KR20070005049A

KR20070005049A - 미백활성을 갖는 제주조릿대 잎 추출물

Info

Publication number: KR20070005049A
Application number: KR1020050059971A
Authority: KR
Inventors: 김세재; 최수연; 박수영; 고희철; 정완석; 윤훈석
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2005-07-05
Filing date: 2005-07-05
Publication date: 2007-01-10

Abstract

본 발명은 미백활성을 갖는 제주조릿대 잎 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 잎 추출물은, 제주조릿대 잎을 음건하는 제1공정, 음건한 제주조릿대 잎을 마쇄기로 갈아 미세분말로 만드는 제2공정, 제2공정의 미세분말을 증류수에 침적하는 제3공정, 제3공정의 증류수 침적물을 고압 추출기를 이용하여 80 ℃, 100 ℃, 121 ℃에서 각각 2 시간씩 2 회 추출하는 제4공정, 제4공정의 추출액의 상층액을 회수하여 감압농축 및 진공건조 후 동결 건조기를 사용하여 잔여 수분을 제거하여 분말을 얻는 제5공정을 거쳐 미백활성을 가지는 제주조릿대 잎 추출물이 제조된다.

본 발명에 의해, 항산화활성, 항염활성, 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성억제성 등이 우수한 미백활성을 가지는 제주조릿대 잎 추출물이 제공되며, 본 발명의 제주조릿대 잎 추출물을 포함하는 미백효과가 우수한 화장료 조성물이 제공된다.

제주조릿대, 추출, 미백활성, 항산화, 항염, 티로시나제 저해

Description

미백활성을 갖는 제주조릿대 잎 추출물{THE LEAF OF EXTRACTS SASA QUELPAERTENSIS THAT HAVING BLEACHING ACTIVITY}

도 1은 본 발명의 제주조릿대 잎 추출물의 제조공정도

도 2는 본 발명의 제주조릿대 잎 추출물에 대한 DPPH유리기 소거활성을 나타내는 그래프

도 3은 본 발명의 제주조릿대 잎 추출물에 대한 수퍼옥사이드 유리기 소거활성과 크산틴산화효소 저해활성을 나타내는 그래프

A : 80 ℃ 에서 열수추출한 제주조릿대 잎 추출물

B : 100 ℃ 에서 열수추출한 제주조릿대 잎 추출물

C : 121 ℃ 에서 열수추출한 제주조릿대 잎 추출물

D : 대조구인 알로퓨리놀(Allopurinol)

도 4는 본 발명의 제주조릿대 잎 추출물에 대한 RAW 264.7 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프

A : MTT 환원활성

B : Lactate dehydrogenase(LDH) 해리활성

도 5는 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 LPS(100 ng/㎖) 단독 처 리군에서의 항염활성 실험

A : NO 생성량

B : Lactate dehydrogenase(LDH) 해리활성

C : MTT 환원활성

도 6는 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 IFN-γ (100 U/㎖)단독처리군에서의 항염활성 실험

A : NO 생성량

B : Lactate dehydrogenase(LDH) 해리활성

C : MTT 환원활성

도 7는 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 LPS(100 ng/㎖) + IFN-γ (100 U/㎖) 처리군에서의 항염활성 실험

A : NO 생성량

B : Lactate dehydrogenase(LDH) 해리활성

C : MTT 환원활성

도 8은 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS와 COX-2 발현의 저해 정도를 나타내는 웨스턴 블랏 실험결과

도 9는 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물(121 ℃)을 B16/F10 melanoma cell에 처리한 후 세포내 tyrosinase 활성저해 정도를 나타내는 그래프

도 10은 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물(121 ℃)을 B16/F10 melanoma cell에 처리한 후 단백질 수준에서 발현양상 비교를 나타낸 이뮤노블랏 분석 결과

조릿대는 대나무 중에서 가장 작은 대나무로서 우리나라 중부이남 지방의 산에 빽빽하게 무리 지어 흔히 자란다.

조릿대는 동의보감, 본초강목, 신농본초경에 따르면 조릿대는 인삼을 훨씬 능가한다고 할만큼 놀라운 약성을 지닌 약초이며, 대나무 중에서 약성이 제일 강하여 조릿대 한 가지만 써서 당뇨병, 고혈압, 위염, 위궤양, 만성간염, 암 등의 난치병이 완치된 경우가 적지 않다고 한다.

또한, 조릿대는 열을 내리고 독을 풀며, 가래를 없애고 소변을 잘 나오게 하며, 염증을 치료하고 암세포를 억제하는 등의 효과가 있다고 알려져 있다.

