KR101904216B1 - 대추씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선을 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대추씨(Jujube seed) 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 대추씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 티로시나제 저해활성 효과 및 DOPA 산화 저해활성을 가짐으로써 피부미백 효과를 가지며, 엘라스타제 및 콜라게나제 활성을 저해시킴으로써 주름 개선효과를 가진다. 또한, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 대추씨(Jujube seed) 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 대추씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선을 위한 화장료, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 사람의 눈동자, 머리 및 피부색은 피부 내 멜라닌의 농도와 분포에 따라 결정되기도 하고, 멜라닌의 종류에 따라서도 달라지기도 하지만, 자외선이나 스트레스 등 다양한 환경 및 생리적인 요소들에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)에서 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌 세포의 멜라노좀에서 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 도파로 산화되어 도파크롬으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 효소적 산화과정 및 비효소적 산화과정을 거쳐 생성된다. 이런 멜라닌의 생성과 합성에는 대표적인 영향인자로 자외선이 있고, 그 밖에도 유전적 요인과 환경적 요인, 호르몬, 식품, 의약품 등의 화학물질 등이 작용한다. 이러한 멜라닌은 일정량의 자외선을 흡수하여 피부를 보호하고 체온을 유지해주는 역할을 하지만, 심한 자극을 받게 될 경우 과생성된 멜라닌이 침착되어 주근깨, 노인성 반점, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과색소침착, 광독성 반응 등이 일어날 수 있다.
최근 동양권 여성들은 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며, 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 피부색소 이상침착의 치료 및 미용욕구 충족을 위한 미백제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다. 현재 피부미용을 위한 미백제의 개발에 있어서, 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색하는 방법과 멜라닌 색소를 형성하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있다. 그러나 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민류 등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색효과가 미미한 것으로 알려져 있으므로 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 저해제에 관한 연구가 다수 진행되고 있다.
종래에는 피부 미백이나 피부 과색소 침착증을 개선하기 위하여, 히드로퀴논(hydroquinone), 아스콜빈산(ascorbic acid), 코직산(kojic acid), 글루타치온(glutathione) 및 시스테인(cysteine)과 같은 티로시나제에 대해 저해 활성을 갖는 물질을 사용하여 왔다. 그러나, 히드로퀴논은 소정의 미백효과를 발휘하지만 피부자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한해야 하는 문제점이 있고, 아스콜빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료의 경우 변색, 변취되는 등의 문제가 발생하며, 코직산은 용액 내에서 불안전하여 화장료의 제조공정이 복잡해진다는 단점이 있다. 또한, 글루타치온 및 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료의 배합 성분으로 사용하기는 어렵다. 그 외에 비타민 C의 경우 수용액 상태에서 쉽게 산화되어 지속적인 효과를 내지 못하는 문제점이 있다.
한편, 사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 피부 표피층에 있는 멜라노사이트에서 합성되는데, 멜라노사이트 내 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시킨다. 따라서, 피부 내의 티로시나제 활성을 저해하여 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.
피부는 노화가 일차적으로 나타나는 기관으로 이를 지연 또는 예방하기 위하여 화장품 영역에서도 많은 연구가 진행되어 왔다. 통상적으로 피부노화는 25세를 전후하여 진행되기 시작하여 40세를 전후한 시기에 본격적으로 피부노화가 진행된다. 피부노화의 대표적 현상으로 피지 분비량이 감소되어 피부가 건조해지고, 세포 재생이 늦어지고, 노화 각질이 많이 쌓여서 피부가 거칠어지는 특징이 있다. 또한, 표피를 지탱해주는 콜라겐의 합성양이 감소되고 엘라스틴(탄력섬유)이 변성되어 주름이 생긴다. 아울러, 피부색이 얼룩지거나 기미, 검버섯 등의 색소 침착 증상이 나타나며, 표피가 얇아져서 피부보호 기능이 약화된다. 그 밖의 현상으로는 피부 두께의 감소와 관련된 피부 장벽작용(Barrier Effect)의 저하로 인한 피부 트러블의 증가를 들 수 있다. 피부노화와 관련된 연구는 크게 피부노화의 주요원인이 되는 자외선과 활성산소로부터 피부를 보호하는 소재, 피부주름 개선 소재, 피부탄력 증진 소재, 피부 표피와 진피 접합부(Dermal-Epidermal Junction, DEJ) 강화에 관련된 소재로 분류하여 심도 깊게 연구되고 있다.
