KR20200046674A

KR20200046674A - 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 조성물

Info

Publication number: KR20200046674A
Application number: KR1020180128165A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 강연자; 박종국; 전동하; 박상미; 정다운; 김하은; 김후자
Original assignee: (주)튜링겐코리아
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-05-07

Abstract

본 발명은 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 콜라게나제 및 엘라스타제 활성을 저해시킴으로써 주름 개선효과를 가진다. 또한 본 발명의 흑감 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 조성물{A COMPOSITION FOR ANTIOXIDATING, WHITENING AND IMPROVING WRINKLE COMPRISING EXTRACTS OF BLACK PERSIMMON}

본 발명은 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 화장료, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 외부 표면을 덮고 있는 가장 큰 기관으로서, 자외선, 온도의 변화, 먼지, 습기, 대기오염 등의 외적요인들로부터 인체를 보호하는 동시에 전신의 대사에 필요한 생화학적 기능을 갖고 있는 생명 유지에 없어서는 안 되는 아주 중요한 기관이다.

사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데, 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 이러한 피부에서의 노화의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉, 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다.

피부의 세포는 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 인간의 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 끊임없이 일어나는 생화학 반응에서 발생하는 활성산소종에 의해 산화적 스트레스가 가해지게 되면, 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물과 DNA 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 피부암 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되며, 노화를 촉진시킨다. 아울러 외적 노화의 원인 중에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 것은 자외선에 의한 광노화로서 UV에 지속적인 노출을 통해 피부암 등의 급성 및 만성적인 피부의 상해가 유발된다.

또한, 피부의 조직 중에서 표피의 기저층에 사람의 피부색과 관계가 있는 멜라닌이 만들어지는 멜라닌 세포(Melanocyte)가 존재한다. 피부 내부의 멜라닌(Melanin) 농도와 분포에 따라서 사람의 피부색은 결정되어지는데, 유전적 요인이나 자외선, 그리고 생활습관과 호르몬 등에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌의 생합성은 티로시나아제(Tyrosinase)에 의해 티로신(Tyrosine)이 도파(Dopa)와 도파퀴논으로 전환되고 지속적인 산화작용을 통해 이루어지며, 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀을 통해 케라티노사이트(Keratinocyte)라는 표피 세포로 이동되어 약 28일간의 각화 과정 이후에 소실된다. 이러한 멜라닌은 햇빛에서 오는 자외선을 흡수해 자외선이 피부 속으로 침투하지 않도록 막아 피부를 보호하는 중요한 기능도 하기 때문에 적게 생성되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되지만, 반대로 멜라닌이 자외선 등과 같은 다양한 원인에 의해 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 될 경우에는 멜라닌이 피부의 표면에 침착되어 기미, 주근깨 등과 같은 다양한 색소 침착을 유발하며 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다. 따라서, 이러한 멜라닌의 과생산 및 이에 따른 색소 침착을 방지하기 위해서 티로시나아제 작용 억제 및 생성을 억제하거나 멜라닌 생성에 관여하는 중간 단계를 억제 하는 등의 다양한 연구와 피부 미백용 조성물들의 개발이 활발히 진행되고 있다.

한편, 자외선은 피부에 주근깨, 잡티, 기미, 검버섯 등의 다양한 색소 변화를 일으키기도 하지만, 피부 노화를 일으키는 중요한 원인이 되기도 한다. 피부 노화는 크게 세월이 흘러감에 따라 자연히 발생하는 내인적 노화와 주위환경(오염물질, 세균, 스트레스 등)으로 인해 발생하는 외인적 노화로 나눌 수 있다. 특히, 피부는 태양 자외선에 노출됨으로써 항산화효소와 비타민 C와 E, 글루타치온과 같은 항산화제가 감소되어 반응성이 매우 큰 유해한 활성산소종(ROS; Reactive oxyten species)을 생성한다. 이러한 활성산소종은 멜라닌 생성을 촉진시키고, 주름을 유발시키는 광노화를 일으키는 원인물질로 잘 알려져 있고, 또한 피부의 효소 및 비효소적 항산화 방어체계를 손상시키면서 DNA, 단백질 산화, 피부의 면역기능을 억제하여 염증반응을 유발시키기도 한다. 따라서, 활성산소를 제거하여 피부 세포를 보호하고 피부노화를 완화할 수 있는 항산화제 개발에 대한 관심과 연구가 많이 진행되고 있다.

