CN113433256A - 一种中药中美白活性成分的筛选方法 - Google Patents

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李璟
杨斐
李家旭
童胜强
陈素红
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Abstract

本发明提供了一种中药中美白活性成分的筛选方法，所述的美白活性成分包括酪氨酸酶抑制活性成分和抗氧化活性成分。该筛选方法利用HPLC对待测中药进行色谱分离，流出液微馏分化处理，收集馏分进行酪氨酸酶抑制活性评价或自由基清除活性评价以筛选出美白活性成分，再利用HPLC‑Q‑TOF/MS确定美白活性成分的结构，最后再验证筛选出的美白活性成分的体外活性。该方法将HPLC分离得到的馏分直接收集到孔板中，并在孔板上进行活性评价实验，可以直观显示出相应馏分是否具有目标活性，且操作简单、高效、实验成本低、能在复杂体系中快速筛选鉴定出美白活性成分、准确度高、避免假阳性结果。

Description

一种中药中美白活性成分的筛选方法
技术领域
本发明涉及天然药物筛选领域，尤其涉及一种中药中美白活性成分的筛选方法。
背景技术
酪氨酸酶是合成黑色素最主要的限速酶，同时具有单酚酶活性和二酚酶活性。主要底物L-tyrosine(L-酪氨酸)在酪氨酸酶单酚酶作用下被羟基化生成L-DOPA(左旋多巴)，L-DOPA在酪氨酸酶存在下可继续发生氧化反应，生成多巴醌，多巴醌在一系列复杂的氧化反应后生成黑色素。可以通过抑制酪氨酸酶活性、清除自由基来减少黑色素的形成而达到美白的功效。因此，酪氨酸酶抑制效果和自由基清除活性可以作为评价活性物质美白效果的指标。
白芍，毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，是中国传统美白药方中的一味重要中药材，有研究表明，白芍中没食子酰芍药苷和五没食子酰葡萄糖等成分具有酪氨酸酶抑制活性。
现有市场上的美白活性成分主要分为化学、生物和天然植物类。化学类美白活性成分效果显著，一般以直接破坏黑色素细胞为主要作用途径，但此类美白成分大多具有一定的细胞毒性或对人体具有一定损伤性；生物类美白成分来源较安全，效果可观，但一般生产周期较长，产率低，成本高；天然植物类美白活性成分来源自然，较化学类美白成分安全性更高，较生物类美白成分成本更低、产率更高，且天然植物的种类繁多，为美白成分的研发提供了广阔的取材空间，传统中医用药以草药为主，可为美白研究提供新的研究思路。
公开号为CN105158180B的中国专利文献中公开了一种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，包括：利用双孢蘑菇制备酪氨酸酶的粗提液；在96孔板中加入酪氨酸酶的粗提液，置于低温环境中；配制L-DOPA底物溶液，称取待筛选的酪氨酸酶抑制剂溶液；在上述96孔板中加入底物溶液和酪氨酸酶抑制剂溶液培养，设置对照组；比较酪氨酸酶抑制剂与对照组溶液的颜色深浅来判断曲酸对酪氨酸酶的抑制效果。
公开号为CN100519760C的中国专利文献中公开了一种快速从天然产物中筛选具有抗肿瘤活性物质的方法，将胞内或胞外的萃取物或水相提取物过滤，收集粒径小于0.22μm的滤液，作为待测样品；将待测样品、酪氨酸激酶、酪氨酸激酶活力试剂盒底物、酪氨酸激酶活力试剂盒的缓冲液混合，按照试剂盒的常规方法进行操作，至酶反应结束，读取其吸光度值；同时设置对照组，采用相同的方法处理后读取其吸光度值，将两个吸光度值进行计算比较，判断是否存在抗肿瘤活性的物质。
现有的筛选活性成分的方法大多依据酶或固定化酶支持物与中药成分的结合力，后续需要分离纯化步骤得到大量纯物质后再进行活性验证，方法不能直观显示出该成分是否具有相应活性，可能会出现假阳性结果。
发明内容
本发明提供了一种中药中美白活性成分的筛选方法，该方法操作简单、实验成本低、能在复杂体系中快速筛选、鉴定出美白活性成分、准确度高。
具体采用的技术方案如下：
一种中药中美白活性成分的筛选方法，所述的美白活性成分包括酪氨酸酶抑制活性成分和抗氧化活性成分，所述的筛选方法包括以下步骤：
(1)样品分析
对待测中药进行预处理，得到粗提物，将粗提物复溶，得到粗提物溶液，再进行HPLC分析得到样品色谱图；
