KR20160009752A - 자생석곡 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 및 주름개선용 조성물, 및 이를 이용하여 제조되는 기능성 식품 및 한방 화장품 - Google Patents
자생석곡 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 및 주름개선용 조성물, 및 이를 이용하여 제조되는 기능성 식품 및 한방 화장품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자생석곡 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 및 주름개선용 조성물, 및 이를 이용하여 제조되는 기능성 식품 및 한방 화장품에 관한 것으로서, 본 발명의 실시예에 의하면 자생석곡 추출물은 멜라닌 합성을 저해, 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 저해, tyrosinase 단백질의 발현 감소 및 TRP1, MITF, TRP2 mRNA 발현 감소효과를 통해 미백 개선에 탁월한 효과를 보였으며, 또한 본 발명에 따른 자생석곡 추출물은 인체유래 섬유아세포에서 type 1 procollagen 생합성량을 증가시키고, TNF-a에 의한 MMP-1, MMP-3의 mRNA 발현을 억제시켰다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 미백 및 주름개선용 기능성 식품 및 한방화장품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자생석곡 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 및 주름개선용 조성물, 및 이를 이용하여 제조되는 기능성 식품 및 한방 화장품에 관한 것이다.
멜라닌은 멜라닌세포에 있는 멜라노좀의 표면에서 생기는 물질로써 tyrosinase와 tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2, DCT) 3개의 key 효소들에 의해 생성된다. Tyrosinase는 tyrosine을 가수분해하여 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA), DOPA quinone으로 변환되어 붉은 계열의 eumelanin과 갈색계열의 pheomelanin이 합성된다. tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2, DCT)는 eumelanin 합성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이의 조절에 관여하는 신호전달 경로중에 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)가 중요한 역할을 한다.
이와 같은 멜라닌은 분포정도나 양에 따라 피부색깔이나 전체적인 외형에 영향을 미치게 되는데, 더욱 중요한 것은 자외선(UV; ultraviolet) 빛에 의한 피부손상을 보호해주는 역할을 한다. 하지만 비정상적인 멜라닌의 증가는 일광성흑점(solar lentigines)이나 기미(melasma), 염증성 색소침착(postinflammatory hyperpigmentation), 피부암 흑색종(melanoma)와 같은 질병을 야기하기도 한다.
최근에는 멜라닌과 관련된 기미, 주근깨 등의 색소침착을 예방하거나 제거하려는 목적으로 티로시나아제(tyrosinase) 활성 및 멜라닌 생합성을 억제하는 새로운 소재를 개발하기 위하여 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그 중에서도 환경 친화적이고 피부 안정성이 우수한 한방화장품의 개발이 활발히 진행 중이다. 현재까지 tyrosinase 억제제로 알려진 물질로는 4-히드록시아니졸(hydroxyanisole), 5-히드록시아니졸(hydroxyanisole) 및 하이드로퀴논(hydroquinone)과 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol)등이 있으며, 그 외에도 스틸벤(stilbene)계 화합물인 α-비니페린(viniferin), 아이소플라보노이드(isoflavonoid)류인 페룰린산(ferulic acid)이 알려져 있다.