피부에 노화가 진행되면 진피의 변화가 현저하게 나타나며, 70세 이후 나타나는 진피위축은 대표적인 노화현상이다. 진피의 변화는 섬유아세포(fibroblast)의 숫자와 이들의 합성 능력의 감소로 인하여 세포 외 기질 중 큰 분자량을 가진 물질들의 변화로 발생된다. 그 구체적인 변화는 콜라겐 다발의 분리, 점다당질 합성감소, 콜라겐과 탄력섬유(elastin) 수와 직경 감소, 콜라겐과 탄력섬유 분해 및 혈관의 팽창 등을 들 수 있다. 일반적으로 피부의 수분 함유량, 콜라겐 함유량 및 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 복합적인 요인들 중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량과 콜라겐의 함량을 감소시키는 콜라겐 분해 효소인 콜라게나제의 발현량과 활성이다. 콜라게나제는 기질단백질 분해에 중요한 역할을 하는 금속단백분해효소(Matrix metalloproteinases, MMPs) 그룹에 속한다. 이러한 콜라게나제는 자외선, 성장인자, 염증성 사이토카인, 포르볼 에스테르(phorbol ester)에 의해 발현이 촉진되어 제1,2,3,5형 교원질(collagen)을 분해하는 것으로 알려져 있으며, 특히 자외선에 의한 광노화에 주요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 그 밖에 금속단백분해효소(MMPs)는 4형 교원섬유(MMP-2,-3), 탄력섬유(MMP-2), 또는 피브로넥틴(fibronectin)이나 라미닌(laminin, MMP-3)과 같은 기질단백질을 분해하며, 노화된 피부에서 발현이 현저히 증가됨을 관찰할 수 있다. 따라서 금속단백분해효소의 활성을 감소시킬 수 있는 소재개발이 활발하게 이루어지고 있다.

또한, 엘라스틴(elastin) 섬유는 콜라겐과 가교 결합을 형성하며 피부 탄력에 관여하고 있는 주름 생성에 중요한 피부 구성성분이다. 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스틴 분해 효소인 엘라스타제(elastase)의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름생성 요인 중의 하나로 밝혀지고 있다. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해할 수 있는 유일한 효소로서 이에 대한 저해는 피부 주름 개선을 근본적으로 줄여줄 수 있다고 알려져 있다.

한편, 감은 감나무의 열매로서 감의 주성분은 당질로 포도당과 과당의 함유량이 많으며, 비타민 CㅇA, 탄닌, 칼륨과 마그네슘 등이 풍부하게 함유되어 있으며 고혈압 예방, 혈중 알코올의 상승률을 낮추는 효능이 있다. 요즘에는 감식초, 감장아찌, 주스 등 다양한 제품으로 가공하여 사용하고 있다.

이에 본 발명자들은 안전성이 높아 피부 부작용이 없는 천연물질을 대상으로 피부 개선효과를 가지는 화장품 원료물질을 개발하기 위하여 계속 연구를 진행한 결과, 감을 증숙처리하여 수득된 흑감을 용매로 추출한 추출물이 세포 독성이 없으면서 항산화, 미백효과 뿐만 아니라 주름 개선효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 인체 안정성이 우수하며 항산화, 미백효과 및 주름개선 효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서 흑감 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 흑감은 감을 숙성하여 제조되는 검은 색을 띠는 감으로서 흑감을 60 내지 90℃의 온도에서 증숙 처리하여 수득할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 흑감은 감을 과습 상태에서 60 내지 90℃의 온도에서 증숙하고 증기 배출에 의해 감온하는 과정을 수차례 반복하여 흑감을 제조할 수 있다.

본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 발명의 흑감 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 흑감 추출물은 수득된 흑감을 분쇄한 후 추출용매, 예컨대 물, 탄소수 1~3개의 무수 또는 함수 저급 알콜 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 용매를 추출용매로 사용하여 추출할 수 있으며, 상기 추출 용매의 양은 생약 건조 중량의 2 내지 20 중량배, 바람직하게는 5 내지 15 중량배로 할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 흑감 추출물은 물, 에탄올 또는 계면활성제가 용해된 수용액, 바람직하게는 물, 70% 에탄올 또는 LAURETH-23 및 폴리소르베이트 20이 1:1로 용해된 1, 5 및 10%(v/v) 수용액을 사용하여 실온 내지 60℃의 온도에서 10 내지 35시간, 바람직하게는 20 내지 30시간 동안 추출한 다음, 여과지로 여과하여 흑감 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 흑감을 LAURETH-23 및 폴리소르베이트 20이 1:1로 용해된 수용액을 사용하여 추출한 경우 총 플라보노이드 및 폴리페놀의 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다.