그 중, 제주조릿대(Sasa quelpaertensisn Nakai)는 한라산 일대에서만 제한 적으로 분포하는 지역 고유종으로 분포지 내에서 대규모의 군락을 이루어 생육하고 있으며, 내륙 지방의 조릿대와는 형태상의 특징으로 구별된다.

제주조릿대는 자원 식물학적으로는 열매에 저장 전분을 많이 함유하고 있어, 제주 지방에서는 예로부터 식량 기근시의 중요한 구황식물로 활용되어 왔으며, 앞으로도 자원식물로서 활용 가능성이 높은 식물로 알려져 있다(Kim, C. H.: Ecotypic Variation of Sasa quelpaertensis Nakai According to the Environmental Gradient of Habitats, Journal of Natural Science of Pusan Women's University, 1996; 2, 21 ~ 36).

그러나, 제주조릿대를 이용한 생리활성 탐색은 타 지역의 조릿대류에서 보고된 기능성 식·의약품과 달리 거의 미개척분야로 독자적인 기술 및 물질을 확보할 수 있을 것으로 예상되며 새로운 물질의 확보는 기능성 식품의 개발뿐만 아니라 나아가서는 의약품 산업으로도 그 응용성이 크므로 많은 연구가 필요한 실정이다.

한국공개특허공보 10-2005-0007449 (화분증 치료 및/또는 예방용 조성물)에는, 조릿대 엑기스를 고형분으로 1 ~ 10 질량% 함유하는 화분증 치료 및/ 또는 예방용 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

또, 한국등록특허공보 10-0441596 (미백과 세포 증식효과를 갖는 혼합 식물추출물을 함유한 화장료 조성물)에는, 마치현, 로즈마리, 황금, 신선초, 송이, 알부틴, 홍삼, 및 식물성 플라센타 혼합물에 증류수, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 프로판올, 함수 부틸렌글리콜, 함수 프로필렌글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 용매를 10 ~20 배 부피량을 가해 추출하는 것에 관한 것이 공개되어 있다.

또한, 한국등록특허공보 10-0389096(피부미백기능을 가지는 장미꽃잎추출물 및 이를 함유한 피부미백화장료 조성물)에는, 장미꽃잎의 추출물의 피부미백기능을 이용하여 이를 기능성 화장품에 적용하는 것에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 상기와 같이 아직까지는 종래의 조릿대나 다른 종류의 식물추출물에 비해 월등히 미백활성이 우수한 제주조릿대 잎 추출물에 대한 연구가 이루어지지 않고 있는 실정이다.

본 발명에 의해, 항산화활성, 항염활성, 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성억제성 등이 우수한 미백활성을 가지는 제주조릿대 잎 추출물이 제공된다.

또한, 본 발명의 제주조릿대 잎 추출물을 포함하는 미백효과가 우수한 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 주 재료인 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 한라산 일대에서만 제한적으로 분포하는 지역고유종으로 분포지 내에서 대규모의 군락을 이루어 생육하고 있으며, 내륙 지방의 조릿대와는 형태상의 특징으로 구별된다.

제주조릿대는 자원 식물학적으로는 열매에 저장 전분을 많이 함유하고 있어, 제주 지방에서는 예로부터 식량 기근시의 중요한 구황식물로 활용되어 왔으며, 앞으로도 자원식물로서 활용 가능성이 높은 식물로 알려져 있다.

본 발명은 이러한 제주조릿대 잎을 이용하여 미백활성이 큰 추출물을 제조하고, 그 미백활성을 가진 제주조릿대 잎 추출물을 활성성분으로 하는 치료용 및 예방용 조성물로서의 가능성을 모색하는데 목적을 두고 연구를 하였다.

본 연구에서 제주조릿대 열수추출물의 활성산소 소거력과 항염증 효과 및 미백효과 사이의 연관성을 알아본 결과, 제주조릿대 잎을 온도별로 열수추출하여 DPPH에 의한 수소공여능 측정과 수퍼옥사이드 유리기의 소거활성, 크산틴산화효소활성억제 효과 및 세포독성 등의 생리 활성을 측정하였다.

그 결과 제주조릿대의 열수추출물이 전반적으로 항산화 활성을 모두 나타내었으며, 뮤린대식세포주 RAW264.7 으로부터의 LPS 혹은 IFN-γ 자극에 의한 NO의 형성억제 효과 및 iNOS의 발현, COX-2의 생성 및 활성저해 정도를 알아본 결과, 제주조릿대의 열수추출물에 의해 농도의존적으로 NO의 생성량이 현저히 저해되었으며 iNOS와 COX-2의 단백질 발현도 저해됨을 확인할 수 있었다.