(2)美白活性谱的构建
将粗提物溶液利用HPLC进行色谱分离，流出液微馏分化处理，收集馏分到孔板中，浓缩干燥得到干燥馏分；
在装有干燥馏分的孔板中进行酪氨酸酶抑制活性评价实验，计算各孔中馏分的酪氨酸酶抑制率，绘制酪氨酸酶抑制率随保留时间的变化曲线；
在装有馏分的孔板中进行自由基清除活性评价实验，计算各孔中馏分的自由基清除率，绘制自由基清除率随保留时间的变化曲线；
结合步骤(1)的样品色谱图、酪氨酸酶抑制率随保留时间的变化曲线和自由基清除率随保留时间的变化曲线，构建美白活性谱，筛选出美白活性成分的目标峰；
(3)美白活性成分的结构鉴定
利用HPLC-Q-TOF/MS鉴定步骤(2)筛选出的美白活性成分的结构。
优选的，所述的中药中美白活性成分的筛选方法还包括有美白活性验证步骤，分离纯化步骤(2)筛选出美白活性成分，体外验证所述的美白活性成分的美白活性。
本发明利用HPLC对待测中药进行色谱分离，流出液微馏分化处理，收集馏分进行美白活性评价并筛选出美白活性成分，再利用HPLC-Q-TOF/MS确定美白活性成分的结构，最后再进行美白活性成分体外活性的验证，实现了中药中美白活性成分快速、准确的筛选。
优选的，步骤(2)中，所述的粗提物溶液的浓度为10-80mg/mL，所述的HPLC进样量为2-20μL，收集保留时间≥3min的馏分，分辨率为8.8-10.08point/min。
酪氨酸酶有两个主要功能，一是作为单酚酶，羟基化L-酪氨酸生成L-DOPA，二是作为二酚酶，氧化L-DOPA生成多巴醌，因此，酪氨酸酶抑制活性包括酪氨酸酶单酚酶抑制活性和酪氨酸酶二酚酶抑制活性。
所述的酪氨酸酶抑制活性评价实验包括酪氨酸酶单酚酶抑制活性评价实验和酪氨酸酶二酚酶抑制活性评价试验；所述的酪氨酸酶抑制活性评价实验的步骤为：向装有干燥馏分的孔板中加入二甲基亚砜(DMSO)、PBS溶液和酪氨酸酶溶液，振荡孵育后加入底物溶液开启催化反应。
优选的，所述的振荡孵育的参数为：30-35℃，5-10min。
优选的，当进行的是酪氨酸酶单酚酶抑制活性评价实验时，所述的二甲基亚砜的加入量为反应体系体积分数的1％-4％；所述的底物溶液为L-酪氨酸溶液，浓度为1mM。在相应的参数下，筛选灵敏度较高。
优选的，当进行的是酪氨酸酶二酚酶抑制活性评价实验时，所述的二甲基亚砜的加入量为反应体系体积分数的1％-3％；所述的底物溶液为左旋多巴溶液，浓度为5-7mM。在相应的参数下，筛选灵敏度较高。
所述的自由基清除活性评价实验的步骤为：向装有馏分的孔板中加入自由基工作液，避光反应。
优选的，所述的自由基清除活性评价实验为ABTS自由基清除活性评价实验。
优选的，所述的待测中药为白芍，步骤(1)中，所述的预处理方式为：将白芍粉末与70％乙醇水溶液混合，超声提取，过滤取滤液，回收溶剂，复溶于水，再加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相，回收溶剂，复溶于水后过HLB固相萃取小柱，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得到白芍粗提物。
进一步优选的，步骤(2)中，所述的粗提物溶液的浓度为20mg/mL；所述的HPLC进样量为8-20μL，收集保留时间4-42min的馏分，分辨率为8.8-10.08point/min。
本发明还提供了所述的中药中美白活性成分的筛选方法在中药中筛选美白活性成分的应用。
本发明相对现有技术，具有如下的优点：
(1)本发明公开的中药中美白活性成分的筛选方法能够快速在复杂体系中筛选、鉴定目标活性成分并进行验证，且高效、操作简单、实验成本低。
(2)本发明将液相色谱分离得到的馏分直接收集到孔板中，并在孔板上进行活性评价实验，可以直观显示出相应馏分是否具有目标活性，筛选的准确度高，避免假阳性结果。
附图说明
图1为DMSO的加入量及底物浓度对酪氨酸酶活力影响曲线图，A为DMSO加入量对酪氨酸酶单酚酶活力的影响，B为DMSO加入量对酪氨酸酶二酚酶活力的影响，C为底物浓度对酪氨酸酶单酚酶活力的影响，D为底物浓度对酪氨酸酶二酚酶活力的影响。
图2为中药中美白活性成分的筛选方法的流程图。
图3为白芍的美白活性谱。