본 발명의 조성물에는 흑감 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 0.1 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 10 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 이 때 흑감 추출물의 함량이 0.1 중량% 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 항산화, 미백 및 주름 개선효과를 수득할 수 없으며, 90 중량%를 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 흑감 추출물을 함유하는 조성물은 항산화 효과, 미백효과 및 주름 개선효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 흑감 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 막형성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 흑감 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 흑감 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 흑감 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 흑감 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 콜라게나제 및 엘라스타제 활성을 저해시킴으로써 주름 개선효과를 가진다. 또한 본 발명의 흑감 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

도 1은 흑감 추출물의 총 플라보노이드의 함량을 나타낸 것이다.
도 2는 흑감 추출물의 총 폴리페놀의 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 흑감 추출물의 전자공여능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 흑감 추출물의 ABTS 라디칼 양이온 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 흑감 추출물의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 흑감 추출물의 과산화수소 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 흑감 추출물의 잔틴 옥시다제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 흑감 추출물의 티로시나제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 흑감 추출물의 엘라스타제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 흑감 추출물의 콜라게나제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 흑감 추출물의 수렴활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 흑감 추출물의 제조

감을 과습 상태에서 60 내지 90℃의 온도에서 증숙하고, 증기 배출하여 감온하는 과정을 3회 이상 반복하여 흑감을 수득하였다.

수득된 흑감을 분쇄하여 분말화한 후 LAURETH-23 및 폴리소르베이트 20이 1:1의 중량비로 혼합되어 용해된 10%(v/v) 수용액, 물 및 70% 에탄올을 사용하여 실온에서 24시간 동안 각각 추출한 다음, 여과지로 여과하여 흑감 추출물을 각각 수득하였다.

<시험예 1> 흑감 추출물의 유용성분 함량 측정

(1) 총 플라보노이드 함량 측정

플라보노이드 함량은 각 흑감 추출물 시료액 0.1ml에 10% 질산 알루미늄 0.1ml, 1M의 아세트산칼륨 0.1ml 그리고 80% 에탄올 4.7 ml를 가하여 25℃에서 40분간 반응시킨 후 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 정량은 퀘르세틴(quercetin, Sigma Co., USA)을 이용하여 최종농도가 0-500 μg/mL가 되도록 취하여 위와 동일한 방법으로 측정한 검량선으로부터 산출하여 함유된 플라보노이드 함량을 구하였다.

흑감 추출물의 총 플라보노이드의 함량은 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

도 1은 흑감 추출물의 총 플라보노이드의 함량을 나타낸 것이다. 여기에서, BP-Surfactant 10%은 LAURETH-23 및 폴리소르베이트 20이 1:1의 중량비로 혼합되어 용해된 10%(v/v) 수용액으로 추출된 흑감 추출물이고, BP-water는 물을 이용하여 추출된 흑감 추출물이고, BP-70%EtOH는 70% 에탄올을 이용하여 추출된 흑감 추출물이다,

sample	polyphenol contents (mg QE/g)
BP-Surfactant 10%	187.4
BP-water	140.9
BP-70%EtOH	99.4

(2) 총 폴리페놀 함량 측정

폴리페놀 정량은 100배 희석한 시료용액 3ml에 Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약 1ml를 가하고, 1N HCl 0.2ml을 넣은 후, 포화용액 Na₂CO₃ 1ml를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, 640nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 탄닌산으로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 분자구조와 분자량을 가진다. 이들은 페놀성 히드록실(OH)기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하여, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가지며, 이들 대부분은 식물기원으로 나무, 수피, 줄기, 잎, 과일, 뿌리, 꽃, 씨앗 등의 식물 모든 부분에 존재하고 있다. 현재까지 페놀화합물 및 플라보노이드의 구조에 따른 항산화 활성과의 상관성에 대한 연구도 보고되었다. 폴리페놀계 물질들은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화환원반응에서 기질로 작용하며, 한 분자 내에 2개 이상의 페놀성 히드록실(OH)기를 가진 방향족 화합물들을 가리키며 플라보노이드와 탄닌이 주성분으로 충치 예방, 고혈압 억제, 항에이즈, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다.