한편, 콜라겐(Collagen)은 진피조직을 형성하는 단백질로, 피부 탄력성은 진피조직의 두께로 결정이 된다. collagen의 형성억제나 파괴증가는 피부탄력성을 저하시켜 주름살의 원인이 되고 있다(Lee SY, An JH, Cho HY. Isolation and characterization of MMP-1 inhitor peptide from Crataegus pinnatifida bunge in fibroblast cell line HS68 cells. J Kor Soc Argic Chem Biotechno. 2003;46(1):60-5). 따라서, collagen 생성을 촉진하거나 collagen을 분해하는 collagenase나 다양한 기질 단백질 분해 효소인 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현이나 활성을 억제함으로서 주름생성을 억제할 수 있다. (Fisher, G. J., Talwar, H. S., Lin, J. and Voorhees, J. J. 1999. Molecular mechanism of photoaging in human skin in vivo and their provention by all-trans retinoic acid. Photochem Photobiol. 69, 154-157)
또한, 본 발명에 사용되는 국내 자생석곡은 난초과에 속한 다년생 초본으로 바위나 나무 위에 붙어사는 상록성 여러해살이풀이며, 주요 연구로는 약용석곡으로 알려진 금채석곡(Dendrobium nobile Lindley)의 항산화 효능에 관한 연구와 H2O2에 의해 손상된 신경세포주에 대한 보호효과 그리고 항산화, 항염증, 미백, 주름개선 효능에 대한 보고가 있다(Min Hwang-bo·Seok-Sun Roh·Hyeong-Sik Seo Effects of Dendrobii herba and Punica granatum Extract on the Anti-oxidant, Anti-inflammatory, Anti-wrinkle and Whitening The Journal of Korean Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology 2010; 23(3) : 11-32). 그리고 Dendrobium속 식물은 면역조절작용, 간보호효과, 항산화, 항암 등의 작용이 있다고 알려져 있다(Tzi Bun Ng, Jingyi Liu, Jack Ho Wong, Xiujuan Ye, Stephen Cho Wing Sze, Yao Tong, Kalin Yanbo Zhang Review of research on Dendrobium, a prized folk medicine Applied Microbiology and Biotechnology March 2012, Volume 93, Issue 5, pp 1795-1803).
그러나, 자생석곡은 대부분 관상용으로 판매하기 위해 다양한 농가들에서 재배 판매를 하고 있으며, 일본이나 대만 등에서는 이미 난류에서 생리활성 물질 등을 분리하여 화장품 신소재로 활용하기 위한 연구 및 상품화가 진행되었지만 현재 우리나라에서는 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 자생석곡의 추출물을 활용하여 미백 및 주름개선 효능을 평가하여 향후에 제품화 소재로 이용하고자 한다.
종래 약용석곡의 미백효과와 관련된 특허로는, 대한민국등록특허 10-0604073호가 있으나, 이는 생약재로 쓰이는 석곡인 금채석곡(Dendrobium nobile Lindley)의 알콜 추출물을 추출하여 제조되는 것이 소개되어 있을 뿐이다.
본 발명의 목적은 자생석곡의 효능에 근거하여, 자생석곡의 추출물이 미백 및 주름을 개선시키는 효과가 탁월함을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 목적을 달성하기 위하여,
본 발명에 따른 미백 및 주름개선용 조성물은
자생석곡 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미백 및 주름개선용 조성물에서,
상기 자생석곡 추출물은,
상기 자생석곡을 건조하고 분쇄한 다음 상기 분쇄한 석곡 중량의 10배의 MeOH을 가한 다음, 환류냉각하에서 3시간 동안 3회 반복하여 메탄올추출하여 추출물을 수득한 후, 여과하고 감압농축 및 동결건조하여 최종 자생석곡 추출물을 수득하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미백 및 주름 개선용 조성물에서,
상기 자생석곡 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 농도 10 내지 200 ㎍/㎖로 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미백 및 주름개선용 조성물을 이용하여 미백 및 주름개선용 기능성 식품이 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미백 및 주름개선용 조성물을 이용하여 미백 및 주름개선용 한방 화장품이 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자생석곡 추출물은 B16F10 흑색종 세포와 인간 유래 섬유아세포의 다양한 조건에서 미백과 주름방지 효과를 나타냈다. 즉, 자생석곡 추출물 처리군은 미처리군에 비해 농도의존적으로 melanin 함량 및 tyrosinase 활성을 억제하였고, 자생석곡 추출물 처리시 a-MSH로 유도한 melanin 형성과 tyrosinase 활성 및 수지상 돌기형성을 억제하였으며, 더욱이 a-MSH로 유도된 TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 유전자 발현과 tyrosinase 단백질 발현이 현저히 감소되었다.