图4为白芍中的潜在美白活性成分和阳性对照β-熊果苷对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，A为不同浓度的β-熊果苷对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，B为不同浓度的没食子酸对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，C为不同浓度的没食子酰芍药苷对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，D为不同浓度的1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，E为不同浓度的儿茶素对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图。
图5为白芍中的潜在美白活性成分和阳性对照β-熊果苷对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图，A为不同浓度的β-熊果苷对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图，B为不同浓度的没食子酸对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图，C为不同浓度的儿茶素对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图，D为不同浓度的1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图。
具体实施方式
实施例1：酪氨酸酶单酚酶抑制活性评价实验中DMSO加入量的选择
在孔板中加入酪氨酸酶溶液(125U/mL)50μL，再分别加入0、2、4、6、8、10μL的DMSO溶液，用PBS溶液补足体积至150μL，于35℃下振荡孵育5min，再加入L-酪氨酸溶液50μL开启反应，立即在酶标仪492nm波长下监测30min，隔1min检测吸光度值。
将酪氨酸酶酶活力单位(△Abs/0.001/min)定义为：在492nm波长下，每分钟多巴醌的吸光度值增加0.001为一个酶活力单位。以酪氨酸酶相对酶活为指标，将DMSO加入量为0％时的相对酶活设定为100％。
由图1A可知，当DMSO在反应体系中的加入量从0％增加到2％时，酪氨酸酶单酚酶相对活性呈缓慢下降趋势，仅从100％降低到92.56％。当DMSO加入量继续增加到5％时，酪氨酸酶单酚酶相对酶活迅速下降至82.16％，因此，DMSO的加入量为1％-4％，DMSO加入量优选为2％。
实施例2：酪氨酸酶单酚酶抑制活性评价实验中底物浓度的选择
分别设置样品组、样品空白组、对照组和对照空白组。使用酶标仪测定反应体系的吸光度值，以相同浓度的β-熊果苷在不同浓度底物的反应体系中的抑制率作为优化L-酪氨酸浓度的指标。
样品组按如下步骤处理：在96孔板各孔中加入β-熊果苷溶液(1mg/mL)10μL、DMSO4μL、酪氨酸酶溶液(125U/mL)50μL，用PBS溶液补足体积至150μL；样品空白组加入β-熊果苷溶液(1mg/mL)10μL、DMSO 4μL、用PBS溶液补足体积至150μL；对照组加入β-熊果苷的溶剂10μL、DMSO 4μL、酪氨酸酶溶液(125U/mL)50μL，用PBS溶液补足体积至150μL；对照空白组β-熊果苷的溶剂10μL、DMSO 4μL、用PBS溶液补足体积至150μL；于35℃下振荡孵育5min后。分别加入0.75、1、1.5、3、4.5和6mM的L-酪氨酸溶液50μL开启反应，并立即在酶标仪492nm波长下监测30min，隔1min检测吸光度值。波长在492nm处的吸光度用A样品、A样品空白、A对照和A对照空白表示，按下述公式计算在不同的底物浓度下β-熊果苷对酪氨酸酶单酚酶的抑制率。
Figure BDA0003148408520000061
式中，A样品——样品组的吸光度；A样品空白——样品空白组的吸光度；
A对照——对照组的吸光度；A对照空白——对照空白组的吸光度。
如图1C所示，L-酪氨酸浓度为1mM时，反应体系表现出较好的酪氨酸酶抑制剂筛选灵敏度，因此，底物溶液选用1mM的L-酪氨酸。