흑감 추출물의 총 폴리페놀의 함량은 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

도 2는 흑감 추출물의 총 폴리페놀의 함량을 나타낸 것이다.

sample	polyphenol contents (mg TAE/g)
BP-Surfactant 10%	83.25
BP-water	6.3
BP-70%EtOH	5.7

상기 결과에서 보듯이, LAURETH-23 및 폴리소르베이트 20이 1:1의 중량비로 혼합되어 용해된 10%(v/v) 수용액으로 추출된 흑감 추출물이 총 플라보노이드 함량 및 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 것이 확인되었다.

<시험예 2> 항산화 효과 측정

(1) DPPH radical 소거능 측정

전자공여능(EDA; electron donating ability)은 Blois의 방법(1958)에 따라 측정하였다. 각 시료용액 2 ml에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 1 ml 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여 능은 시료용액의 첨가구와 무 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

1,1 Diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) 라디칼을 이용한 항산화능 측정법은 주로 phenolic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용되는 방법이다. DPPH alcohol 용액은 517nm에서 가장 강한 UV 흡수가 있으며 실온에서 매우 안정한 유리 라디칼이다. 전자공여체로부터 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 됨으로써 517nm에서 나타났던 DPPH의 특이적인 흡수 band가 사라지게 된다. 가시적인 DPPH의 보라색은 안정해진 분자의 몰수에 비례하여 노란색으로 변하게 된다.

도 3은 흑감 추출물의 전자공여능을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 아스코브산(Ascorbic Acid, AA)를 사용하였다. 흑감 추출물(BP)의 농도가 증가할수록 전자공여능 활성이 높아짐을 볼 수 있었다.

(2) ABTS 라디칼 양이온 소거능 측정

ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ cation decolorization assay 방법(Roberta, et al., 1999)에 의하여 측정하였다. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.4 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+^??을 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 ABTS+100 ul에 시료 100 ul를 가하여 1분 동안 방치한 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS 라디칼 소거능은 추출물들의 상대적인 항산화효과 측정인 hydrogen-donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다. 또한 aqueous phase 모두에 적용이 가능하며 표준물질 사용으로 추출물의 상대비교가 가능하도록 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS⁺ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한다.

도 4는 흑감 추출물의 ABTS radical cation 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 아스코브산(Ascorbic Acid, AA)를 사용하였다. 여기에서 보듯이, 흑감 추출물의 농도가 능가할수록 ABTS 라디칼 소거능의 활성도 증가하였다.

(3) 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(Superoxide anion radical) (O₂ ^-) 소거능 측정

SOD 유사활성은 Marklund의 방법에 따라 측정한다. 각 시료용액 0.2ml에 Tris-HCl 완충용액 (50mM tris+10mM EDTA, pH 8.5) 2.6mL와 7.2mM pyrogallol 0.2ml 가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1M HCl 0.1ml를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420nm에서 측정한다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.

항산화 효소 중의 하나인 수퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase, SOD)는 생체에 매우 유해한 수퍼옥사이드 음이온 라디칼과 반응하여 과산화수소(H₂O₂)를 생성하는 효소로, 산소를 소비하는 모든 생물 종에 존재하여 생체 내에서 활성산소 장애에 대한 방어 작용을 하는 대표적인 활성산소 저해제이다. 또한 SOD는 자유 라디칼을 근본적으로 제거하는 효소이고 다른 종류의 항산화제보다 우수한 효과를 나타내기 때문에 의약제재로서 많은 관심을 일으키고 있으며, 현재 항염증제재나 피부 노화방지를 위한 미용제재로 화장품 등에 이용되고 있다.

도 5는 흑감 추출물의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 아스코브산(Ascorbic Acid, AA)를 사용하였다. 여기에서 보듯이, 흑감 추출물의 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD)를 측정한 결과 BP 경우 양성대조군과 비교했을 때 50% 유사활성을 나타내었다.

(4) 과산화수소(Hydrogen peroxides) 소거능 측정

과산화수소 저해활성은 과산화수소 분석(Jayaprakasha et al., 2004)에 의해 측정하였다. 농도별 시료용액 1 ml와 인산완충액(PBS, pH 7.4)에 녹인 40 mM 과산화수소 용액 2 ml를 37℃에서 10분 간 반응시킨 후 반응액 중에 저해된 과산화수소의 양을 230 nm에서 흡광도를 측정하였다.

과산화수소는 산소의 환원대사물질로서 미토콘드리아나 peroxisome 등의 정상세포로부터 형성되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성되는데, DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 생체막 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 지질을 생성함으로써 생체기능저하 또는 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다.

