获得细胞悬液；在细胞悬液中加入不同体积分数的烟籽油或熊果苷，培养不同时间后，离心后弃上清，添加含DMSO的NaOH溶液，水浴孵育，待细胞完全溶解破碎后，取上清液摇床震动，测定405nm吸光值，根据吸光值计算黑色素合成抑制率。
本发明的第三个目的是这样实现的，一种具有美白活性成分烟籽油的应用，所述具有美白活性成分的烟籽油经美白活性评价合格后添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将烟籽油直接作为美白精油。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1、本发明通过先将烟草籽利用热压榨法榨取烟籽初油，再将经生物吸附剂吸附及微孔滤膜分离过滤后的烟籽油半成品进行三次分子蒸馏，使其美白活性成分富集，获得具有美白活性成分的功能性烟籽油。
2、本发明通过采用酵母粉作为生物吸附剂吸附，采用微孔滤膜分离过滤烟籽初油，能有效去除烟草籽热压榨时产生的重金属、盐分、色素及杂质等。
3、本发明通过将烟籽油半成品在不同温度和压强下进行三次分子蒸馏，通过严格控制蒸馏温度，不仅能有效保留烟籽油的美白活性成分，还能再次分离出烟籽油中的杂质成分，通过三次分子蒸馏获得了具有美白活性成分的高纯度功能性烟籽油。
4、本发明通过将烟籽油的美白活性进行综合评价，确定烟籽油具有美白活性成分；将经美白活性评价合格的烟籽油添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将具有美白活性成分的烟籽油直接作为美白精油，发挥烟籽油的美白活性。
5、本发明不仅提高了烟草资源的利用率，还拓宽了烟籽油的用途及市场应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例以香料烟中的保山4号品种为例。
1.1一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料选取：采集成熟的保山4号烟草蒴果，晾晒至保山4号烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的保山4号烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至9％，备用；
(2)将干燥后的饱满保山4号烟草籽研磨至粒度为50目后，在200℃下进行热压榨，获得热压榨后的烟籽初油；
(3)将热压榨后的烟籽初油静置20h后进行过滤，过滤去除大颗粒杂质，获得过滤后的烟籽初油；
(4)将过滤后的烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应7h；
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50mL/h，转子转速为120r/min；在88℃、100Pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油L1；将第一次蒸馏剩余物在98℃、10Pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油L2；将第二次蒸馏剩余物在118℃、1Pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油L3；
(7)将烟籽油L1、烟籽油L2和烟籽油L3合并，即获得具有美白活性成分的保山4号烟籽油。
1.2将具有美白活性成分的保山4号烟籽油进行GC-MS检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
1.2.1脂肪酸含量的测定方法：采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)萃取和富集保山4号烟籽油样品，萃取纤维头型号为50/30μm DVB/CAR/PDMS。萃取纤维每次使用之前，均需在240℃的GC-MS进样口老化3min。准确称取3mL具有美白活性成分的保山4号烟籽油加入到20mL的顶空瓶中立即密封，在40℃的条件下萃取20min。萃取完成后，取出固相微萃取纤维针，然后插入GC注射口进行解吸附(3min，240℃)及后续GC-MS分析。
具体的，GC检测条件为：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1mL/min，不分流进样；色谱柱型号为HP-5的30m×0.32mm×0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
具体的，MS检测条件为：离子源为EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
具有美白活性成分的保山4号烟籽油的主要脂肪酸成分如表1所示。
Figure BDA0003519050650000051
Figure BDA0003519050650000061
表1
1.2.2挥发性成分含量的测定：
检测条件：以氮气为载气，流速为2mL/min，进样量为1μL，分流比为1:29.5，进样口温度和检测器温度分别为270℃和280℃；初始柱温100℃保持3min，以20℃/min升至170℃，保持10min，再以10℃/min升至200℃，保持5min，最后以2℃/min升至230℃，保持5min；其余与脂肪酸含量的测定方法一致。
具有美白活性成分的保山4号烟籽油的挥发性主要成分及占比如表2所示。
Figure BDA0003519050650000062
表2
1.3保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率。
B16黑色素瘤细胞在含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗(青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养；培养条件：37℃、5％CO2、95％空气条件细胞培养箱。
待B16黑色素瘤细胞生长到对数期，使用胰蛋白酶溶液(含EDTA)消化细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于96孔板中，每孔200μL。培养箱培养24h后弃上清，得细胞悬液；将细胞悬液中分别加入体积分数为1.25％、0.83％、0.63％、0.50％的烟籽油及31μg/ml的熊果苷，空白组加等体积DMEM培养基，每孔200μL、每组设5个复孔，分别培养48、72h后，每孔加100μL MTT，4h后小心吸去上清液，然后每孔加150μL的DMSO，震荡5～10min，使用酶标仪测定490nm吸光值，根据吸光值计算细胞抑制率。
细胞抑制率计算公式为：细胞抑制率(％)＝(1-OD实验组/OD空白组)×100％。