피부에 노화가 진행되면 진피의 변화가 현저하게 나타나며, 70세 이후 나타나는 진피위축은 대표적인 노화현상이다. 진피의 변화는 섬유아세포(fibroblast)의 숫자와 이들의 합성 능력의 감소로 인하여 세포 외 기질 중 큰 분자량을 가진 물질들의 변화로 발생된다. 그 구체적인 변화는 콜라겐 다발의 분리, 점다당질 합성감소, 콜라겐과 탄력섬유(elastin) 수와 직경 감소, 콜라겐과 탄력섬유 분해 및 혈관의 팽창 등을 들 수 있다. 일반적으로 피부의 수분 함유량, 콜라겐 함유량 및 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 복합적인 요인들 중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량과 콜라겐의 함량을 감소시키는 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현량과 활성이다. 콜라게네이즈는 기질단백질 분해에 중요한 역할을 하는 금속단백분해효소(Matrix metalloproteinases, MMPs) 그룹에 속한다. 이러한 콜라게네이즈는 자외선, 성장인자, 염증성 사이토카인, 포르볼 에스테르(phorbol ester)에 의해 발현이 촉진되어 제1,2,3,5형 교원질(collagen)을 분해하는 것으로 알려져 있으며, 특히 자외선에 의한 광노화에 주요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 그 밖에 금속단백분해효소(MMPs)는 4형 교원섬유(MMP-2,-3), 탄력섬유(MMP-2), 또는 피브로넥틴(fibronectin)이나 라미닌(laminin, MMP-3)과 같은 기질단백질을 분해하며, 노화된 피부에서 발현이 현저히 증가됨을 관찰할 수 있다. 따라서 금속단백분해효소의 활성을 감소시킬 수 있는 소재개발이 활발하게 이루어지고 있다.
또한, 노화가 진행되면 피부진피뿐 아니라 진피와 표피 부착을 담당하는 DEJ(Dermal epidermal junction) 단백질 역시 발현이 감소하면서 표피-진피 접합부가 평평해지고 연결이 약해져 피부가 쉽게 손상을 받게 된다. DEJ가 약화되면 표피와 진피의 원활한 커뮤니케이션이 이루어지지 않아 피부재생이 원활히 이루어지지 않는다. 최근 연구결과에 따르면 DEJ가 주름과 피부장벽 뿐 아니라 자외선 자극에 의한 피부색소 침착에도 관련하고 있다고 알려져 있다(Iriyama S, J Dermatol Sci. 64(3):223-228, 2011). 진피 접합부에는 라미닌-5(laminin-5), 콜라겐-Ⅳ(collagen-IV), 콜라겐 Ⅶ(collagen Ⅶ)이 존재하고 이들 단백질 발현을 증가시킬 수 있는 소재는 피부주름을 개선시킬 수 있다.
또한, 엘라스틴(elastin) 섬유는 콜라겐과 가교 결합을 형성하며 피부 탄력에 관여하고 있는 주름 생성에 중요한 피부 구성성분이다. 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스틴 분해 효소인 엘라스타제(elastase)의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름생성 요인 중의 하나로 밝혀지고 있다. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해할 수 있는 유일한 효소로서 이에 대한 저해는 피부 주름 개선을 근본적으로 줄여줄 수 있다고 알려져 있다.
따라서, 화장품 분야에서는 피부미백 효과 및 주름 개선효과를 가지는 기능성 화장품에 대한 연구 및 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 특히 피부에 독성이나 자극을 주지 않기 위하여 천연 물질을 이용한 연구가 계속되고 있다.