또한, 본 발명에 따른 자생석곡 추출물은 인체유래 섬유아세포에서 type 1 procollagen 생합성량을 증가시키고, TNF-a에 의한 MMP-1, MMP-3의 mRNA 발현을 억제시켰다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 미백 및 주름개선용 기능성 식품 및 한방화장품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 세포독성 효과를 나타내는 도면,
도 2는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 멜라닌 생성 저해효과를 나타내는 도면,
도 3은 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 세포내 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 저해효과를 나타내는 도면,
도 4는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 tyrosinase 단백질의 발현 감소효과를 나타낸 도면,
도 5의 (a),(b),(c)는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 TRP1, MITF, TRP2 mRNA 발현 감소효과를 나타낸 도면,
도 6은 HDFn 세포주에서 석곡추출물에 의한 Procollagen 생합성 증대효과를 나타낸 도면,
도 7의 (a),(b),(c)는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 HDFn 세포주에서 석곡추출물에 주름관련 유전자 발현 억제를 나타낸 도면.
도 2는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 멜라닌 생성 저해효과를 나타내는 도면,
도 3은 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 세포내 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 저해효과를 나타내는 도면,
도 4는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 tyrosinase 단백질의 발현 감소효과를 나타낸 도면,
도 5의 (a),(b),(c)는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 B16F10 세포주에서 TRP1, MITF, TRP2 mRNA 발현 감소효과를 나타낸 도면,
도 6은 HDFn 세포주에서 석곡추출물에 의한 Procollagen 생합성 증대효과를 나타낸 도면,
도 7의 (a),(b),(c)는 본 발명에 따른 자생석곡 추출물의 HDFn 세포주에서 석곡추출물에 주름관련 유전자 발현 억제를 나타낸 도면.
본 발명에서는 미백 및 주름개선용 한방화장품을 만들기 위해 최근에 연구가 진행되고 있는 자생석곡을 이용하여 피부에 자극적이지 않은 추출물을 만들었고, 이 자생석곡 추출물의 미백효과를 입증하기 위하여 이 추출물이 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성을 조절하는지 실험하였고, 주름개선효과를 입증하기 위하여 인체유래 섬유아세포에서 type 1 procollagen 생합성량을 증가여부와 TNF-a에 의한 MMP-1, MMP-3의 mRNA 발현을 억제여부를 실험하였다.
이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세하게 설명한다.
본 발명은 자생석곡 추출물을 활용하여 제조하는 것으로, 본 발명의 추출물은 자생석곡을 건조하고 분쇄한다.
여기서, 자생석곡의 추출물에는 덴드로빈(dendrobine), 덴드라민(dendramine), 노빌로닌(nobilonine), 클로라이드(N-methyldendrobium chloride) 등이 포함되어 있다.
그런 다음 분쇄한 석곡 중량의 10배의 MeOH을 가한 다음, 환류냉각하에서 3시간 동안 3회 반복하여 메탄올추출하여 추출물을 수득한다.
그런 다음, 수득한 추출물을 실온에서 방냉하고 여과한 다음 감압농축기로 감압농축하고 동결건조기(LYOPH-PRIDE 20R, ILSIN, Korea)를 이용하여 -60 내지 -80℃, 바람직하게는 -70℃에서 동결 건조하여 본 발명의 자생석곡의 최종 추출물을 수득하여 실험의 석곡추출물로 사용하였다.
본 발명은 상기의 제조방법으로 수득한 자생석곡 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 농도범위 1 내지 500 ㎍/㎖, 바람직하게는 10 내지 200 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 100 내지 200 ㎍/㎖로 함유하는 것을 특징으로 한다. 조성물 중 본 발명의 자생석곡의 추출물 농도가 10㎍/㎖보다 적게되면 멜라닌합성저해효과가 거의 없으며, 500㎍/㎖을 넘으면 독성효과가 생기게된다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 화장료 조성물은, 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 화장료 조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것이 아님은 물론이다.
<실시예 1> 추출물의 제조
1-1. 시료
자생석곡은 진도산 자생석곡을 완도수목원으로부터 기증 받아 한방산업진흥원 유리온실에서 생육시켜 정선, 수세 후 건조하여 분쇄기를 이용하여 균일하게 분쇄하여 냉장보관 하였다.
1-2. 추출물의 제조
정선, 수세, 건조한 다음 분쇄기를 이용하여 균일하게 분쇄되어 냉장보관 한 시료인 자생석곡의 무게를 칭량한 뒤 MeOH를 칭량한 시료무게의 10배를 가한 다음 환류냉각하에서 추출을 약 3시간 동안 3회 반복 수행하여 추출물을 제조하였다.