熊果苷和保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果如表3所示。
Figure BDA0003519050650000071
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表3
由表3可知，随着样品浓度和作用时间的增加，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用逐渐增加。作用时间72h时，0.83％、1.25％体积分数的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用显著优于阳性对照(P<0.05)，其中1.25％体积分数的保山4号烟籽油抑制增殖效果最佳，细胞存活率为81％左右。
1.4保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率。
选择对数生长期的B16黑色素瘤细胞，用胰蛋白酶溶液(含EDTA)消化细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于12孔板中，每孔1mL。培养箱培养24h后弃上清，分别加入体积分数为1.25％、0.83％、0.63％、0.50％的烟籽油及31μg/mL的熊果苷，空白组加等体积DMEM培养基，作用48、72h后，弃上清，PBS清洗2～3次，每孔加0.3mL胰蛋白酶消化细胞，之后收集细胞，每组取20μL计数；其余细胞悬液1000rmp/min离心3min后弃上清，添加1ml、1mol/mLNaOH溶液(含10％DMSO)，80℃水浴锅孵育2h，待细胞完全溶解破碎后，取200μL上清液移到96孔板中，摇床震动5min，使用酶标仪测定405nm波长吸光值，计算黑色素合成抑制率。
黑色素合成抑制率的计算公式为：黑色素合成抑制率(％)＝(1-样品OD值/实验组细胞存活率/空白孔OD值)×100％。
熊果苷和保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率如表4所示。
Figure BDA0003519050650000072
Figure BDA0003519050650000081
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表4
由表4可知，随着样品浓度和作用时间的增加，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用逐渐增加。相反，阳性对照对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用随着作用时间的增加而降低。作用时间72h时，不同体积分数的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用均优于阳性对照，其中1.25％体积分数的保山4号烟籽油抑制效果最佳，抑制率为9％左右。
以上结果表明，相比于熊果苷，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的增殖及B16黑色素瘤细胞内黑色素的合成具有较强抑制率。
1.5具有美白活性成分的保山4号烟籽油的应用
结合1.2中测定出的保山4号烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、1.3中的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率及1.4中的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率，可知保山4号烟籽油具有较强的美白活性能力。保山4号籽油可按需要添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将具有美白活性成分的保山4号烟籽油直接作为美白精油，使其具有较佳的美白活性能力。
实施例2
本实施例以野生烟中的Rustica品种为例。
2.1一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料选取：采集成熟的Rustica烟草蒴果，晾晒至Rustica烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的Rustica烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至9％，备用；
(2)将干燥后的饱满Rustica烟草籽研磨至粒度为45目后，在195℃下进行热压榨，获得热压榨后的烟籽初油；
(3)将热压榨后的烟籽初油静置18h后进行过滤，过滤去除大颗粒杂质，获得过滤后的烟籽初油；
(4)将过滤后的烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应6h；
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50mL/h，转子转速为120r/min；在85℃、100Pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油L1；将第一次蒸馏剩余物在95℃、10Pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油L2；将第二次蒸馏剩余物在115℃、1Pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油L3；
(7)将烟籽油L1、烟籽油L2和烟籽油L3合并，即获得具有美白活性成分的Rustica烟籽油。
2.2将具有美白活性成分的Rustica烟籽油进行GC-MS检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
脂肪酸含量的测定方法与挥发性成分含量的测定方法与实施例1中的一致。
具有美白活性成分的Rustica烟籽油的主要脂肪酸成分如表5所示。
Figure BDA0003519050650000091
Figure BDA0003519050650000101
表5
具有美白活性成分的Rustica烟籽油的挥发性主要成分及占比如表6所示。
Figure BDA0003519050650000102
表6
2.3Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率，其测定方法与实施例1中的一致。
熊果苷和Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果如表7所示。
Figure BDA0003519050650000103
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表7