实施例3：酪氨酸酶二酚酶抑制活性评价实验中DMSO加入量的选择
在孔板中加入酪氨酸酶溶液(71.4U/mL)50μL，再分别加入0、2、4、6、8、10μL的DMSO溶液，用PBS溶液补足体积至150μL，于30℃下振荡孵育10min，再加入L-DOPA溶液50μL开启反应，立即在酶标仪492nm波长下监测6min，隔1min检测吸光度值。
以酪氨酸酶相对酶活为指标，将DMSO含量0％时的相对酶活设定为100％。
如图1B所示，当DMSO在反应体系中的加入量在0％-2％内时，随着DMSO加入量的增加，酪氨酸酶二酚酶相对酶活略有下降，但仍能保持96.96％的高活性，当DMSO的加入量大于2％时，酪氨酸酶二酚酶相对酶活下降的趋势明显，因此，DMSO的加入量为1％-3％，DMSO加入量优选为2％。
实施例4：酪氨酸酶二酚酶抑制活性评价实验中底物浓度的选择
在孔板中加入酪氨酸酶溶液(71.4U/mL)50μL，DMSO溶液4μL，用PBS溶液补足体积至150μL，于30℃下振荡孵育10min，分别加入浓度为1、3、5和7mM的L-DOPA溶液50μL开启反应，立即在酶标仪492nm波长下监测体系的吸光度值，监测6min，隔1min检测吸光度。以酪氨酸酶酶活力为指标。
如图1D所示，当L-DOPA浓度在1mM-5mM范围内，酪氨酸酶二酚酶活性增长较快，而在5mM-7mM浓度范围内，酪氨酸酶二酚酶活性增长趋势变缓，因此，底物L-DOPA溶液的浓度为5mM-7mM，进一步优选为5mM。
实施例5：白芍中美白活性成分的筛选
以白芍为待测中药，按流程图图2所示的步骤筛选、鉴定白芍中的美白活性成分，并体外验证美白活性。
(1)白芍样品分析
精密称取白芍粉末5.0g于250mL锥形瓶中，加入100mL 70％乙醇水溶液，在50℃条件下超声30min，过滤，回收溶剂后复溶于水，加入乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯与水复溶物的体积比为1：1，取乙酸乙酯相，回收溶剂，制备得到白芍萃取物。
用1mL甲醇活化Waters HLB固相萃取小柱(规格：1mL)，重复3次，再用1mL去离子水清洗该固相萃取小柱，重复3次，排干管内液体，将1mL白芍萃取物的水溶液注入固相小柱，推干水后用1mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，制备得到白芍粗提物。将白芍粗提物复溶于甲醇，进行高效液相色谱分析，分析条件如下：
仪器为安捷伦高效液相色谱系统，含在线真空脱气机、高压二元梯度泵、盘式自动进样器、柱温箱。色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(5mm，250mm×4.6mm)，流动相，乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，流速为1mL/min，柱温30℃，检测波长为230nm，洗脱梯度如表1所示。
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0003148408520000071
(2)美白活性谱的构建
精密称取白芍粗提物适量，用甲醇配制成20mg/mL的溶液。将白芍粗提物溶液在配有馏分收集器的Agilent 1260高效液相色谱仪上进行色谱分离(HPLC分析条件与本实施例中步骤(1)中相同)，进样量为8μL，按保留时间收集4-42min内的馏分，馏分收集至4块96孔板中，以8.8point/min的分辨率将微馏分收集至336个微孔中。每块96孔板的H行留作空白，浓缩干燥得到干燥馏分。
在实施例1、2的优选条件下测定各孔中馏分对酪氨酸酶单酚酶的抑制率，取装有干燥馏分的孔板，在各孔中加入4μL DMSO以溶解孔中干燥馏分，再依次加入96μL PBS溶液、50μL酪氨酸酶溶液(125U/mL)，在35℃下孵育5min。加入50μL L-酪氨酸溶液(1mM)开启反应后，在酶标仪492nm波长下监测30min，隔1min检测吸光度值。计算各孔中馏分对酪氨酸酶单酚酶活性的抑制率，并获得酪氨酸酶单酚酶抑制率随保留时间变化的曲线。
