KR100864203B1 - 미백활성을 나타내는 제주아그배 추출물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미백활성을 나타내는 제주아그배 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 제주아그배 추출물은 제주아그배의 잎, 가지, 꽃, 열매 중 선택된 1종 이상을 세척한 후 3 일 동안 40 ℃로 열풍건조한 다음 분쇄하고, 이 제주아그배 분쇄물을 70 % 에탄올에 침적시키고 2 ~ 3 일동안 실온에서 교반하여 침출한 다음, 여과기로 여과한 후, 이 침출.여과 과정을 2 ~ 3회 더 반복하여 제주아그배 조추출물을 제조하고, 이 조추출물을 극성이 다른 용매를 이용하여 순차적으로 분획하여 추출분획물을 제조하는 것으로 구성된다.
본 발명에 의해 미백 활성이 뛰어나고, 항산화 및 항염활성이 뛰어난 제주아그배 추출물이 제공되며, 이 제주아그배 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 제공된다.
제주아그배, 미백, 티로시나제, 멜라닌, 항산화, 항염

Description

미백활성을 나타내는 제주아그배 추출물{MALUS MICROMALUS EXTRACTS HAVING WHITENING ACTIVITY}
도 1은 본 발명의 제주아그배 추출물 및 분획물에 대한 Melan-a 세포에서의 멜라닌 합성억제 효과를 나타내는 그래프
A : 제주아그배 조추출물, B : 제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물
도 2는 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 Melan-a 세포에서의 세포 티로시나제 억제 효과를 나타내는 그래프
A : 제주아그배 조추출물, B : 제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물
도 3은 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 Melan-a 세포에서의 티로시나제 및 TRP-1 단백질 발현 결과를 나타내는 웨스턴블랏 사진
A : 제주아그배 조추출물, B : 제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물
도 4는 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 Melan-a 세포에서의 티로시나제 및 TRP-1 mRNA 발현 결과를 나타내는 웨스턴블랏 사진
A : 제주아그배 조추출물, B : 제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물
도 5는 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거활성 결과를 나타내는 그래프
도 6은 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 NO 소거활성 결과를 나타내는 그래프
도 7은 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 잔틴 산화효소 억제활성 결과를 나타내는 그래프
도 8은 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 과산화 라디칼 소거활성 결과를 나타내는 그래프
도 9는 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 LPS 자극된 RAW264.7 세포에서의 NO 에세이 결과를 나타내는 그래프
도 10은 본 발명의 제주아그배 추출물의 농도별 처리시 LPS 자극된 RAW264.7 세포에서의 NO 에세이와 MTT 에세이 결과를 나타내는 그래프
A : LPS 단독 또는 제주아그배 조추출물을 농도별로 함께 처리,
B : LPS 단독 또는 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 함께 처리
도 11은 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 LPS 자극된 RAW264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 대한 결과를 나타내는 웨스턴블랏 사진결과
A : 제주아그배 조추출물, B : 제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물
도 12는 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 LPS 자극된 RAW264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현에 대한 결과를 나타내는 웨스턴블랏 사진결과
A : 제주아그배 조추출물, B : 제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물
본 발명은 미백활성을 나타내는 제주아그배 추출물에 관한 것이다.
사람의 피부색은 표피에 존재하는 색소세포인 멜라닌 세포에서 생성하는 피부멜라닌, 헤모글로빈이나 카로티노이드 등의 색소의 유.무 및 피부의 두께와 반사도 등에 영향을 받는다.
이 중 피부색을 결정하는데 가장 중요한 요소인 멜라닌 색소는 인체에 정상적으로 존재하는 아미노산의 일종인 티로신(Tyrosin)이 멜라닌 세포내에 존재하는 효소인 티로시네이즈(Tyrosinase)에 의해 도파(DOPA)되고, 계속되는 일련의 복잡한 산화과정을 통해 최종적으로 흑갈색의 중합체인 멜라닌을 생성하게 된다.
멜라닌 합성은 자외선 노출, 멜라노마(melanoma), 색소과다침착증( hyperpigmentation disease)등의 요인에 의하여 합성이 촉진된다.
또한, 멜라닌 색소의 생합성은 티로시나제(tyrosinase) 효소를 비롯하여 여러 효소들에 의하여 조절되고 있으며, 그중 티로시나제는 티로신(tyrosin)을 기질로 하여 L-도파퀴논(L-dopaquinone)으로 전이되는 초기 생합성 과정 이후 디하이드록시인돌(dihydroxyindole)의 산화에 작용한다.