由表7可知，随着样品浓度和作用时间的增加，Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用逐渐增加。作用时间72h时，不同体积分数的Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用均显著优于阳性对照(P<0.05)，其中1.25％体积分数的Rustica烟籽油抑制增殖效果最佳，细胞存活率为62％左右。
2.4Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率，其测定方法与实施例1中的一致。
熊果苷和Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率如表8所示。
Figure BDA0003519050650000111
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表8
由表8可知，随着样品浓度和作用时间的增加，Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用逐渐增加。相反，阳性对照对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用随着作用时间的增加而降低。作用时间72h时，0.50％、0.63％、0.83％、1.25％体积分数的Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用均显著优于阳性对照(P<0.05)，其中1.25％体积分数的Rustica烟籽油抑制效果最佳，抑制率为13％左右。
以上结果表明，相比于熊果苷，Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞的增殖及B16黑色素瘤细胞内黑色素的合成具有较强抑制率。
2.5具有美白活性成分的Rustica烟籽油的应用
结合2.2中测定出的Rustica烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、2.3中的Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率及2.4中的Rustica烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率，可知Rustica烟籽油具有较强的美白活性能力。Rustica籽油可按需要添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将具有美白活性成分的Rustica烟籽油直接作为美白精油，具有较佳的美白活性能力。
实施例3
3.1本实施例以香料烟中的保山4号品种为例，提供一种具有美白活性成分保山4号烟籽油的另一个制备方法，包括如下步骤：
(1)原料选取：采集成熟的保山4号烟草蒴果，晾晒至保山4号烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的保山4号烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至8％，备用；
(2)将干燥后的饱满保山4号烟草籽研磨至粒度为45目后，在195℃下进行热压榨，获得热压榨后的烟籽初油；
(3)将热压榨后的烟籽初油静置18h后进行过滤，过滤去除大颗粒杂质，获得过滤后的烟籽初油；
(4)将过滤后的烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应6h；
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50mL/h，转子转速为120r/min；在85℃、100Pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油L1；将第一次蒸馏剩余物在95℃、10Pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油L2；将第二次蒸馏剩余物在115℃、1Pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油L3；
(7)将烟籽油L1、烟籽油L2和烟籽油L3合并，即获得具有美白活性成分的保山4号烟籽油。
3.2将具有美白活性成分的保山4号烟籽油进行GC-MS检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
3.2.1脂肪酸含量的测定方法：采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)萃取和富集保山4号烟籽油样品，萃取纤维头型号为50/30μm DVB/CAR/PDMS。萃取纤维每次使用之前，均需在240℃的GC-MS进样口老化3min。准确称取3mL具有美白活性成分的保山4号烟籽油加入到20mL的顶空瓶中立即密封，在40℃的条件下萃取20min。萃取完成后，取出固相微萃取纤维针，然后插入GC注射口进行解吸附(3min，240℃)及后续GC-MS分析。
具体的，GC检测条件为：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1mL/min，不分流进样；色谱柱型号为HP-5的30m×0.32mm×0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
具体的，MS检测条件为：离子源为EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
具有美白活性成分的保山4号烟籽油的主要脂肪酸成分如表9所示。
Figure BDA0003519050650000121
Figure BDA0003519050650000131
表9
3.2.2挥发性成分含量的测定：
检测条件：以氮气为载气，流速为2mL/min，进样量为1μL，分流比为1:29.5，进样口温度和检测器温度分别为270℃和280℃；初始柱温100℃保持3min，以20℃/min升至170℃，保持10min，再以10℃/min升至200℃，保持5min，最后以2℃/min升至230℃，保持5min；其余与脂肪酸含量的测定方法一致。
具有美白活性成分的保山4号烟籽油的挥发性主要成分及占比如表10所示。
Figure BDA0003519050650000132
Figure BDA0003519050650000141
表10
3.3保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率。