한편, 대추씨는 대추의 과육 안에 있는 종자부위로써 대추 과육의 가공 후 생성되는 대추 가공 부산물이다. 대추 가공 시 생산되는 대추씨 부산물은 대추가공원료의 약 30% 중량을 차지한다. 예로부터 대추는 한방에서 감초처럼 감미를 내기 위해 첨가되는 경우가 많았고 그 자체로도 위경련, 불면증, 소화불량, 대장하혈, 청혈, 지각과민증의 증상을 개선시키는 약리효과가 있다.
현재 대추의 잎과 열매는 식용이 가능하나 씨는 제한적으로 식용이 가능하다고 고시되어 있다. 대추씨는 단백질, 미네랄, 식이섬유 등의 함량이 높아 영양학적인 가치가 높고 한방에서는 산조인이라는 약재로도 사용되어져 왔다. 이러한 우수한 영양 및 약리학적인 가치에도 불구하고 대부분의 대추씨 자원은 산업적으로 활용되지 못하고 폐기되는 실정이다.
대추 종자의 성분으로는 주로 oleic acid, linoleic acid의 불포화 지방산으로 이루어진 지방유와 사포닌, eblin, lactone 등이 함유되어 있다. 약용성분으로는 betulin, betulicacid 등이 알려져 있으며, 대추의 약용성분으로는 각종 스테롤, 알칼로이드, 비타민, 사포닌, 세로토닌, 지방산, 폴리페놀, 플라보노이드 등이 알려져 있다. 특히 cyclic-AMP 성분은 일반식물보다 약 1,000배 이상 높은 함량을 나타내며 그 외 당류와 유기산 등의 영양성분이 알려져 있다(Ministry of food and drug safety, 2013).
그러나, 아직까지 대추씨의 피부미백 효과 및 주름 개선효과에 관해서는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 피부미백 효과 및 주름 개선효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 새로운 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 대추씨 추출물이 세포 독성이 없으면서도 우수한 피부미백 효과 및 주름 개선효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 피부미백 효과 및 주름 개선효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 대추씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름개선을 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 대추씨 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
본 발명의 대추씨 추출물은 당분야에 공지된 통상적인 추출용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 이때, 상기 추출용매는 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 추출용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 추출용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
또한, 상기 대추씨 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 대추씨 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 대추씨 추출물은 대추씨를 분쇄한 후 추출용매, 예컨대 물, 탄소수 1~3개의 무수 또는 함수 저급 알콜 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 용매를 추출용매로 사용하여 추출할 수 있으며, 상기 추출 용매의 양은 생약 건조 중량의 2 내지 20 중량배, 바람직하게는 5 내지 15 중량배로 할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시태양에서는, 대추씨 추출물은 20 내지 95% 에탄올 수용액, 바람직하게는 50 내지 70% 에탄올 수용액을 이용하여 20 내지 30시간, 바람직하게는 22 내지 26시간 동안 침적시킨 후 회수한 다음, 여과지로 여과하고 농축하여 대추씨 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 대추씨 추출물이 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.005 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 이 때 대추씨 추출물의 함량이 0.005 중량% 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 피부미백 효과 및 주름 개선효과를 수득할 수 없으며, 50 중량%를 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 대추씨 추출물을 함유하는 조성물은 피부미백 효과 및 주름 개선효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 대추씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 대추씨 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따른 약학적 조성물은 대추씨 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 대추씨 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 대추씨 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 대추씨 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 대추씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 엘라스타제 및 콜라게나제 활성을 저해시킴으로써 주름 개선효과를 가진다. 또한, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 대추씨 추출물의 티로시나제 활성억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 대추씨 추출물의 DOPA 산화 저해 활성억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 대추씨 추출물의 추출용매인 에탄올의 농도에 따른 엘라스타제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 대추씨 추출물의 추출용매인 에탄올의 농도에 따른 콜라게나제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6은 대추씨 추출물의 미생물에 대한 항균 활성을 나타낸 사진이다.
도 7는 대추씨 추출물의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 HaCaT 세포에서 UVB로 인한 세포사멸에 대한 대추씨 추출물의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 대추씨 추출물의 MMP-2 및 MMP-9 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 대추씨 추출물이 UVB 조사된 Pro-Collagen Type 1과 MMP-2 및 MMP-9 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 대추씨 추출물의 DOPA 산화 저해 활성억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 대추씨 추출물의 추출용매인 에탄올의 농도에 따른 엘라스타제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 대추씨 추출물의 추출용매인 에탄올의 농도에 따른 콜라게나제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6은 대추씨 추출물의 미생물에 대한 항균 활성을 나타낸 사진이다.