따라서, 티로시나제 활성 억제제를 찾는 연구가 미백제의 개발에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 현재 계속 알려지고 있는 티로시나제 저해제로 하이드로퀴논(hydroquinone), 4-하이드록시아니졸(4-hydroxyanisole), 아스코르빈산 (ascorbic acid) 유도체, 코지산(kojic acid), 아젤라인산(azelaic acid), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 레티노이드(retinoids), 알부틴(arbutin), 카테킨(catechin) 등이 있으나, 이들의 안전성과 경제성 등의 문제점으로 사용에 있어 서 어려움이 있다.
이에 따라 최근에는 천연식물을 이용한 미백 원료, 기능성 식품, 기능성 화장료 등 각 분야에서 인공물질이 아닌 천연물을 이용한 연구가 활발히 진행되어 지고 있다.
한국등록특허공보 10-0602684(망초 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료조성물)에는, 망초 추출물이 멜라닌 생성 세포에서의 멜라닌 생성을 저해하고 티로시나제 활성을 억제하며, 항산화활성도 함께 나타내는 피부 미백용 화장료조성물에 관한 것이 공개되어 있다.
한편, 제주아그배(Malus micromalus Makino)는 개아그배나무, 좀아그배나무라고도 불리는 제주도 한라산에서 자생하는 낙엽관목으로서, 5 ~ 6 월에 개화하여 9 월에 열매가 열리며, 제주아그배의 과실은 하리(下痢) 치료에 효과가 있다고 알려져 있다.
한국공개특허공보 10-2004-0087644(배나무 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물)에는, 배나무 가지의 목피로부터 추출한 추출물을 기미, 주근깨 및 다양한 색소침착 제거를 목적으로 한 미백 화장료 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.
그러나, 상기 발명에서 이용하는 배나무는 배나무속(Pyrus)에 속하는 식물로서, 사과나무속(Malus)에 속하는 식물인 제주아그배와는 다른 속의 식물이다.
따라서, 현재 배나무속 식물의 추출물에 대한 생리활성에 대한 연구는 다소 이루어지고 있으나, 제주아그배와 같은 사과나무속 추출물의 생리활성에 대한 연구가 미비한 실정이고, 이 사과나무속 추출물을 이용한 화장료조성물 등 그 활용방안 에 대한 연구 또한 부족한 실정이다.
본 발명은 멜라닌 생합성 및 티로시나제 활성 억제효과가 뛰어나 미백 활성이 뛰어나며, 항산화 및 항염활성이 뛰어난 제주아그배 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 제주아그배 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은 미백활성을 나타내는 제주아그배 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 제주아그배 추출물은 제주아그배의 잎, 가지, 꽃, 열매 중 선택된 1종 이상을 세척한 후 3 일 동안 40 ℃로 열풍건조한 다음 분쇄하고, 이 제주아그배 분쇄물을 70 % 에탄올에 침적시키고 2 ~ 3 일동안 실온에서 교반하여 침출한 다음, 여과기로 여과한 후, 이 침출.여과 과정을 2 ~ 3회 더 반복하여 제주아그배 조추출물을 제조하고, 이 조추출물을 극성이 다른 용매를 이용하여 순차적으로 분획하여 추출분획물을 제조하는 것으로 구성된다.
또한, 본 발명은 상기의 제주아그배 추출물이 유효성분으로 포함된 조성물을 제조하는 것으로 구성된다.
한편, 제주아그배(Malus micromalus Makino)는 개아그배나무, 좀아그배나무라고도 불리는 제주도 한라산에서 자생하는 낙엽관목으로서, 5 ~ 6 월에 개화하여 9 월에 열매가 열리는 식물이다.
제주아그배의 과실은 하리(下痢) 치료에 효과가 있다고 알려져 있는 정도이며, 그 생리활성에 대한 연구보고는 없는 실정이다.
본 발명의 발명자들이 미백 활성 등 생리활성이 뛰어난 천연식물에 대한 연구를 하던 중 제주아그배 추출물에서 멜라닌 생합성억제 활성 및 티로시나제 저해활성 등의 미백활성이 뛰어나고 항산화 및 항염활성까지 그 생리활성이 뛰어나다는 사실을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제주아그배 추출물에 대하여 미백활성을 측정하기 위해 melan-a 세포에서 독성을 보이지 않는 농도에서 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물의 멜라닌 억제효과를 실험하였다.