이는 UV를 조사한 각질형성세포에서 멜라닌생성을 유도하기에 충분한 NO가 생성되는 것을 저해하여 멜라노사이트로 보내는 paracrine factor의 양을 줄일 수 있게 해주며, NO는 Tyrosinase의 활성을 mRNA 수준에서 유도하는 과정에 관여하는 것으로 보고되어 있으며 제주 조릿대 잎의 열수추출물이 이러한 세포내에서의 NO 저해활성이 멜라노사이트의 수상돌기 가지생성(dendritic branching)의 촉진을 막 고 melatonin에 의해 유도되어지는 멜라노솜의 응집현상을 저해할 수 있게 되므로 미백기능성 화장품의 소재로서 활용가능성이 높다고 하겠다(Romero-Graillet, C., Aberdam, E., Biagoli, N., Massabni, W., Ortonne, J. P., Ballotti, R. Ultraviolet B radiation acts through the nitric oxide and cGMP signal transduction pathway to stimulate melanogenesis in human melanocytes. J. Biol. Chem. 1996; 271: 28052-28056 ; Lassalle, M. W., Igarashi, S., Sasaki, M., Wakamatsu, K., Ito, S., Horikoshi, T. Effects of melanogenesis-inducing nitric oxide and histamine on the production of eumelanin and pheomelanin in cultured human melanocytes. Pigment cell res. 2003; 16: 81-84 ; Sasaki, M., Horikoshi, T., Uchiwa, H., Miyachi, Y. Up-regulation of tyrosinase gene by nitric oxide in human melanocytes. Pigment cell res. 2000; 13: 248-252).

그리고 제주 조릿대 잎 열수출물의 폴리페놀 함량은 18.50 %이며 DPPH 라디칼 소거능은 IC₅₀값이 500 ㎍/㎖ 이상인 것으로 분석결과 밝혀졌다.

즉, 활성산소 소거력이 그다지 높지 않지만 제주 조릿대 잎 열수출물의 멜라닌 생성 억제력은 뛰어난 것으로 관찰되었다.

이는 미백효과를 보인 제주 조릿대 잎 열수추출물이 활성산소 소거를 통하는 것보다 산화 환원에 민감한 구조인 항산화 물질이 티로시나제의 활성부위인 구리 이온과 결합하여 티로시나제 작용을 억제하는 경로를 거쳤을 가능성이 높다. 실제로 티로시나제 활성 억제력이 뛰어난 식물 추출물들이 멜라닌생성 억제력도 뛰어난 것으로 관찰되었다.

이 분석결과로 미루어 볼때 제주 조릿대 잎의 열수추출물이 폴리히드록시 페놀화합물이 갖는 세포독성과 항산화 활성을 갖는 화합물(Kang, H.H., Rho. H.S., Hwang, J.S. Oh, S-G. Depigmenting activity and low cytotoxicity of alkoxy benzoates or alkoxy cinnamate in cultured melanocytes. Chem. Pharm. Bull. 2003: 51(9), 1085 ~ 1088)이 화장품 제형에 들어갔을 때의 불안정성, 변색, 변취 등의 문제를 줄일 수 있을 것이라 사료된다.

따라서 제주조릿대 잎의 열수추출물은 활성산소종 등 자유기에 의해 발생되는 여러 만성질환 발병을 지연시키고 나아가서는 예방하는데 효과적일 것으로 기대되며, 특히 항노화 및 항염증 효과와 관련된 미백관련 기능성 화장품 원료로서의 활용 가능성도 높을 것으로 사료된다.

이하, 본 발명의 제주조릿대 잎 추출물에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 미백활성을 가지는 제주조릿대 잎 추출물 제조

제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 2004년 4 월경 제주 교래리(물찻오름) 지역에서 채집하여 신엽만을 준비하였다.

제주조릿대 잎 100 g을 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세분말로 만들었다.

준비한 제주조릿대 잎 분말을 제주조릿대 잎 분말의 10 배되는 증류수에 침적하고 80 ℃, 100 ℃, 121 ℃에서 각각 2 시간씩 2 회 추출하였다.

이 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하였다.

감압 농축 후 동결건조기로 잔여 수분을 제거하였다.

<실험예 1> 본 발명의 제주조릿대 일반 분석 및 총 폴리페놀 함량분석실험

제주조릿대의 열수추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였는데, 여기서는 Tannic acid 표준곡선을 이용하여 제주조릿대의 열수추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.

페놀성 물질은 식물계에서 널리 분포되어 있는 2 차 대사산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 갖는다.