B16黑色素瘤细胞在含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗(青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养；培养条件：37℃、5％CO2、95％空气条件细胞培养箱。
待B16黑色素瘤细胞生长到对数期，使用胰蛋白酶溶液(含EDTA)消化细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于96孔板中，每孔200μL。培养箱培养24h后弃上清，得细胞悬液；将细胞悬液中分别加入体积分数为1.25％、0.83％、0.63％、0.50％的烟籽油及31μg/ml的熊果苷，空白组加等体积DMEM培养基，每孔200μL、每组设5个复孔，分别培养48、72h后，每孔加100μL MTT，4h后小心吸去上清液，然后每孔加150μL的DMSO，震荡5～10min，使用酶标仪测定490nm吸光值，根据吸光值计算细胞抑制率。
细胞抑制率计算公式为：细胞抑制率(％)＝(1-OD实验组/OD空白组)×100％。
熊果苷和保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果如表11所示。
Figure BDA0003519050650000142
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表11
由表11可知，随着样品浓度和作用时间的增加，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用逐渐增加。作用时间72h时，0.83％、1.25％体积分数的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用显著优于阳性对照(P<0.05)，其中1.25％体积分数的保山4号烟籽油抑制增殖效果最佳，细胞存活率为81％左右。
3.4保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率。
选择对数生长期的B16黑色素瘤细胞，用胰蛋白酶溶液(含EDTA)消化细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于12孔板中，每孔1mL。培养箱培养24h后弃上清，分别加入体积分数为1.25％、0.83％、0.63％、0.50％的烟籽油及31μg/mL的熊果苷，空白组加等体积DMEM培养基，作用48、72h后，弃上清，PBS清洗2～3次，每孔加0.3mL胰蛋白酶消化细胞，之后收集细胞，每组取20μL计数；其余细胞悬液1000rmp/min离心3min后弃上清，添加1ml、1mol/mLNaOH溶液(含10％DMSO)，80℃水浴锅孵育2h，待细胞完全溶解破碎后，取200μL上清液移到96孔板中，摇床震动5min，使用酶标仪测定405nm波长吸光值，计算黑色素合成抑制率。
黑色素合成抑制率的计算公式为：黑色素合成抑制率(％)＝(1-样品OD值/实验组细胞存活率/空白孔OD值)×100％。
熊果苷和保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率如表12所示。
Figure BDA0003519050650000151
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表12
由表12可知，随着样品浓度和作用时间的增加，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用逐渐增加。相反，阳性对照对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用随着作用时间的增加而降低。作用时间72h时，不同体积分数的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用均优于阳性对照，其中1.25％体积分数的保山4号烟籽油抑制效果最佳，抑制率为9％左右。
以上结果表明，相比于熊果苷，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的增殖及B16黑色素瘤细胞内黑色素的合成具有较强抑制率。
3.5具有美白活性成分的保山4号烟籽油的应用
结合3.2中测定出的保山4号烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、3.3中的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率及3.4中的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率，可知保山4号烟籽油具有较强的美白活性能力。保山4号籽油可按需要添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将具有美白活性成分的保山4号烟籽油直接作为美白精油，使其具有较佳的美白活性能力。
实施例4
4.1本实施例以香料烟中的保山4号品种为例，提供一种具有美白活性成分保山4号烟籽油的另一个制备方法，包括如下步骤：
(1)原料选取：采集成熟的保山4号烟草蒴果，晾晒至保山4号烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的保山4号烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至10％，备用；
(2)将干燥后的饱满保山4号烟草籽研磨至粒度为55目后，在205℃下进行热压榨，获得热压榨后的烟籽初油；
(3)将热压榨后的烟籽初油静置24h后进行过滤，过滤去除大颗粒杂质，获得过滤后的烟籽初油；
(4)将过滤后的烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应8h；
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50mL/h，转子转速为120r/min；在90℃、100Pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油L1；将第一次蒸馏剩余物在100℃、10Pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油L2；将第二次蒸馏剩余物在120℃、1Pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油L3；
(7)将烟籽油L1、烟籽油L2和烟籽油L3合并，即获得具有美白活性成分的保山4号烟籽油。
4.2将具有美白活性成分的保山4号烟籽油进行GC-MS检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