在实施例3、4的优选条件下测定各孔中馏分对酪氨酸酶二酚酶的抑制率，取装有干燥馏分的孔板，在各孔中依次加入4μL DMSO以溶解孔中干燥馏分，再依次加入96μL PBS溶液和50μL酪氨酸酶溶液(71.4U/mL)，于30℃孵育10min。加入50μL L-DOPA(5mM)开启反应后，在酶标仪492nm波长下监测6min，隔1min检测吸光度值。计算各孔中馏分对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率，并获得酪氨酸酶二酚酶抑制率随保留时间变化的曲线。
所述酪氨酸酶单酚酶抑制率/酪氨酸酶二酚酶抑制率计算公式为：
抑制率(％)＝(1－△A样品/△A空白)×100％
式中，△A样品——含干燥馏分的反应体系吸光度变化值；
△A空白——不含干燥馏分(H行)的反应体系吸光度变化值。
精密称取白芍粗提物适量，用甲醇配制成20mg/mL的溶液。将白芍粗提物溶液在配有馏分收集器的Agilent 1260高效液相色谱仪上进行色谱分离(HPLC分析条件与本实施例中步骤(1)中相同)，进样量为20μL，按保留时间收集4-42min内的馏分，馏分收集至4块96孔板中，以10.08point/min的分辨率将微馏分收集至336个微孔中。每块96孔板的H行留作空白。
取装有馏分的孔板，在各孔中加入200μL ABTS·+工作液，避光放置反应6min，立即在酶标仪720nm波长下持续监测20min，隔1min检测吸光度值。ABTS自由基清除的能力用反应体系后10min的吸光度平均值值来衡量。计算各孔中吸光度的下降值，并绘制ABTS自由基清除率随保留时间的变化曲线。
所述ABTS自由基清除率的计算公式为：
△AABTS＝A样品－A空白
式中，A样品——含馏分的反应体系后10min吸光度值的平均值；
A空白——不含馏分(H行)的反应体系后10min吸光度值的平均值。
结合步骤(1)的样品色谱图，酪氨酸酶抑制率随保留时间的变化曲线和自由基清除率随保留时间的变化曲线，获得美白高分辨活性谱，如图3所示，其中，峰1、3、6、7、8、9和峰11对应的活性成分表现出潜在的酪氨酸酶单酚酶抑制活性，峰7、峰9和峰10对应的活性成分表现出潜在的酪氨酸酶二酚酶抑制活性，峰1、峰3和峰7对应的活性成分表现出潜在的抗氧化活性。
(3)美白活性成分的结构鉴定
将20mg/mL白芍粗提物的甲醇溶液在Agilent 1290高效液相色谱系统上进行色谱分离，HPLC进样量为10μL，分离条件如下：色谱柱，Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)；柱温，30℃；进样量，10μL；流速，1mL/min；检测波长，230nm。流动相由0.1％甲酸水溶液和乙腈组成，洗脱梯度同表1。
HPLC-Q-TOF/MS的定性分析采用Agilent 6560四极杆飞行时间质谱仪，配置ESI离子源，采用全扫描模式，负离子检测，TOF/MS分辨率为9500±500(m/z 922.0098)，记录离子质量数扫描范围为100-1500的质谱信息。离子源参数如下：鞘气温度，350℃；鞘气流速，11L/min；干燥气(N2)流速，5L/min；雾化气压(N2)，35psi；毛细管电压，3500V；破碎电压，175V；OCT RF V，750V。
根据保留时间、230nm处的紫外吸收谱和化合物的精确分子式(MS1信息)，对上述美白高分辨活性谱中潜在美白活性成分进行了鉴定，确定了7种化合物的结构，分别对应峰1、3、6、7、8、9和10，其中包括2种单萜苷类化合物(峰6、8)，3种没食子酰葡萄糖类化合物(峰7、9、10)和2种多酚类化合物(峰1、3)。结果如表2所示，tR为保留时间，Error为相对误差。
表2 HPLC-Q-TOF/MS对白芍中美白活性成分的结构鉴定
Figure BDA0003148408520000101
(4)美白活性验证
取白芍粗提物，将白芍粗提物复溶于甲醇，在制备液相上分离纯化出步骤(2)中筛选的美白活性成分：没食子酸、儿茶素、没食子酰芍药苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖。
所述制备液相的条件：色谱柱，C18柱，5μm，250mm×20mm；柱温，30℃；流动相，乙腈-0.1％甲酸水；流速，10mL/min；紫外检测波长，230nm。洗脱梯度同表1。