이 추출물을 감압농축기(NE-10001V, Eyela, Japan)로 농축하여 완전히 용매를 제거한 다음, 시료를 실험 목적에 맞춰서 용매에 녹여 사용하였다.
1-3. 시약
달벳코 수정 이글 배지(DMEM; Dulbecco's modified eagle's medium)와 소태반혈청(FBS; fetal bovine serum), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), Medium 106, Low Serum Growth Supplement는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS, CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)는 Promega(Madison, USA)에서 구입하였다. a-MSH와 L-DOPA는 Sigma Chemical Co. (St. Lousi, MO, USA)에서 구입하였고, 티로시나제 항체(Tyrosinase antibody)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(USA), Gapdh antibody는 Cell Signaling Technology, Inc. (MA, USA)에서 구입하였다. Procollagen type I C-prtide EIA kit는 Takara(Japan)에서 구입하였고,단백질(protein) 정량에 사용하는 브래드포드(Bradford)시약은 Bio-Rad Laboratories(PA, USA)에서 구입을 하였다.
1-4. 세포주 및 세포배양
B16F10 멜라닌 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10 % fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 Dulbecco's modified eagle 's medium (DMEM)을 사용하였고, Human Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) 세포는 깁코(Gibco)에서 구입하여 Medium 106 배지에 Low Serum Growth Supplement (LSGS)를 넣고 CO2 배양기(MCO-17A1, Sanyo, Japan)에서 온도 37℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다.
1-5. 세포 독성 측정
B16F10 세포를 96 well에 5×103cells/well 씩 세포를 분주하여 24시간 동안 세포를 안정화시킨 뒤에 석곡추출물를 농도별로 처리를 하였다. 24시간 배양을 한 뒤에 MTS 용해액을 세포배양액 용액의 1/10을 첨가한 후 37℃에서 2 시간 배양하였다. ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-6. 세포내 티로시나아제 활성도(tyrosinase activity) 측정
B16F10 세포를 6 well에 5×104cells/well 씩 세포를 분주하여 24시간동안 세포를 안정화시킨 뒤에 석곡추출물을 농도별로 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 처리를 하였고 1시간 뒤에 α-MSH를 100 nM이 되게 처리를 한 뒤에 72시간 동안 배양을 하였다. PBS로 2회 세척을 하고 RIPA protein lysis buffer을 처리를 한 후에 4℃ 에서 30분 동안 incubation을 하였다. 그 후에 4℃에서 13000 rpm으로 30분동안 원심분리를 통해 단백질이 든 상층액만을 가지고 tyrosinase activity를 측정하였다. 단백질 양을 브래드포드(Bradford) 정량법을 통해 595 nm로 ELISA를 측정을 하고 동일한 단백질을 이용해서 L-DOPA를 처리를 하여 540 nm 흡광도로 세포내 tyrosinase activity를 측정하였다.
1-7. Melanin 측정 및 관찰
B16F10 세포에 6cm dish에 5×104cells/dish 씩 세포를 분주하여 석곡추출물을 α-MSH(100 nM)보다 1시간 이전에 처리를 하고 72시간 동안 배양을 하였다. 그 후에 PBS로 2회 wash를 하고 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수확한 뒤 3,000 rpm으로 5분 동안 세포를 모으고 상층액을 제거한 후 10% dimethylsulfoxide(DMSO)가 첨가된 1 N NaOH용액을 처리하여 80℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 멜라닌 정량은 합성멜라닌을 이용하여 ELISA microplate reader로 410 nm에서 각각의 흡광도를 측정하였다.
1-8. 미백 및 주름관련 유전자 발현 Real-time PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)
미백관련 유전자 발현을 확인하기 위하여 B16F10 세포를 60mm 배양 용기에 1×105cells/dish 씩 분주한 후 24시간 배양한다. 석곡추출물을 다양한 농도로 1시간 동안 처리 한 뒤 α-MSH(100 nM)로 melanin 생성을 유도하여 24시간동안 배양을 하고 PBS로 2회 세척 후 세포를 수확하였다.