4.2.1脂肪酸含量的测定方法：采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)萃取和富集保山4号烟籽油样品，萃取纤维头型号为50/30μm DVB/CAR/PDMS。萃取纤维每次使用之前，均需在240℃的GC-MS进样口老化3min。准确称取3mL具有美白活性成分的保山4号烟籽油加入到20mL的顶空瓶中立即密封，在40℃的条件下萃取20min。萃取完成后，取出固相微萃取纤维针，然后插入GC注射口进行解吸附(3min，240℃)及后续GC-MS分析。
具体的，GC检测条件为：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1mL/min，不分流进样；色谱柱型号为HP-5的30m×0.32mm×0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
具体的，MS检测条件为：离子源为EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
具有美白活性成分的保山4号烟籽油的主要脂肪酸成分如表13所示。
Figure BDA0003519050650000171
表13
4.2.2挥发性成分含量的测定：
检测条件：以氮气为载气，流速为2mL/min，进样量为1μL，分流比为1:29.5，进样口温度和检测器温度分别为270℃和280℃；初始柱温100℃保持3min，以20℃/min升至170℃，保持10min，再以10℃/min升至200℃，保持5min，最后以2℃/min升至230℃，保持5min；其余与脂肪酸含量的测定方法一致。
具有美白活性成分的保山4号烟籽油的挥发性主要成分及占比如表14所示。
Figure BDA0003519050650000181
表14
4.3保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率。
B16黑色素瘤细胞在含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗(青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养；培养条件：37℃、5％CO2、95％空气条件细胞培养箱。
待B16黑色素瘤细胞生长到对数期，使用胰蛋白酶溶液(含EDTA)消化细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于96孔板中，每孔200μL。培养箱培养24h后弃上清，得细胞悬液；将细胞悬液中分别加入体积分数为1.25％、0.83％、0.63％、0.50％的烟籽油及31μg/ml的熊果苷，空白组加等体积DMEM培养基，每孔200μL、每组设5个复孔，分别培养48、72h后，每孔加100μL MTT，4h后小心吸去上清液，然后每孔加150μL的DMSO，震荡5～10min，使用酶标仪测定490nm吸光值，根据吸光值计算细胞抑制率。
细胞抑制率计算公式为：细胞抑制率(％)＝(1-OD实验组/OD空白组)×100％。
熊果苷和保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制结果如表15所示。
Figure BDA0003519050650000182
Figure BDA0003519050650000191
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表15
由表15可知，随着样品浓度和作用时间的增加，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用逐渐增加。作用时间72h时，0.83％、1.25％体积分数的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制增殖作用显著优于阳性对照(P<0.05)，其中1.25％体积分数的保山4号烟籽油抑制增殖效果最佳，细胞存活率为81％左右。
4.4保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制结果
以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷及保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率。
选择对数生长期的B16黑色素瘤细胞，用胰蛋白酶溶液(含EDTA)消化细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于12孔板中，每孔1mL。培养箱培养24h后弃上清，分别加入体积分数为1.25％、0.83％、0.63％、0.50％的烟籽油及31μg/mL的熊果苷，空白组加等体积DMEM培养基，作用48、72h后，弃上清，PBS清洗2～3次，每孔加0.3mL胰蛋白酶消化细胞，之后收集细胞，每组取20μL计数；其余细胞悬液1000rmp/min离心3min后弃上清，添加1ml、1mol/mLNaOH溶液(含10％DMSO)，80℃水浴锅孵育2h，待细胞完全溶解破碎后，取200μL上清液移到96孔板中，摇床震动5min，使用酶标仪测定405nm波长吸光值，计算黑色素合成抑制率。
黑色素合成抑制率的计算公式为：黑色素合成抑制率(％)＝(1-样品OD值/实验组细胞存活率/空白孔OD值)×100％。
熊果苷和保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率如表16所示。
Figure BDA0003519050650000192
*与对照相比，P<0.05；结果表示为平均值±SD。
表16
由表16可知，随着样品浓度和作用时间的增加，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用逐渐增加。相反，阳性对照对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用随着作用时间的增加而降低。作用时间72h时，不同体积分数的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用均优于阳性对照，其中1.25％体积分数的保山4号烟籽油抑制效果最佳，抑制率为9％左右。
以上结果表明，相比于熊果苷，保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的增殖及B16黑色素瘤细胞内黑色素的合成具有较强抑制率。
4.5具有美白活性成分的保山4号烟籽油的应用