이들은 페놀 하이드록시기를 갖고 있기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하려는 성질이 높으며, 항산화 효과 등 여러가지의 생리활성 기능도 갖는 것으로 보고되고 있다(Yinrong Lu and L. Yeap Foo (2001) Antidxidant activity of polyphenols from sage(Salvia officinalis). Food chemistry. 75, 197-202).

따라서, 다음과 같이 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 폴리페놀함량분석실험을 하였다.

1. 실험재료준비

제주조릿대 잎 100 g을 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세분말로 하여 각각의 미세분말 시료를 미세분말 시료의 10 배되는 증류수에 침적하고 80 ℃, 100 ℃, 121 ℃에서 각각 2 시간씩 2 회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축 한 다음, 동결건조기로 잔여 수분을 제거하여, 80 ℃에서 12.08 g, 100 ℃에서 14.29 g, 121 ℃에서 15.59 g의 수율을 얻어 실험에 사용하였다.

2. 폴리페놀 화합물의 함량분석

폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Denis법(Gutfinger, T: Polyphenols in olive olis. J. Am. Oil Chem. Soc., 1981: 58, 966-968)을 약간 변형시켜 측정하였다.

즉, 조릿대 열수추출물을 1 mg/㎖로 녹인 다음 0.2 ㎖를 시험관에 취하고 증류수를 가하여 2 ㎖로 만든 후, 여기에 0.2 ㎖ Folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma)를 첨가하여 잘 혼합한 후 3 분간 실온에 방치하였다.

3 분 후 2 M Na₂CO₃용액 0.4 ㎖를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 ㎖로 만든 후, 실온에서 1 시간 방치하여 상징액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Tannic acid(Sigma)를 이용한 표준곡선은 tannic acid 1 mg을 50 % 메탄올용액 1 ㎖에 녹이고 최종농도가 0, 32.5, 75, 125, 250 및 500 ㎍/㎖용액이 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 725 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.

상기와 같이, 제주조릿대 잎의 열수추출물의 총 폴리페놀 함량은 18.50 %로 나타났으며, 참고로 에탄올 추출물에서는 23.65 %로 열수추출물과는 약 5 %의 차이를 보였다.

<실험예 2> 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 항산화 활성실험

항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거 작용은 자유라디칼(free radical)에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 사용된다.

DPPH는 안정한 유리기로 시스테인, 글루타시온과 같은 함유황 아미노산과 ㅇ아스코르빈산, 아로마틱 아민(ρ-phenylenediamine, ρ-aminophenol) 등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 물질의 항산화능 측정에 많이 이용되고 있다(Blois, M. S. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 1958: 26, 1199-1200).

따라서, 다음과 같이 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 항산화 활성실험을 하였다.

1. 실험재료준비

제주조릿대 잎 100 g을 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세분말로 하여 각각의 미세분말 시료를 미세분말 시료의 10배 되는 증류수에 침적하고 80 ℃, 100 ℃, 121 ℃에서 각각 2 시간씩 2 회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축한 다음, 동결건조기로 잔여 수분을 제거하여, 80 ℃에서 12.08 g, 100 ℃에서 14.29 g, 121 ℃에서 15.59 g의 수율을 얻어 실험에 사용하였다.

2. 전자공여능 측정

전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blois 방법(Blois, M. S. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 1958: 26, 1199 ~ 1200)에 의한 DPPH 유리기 소거법에 따라 측정하였다.

즉, 메탄올에 녹인 각각의 시료를 여러 농도로 하여 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 유리기 소거활성은 아래의 식으로부터 산출하였고, 각 시료는 3 회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.

[DPPH radical 소거활성(%) = (A_control - A_sample)/A_control × 100]

* A_sample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도임.

* A_control = 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도임.

상기와 같이, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)의 자유 유리기 소거활성으로 제주조릿대 잎의 온도별 열수추출물 시료의 항산화 활성을 측정한 결과, 추출온도에 상관없이 모두 농도의존적으로 radical 소거 활성을 나타냈다(도 2).

3. 크산틴산화효소 억제 및 수퍼옥사이드 유리기 소거활성 측정실험

크산틴산화효소(Xanthine oxidase)는 산화적 환경에서 xanthine dehydrogenase로부터 생성된다.

크산틴산화효소는 hypoxanthine을 산화시켜 최종적으로 요산(uric acid)과 산소를 생성하며 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생하게 된다.

요산의 축적은 고요산혈증과 통풍을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 요산 형성의 억제제가 이들 질환을 위한 치료 물질로서 유용할 것이다.