또한 주름 관련 유전자 발현을 확인하기 위해서 HDFn 세포를 60mm Dish에 2×105cells/dish 씩 분주한 후 24시간 동안 배양하고 석곡추출물을 다양한 농도로 1시간 처리한 뒤 TNF-α(10ng/ml) 농도로 처리하여 주름 형성 관련 유전자 발현을 유도하여 6시간 동안 배양하고 PBS로 2회 세척 후 세포를 수확하였다.
수확한 세포는 Tripure Isolation Reagent (Roche 11 667 165 001)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 5㎍의 mRNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied biosystem 4368814)를 이용하여 cDNA로 합성을 하였다. 실험은 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였다. 합성된 cDNA 1㎕, taqman primer 1㎕, Taqman Universal Master Mix II (Appiled biosystem) 10㎕, 3차 증류수 8㎕를 넣고 Real-time PCR기기(ABI7500, Applied biosystem, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 http://www.lifetechnologies.com/kr/ko/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays.html 에서 검색하여 주문 후 사용하였고 분석하고자 하는 유전자 특이적 gene의 정보는 표 1에서 나타내었다. 또한 Real-time PCR 반응 조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.
1-9. Immunoblotting (면역학적 블로팅) 분석
Western blot을 이용하여 티로시나아제(tyrosinase) 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 석곡추출물을 농도별로 처리한 실험군과 대조군을 24시간 배양 후 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2 % SDS, 5 % β-mercaptoethanol, 2 mM phenyl-methylsulfonyl fluoride, protease inhibitors (completeTM, Roche, Manngeim, Germany), 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF과 10 mM EDTA을 함유하는 완충제를 사용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액을 15,000 rpm으로 4℃에서 30 분간 원심 분리하여 단백질만 포함하고 있는 상층액만을 얻었다. 정량한 단백질 20 ㎍을 10 % SDS-PAGE에 전기 영동시킨 후 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)으로 옮겼다. 그리고 membrane의 blocking은 5 % bovine serum albumin (BSA)이 함유된 TTBS (0.1 % Tween 20 + TBS) 용액을 상온에서 2시간 동안 실시한 다음 Tyrosinase, Gapdh에 대한 1차 항체와 반응시킨 후 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse IgG를 반응시키고 ECL detection reagents (Millipore, MA, USA)를 사용하여 단백질의 발현정도를 확인하였다.
1-10. 프로콜라겐 타입 I C 펩타이드(Procollagen type I C peptide) 생합성 측정
콜라겐(Collagen) 생합성량 측정은 procollagen type I C-prtide EIA kit (Takara, Japan)를 이용하여 kit 매뉴얼에 따라 실험하였다. Human Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) 세포를 Medium 106 배지에 LSGS를 넣고 배양한뒤, 24well plate에 2×105cells/dish 씩 분주한 후 24시간 후에 배양액을 교환하여 석곡추출물 용액을 농도별로 처리한 뒤, 다시 24시간 뒤에 세포배양액을 채취하여 procollagen type I C-prtide EIA kit를 이용하여 collagen 생합성량을 측정하였다. 먼저 1차 collagen 항체가 균일하게 도포된 96well plate에 채취한 세포 배양액 20㎕과 2'항체 100㎕를 섞어 넣고, 37℃ 항온조에서 3시간 동안 반응시킨 뒤 PBS로 4회 세척한 다음 발색시켜 ELISA reader(Infinite 200 pro, TECAN, Austria)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-11. 통계처리
본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치 ± 표준편차(mean ±S.D.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test로 분석하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
<실험결과>
2-1. 석곡추출물의 B16F10 세포주에 대한 세포독성 효과
B16F10 세포주에서 석곡 메탄올 추출물의 독성을 조사하기 위해, MTS 실험을 수행하였다. 각각 B16F10 세포에 농도별(10, 50, 100, 200, 500 ㎍/㎖)로 석곡추출물을 처리하고 24시간 후에 MTS를 처리한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 가장 고농도인 500㎍/㎖에서는 약 80%의 세포생존율을 나타내 약 20%의 세포독성이 나타났지만, 나머지 10, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 처리한 농도에서는 독성이 없는 것으로 나타났다.