그 결과, 세포 내의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하기 위해 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 처리하였을 때, 농도의존적으로 멜라닌 생성이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물에서 멜라닌 생성 억제율에 대한 IC50 값은 38.2 ㎍/㎖이었다(도 1B).
또한, 세포 내의 티로시나제 억제활성을 확인하기 위해 상기와 동일한 농도로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 세포내 티로시나제 활성이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다(도 2).
제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서의 티로시나제 활성 억제율에 대한 IC50 값은 각각 22.8 ㎍/㎖, 17.9 ㎍/㎖였다.
따라서, 제주아그배 조추출물 및 에틸아세테이트 분획물은 melan-a 세포에서 투여량이 처리 농도가 증가 함에 따라 멜라닌 생성이 억제되는 경향을 보였다.
또한, 본 발명의 제주아그배 추출물에 대하여 멜라닌 생성에 관여하는 단백질 발현 저해 활성 및 mRNA 발현 저해 활성에 대해 실험하였다.
그 결과, 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서 티로시나제, TRP-1 단백질의 발현양이 농도 의존적인 감소를 보였다(도 3).
또한, 이 멜라닌 저해 활성이 티로시나제와 TRP-1 mRNA의 감소에 의한 것인지 확인하기 위해 RT-PCR를 실시한 결과, 티로시나제, TRP-1 mRNA의 발현양이 농도 의존적인 감소를 보였으며(도 4), 에틸아세테이트 추출분획물을 50 ㎍/㎖ 처리한 군은 무처리군에 비해 티로시아제는 약 10 %, TRP-1은 약 25 % 이하의 발현율을 보였다(도 4B).
따라서, 제주아그배 추출물은 멜라닌 생성 억제활성 및 티로시나제 저해활성이 뛰어나 미백효과가 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 항산화활성을 실험하였다.
항산화 물질의 가장 특이적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거작용은 활성라디칼(free radical)에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인 체에서 노화를 억제하는 척도로 사용되므로 전자공여능(electron donating ability)측정에 의한 DPPH 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.
그 결과, 제주아그배 추출물의 IC50값은 에탄올 추출물에서 16.12 ㎍/㎖, 헥산 추출분획물에서 541.29 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 추출분획물에서 1.23 ㎍/㎖, 부탄올 추출분획물에서 15.24 ㎍/㎖, 물 분획물에서 80.93 ㎍/㎖를 나타내었다(표 1, 도 5).
이 중 에틸아세테이트 추출분획물이 대조군인 BHA와 트롤록스보다 높은 활성을 보였다.
또, 제주아그배 추출물의 nitric oxide 생성저해 활성을 측정한 결과, 제주아그배 추출물의 NO 소거활성의 IC50값이 조추출물에서 901.18 ㎍/㎖, 헥산 추출분획물에서 861.49.29 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 추출분획물에서 584.95 ㎍/㎖를 나타내었고(표 1, 도 6), 다른 용매 분획물에서의 소거 활성은 1 ㎎/㎖에서 20 ~ 30 % 정도를 나타내었다.
또, 잔틴 산화효소 억제활성을 측정한 결과, 제주아그배 에탄올 조추출물 및 각 분획물에서 모두 억제활성을 보였고, 그 중 에틸아세테이트 추출분획물(IC50=4.91 ㎍/㎖)에서 가장 높은 활성을 보였다(표 1, 도 7).
과산화물 소거활성 또한 조추출물 및 각 분획물에서 모두 억제활성을 보였으며, 그 중 에틸아세테이트 추출분획물(IC50=0.16 ㎍/㎖)에서는 양성 대조군 알로푸 리놀(IC50=2.11 ㎍/㎖) 보다 높은 활성을 보였다(표 1, 도 8).
따라서, 본 발명의 제주아그배 추출물은 항산화 활성이 뛰어나며, 이로 인해 노화 방지 및 주름형성 예방 등의 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 제주아그배 추출물에 대하여 항염활성 실험을 하였다.
제주아그배 추출물에 대하여 RAW264.7 cell에서의 Cell NO 생성 억제활성을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖의 LPS와 제주아그배 조추출물 및 분획물을 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, LPS 단독 처리군에서 NO 생성량이 19.95 μM로 생성되었으나, 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서 각각 NO 생성량이 3.57 μM, 0.74 μM로 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 9).