结合4.2中测定出的保山4号烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、4.3中的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率及4.4中的保山4号烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率，可知保山4号烟籽油具有较强的美白活性能力。保山4号籽油可按需要添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将具有美白活性成分的保山4号烟籽油直接作为美白精油，使其具有较佳的美白活性能力。
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种具有美白活性成分烟籽油的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)原料选取：采集成熟的烟草蒴果，晾晒至烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至8％～10％，备用；
(2)将步骤(1)中干燥后的饱满烟草籽经研磨后进行热压榨，获得热压榨后的烟籽初油；
(3)将步骤(2)中的烟籽初油静置18-24h后进行过滤，获得过滤后的烟籽初油；
(4)将步骤(3)中过滤后的烟籽初油中加入生物吸附剂，置于恒温摇床中振荡吸附反应6-8h；
(5)待步骤(4)反应结束后，用微孔滤膜分离过滤除去生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
(6)将步骤(5)中的烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，在85-90℃、100Pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油L1；将第一次蒸馏剩余物在95-100℃、10Pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油L2；将第二次蒸馏剩余物在115-120℃、1Pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油L3；
(7)将步骤(6)中的烟籽油L1、烟籽油L2和烟籽油L3合并，即获得具有美白活性成分的烟籽油。
2.根据权利要求1中所述的具有美白活性成分烟籽油的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述热压榨为将饱满烟草籽研磨至粒度为45-55目后，在195-205℃下进行压榨。
3.根据权利要求1中所述的具有美白活性成分烟籽油的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述生物吸附剂优选为酵母粉末，所述酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20。
4.根据权利要求1中所述的具有美白活性成分烟籽油的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述微孔滤膜的孔径为0.32μm。
5.根据权利要求1中所述的具有美白活性成分烟籽油的制备方法，其特征在于：步骤(6)中所述分子蒸馏仪的进料速度为50mL/h，转子转速为120r/min。
6.一种烟籽油的美白活性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：将权利要求1-5任一项所述的具有美白活性成分的烟籽油进行GC-MS检测，检测出所述具有美白活性成分烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量；
S2：以熊果苷为阳性对照，测定熊果苷对B16黑色素瘤细胞的抑制率及对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率；
S3：测定烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率及对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率；
S4：将步骤S2中熊果苷对B16黑色素瘤细胞的抑制率与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率进行对比，将步骤S2中熊果苷对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率进行对比，确定烟籽油的美白活性能力；
S5：结合步骤S4中确定的烟籽油美白活性能力、步骤S1中的烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量，对烟籽油的美白活性能力进行综合评价。
7.根据权利要求6中所述的烟籽油的美白活性评价方法，其特征在于：步骤S1中所述脂肪酸含量的GC-MS检测条件为：
GC检测条件：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1mL/min，不分流进样；色谱柱型号为HP-5的30m×0.32mm×0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
MS检测条件：离子源为EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
8.根据权利要求6中所述的烟籽油的美白活性评价方法，其特征在于：步骤S2中所述熊果苷对B16黑色素瘤细胞的抑制率的测定方法与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞的抑制率的测定方法均为：将B16黑色素瘤细胞经培养后弃上清液，得细胞悬液；将细胞悬液中加入不同体积分数的烟籽油或熊果苷；培养不同时间后，加入MTT继续培养，弃上清液，加入DMSO震荡，测定490nm吸光值，根据吸光值计算细胞抑制率。
9.根据权利要求6中所述的烟籽油的美白活性评价方法，其特征在于：步骤S2中所述熊果苷对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率的测定方法与步骤S3中烟籽油对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制率的测定方法均为：将B16黑色素瘤细胞经培养后弃上清液，获得细胞悬液；在细胞悬液中加入不同体积分数的烟籽油或熊果苷，培养不同时间后，离心后弃上清，添加含DMSO的NaOH溶液，水浴孵育，待细胞完全溶解破碎后，取上清液摇床震动，测定405nm吸光值，根据吸光值计算黑色素合成抑制率。
10.一种具有美白活性成分烟籽油的应用，其特征在于：所述具有美白活性成分的烟籽油经美白活性评价合格后添加于荷荷巴油中作为美白精油，或将具有美白活性成分的烟籽油直接作为美白精油。
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