2-2. 석곡추출물의 멜라닌 생성 저해효과
석곡추출물이 B16F10 세포주에서 멜라닌 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 석곡추출물(10, 50, 100, 200 ㎍/㎖)과 대조군인 알부틴(Arbutin) 100㎍/㎖을 처리한 후 1시간 뒤에 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후 72시간 배양하여 전체 멜라닌 함량을 비교하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 도시된 바와 같이, α-MSH를 단독으로 처리한 세포군에 비해 석곡추출물을 처리한 군에서 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소되는 것을 알 수 있었다. 또한 석곡추출물 100, 200 ㎍/㎖ 처리한 그룹에서는 유의성 있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. 석곡추출물의 세포내 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 저해효과
멜라닌은 멜라노좀이라고 불리우는 기관표면에 합성되는 물질로 알려져 있는데 tyrosinase 효소는 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 것이다. 본 실험에서 석곡추출물이 α-MSH의해 증가된 tyrosinase 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포내 tyrosinase 활성도를 확인하여 보았으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 도시된 바와 같이, α-MSH에 의해 tyrosinase 활성도가 증가한 것을 확인할 수 있었고 이들 석곡추출물에 의해 α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase 활성을 낮출 수 있는 것을 확인하였다. 이는 석곡추출물이 tyrosinase 활성을 낮춤으로써 미백기능을 할 수 있음을 시사한다.
2-4. B16F10 세포주에서 석곡추출물에 의한 tyrosinase 단백질의 발현 감소
Tyrosinase는 멜라닌 생합성에 결정적인 효소로 알려져 있다. 석곡추출물이 tyrosinase 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, B16F10 세포주에 농도별(10, 50, 100, 200 ㎍/㎖) 처리를 한 후 72시간 배양을 하였다.
그 결과는 도 4에 나타내었으며, 도 4에 도시된 바와 같이, tyrosinase 단백질의 양이 석곡추출물을 처리하였을 때 두드러지게 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
2-5. B16F10 세포주에서 석곡추출물에 의한 TRP1, MITF, TRP2 mRNA 발현 감소
TRP1과 TRP2는 MITF의 전사인자에 의해 발현이 증가하는 것으로 알려져 있고, 멜라닌 생합성에 요구되는 기전으로 알려져 있다. 석곡추출물이 이러한 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 B16F10 세포주에 α-MSH와 석곡추출물을 처리하여 24시간 후에 Reatime-PCR로 유전자발현을 확인하였다.
그 결과는 도 5에 나타내었으며, 도 5에 도시된 바와 같이, 석곡추출물에 의해 유의성 있게 α-MSH에 의해 증가된 MITF, TRP1, TRP2의 mRNA level이 농도 의존적으로 감소하였다.
2-6. HDFn 세포주에서 석곡추출물에 의한 Procollagen 생합성 증대
Collagen(type Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ 및 Ⅴ)들은 세포내에서 procollagen이라는 전구물질로 합성된 후 세포외로 분비되어 collagen 섬유로 중합된다. Collagen은 피부 진피층을 구성하고 있는 주요 구조 단백질로 type-1 collagen이 대부분을 차지하며, 자외선으로부터 피부 손상을 막아주고 수분 균형을 유지하여 주름 예방 및 탄력적인 피부를 유지하는데 필수적인 요소로 collagen의 감소는 피부노화 및 주름생성과 매우 밀접한 관계를 가지고 있다.
자생석곡의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 즉 석곡추출물이 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 석곡추출물을 (50, 100, 200 ㎍/㎖) 농도로 처리하고 24시간 배양 후 procollagen 양을 조사하였다.
그 결과는 도 6에 나타내었으며, 도 6에 도시된 바와 같이, 석곡추출물은 처리하지 않은 대조군에 비하여 procollagen 합성을 농도의존적으로 증대시켰으며, 처리한 농도군 중에서 200㎍/㎖ 농도에서 무처리군에 비해 procollagen 합성이 약 49% 증가하였다.
2-7. HDFn 세포주에서 석곡추출물에 주름관련 유전자 발현 억제효과
또한, 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 분비되어 피부주름 생성에 관여하는 MMPs에 관하여 조사하였다.