제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 NO 생성량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 10).
제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서의 NO 생성 억제율에 대한 IC50값은 각각 16.7 ㎍/㎖, 4.1 ㎍/㎖이었다.
또한, 제주아그배 추출물의 NO 생성 저해활성이 시료의 NO 소거활성으로 인한 것이 아니라 iNOS와 COX-2 단백질의 감소에 의한 것임을 확인하기 위해 웨스턴 블랏과 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.
그 결과, LPS를 단독처리하였을 때 iNOS 단백질 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 처리하였을 때 iNOS 단백질은 농도 의존적으로 감소하였다(도 11).
RT-PCR로 분석한 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 또한 농도 의존적인 감소를 나타냈다(도 12).
에틸아세테이트 분획물을 50 ㎍/㎖ 처리한 군에서 iNOS의 mRNA 발현양이 LPS만 처리한 실험군에 비하여 약 80 % 정도 감소된 mRNA 발현양을 보였다(도 12B).
따라서, 본 발명의 제주아그배 추출물은 항염활성이 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.
한편, 본 발명의 제주아그배 추출물은 식품첨가제, 사료첨가제, 음료조성물, 화장료조성물 등으로 다양하게 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 생리활성을 나타내는 제주아그배 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 및 개선용 조성물 또는 항산화용 조성물을 제조할 수 있다.
이때, 본 발명의 조성물은 환, 캡슐, 과립, 현탁액 등 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명의 제주아그배 추출물에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명의 제주아그배 추출물 제조
제주도에서 자생하고 있는 제주아그배(Pimpinella komarovii) 가지, 잎, 열매를 준비하였다.
준비한 제주아그배를 흐르는 물에 세척한 후 3 일 동안 40 ℃로 열풍건조하였다.
건조된 제주아그배 360 g을 분쇄기로 분쇄하고, 이 분쇄물을 70 % 에탄올에 침적시키고 2 ~ 3 일 동안 실온에서 교반하여 침출하였다.
이 침출물을 여과기로 여과하고, 상기의 침출 및 여과과정을 2 ~ 3 회 더 반복하여 본 발명의 제주아그배 조추출물 60.3 g을 제조하였다.
상기의 제주아그배 조추출물을 증류수에 용해시키고, n-헥산을 첨가하여 n-헥산층과 수층으로 분획한 후 이를 3 회 반복하여 헥산층을 얻었다.
그 다음, 상기의 수층에 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트와 수층으로 분획한 후 이를 3 회 반복하여 에틸아세테이트 층을 얻었고, 상기 수층에 부탄올을 첨가하여 부탄올 층과 수층을 분획한 후 이를 3 회 반복하여 부탄올층을 얻었다.
상기의 분획물을 각각 감압농축시켜 제주아그배 헥산분획물 3.55 g, 에틸아세테이트 분획물 17.25 g, 부탄올 분획물 12.24 g, 물분획물 26.09 g을 제조하였다.
<실시예 2> 제주아그배 추출물을 이용한 환 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 감압농축한 다음, 동결건조하여 분말로 준비하였다.
준비한 분말 1 ㎏에 물 200 g, 꿀 100 g을 넣고 반죽하여 환 제조장치에 넣 어 환 모양으로 만든 후, 건조기에 넣고 30 ℃ 에서 12 시간 동안 건조하여 환을 제조하였다.
<실시예 3> 제주아그배 추출물을 이용한 캡슐 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 추출물을 감압농축한 다음, 동결건조하여 분말로 준비하였다.
준비한 물질을 이용해 통상적인 방법으로 캡슐로 제조하였다.
<실시예 4> 제주아그배 추출물이 함유된 음료조성물의 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 준비하였다.
정제수 1 ℓ 당 준비한 제주아그배 추출물 20 g, 비타민 B2 4 g, 비타민 B6 6 g, 니코틴산아미드 10 g, 구연산 30 g, 액상과당 2 ㎏, 허브향 70 ㎖ 를 첨가하여 본 발명의 제주아그배 추출물이 함유된 음료조성물을 제조하였다.
<실시예 5> 제주아그배 추출물이 함유된 미백용 스킨조성물의 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 준비하였다.
통상적인 스킨조성물 제조시, 상기의 추출물을 2 중량% 첨가하여 미백용 스킨조성물을 제조하였다.
<실시예 6> 제주아그배 추출물이 함유된 미백용 로션조성물의 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 준비하였다.