도 7는 대추씨 추출물의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 HaCaT 세포에서 UVB로 인한 세포사멸에 대한 대추씨 추출물의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 대추씨 추출물의 MMP-2 및 MMP-9 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 대추씨 추출물이 UVB 조사된 Pro-Collagen Type 1과 MMP-2 및 MMP-9 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 대추씨 추출물 제조
본 실험에 사용한 대추씨 추출물은 매남농산(경북 청도군)에서 제공 받은 것을 분쇄하여 사용하였다. 시료 1kg에 각각 20%, 40%, 60% 80%, 95% 에탄올 1000 ml을 24시간씩 침적시킨 후 3회 반복 회수하여 수집 후 No. 2 filter paper로 여과하여, 여액을 진공회전농축기를 사용하여 농축하고, 동결건조하였으며, -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
<시험예 1> 미백 효과 측정
(1) 티로시나제(Tyrosinase) 저해활성 측정
티로시나제 저해 활성 측정은 dopachrome 방법을 이용하여 측정하였다. 반응구는 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) 110 ul에 11.5 mM L-tyrosine을 녹인 기질액 10 ul 및 시료용액 10 ul 의 혼합액에 mushroom tyrosinase (2,000U/mL) 10 ul 첨가하여 37℃에서 15 분간 반응시켜 490nm에서 측정하였다. DOPA 산화 저해 활성 측정은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
티로시나제(monophenol, dihydroxy-L-phenylalanin : oxygen oxidore- ductase, EC 1.14.18.1)는 구리를 함유한 효소로서 melanin 합성의 초기단계인 L-tyrosine에서 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), DOPA에서 L-dopaquinone으로의 전이에 작용한다. 자외선에 의하여 melanocyte의 유사분열이 일어나고 이어서 melanocyte가 활성화 된다. 활성화된 melanocyte 에서는 tyrosinase 합성이 촉진되고 melanin이 생성되어 이를 표피 밖으로 운반 배출하게 되어 기미, 주근깨와 같은 색소침착이 일어나게 된다. 그러므로 티로신 활성 억제제는 피부 내에서의 melanin polymer 합성을 효과적으로 저해할 수 있어 피부 미백제의 개발에 있어서 티로시나제 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다. 따라서 티로시나제는 melanin 생합성 과정에서 중요한 역할을 하므로 티로시나제 억제제를 피부의 melanin 색소생성을 조절할 수 있는 물질로 사용할 수 있다. 또한 티로시나제 저해제인 4-hydroxyanisole, hydroquinone 등은 인체의 hyper-pigmentation 치료에 사용되고 있으며, melanoma cell의 증식억제에도 효과가 있는 것으로 보고되었다.
도 1은 대추씨 추출물의 티로시나제 활성억제 효과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, J20는 20% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J40는 40% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J60는 60% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J80는 80% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J95는 95% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, 알부틴(arbutin)을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 1에서 보듯이, 대추씨 추출물의 미백효과 측정결과 Tysonise을 기질로 사용시 1,000 ug/mL의 농도에서도 15% 정도의 효과가 측정되었으며, 나머지 추출물도 미미하지만 22.8% ~ 31.7%의 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다.