게다가 크산틴산화효소에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다고 알려져 있다(Cheng, Z. J., S. C. Kuo, S. C. Chan, F. N. Ko, and C. M. Teng. Antioxidant properties of butein isolated from Dalbergia odorifera. Biochim . Biophys. Acta, 1998: 1392, 291 ~ 299).

그러므로, 산소 유리기의 자유기를 소거할 수 있는 물질 또한 산화적 손상의 예방에 유용할 것이다.

통풍은 요산의 수치가 높아지면서 일어나며 이들이 결정체를 이루어 관절에 흡착하여 염증이 생기며, 심한 경우 신장이나 심장 등에 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있다.

크산틴산화효소 저해제는 통풍, 신장결적, 허혈, 심근증을 일으키는 요산혈증에 대한 치료제로 사용되어 왔으며 통풍치료에 사용되는 물질로는 allopurinol, alloxanthine등이 알려져 있다.

따라서, 본 실험에서는 제주조릿대 잎 열수추출물의 크산틴산화효소(xanthine oxidase) 저해효과를 알아보았다.

Xanthine/xanthime oxidase에 의한 요산 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 수퍼옥사이드의 양은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다 (Cheng, Z. J., S. C. Kuo, S. C. Chan, F. N. Ko, and C. M. Teng. 1998. Antioxidant properties of butein isolated from Dalbergia odorifera. Biochim . Biophys. Acta, 1392: 291 ~ 299).

반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.5 mM xanthine와 1 mM EDTA를 200 mM phosphate buffer (pH 7.5) 100 ㎕에서 준비하였고 50 mU/㎖ xanthine oxidase를 첨가하여 uric acid의 생성을 유도하였다.

제주조릿대 잎의 온도별 열수추출물 시료의 크산틴산화효소 활성 억제에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

온도별에 따른 열수추출물 시료의 크산틴산화효소 활성 억제율은 그다지 높게 나타나지 않았으나, 121 ℃ 열수추출물에서 비교적 농도의존적으로 활성억제률을 보여주었다.

크산틴산화효소 활성 억제에 대한 이들의 활성 순서는 수퍼옥사이드 유리기소거활성과 달리 121 ℃ > 100 ℃ > 80 ℃ 열수추출물 순이었다.

또한, 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대하여 수퍼옥사이드 유리기 소거활성에 대해 측정을 하였다.

정상적인 oxidative phosphylation의 과정동안 소모되는 전체 산소의 0.4 ~ 4 % 정도는 자유라디칼 수퍼옥사이드(free radical superoxide (·O₂ ^-))로 전환되며 생성된 ·O₂ ^-는 다른 활성산소물질(reactive oxygen species (ROS))로 전환되어 직접적 또는 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.

정상적으로는 ·O₂ ^-는 내인성 항산화 방어기전에 의해 superoxide dismutase (SOD)에 의해 빠르게 과산화수소로 전환된다(Korycka-Dahl M, Richardson T, Hicks CL. Superoxide dismutase activity in bovine milk serum. J. Food Prot. 1979: 42, 867 ~ 871).

그러나 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화-환원 균형을 유지하는데에 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며 이 산화스트레스는 직접적으로 세포내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다.

수퍼옥사이드(Superoxide) 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가하여 반응시켰다.

수퍼옥사이드 유리기 소거 활성은 각각 생성된 수퍼옥사이드의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC₅₀)로 표시하였다.

수퍼옥사이드 라디칼 소거활성에 대한 결과를 도 3 에 나타내었다.

제주조릿대 잎의 온도별 열수추출물 시료 중 80 ℃에서 가장 높은 수퍼옥사 이드 라디칼 소거활성을 나타냈으며 100 ℃와 121 ℃ 열수추출물 시료에서도 비교적 높은 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성을 보여주었다.

수퍼옥사이드 라디칼 소거활성이 가장 높게 나타난 80 ℃ 열수추출물 시료의 IC₅₀ 값은 86.58 ㎍/㎖이었으며, 100 ℃ 열수추출물의 IC₅₀ 값이 106.44 ㎍/㎖, 121 ℃의 열수추출물의 IC₅₀ 값이 105.55 ㎍/㎖로 나타났다.

<실험예 3> 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물이 뮤린대식세포인 RAW264.7에 미치는 효과실험

제주조릿대 잎 열수추출물의 투여가 뮤린대식세포인 RAW264.7에 가해지는 독성을 완화 또는 저해하는 활성이 있는 지를 검증하고자 하였다.

RAW264.7에서의 세포독성 실험은 MTT assay방법과 LDH cytotoxicity detection 방법을 사용하였다.