통상적인 로션조성물 제조시, 상기의 추출물을 2 중량% 첨가하여 미백용 로션조성물을 제조하였다.
<실시예 7> 제주아그배 추출물이 함유된 염증성 질환의 개선 및 치료용 에센스조성물의 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 준비하였다.
통상적인 에센스 조성물 제조시, 상기의 추출물을 2 중량% 첨가하여 염증성 질환의 개선 및 치료용 에센스 조성물을 제조하였다.
<실시예 8> 제주아그배 추출물이 함유된 염증성 질환의 개선 및 치료용 로션조성물 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 준비하였다.
통상적인 로션조성물 제조시, 상기의 추출물을 3 중량% 첨가하여 염증성 질환의 개선 및 치료용 로션조성물을 제조하였다.
<실시예 9> 제주아그배 추출물이 함유된 식품첨가제의 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 동결건조 후 분말로 제조하였다.
통상적인 식품 제조시 상기의 분말을 2 중량% 첨가하여 사용하였다.
<실시예 10> 제주아그배 추출물이 함유된 사료첨가제의 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 제주아그배 추출물을 동결건조 후 분말로 제조하였다.
통상적인 가축용 사료에 상기의 분말을 2 중량% 첨가하여 사용하였다.
<실험예 1> 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 미백활성 실험
1. 실험준비
melan-a 세포를 24 well plate에 well당 1×105개의 세포를 접종하고 24 시간동안 37 ℃, 10 % CO2 세포배양기에서 배양한 후 제주아그배 추출물을 각각의 well에 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 그리고 100 ㎍/㎖의 농도로 3 일간 처리하여 배양하였다.
배지를 제거하고, 세포를 PBS로 2 회 세척하였다.
각 well 당 500 ㎕의 1N NaOH를 가하고, 56 ℃에서 30 분 용해한 후, ELISA reader(μQuant, USA)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2. 세포 내의 멜라닌 생성과 티로시나제 억제활성 실험
Melan-a 세포에서 독성을 보이지 않는 농도에서 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물의 멜라닌 억제 효과를 시험하였다.
그리고, 본 실험은 티로시나제(tyrosinase) 활성억제 효과로 인하여 멜라닌 생선과정의 최종 산물인 멜라닌생성의 억제를 확인하기 위하여 실험하였다.
먼저, 세포 내의 멜라닌 생성 억제를 보기 위해서 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 멜라닌 생성이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
에틸아세테이트 추출분획물에서 멜라닌 생성 억제율에 대한 IC50 값은 38.2㎍/㎖ 이었다(도 1B).
또한, 제주아그배 조추출물 처리 후 최종 멜라닌양이 억제된 것은 멜라닌 합성에 관여하는 효소들의 활성과 관련이 있음을 나타내므로 melan-a 세포에서 티로시나제(tyrosinase) 활성을 측정하였다.
그 결과, 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 세포내 티로시나테 활성이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서의 티로시나제 활성 억제율에 대한 IC50 값은 각각 22.8㎍/㎖, 17.9㎍/㎖ 이었다.
3. 멜라닌 생성에 관여하는 단백질 발현 저해활성
melan-a 세포에서 독성을 보이지 않는 농도에서 본 발명의 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물의 멜라닌 억제효과가 단백질 발현에 의한 것인 지를 알아보았다.
멜라닌 생성에 주요한 효소로 알려진 티로시나제, TRP-1 단백질의 발현양상을 보기 위해 웨스턴 블랏을 실시하였다.
그 결과, 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서 티로시나제, TRP-1 단백질의 발현양이 농도 의존적인 감소를 보였다(도 3).
4. 멜라닌 생성에 관여하는 mRNA 발현 저해활성
제주아그배 에틸아세테이트 추출분획물의 멜라닌 저해 활성이 티로시나제와 TRP-1 mRNA의 감소에 의한 것인지 확인하기 위해 RT-PCR를 실시하였다.
그 결과, 티로시나제, TRP-1 mRNA의 발현양이 농도 의존적인 감소를 보였으며(도 4), 에틸아세테이트 추출분획물을 50 ㎍/㎖ 처리한 군은 무처리군에 비해 티로시아제는 약 10 %, TRP-1은 약 25 % 이하의 발현율을 보였다(도 4B).
따라서, 제주아그배 추출물은 멜라닌 생성 억제활성 및 티로시나제 저해활성이 뛰어나 미백효과가 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.