取β-熊果苷阳性对照品、纯化的没食子酸、儿茶素、没食子酰芍药苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖，用pH 6.8的PBS溶液配制成一系列不同浓度梯度的溶液。分别设置样品组、样品空白组、对照组和对照空白组，样品组：在孔板中加入潜在美白活性成分溶液或阳性对照β-熊果苷溶液、PBS溶液和酪氨酸酶溶液；样品空白组：在孔板中加入潜在美白活性成分溶液或阳性对照β-熊果苷溶液、PBS溶液；对照组：在孔板中加入潜在美白活性成分溶剂或阳性对照β-熊果苷溶剂、PBS溶液和酪氨酸酶溶液；样品空白组：在孔板中加入潜在美白活性成分溶剂或阳性对照β-熊果苷溶剂、PBS溶液；振荡孵育后加入底物溶液开启酪氨酸酶单酚酶或酪氨酸酶二酚酶催化反应，在酶标仪中监测反应，获取活性化合物对酪氨酸酶单酚酶/酪氨酸酶二酚酶的抑制IC50值，所述的酪氨酸酶单酚酶/酪氨酸酶二酚酶反应及抑制活性检测条件同本实施例中步骤(2)，结果如图4和图5所示。
其中，图4A为不同浓度的β-熊果苷对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，图4B为不同浓度的没食子酸对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，图4C为不同浓度的没食子酰芍药苷对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，图4D为不同浓度的1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图，图4E为不同浓度的儿茶素对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性曲线图。没食子酸、儿茶素、没食子酰芍药苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶单酚酶具有一定的抑制活性。
图5A为不同浓度的β-熊果苷对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图，图5B为不同浓度的没食子酸对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图，图5C为不同浓度的儿茶素对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图，图5D为不同浓度的1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性曲线图。没食子酸、儿茶素和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶二酚酶具有一定的抑制活性。
利用SPSS staistics 18软件计算五种化合物对酪氨酸酶单酚酶的抑制IC50值，结果如表3所示。以β-熊果苷的IC50值为阳性对照，其中1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶单酚酶的抑制活性最强，IC50值为0.0234mM，其次为儿茶素(IC50，0.0634mM)、没食子酰芍药苷(IC50，0.1748mM)和没食子酸(IC50，1.5372mM)。
表3白芍中潜在美白活性成分及阳性对照β-熊果苷的IC50
Figure BDA0003148408520000121
通过SPSS软件求得没食子酸、儿茶素、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖和阳性对照β-熊果苷对酪氨酸酶二酚酶活性抑制的IC50值，结果如表4所示，没食子酸、儿茶素和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对酪氨酸酶二酚酶的抑制能力均高于阳性对照，且与儿茶素(IC50，0.0699mM)和没食子酸(IC50，1.0650mM)比较，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(IC50，0.0246mM)展现出更强的二酚酶抑制活性。
表4白芍中潜在美白活性成分及阳性对照β-熊果苷的IC50