1. 실험재료준비

제주조릿대 잎 100 g을 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세분말로 하여 각각의 미세분말 시료를 미세분말 시료의 10 배되는 증류수에 침적하고 80 ℃, 100 ℃, 121 ℃에서 각각 2 시간씩 2 회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축한 다음, 동결건조기로 잔여 수분을 제거하여, 80 ℃에서 12.08 g, 100 ℃에서 14.29 g, 121 ℃에서 15.59 g의 수율을 얻어 실험에 사용하였다.

본 실험에서는 121 ℃에서 열수추출한 시료를 갖고 수행하였다.

2. MTT assay

MTT assay는 세포의 mitochondria의 활성을 측정하여 간접적으로 세포의 생존여부를 측정하는 방법이다.

세포 배양 후 배양액을 제거하고 200 ㎕ 의 MTT reagent (Sigma)를 섞어 37 ℃에서 4 시간정도 반응시킨 후 반응액을 제거하고 200 ㎕의 DMSO을 첨가하여 발색반응을 유도하고 흡광도는 540 nm에서 측정하였다.

각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.

3. LDH cytotoxicity detection

LDH는 대부분의 세포에 존재하는 stable cytoplasmic enzyme으로 원형질막이 손상을 입으면 세포배양액으로 분비된다.

따라서 손상을 입은 세포가 분비하는 LDH 활성을 측정하는 간편하고 간단한 비색분석법이다.

본 실험에서는 LDH cytotocixity detection kit(Takara)를 사용하여 492 nm에서 활성을 측정하였다.

4. 실험결과

도 4의 결과에서 보듯이 제주조릿대 잎의 열수추출물을 농도별로 0, 250, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖로 24 시간 내지 48 시간 동안 처리 시 본 연구에 사용된 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았다.

<실험예 4> 본 발명의 제주조릿대 잎 열수추출물에 대한 항염활성 실험

내독소로 잘 알려진 LPS는 그람음성균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 마크로파지(macrophage) 또는 모노사이트(monocyte)에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 염증매개성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Axtelle, T., Pribble, J.: IC14, a CD14 specific monoclonal antibody is a potential treatment for patients with severe sepsis. J. Endotoxin Res. 7(2001) : Schutt, C., Schumann, R.: The endotoxin recepter CD14. Immun . Infekt . 21(1993) : MukIS, N., Ishikawa, Y., Ikeda, N., Fujioka, N., Watanabe, S., Kuno, K., et al.: Novel insight into molecular mechanism of endotoxin shock; biochemical analysis of LPS receptor signaling in a cell-free system targeting NF-kapperB and regulation of cytokine production/action through beta2 integrin in vivo. J. Leukoc . Biol . 59(1995) : Lazarov, S., Balutsov, M., Ianev, E.: The role of bacterial endotoxins, receptors and cytokines in the pathogenesis of septic(endotoxin) shock. Vutr . Boles. 32(2000)).

또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제(phospholipase) A2의 활성으로 인해 아라키도산(arachidonic acid)이 프로스타글라딘(prostagladin)으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다(Vane, J. A.: Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like durgs. Nat. New. Biol . 1971; 23, 232 : Funk, C. D., Frunk, L. B., Kennedy, M. E., Pong, A. S. and Fitzgerald, G. A. Human platelet/erythroleukemia cell prostaglandin G/H synthase: cDNA cloning, expression, and gene chromosomal assignment. FASEB J. 1991; 5, 2304).

체내 염증과정에서는 과량의 nitric oxide(NO) 및 prostagladin E₂(PGE₂) 등의 염증인자가 NO synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase(COX-2)에 의해 형성된다.

이 중 NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다(Moncada, S., Palmer, R. M. and Higgs, E. A. : Nitric oxide: physiology. pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol . Rev. 43, 109 (1991). : Nathan, C.: Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J. 6, 3051 (1992)).

Nitric oxide (NO)는 NO synthase (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다 (S. Moncada, R.M. Palmer and E.A. Higgs, Nitric oxide: Physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43, 109 ~ 142. : C. Nathan and Q.W. Xie, Nitric oxide synthases: Roles, tolls and controls. Cell 1994; 78, 915 ~ 918. : S.R. Jaffrey and S.H. Snyder, Nitric oxide: A neural messenger. Annu Rev Cell Dev Biol 1995; 11, 417 ~ 440).

LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 연구는 제주조릿대의 열수추출물의 뮤린대식세포인 RAW264.7에서 LPS 자극에 의한 NO의 형성억제 효과 및 iNOS의 발현, COX-2의 생성 및 활성저해 정도를 알아보았다.