<실험예 2> 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 항산화활성 실험
1. DPPH 라디칼 소거활성
항산화 물질의 가장 특이적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거작용은 활성라디칼(free radical)에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인 체에서 노화를 억제하는 척도로 사용된다.
전자공여능(electron donating ability)측정은 Blosis방법에 의한 DPPH 자유라디칼 소거법에 따라 측정하였다.
먼저 메탄올에 녹인 다양한 농도의 시료를 각각 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH용액을 동량으로 첨가하여 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 517 ㎚에서 측정하였다.
이때, 대조군으로는 아스코르빈산(ascrbic acid), 트롤록스(trolox)를 사용하였다.
DPPH 라디칼 소거활성은 아래의 식으로부터 산출하였으며, DPPH의 흡광도가 50 % 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
DPPH radical 소거활성(%)= (A control-Asample)/Acontrol ×100
Asample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도
Acontrol = 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액 흡광도
그 결과, 제주아그배 추출물의 IC50값은 에탄올 추출물에서 16.12 ㎍/㎖, 헥산 추출분획물에서 541.29 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 추출분획물에서 1.23 ㎍/㎖, 부탄올 추출분획물에서 15.24 ㎍/㎖, 물 분획물에서 80.93 ㎍/㎖를 나타내었다(표 1, 도 5).
이 중 에틸아세테이트 추출분획물이 대조군인 BHA와 트롤록스보다 높은 활성을 보였다.
2. Nitirc oxide 소거활성 측정
질소화합물은 세포독성이 강하며 다량의 NO가 생성되면 아질산화(nitrozation), 니트로화(nitration)와 같은 간접적인 효과 및 산화반응을 야기하여 유해효과를 가져온다.
본 실험에서는 쿠세르틴(qucertin)을 대조군으로 하여 본 발명의 제주아그배 추출물의 질소화합물(nitric oxide) 생성저해 활성을 측정하였다.
NO를 생성하는 니트로프루시드나트륨(sodium nitroprusside, SNP)을 사용하여 아질산염의 양을 측정하는 방법으로 NO 소거활성을 측정하였다.
10 mM SNP용액에 200 ㎕에 시료를 농도별로 첨가하고 25 ℃에서 3 시간 동안 반응시킨후 동량의 Griess reagent(2.5% phophoric acid, 1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylendiamine)를 첨가하여 실온에서 10 분간 반응하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Nitric oxide 소거활성은 흡광도가 50 %감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC50)로 표시하였다.
그 결과, 제주아그배 추출물의 nitric oxide 생성저해 활성을 측정한 결과, 제주아그배 추출물의 NO 소거활성의 IC50값이 조추출물에서 901.18 ㎍/㎖, 헥산 추 출분획물에서 861.49.29 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 추출분획물에서 584.95 ㎍/㎖를 나타내었고(표 1, 도 6), 다른 용매 분획물에서의 소거 활성은 1 ㎎/㎖에서 20 ~ 30 % 정도를 나타내었다.
3. 잔틴 산화효소 억제활성 측정
잔틴산화효소(Xanthine oxidase)는 하이포잔틴(hypoxanthine)을 산화시켜 최종적으로 요산(uric acid)과 산소를 생성하며 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생하게 된다.
요산(Uric acid)의 축적은 고요산혈증과 통품 유발, 산화적 손상 등을 하는 것으로 알려져 있다.
잔틴산화효소 저해제는 통풍, 시장결적, 허혈, 심근증 등을 일으키는 요산혈증에 대한 치료제로 사용되어 왔으며 통풍치료에 사용되는 물질로는 알로푸리놀(allopurinol), 알로잔틴(alloxanthine) 등이 있다.
xantihine/xanthine oxidase에 의한 요산(uric acid) 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였다.
반응액(0.5mM xanthine, 200 mM phosphate buffer(pH7.5) 1mM EDTA)에 50mU/ml 크산틴옥사이드(xanthine oxidase)를 첨가하여 요산(uric acid)생성을 유도하였다.
잔틴 산화효소(Xanthine oxidase) 억제활성은 생성된 요산(uric acid)의 흡 광도가 50 %이상 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
잔틴 산화효소 억제활성을 측정한 결과, 제주아그배 에탄올 조추출물 및 각 분획물에서 모두 억제활성을 보였고, 그 중 에틸아세테이트 추출분획물(IC50=4.91 ㎍/㎖)에서 가장 높은 활성을 보였다(표 1, 도 7).