Figure BDA0003148408520000122

Claims (10)

1.一种中药中美白活性成分的筛选方法，所述的美白活性成分包括酪氨酸酶抑制活性成分和抗氧化活性成分，其特征在于，所述的中药中美白活性成分的筛选方法包括以下步骤：
(1)样品分析
对待测中药进行预处理，得到粗提物，将粗提物复溶，得到粗提物溶液，再进行HPLC分析得到样品色谱图；
(2)美白活性谱的构建
将粗提物溶液利用HPLC进行色谱分离，流出液微馏分化处理，收集馏分到孔板中，浓缩干燥得到干燥馏分；
在装有干燥馏分的孔板中进行酪氨酸酶抑制活性评价实验，计算各孔中馏分的酪氨酸酶抑制率，绘制酪氨酸酶抑制率随保留时间的变化曲线；
在装有馏分的孔板中进行自由基清除活性评价实验，计算各孔中馏分的自由基清除率，绘制自由基清除率随保留时间的变化曲线；
结合步骤(1)的样品色谱图、酪氨酸酶抑制率随保留时间的变化曲线和自由基清除率随保留时间的变化曲线，构建美白活性谱，筛选出美白活性成分的目标峰；
(3)美白活性成分的结构鉴定
利用HPLC-Q-TOF/MS鉴定步骤(2)筛选出的美白活性成分的结构。
2.根据权利要求1所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，还包括有美白活性验证步骤，分离纯化步骤(2)筛选出的美白活性成分，体外验证美白活性。
3.根据权利要求1所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的粗提物溶液的浓度为10-80mg/mL，所述的HPLC进样量为2-20μL，收集保留时间≥3min的馏分，分辨率为8.8-10.08point/min。
4.根据权利要求1所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，所述的酪氨酸酶抑制活性评价实验包括酪氨酸酶单酚酶抑制活性评价实验和酪氨酸酶二酚酶抑制活性评价试验；所述的酪氨酸酶抑制活性评价实验的步骤为：向装有干燥馏分的孔板中加入二甲基亚砜、PBS溶液和酪氨酸酶溶液，振荡孵育后加入底物溶液开启催化反应。
5.根据权利要求4所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，当进行的是酪氨酸酶单酚酶抑制活性评价实验时，所述的二甲基亚砜的加入量为反应体系体积分数的1％-4％；所述的底物溶液为L-酪氨酸溶液，浓度为1mM。
6.根据权利要求4所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，当进行的是酪氨酸酶二酚酶抑制活性评价实验时，所述的二甲基亚砜的加入量为反应体系体积分数的1％-3％；所述的底物溶液为左旋多巴溶液，浓度为5-7mM。
7.根据权利要求1所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，所述的自由基清除活性评价实验的步骤为：向装有馏分的孔板中加入自由基工作液，避光反应。
8.根据权利要求1所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，所述的待测中药为白芍，步骤(1)中，所述的预处理方式为：将白芍粉末与70％乙醇水溶液混合，超声提取，过滤取滤液，回收溶剂，复溶于水，再加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相，回收溶剂，复溶于水后过HLB固相萃取小柱，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得到白芍粗提物。
9.根据权利要求8所述的中药中美白活性成分的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的粗提物溶液的浓度为20mg/mL；所述的HPLC进样量为8-20μL，收集保留时间4-42min的馏分，分辨率为8.8-10.08point/min。
10.根据权利要求1-9任一项所述的中药中美白活性成分的筛选方法在中药中筛选美白活性成分的应用。
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