1. 세포배양

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 KCLB(Korean Cell Liine Bank)로 부터 분양 받아 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum ; FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4일에 한번씩 시행하였다.

지질다당류(LPS. E. coli serotype 0111 : B4)는 Sigma로부터 구입하여 실험에 사용하였다.

2. 세포독성 실험

1) MTT assay

세포배양 후 배양액을 제거하고 3-(4,5-dimehtylthiazol)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma) 100 ㎍을 첨가하고 3 시간 동안 더 배양하였다.

배지를 제거한 다음, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide ; DMSO, Sigma) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포마즌(formazan) 침전물을 용해시킨 후 분광광도계(microplate reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) LDH cytotoxicity detection

LDH는 대부분의 세포에 존재하는 stable cytoplasmic enzyme으로서 원형질막이 손상을 입으면 세포배양액으로 방출된다.

따라서, 손상을 입은 세포가 방출하는 LDH 활성을 측정하는 간편하고 간단한 비색분석법(colorimetric assay)이다.

본 실험에서는 RAW264.7 세포를 1.0×10⁵ cells/㎖의 농도로 48 well plate의 각 well에 넣고 24 시간 동안 배양 후, 시료를 농도별로 첨가하여 세포배양이 끝난 후 LDH의 유출을 측정하여 세포의 손상정도를 조사하였다.

LDH cytotocixity detection kit(Takara)를 사용하여 492㎚에서 활성을 측정하였다.

3. NO 생성 억제률 검색

RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0×10⁵cells/㎖로 조절한 후 48 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS (100 ng/㎖)를 단독 및 동시처리, IFN-γ (100 U/ml)를 단독 및 동시처리, LPS (100 ng/㎖) + IFN-γ (100 U/㎖) 동시처리 등의 방법으로 하여 24 시간 내지 48 시간 배양하였다.

생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다.

세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess시약 [1 % (w/v) sulfanilamide, 0.1 % (w/v) naphylethylenediamine in 2.5 % (v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10 분동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다.

생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

4. 세포내 tyrosinase 활성 분석

쥐(Mus musculus)의 멜라노마 세포주 중 B16/F10 멜라노마 세포를 6 well plate에 세포수를 5.0×10⁴cells/㎖이 되게 준비한 후, 제주 조릿대 열수추출물 시 료를 농도별(8 ~ 250 ㎍/㎖)로 처리하였다.

72 시간 동안 5 % CO₂ 항온기에서 37 ℃로 배양하였으며 36 시간이 지난 후, 배지를 교체함과 동시에 시료를 재처리하였다.

세포를 trypsin-EDTA를 이용하여 수집하였으며, 이렇게 수집된 세포에 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)와 1% Triton X-100을 함유한 50 mM Sodium phosphate buffer(pH 6.8)를 500 ㎕ 처리하고 sonication하였으며, 이 상태로 1 시간동안 얼음에서 보관하였다. 1시간 후, 4 ℃이하에서 15,000 rpm으로 15 분간 원심분리하였으며 상층액을 취하여 세포내 tyrosinase 활성분석에 이용하였다.

세포내 tyrosinase 활성분석은 세포내에 존재하는 tyrosinase의 작용결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법(Pomerantz, S. H. The tyrosine hydroxylase activity of mammalian tyrosinase. J. Biol. Chem. 1966: 241(1), 161-168)에 의해 측정했다.

120 ㎕의 67 mM Sodium phosphate buffer(pH 6.8)에 기질로서 작용하는 5 ㎕의 1.5 mM L-tyrosine과 40 ㎕의 25 mM L-DOPA를 혼합한 후 세포에서 얻은 상층액 100 ㎕를 처리하여 37 ℃ 항온기에서 30 분간 반응시켰다.

반응액 중에 생성된 L-DOPA와 DOPA chrome을 475 nm와 490 nm에서 측정하여 alpha-melanocyte stimulating hormone (Sigma cat. No. M4135) 50 nM로 자극한 대조구를 기준으로 상대적인 활성 값을 구하였다.

5. 전기영동 및 Western blot 분석

배양이 끝난 세포를 2 ~ 3회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후 1 ㎖의 lysis buffer을 첨가, 30 분 ~ 1 시간동안 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 20 분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다.

단백질 농도는 BSA (Bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다.

30 ~ 50 ㎍의 lysate를 8 ~ 12 % mini gel SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane(BIO-RAD)에 200 mA로 2 시간 동안 transfer하였다.