(2) DOPA 산화 저해활성 측정
DOPA 산화 저해 활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 1/15M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 0.5mL에 10mM L-DOPA을 녹인 기질액 0.2mL및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/mL) 0.2mL 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. DOPA 산화 저해 활성 측정은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
도 2는 대추씨 추출물의 DOPA 산화 저해 활성억제 효과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, J20는 20% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J40는 40% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J60는 60% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J80는 80% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J95는 95% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, 알부틴(arbutin)을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 2에서 보듯이, DOPA를 기질로 사용시 J60의 경우 500 ug/mL의 농도에서 52.4%의 저해활성을 나타내는 바, DOPA가 L-dopaquinone으로의 전이되는 것을 저해 하는 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 2> 주름개선 효과 측정
(1) 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정
엘라스타제 저해활성 측정은 다음과 같이 측정하였다. 추출물을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5 U/mL)용액 0.5 mL을 가한 후 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 기질 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5 mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 405 nm에서 측정하였다. Elastase 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
자외선 및 활성산소 등에 의해 유발되어 피부 진피층에 존재하는 matrix -metalloproteinases (MMPs)는 피부노화, 특히 주름생성과 밀접한 관계가 있다. MMPs를 이루는 주요성분으로는 콜라게나제, 젤라티나제 및 엘라스타제 등이 있으며, 자외선과 같은 내·외적 스트레스로 인하여 탄력성, 윤택성이 감소하고 과다 발현된 엘라스타제에 의하여 엘라스틴의 그물망 구조가 깨지게 되면 피부가 처지고 주름이 생기므로 피부의 탄력감소 및 주름생성에 있어서 엘라스타제의 활성 감소는 매우 중요하다. 엘라스틴을 가수분해하는 엘라스타제는 피부 주름과 연관성이 있는 효소로서 대추씨 추출물이 엘라스타제 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
도 3은 대추씨 추출물의 추출용매인 에탄올의 농도에 따른 엘라스타제 저해 활성을 나타낸 그래프이다. 여기에서, J20는 20% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J40는 40% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J60는 60% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J80는 80% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J95는 95% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, 양성 대조군으로 우르솔산(ursolic acid)을 사용하였다.
도 3에서 보듯이, 우르솔산은 농도 의존적으로 엘라스타제 저해능을 보인데 반해 대추씨 추출물은 에탄올 60%가 고농도에서 약간의 저해능을 나타냈었으나, 실험농도 내에 다른 추출물들은 저해능이 거의 보이지 않았다.
(2) 콜라게나제(Collagenase) 저해활성 측정
콜라게나제 저해활성 측정은 다음과 같이 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여, 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3 mg/mL)를 녹인 기질액 0.25 mL 및 시료용액 0.1 mL의 혼합액에 콜라게나제 (0.2 mg/mL) 0.15 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 정치한 후 6% citric acid 0.5 mL을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5 mL을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
콜라게나제는 결합조직의 탄력을 나타내며 진피층의 90%이상을 구성하고 피부의 주름과 보습 기능을 갖고 있으며, 나이가 들면서 생합성이 감소하는 대표적인 물질이다. 콜라겐을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 콜라게나제이다.
도 4는 대추씨 추출물의 추출용매인 에탄올의 농도에 따른 콜라게나제 저해 활성을 나타낸 그래프이다. 여기에서, J20는 20% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J40는 40% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J60는 60% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J80는 80% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J95는 95% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, EGCG는 양성 대조군으로 에피갈로카테킨 갈레이트 (Epigallocatechin gallate)이다.
도 4에서 보듯이, 대추씨 추출물의 콜라게나제 저해활성을 측정한 결과 1,000ug/ml의 농도에서 J60이 가장 높은 30.7%의 저해활성을 나타내었다.
<시험예 3> 항균력 측정
(1) 대상균주
Candida albicans(KCTC 7965)의 배양을 위한 액체배지로는 YM broth (YMB)를 사용 하였으며, Escherichia coli(KCTC 1039) 및 Staphylococcus epidermidis(KCTC 1917)의 액체배지로는 nutrient broth (NB)를 사용하였고, Staphylococcus aureus(KCTC 1621)의 액체배지로는 tryptic soy broth (TSB)를 사용하였고 Propionibacterium acnes(KCTC 3314)는 GAM을 사용하였고 고체배지는 상기 액체배지에 agar를 첨가하여 사용하였다. 균주는 BOD incubator에서 생육 온도조건별로 배양하였다.