MMPs는 촉매부분에 금속을 포함하는 효소로 현재까지 약 25개 이상이 밝혀졌고, 자외선, 산화스트레스, TNF-a 등과 같은 다양한 자극에 의해 활성이 나타나게 된다. 이러한 MMPs family 들 중에서도 주름형성에 관여하는 collagenase 역할을 하는 대표적인 MMPs family는 collagenases인 MMP-1, -8, -13 이 있으며, 그중에서도 MMP-1이 MMP-13에 비해서 약 10배 정도 발현이 높게 일어난다고 알려져 있다. 또한 MMP-3의 경우에는 fibronectin, elastin, laminin, aggrecan을 기질로 하는 효소이면서 proMMP-1의 활성에 기여한다. 증가된 MMP들은 진피층에 collagen을 붕괴시킴으로써 피부 주름형성에 매우 중요한 역할을 하고 있다.
이에 석곡추출물이 인체 진피 섬유아세포의 collagen분해에 관련된 MMP 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 석곡추출물을 (50, 100, 200 ㎍/㎖) 농도로 처리하고 1시간 뒤에 TNF-α를 처리한 뒤 6시간 배양한 후에 MMP들의 유전자 발현을 확인하였다.
그 결과는 도 7에 나타내었으며, 도 7에 도시된 바와 같이, 석곡추출물은 TNF-α를 처리한 대조군에 비하여 MMP-1, MMP-3 유전자 발현을 농도의존적으로 억제시키는 경향을 나타냈으나, 가장 고농도인 200ug/ml 농도에서는 TNF-α 처리 대조군에 비하여 유의성 있게 유전자 발현이 억제함을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 자생석곡추출물이 melanin 형성세포주에서 농도의존적으로 melanin 형성을 억제하였고 200㎍/㎖ 농도에서는 양성대조군으로 사용한 arbutin 100㎍/㎖ 처리한 것과 유사한 멜라닌 형성 억제 효과를 나타내었다. 또한, 농도의존적으로 멜라닌 형성에 관여하는 tyrosinase 활성의 억제와 단백질 발현 억제효과를 나타냈으며 이 또한 200㎍/㎖ 농도에서 양성대조군인 arbutin과 유사한 활성을 나타내었다. 또한, 석곡추출물은 Tyrosinase 활성에 관여한다고 알려진 MITF 전사인자의 유전자 발현을 억제하였고, 그에 따라 TRP-1, TRP-2 유전자 발현량 또한 억제함을 확인하였다.
또한, 석곡추출물의 주름 개선 효과를 확인한 결과 농도의존적으로 procollagen 합성을 유도하는 것으로 나타났으며, 또한 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 분비되어 피부주름 생성에 관여하는 MMPs, 특히 MMP-1, MMP-3의 유전자 발현이 농도인 200ug/ml 그룹에서는 유의성 있게 억제함을 확인하였다.
위 연구결과들을 토대로 자생석곡 추출물은 효과적인 미백 및 주름개선 기능성 화장품 소재로 사용가능할 것으로 보인다.
비록 본 발명이 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다른 다양한 수정이나 변형이 가능할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 범위 내에 속하는 그러한 수정 및 변형을 포함함은 물론이다.
Claims (5)
- 자생석곡 추출물을 유효성분으로 하는 미백 및 주름개선용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 자생석곡 추출물은,
자생석곡을 건조하고 분쇄한 다음 상기 분쇄한 석곡 중량의 10배의 MeOH을 가한 다음, 환류냉각하에서 3시간 동안 3회 반복하여 메탄올추출하여 추출물을 수득한 후, 여과하고 감압농축 및 동결건조하여 최종 자생석곡 추출물을 수득하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 미백 및 주름개선용 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 자생석곡 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 농도 10 내지 200 ㎍/㎖로 함유하는 것을 특징으로 하는 미백 및 주름개선용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미백 및 주름개선용 조성물을 이용하여 제조되는 미백 및 주름개선용 기능성 식품.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미백 및 주름개선용 조성물을 이용하여 제조되는 미백 및 주름개선용 한방 화장품.
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2014
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