그리고 membrane의 blocking은 5 % skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2 시간동안 실시하였다.

반응이 끝난 뒤 여러 가지 1 차항체 (1:500 - 1:2000)가 들어있는 TTBS에서 1 시간 (25 ℃) 또는 24 시간(4 ℃)동안 반응시킨 후, TTBS로 3 회 세척하고 HRP-conjugated 2 차 항체와 상온에서 30 분 반응시킨 뒤 Enhanced Chemiluminescence(ECL) 방법으로 각 band의 영상을 얻었다.

6. 실험결과

제주조릿대의 열수추출물의 RAW264.7 에서의 세포독성은 실험에 사용된 농도에서는 거의 세포독성을 나타내지 않았다(도 5 - B, C).

따라서, 세포독성이 나타나지 않는 농도로 추출물을 처리하여 nitric oxide(NO) 생성 억제 효과를 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^- 의 형태로 측정하였다.

그 결과, LPS (100 ng/㎖)단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 제주조릿대의 열수추출물을 동시에 처리한 시험구에서는 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었으며, 이 때의 IC₅₀은 24 시간에서 782.1 ㎍/㎖, 48 시간에서 1405.8 ㎍/㎖로 나타났다 (도 5 - A).

또한, IFN-γ (100 U/㎖) 단독 처리군(도 6), LPS (100 ng/㎖) + IFN-γ (100 U/㎖)과 제주조릿대의 열수추출물을 동시에 처리한 시험구에서도 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 7).

LPS (100 ng/㎖)를 사용하여 RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 생성을 유도한 후, 제주조릿대 잎 열수추출물에 의한 이들 효소의 저해 정도를 Western blot방법으로 분석하였다.

제주조릿대 열수추출물은 농도 의존적으로 iNOS 발현을 현저하게 저해하였으며, iNOS의 단백질 발현 억제 결과와 마찬가지로 COX-2 발현도 저해함을 확인할 수 있었다 (도 8).

제주조릿대 잎 열수추출물 시료(121 ℃)를 B16/F10 melanoma cell에 8 ~ 250 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 세포내 tyrosinase 활성저해 정도를 알아보았다.

그 결과, 지표물질로 사용한 알부틴의 활성저해 효과보다 제주조릿대 열수추출물이 탁월하게 좋은 것으로 나타났다(도 9).

따라서, 세포독성이 없으면서 세포내 티로시나제 활성 저해효과가 관찰된 제주 조릿대 잎의 열수추출물을 이용하여 8 ~ 250 ㎍/㎖의 시료 농도 영역에서 세포내 티로시나제 활성저해 정도를 분석하였다(도 9).

그 결과, 농도의존적인 세포내 티로시나제 활성저해 양상을 관찰할 수 있었다. 또한 단백질 수준에서 발현양상을 비교해본 결과(도 10), 유멜라닌(eumelanin) 생성에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보고된 티로시나제의 활성을 특이적으로 저해하고 있는 것이 밝혀졌으며, Trp-1(DHICA oxidase) 효소도 다소 저해하고 있는 것을 알 수 있었다.

이는 phospho-ERK 1/2의 발현수준이 일정수준으로 유지되고 있고 Trp-1의 저해활성이 높지 않은 것으로 미루어 보아 티로시네이즈 상위에 존재하는 MITF라는 전사인자를 조절할 가능성은 희박한 것으로 보여지며, 제주 조릿대 잎의 열수출물이 멜라닌 합성경로 중 티로신이 DOPA로 변하고 DOPA가 DOPAquinone으로 변하는 과정에서 사용되는 효소인 티로시네이즈의 활성을 특이적으로 저해하는 것으로 사료된다.

Claims

조릿대추출물에 있어서,

제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 잎을 음건하는 제1공정,

음건한 제주조릿대 잎을 마쇄기로 갈아 미세분말로 만드는 제2공정,

제2공정의 미세분말을 증류수에 침적하는 제3공정,

제3공정의 증류수 침적물을 고압 추출기를 이용하여 80 ℃, 100℃, 121에서 각각 2 시간씩 2회 추출하는 제4공정,

제4공정의 추출액의 상층액을 회수하여 감압농축 및 진공건조 후 동결 건조기를 사용하여 잔여 수분을 제거하여 분말을 얻는 제5공정을 거쳐 제조된 추출물로서,

항산화활성, 항염활성, 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성억제성을 나타내는 제주조릿대 잎 추출물.
제1항의 제주조릿대 잎 추출물에 있어서,

미백효과를 나타내는 화장료의 조성물에 사용되는 것이 특징인,

제주조릿대 잎 추출물.