4. 과산화물 소거활성
과산화물(superoxide)의 양은 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT)환원방법에 의해 측정하였다.
반응액(0.5mM xanthine, 200 mM phosphate buffer(pH7.5) 1mM EDTA)에 0.5mM NBT를 첨가하여 과산화물(superoxide) 소거활성을 측정하였다.
과산화물(superoxide) 소거활성은 생성된 과산화물의 흡광도가 50 %이상 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
과산화물 소거활성은 조추출물 및 각 분획물에서 모두 억제활성을 보였으며, 그 중 에틸아세테이트 추출분획물(IC50=0.16 ㎍/㎖)에서는 양성 대조군 알로푸리놀(IC50=2.11 ㎍/㎖) 보다 높은 활성을 보였다(표 1, 도 8).
따라서, 본 발명의 제주아그배 추출물이 항산화 활성이 뛰어나다는 사실을 알 수 있었다.
<표 1> 제주아그배 추출물 및 추출분획물에 대한 항산화 활성 실험 결과
구 분 DPPH(IC50) NO(IC50) 요산 생성 억제활성(IC50) 과산화물 소거활성(IC50)
조추출물 16.12±1.67 901.18±74.61 45.55±11.51 2.73±0.26
헥산분획물 541.29±34.20 861.49±35.00 278.07±73.75 129.6±5.78
에틸아세테이트 분획물 1.23±0.26 584.95±88.71 4.91±0.11 0.61±0.08
부탄올분획물 15.24±0.76 >1000 96.95±5.18 3.31±0.21
물 분획물 80.93±1.49 >1000 >400 16.59±0.47
트록록스 4.13±1.10 >1000 N/A N/A
BHA 7.03±1.21 >1000 N/A N/A
알로푸리놀 N/A N/A 1.91±0.21 2.11±0.91
* IC50(㎍/㎖) 값은 농도별로 3회 반복실험하여 계산된 것임.
* BHA는 부틸하이드록시 아니솔(Butylated hydroxyl anisol) 임.
* N/Y : Not Assay
<실험예 3> 본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 항염활성 실험
본 발명의 제주아그배 추출물에 대하여 RAW264.7cell에서의 Cell NO 억제효과 및 세포독성저해 효과를 측정하였다.
1. 세포배양
본 실험에 사용된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였다.
세포는 10 % 우태혈청(FBS)과 100 uint/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(GIBCO, USA)이 포함된 DMEM(GIBCO, USA) 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하였다.
melan-a 세포는 non-tumorigrnic mouse melanocyte cell line 으로 C57BL의 embryo 로 부터 유래한 세포이다.
2. 제주아그배 추출물에 대한 NO 생성억제 활성 측정
Raw264.7 cell배양은 DMEM 배지에 10%FBS, 1% stereptomycine/ phenicliline를 첨가하여 세포를 유지하였다.
세포농도 1.5×105 cell/ml를 24well plate에 seeding한후 18시간 동안 배양하였다.
시료처리는 100 ㎍/㎖와 LPS(lipopolysaccaride) 1 ㎍/㎖를 동시에 처리한 후 24 시간 배양하였다.
NO생성 측정은 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylene diamine in 2.5% phosphoric acid) 100 ㎕와 배양액 100 ㎕를 혼합한 후, 10 분 동안 반응시켰다.
그리고, 540 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 100 ㎍/㎖의 LPS와 제주아그배 조추출물과 그 분획물을 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, LPS 단독 처리군에서 NO 생성량이 19.95 μM로 생성되었으나, 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서 각각 NO 생성량이 3.57 μM, 0.74 μM로 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다(도 9).
제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 NO 생성량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 10).
동일한 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았다.
제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물에서의 NO 생성 억제율에 대한 IC50 값은 각각 16.7 ㎍/㎖, 4.1 ㎍/㎖ 이었다(도 10).
3. 제주아그배 추출물에 대한 iNOS와 COX-2의 단백질 발현양 측정
제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물의 NO 소거 저해 활성이 시료의 NO 소거활성으로 인한 것이 아니라 iNOS와 COX-2 단백질의 감소에 의한 것임을 확인하기 위해 웨스턴블랏(western blot)과 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.