(2) 감수성검사를 위한 디스크 확산법
항균력 측정은 paper disc법을 이용하여 측정하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이랑 취해서 액체배지 10mL에서 18~24시간 배양하여 0.85% 식염수에 풀어 잘 섞은 후 0.5 McFarland 탁도 (spectrophotometer, 530nm)로 맞추어 균 농도가 약 1~5X106 CFU/mL가 되도록 하였다. 균액을 소독된 면봉을 이용하여 MH-GMB 배지에 고르게 도말하고 대추씨 추출물을 각각 농도 의존적으로 제작한 디스크와 항생제(대조군) 디스크를 올렸다. 37℃에서 18~24시간 배양하여 disc주위의 clear zone (mm)의 직경을 측정하였다. 그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6은 대추씨 추출물의 미생물에 대한 항균 활성을 나타낸 사진이다. 여기에서, J20는 20% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J40는 40% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J60는 60% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J80는 80% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이고, J95는 95% 에탄올로 추출한 대추씨 추출물이다. 그 결과, 대추씨 추출물은 그람양성, 음성, 진균에 대해서 항균력이 없음을 확인하였다.
<시험예 4> 세포재생 측정
(1) 세포배양
CCRF S-180 Ⅱ (Mouse skin fibroblast cell line, KCLB No. 10008)을 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea))으로부터 분양받았다. 세포배양액은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)을 사용하였다. 10 % fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin (100 U/ml), and 100 mg/ml streptomycin (100 mg/ml)을 첨가하였다. 계대배양은 0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA를 사용하였다.
(2) MTT assay에 의한 세포 생존율 평가
대추씨의 세포에 대한 독성은 MTT assay 방법으로 분석하였다. 이는 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 방법으로 96 well plate에 1X 104cell/well의 CCRF S-180 Ⅱ (Mouse skin fibroblast cell)을 분주하고 대추씨 60%에탄올 추출물을 농도별 (62.5 ~ 1000 ug/ml)로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. Well 당 20 ul의 MTT solution을 첨가하여, 37℃ 5% CO2 조건하에서 4시간 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
In vitro 실험을 토대로 가장 저해 효능이 좋았던 J60 이용하여 50~200 ug/ml의 농도에서의 CCRF S-180 Ⅱ(Mouse fibroblast cell)에 대한 세포 생존율을 측정하였다.
도 7은 대추씨 추출물의 세포 생존율을 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 200ug/ml의 농도에서 97.9%의 세포 생존율을 보여 실험의 농도로 사용하였다.
(3) UVB에 대한 J60의 세포사멸 억제효과 측정
자외선은 피부 세포에 조사되면 직, 간접적으로 손상을 주게 되는데 직접적으로 DNA구조 변화를 유도하거나 산화 반응을 통해 세포 구성 물질에 손상을 주게 된다.
UVB를 세포에 조사하여 세포를 사멸시키고 시료를 이용하여 세포의 사멸이 얼마나 억제되는지에 대한 정도를 확인하기 위해 UVB를 조사하고 MTT 시약을 처치하여 세포사멸정도를 확인하였다.
HaCaT cell (Human Keratynocyte Cell)을 96 well plate에 Seeding하여 24시간 배양 후 serum free로 배지를 교환하고 24시간 후 96 well plate에서 배양중인 각질형성세포에 UVB (250mJ/cm2)를 조사하여 광 손상을 주고 J60 (60% ethanol extracts of Jujube seed)을 다양한 농도로 처치한 후 24시간 배양하고 MTT (Thiazolyl Blue Tetra-zolium Bromide) 시약을 처치하고 4시간 후 plate의 상층액을 제거하고 Ethanol : DMSO = 1 : 1 solution을 각 well에 처치하고 540nm에서 흡광도를 관찰하였다.
도 8은 HaCaT 세포에서 UVB로 인한 세포사멸에 대한 대추씨 추출물의 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 대추씨 추출물을 자외선을 조사한 후 첨가되면 세포의 생존을 증가시켜 주는 결과를 보여주며, 이는 대추씨 추출물이 노화 현상을 억제하는데 효과가 있음을 보여준다고 할 수 있다.