배양이 끝난 세포를 2 ~ 3 회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후 100 ㎕의 lysis buffer을 첨가, 30분 ~ 1 시간동안 lysis 시킨 후, 12,000 rpm에서 20 분간 원심분리 하였다.
단백질 농도는 BSA(Bovine serum albumin)을 표준화하여 Protein Assay Kit(Bio-Rad)를 사용하여 정량하였다.
30 ~ 50 μg의 단백질을 8 ~ 12 % mini gel SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane(BIO-RAD)에 15V로 1시간 동안 transfer하였다.
그리고, 막의 블록킹은 5 % skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2 시간 동안 실시하였다.
반응이 끝난 뒤 여러 가지 1차 항체 (1:500 - 1:2000)가 들어있는 5% skim milk에서 1 시간 (25 ℃) 또는 24 시간(4 ℃)동안 반응시킨 후, TTBS로 3회 세척하고 2차 항체(1:1000)와 상온에서 30분 반응시킨 뒤 ECL(Enhanced Chemiluminescence) 방법으로 각 밴드의 영상을 얻었다.
그 결과, LPS을 단독처리 하였을 때 iNOS 단백질 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, 제주아그배 조추출물과 에틸아세테이트 추출분획물을 농도별로 처리하였을 때 iNOS 단백질은 농도 의존적으로 감소하였다(도 11).
4. 제주아그배 추출물에 대한 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현양 측정
본 발명의 제주아그배 추출물에 대한 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 저해활성을 측정하기 위해, RT-PCR을 이용하여 분석하였다.
배양이 끝난 세포를 2 ~ 3 회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후 total RNA 추출은 TRIzol-reagent(Invitrogen)를 이용하여 분리하였다.
세포에 TRIzol-reagent를 첨가하여 균질화 한 후, 클로로포롬을 첨가하여 원심분리(12,000rpm, 15min)하였다.
상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 원심분리(12,000rpm, 10min)하여 RNA를 침전시키고 75 %의 DEPC 처리된 에탄올로 세척한 후, 건조시켜 DEPC 처리된 증류수에 녹인다.
260 nm의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280nm의 비율이 1.7~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다.
cDNA 합성은 Improm-ⅡTM cDNA kit (Promega)를 이용하였고, 1㎕의 total RNA를 oligo(dT)18 primer, dNTP (0.5μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase(2U)로 70℃ 5min, 37℃ 5min, 37℃ 60min, 그리고 70 ℃에서 10 분동안 가열시킴으로서 반응을 중지시켰다.
PCR(Polymerase chain reaction)은 합성된 cDNA로부터 티로시나제(Tyrosinase), TRP-1, TRP-2, MiTF, β-actin를 증폭시키기 위하여 2㎕ cDNA, 4μM의 5’과 3’ primer, 10× buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25 mM MgCl2, 1unit Taq polymerase (Promega, USA)를 섞고 증류수로 최종 25 ㎕로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다.
이때 PCR 조건은 94℃/30초, 50~55℃/45초, 72℃/45초 20~25회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.2 % 아가로스겔에서 전기영동을 실시하고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 특정 밴드를 확인하였다.
RT-PCR에서 사용된 프라이머는 표 2와 같다.
RT-PCR로 분석한 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 또한 농도 의존적인 감소를 나타냈다(도 12).
특히, EtOAc 추출분획물을 50㎍/㎖을 처리한 군에서 iNOS의 mRNA 발현양이 LPS만을 처리한 실험군에 비하여 약 80 % 정도의 감소된 mRNA 발현양을 보였다(도 12B).
<표 2> RT-PCR에서 사용된 프라이머 서열
유전자 프라이머 서열 단편 사이즈(bp)
Tyrosinase Forward 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT-3' 510
Reverse 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3'
TRP-1 Forward 5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3' 290
Reverse 5'-AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT-3'
TRP-2 Forward 5'-GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3' 1200
Reverse 5'-CGG TTG TGA CCA ATG GGT GGC-3'
β-actin Forward 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3' 350
Reverse 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'
본 발명에 의해 멜라닌 생합성 및 티로시나제 활성억제 효과가 뛰어나 미백 활성이 뛰어나고, 항산화 및 항염활성이 뛰어난 제주아그배 추출물이 제공된다.
또한, 본 발명의 제주아그배 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 제공된다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제주아그배(Malus micromalus Makino) 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물.
  5. 제주아그배(Malus micromalus Makino) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 개선 및 예방용 조성물.
  6. 삭제
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