(4) Gelatin Zymography
Gelatin을 분해하는 물질인 MMP-2, MMP-9의 특성을 이용해 대추씨 추출물의 MMP-2, MMP-9 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 Gelatin zymography를 실시하였다. 대추씨의 MMP-2와 MMP-9의 발현정도에 미치는 영향을 알아보기 위해 Gelatin Zymography 방법을 이용하였다. 10% SDS-polyacrylamide gel(30% acrylamide/ 0.8% bis-acrylamide, 1.5M Tris-HCl(pH8.8), 10% SDS, 10% APS, TEMED, 0.2% Gelatin, DW)에 정량한 배지와 sample buffer를 1:1로 섞은 후 전기영동 하였다. SDS를 제거하기 위해 renaturing buffer (Triton X-1002% in D.W)에 30분 동안 shaking 후 Developing buffer (50mM Tris-HCl, 0.2M NaCl, 5mM CaCl2, 1% TritonX-100)에 넣은 후 37℃에서 12시간 반응시켰다. Staining Solution인 0.5% coomassie blue에서 1시간동안 염색하고, Destaining Solution (Methanol : Acetic acid : D.W = 5 : 1 : 4)에 1시간동안 탈색한 다음 투명한 밴드를 확인하였다.
도 9는 대추씨 추출물의 MMP-2 및 MMP-9 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, UVB (50mJ/cm2)를 처치한 구간에서 MMP-2와 MMP-9의 발현량이 증가함을 확인할 수 있다. 이에 대추씨 EtOH 60% 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 50ug/ml을 처치하였을 때는 별다른 발현량의 변화가 나타나지 않았으나 100ug/ml, 200ug/ml을 처치한 구간에서 농도 의존적으로 MMP-2와 MMP-9의 발현량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
(5) Western blot
UVB가 사람 각질세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 HaCaT cell에 UVB(50mJ/cm2)를 조사하여 콜라겐의 전구물질인 Pro-Collagen Type 1과 MMPs의 발현과 관련 있는 kinase들의 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Western blot 방법을 이용하여 단백질 발현량을 측정하였다.
UVB 50mJ/cm2를 조사 후 대추씨 추출물을 농도별로 처리하고 세포를 수거하여 PBS로 세척 후 RIPA buffer (M.biotek)로 1시간동안 용해시킨 후 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 SDS sample buffer (M.biotek)을 첨가하여 90℃에서 10분간 변성(denaturation)시킨 후 단백질을 SDS-PAGE로 분자량별로 분리하였다. 분리된 단백질은 100V의 조건에서 1시간동안 nitrocellulose membrane (Whatman, UK)으로 전이시키고 0.1% BSA 용액으로 blocking 시킨 후 membrane을 Antibody 용액에 담가 4℃에서 18시간 반응시켰다. TBST (10mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 0.2% Tween 20)로 10분씩 3회 세척하였다. 세척된 membrane을 화학적 형광을 낼 수 있는 horse radish peroxidase (HRP)와 결합시키기 위해 2시간 동안 반응시킨 후 화학 발광 이미지 장치(ATTO사)를 이용하였다.
도 10은 대추씨 추출물이 UVB 조사된 Pro-Collagen Type 1과 MMP-2 및 MMP-9 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, Pro-Collagen Type 1의 발현량 확인결과 UVB 조사시 줄어드는 것을 확인할 수 있었고 양성 대조군과 J60은 농도 의존적으로 증가함을 관찰할 수 있었다. MMP-2와 MMP-9의 경우 MMP-9는 가시적인 발현량의 억제가 확인되었다.
이와 같이, 본 발명의 대추씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 티로시나제 저해활성 효과 및 DOPA 산화 저해활성을 가짐으로써 피부미백 효과를 가지며, 엘라스타제 및 콜라게나제 활성을 저해시킴으로써 주름 개선효과를 가진다. 또한, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
Claims (5)
- 대추씨(Jujube seed) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 대추씨 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 대추씨 에탄올 추출물이 대추씨를 분쇄한 후 20 내지 95% 에탄올 수용액을 이용하여 20 내지 30시간 동안 침적시킨 후 회수한 다음, 여과지로 여과하고 농축하여 수득된 것임을 특징으로 하는 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 대추씨 에탄올 추출물이 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.005 내지 50 중량%의 양으로 포함된 것을 특징으로 하는 조성물.
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