도 6은 흑감 추출물의 과산화수소 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 아스코브산(Ascorbic Acid, AA)를 사용하였다. 여기에서 보듯이, 흑감 추출물의 농도가 증가할수록 높은 저해 활성을 나타내었으며, BP 100ug/ml의 농도에서 50%의 높은 과산화수소 소거능을 확인할 수 있었다.

(5) 잔틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 저해활성 측정

잔틴 옥시다제 저해활성 측정은 잔틴을 기질로 하여 생성된 urate를 분광광도법으로 측정하는 Stipe 등의 방법을 변형시켜서 측정하였다. 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.5)에 기질인 2mM 잔틴 및 효소액을 0.049 units/ml로 혼합하고 37℃에서 15분간 반응시키고, 반응정지 시약인 1N HCl을 가하여 반응을 중단시켜 생성된 urate를 290nm에서 측정하였다.

체내 산화물질인 퓨린의 대사에 관여하는 잔틴 옥시다제 효소는 잔틴 또는 하이포잔틴으로부터 요소(urea)를 형성하며 요소가 혈장 내에 증가하게 되면 골절에 축적되므로 통증을 동반하는 통풍을 유발할 뿐만 아니라 신장에 침작되어 신장질환의 원인이 되기도 한다.

도 7은 흑감 추출물의 잔틴 옥시다제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 아스코브산(Ascorbic Acid, AA)을 사용하였다. 여기에서 보듯이, 흑감 추출물의 농도가 증가할수록 저해능 또한 증가하는 것을 알 수 있었다. 그러나 대조군인 아스코브산과 비교하였을 때, 흑감 추출물은 대조군에 비해 낮은 저해 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.

<시험예 3> 미백효과 측정

(1) 티로시나제(Tyrosinase) 저해활성 측정

티로시나제 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.175M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5ml에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2ml 및 시료용액 0.1ml의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/ml) 0.2ml을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. 티로시나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

피부의 색조를 결정하는 주요한 인자인 멜라닌은 표피 기저층의 멜라노사이트(melanocyte)라고 불리는 색소세포내의 melanosome에서 생합성 된다. 멜라닌을 합성하는데 있어서의 출발물질은 아미노산의 일종인 티로신이다. 티로신은 멜라닌 세포내에서의 시나제티로시나제에 의해 L-3,4-다이하이드록실 페닐알라닌(DOPA), DOPA 퀴논으로 산화된다. 그 후 DOPA퀴논이 DOPA chrome, 5,6-다이하이드록시인돌, 인돌-5,6-퀴논이 되고, 이어서 인돌-5,6-퀴논으로의 중합에 의해 멜라닌을 생성하는 것으로 알려져 있다. 또한 티로시나제는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, melanosome 내에서 티로신을 산화시켜 DOPA를 만드는 티로신 하이드로실라제로, DOPA를 산화시켜 DOPA 퀴논을 만드는 DOPA 옥시다제로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용한다.

도 8은 흑감 추출물의 티로시나제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 아스코브산(Ascorbic Acid, AA)를 사용하였다. 여기에서 보듯이, 1000ug/ml 농도에서 AA는 84%, BP는 40% 저해활성을 나타내었다. BP의 경우 대조군 Ascorbic Acid에 비해 낮은 저해 활성을 나타내었다.

<시험예 4> 주름개선 효과 측정

(1) 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정

엘라스타제 저해활성 측정은 다음과 같이 측정하였다. 추출물을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 ml씩 시험관에 취하고, 50 mM tris-HCl 완충액 (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5 Unit/ml)용액 0.5 ml을 가한 후 50 mM tris-HCl 완충액(pH 8.6)에 녹인 기질 N-숙시닐-(L-Ala)3-p-니트로아닐라이드 (0.5mg/ml)을 첨가하여 20분간 반응시켜 기질로부터 생성되는 p-니트로아닐라이드의 생성량을 405 nm에서 측정하였다. 엘라스타제 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

엘라스타제는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소로 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 피부의 진피조직 속에는 콜라겐과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 엘라스틴이 엘라스타제에 의해 분해되어 피부의 그물망 구조 결합이 끊어짐으로, 엘라스타제가 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있다. 그리고 체내의 엘라스틴을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실을 유발한다.

도 9는 흑감 추출물의 엘라스타제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 우르솔산(Ursolic Acid, UA)을 사용하였다. 여기에서 보듯이, BP의 경우 농도가 증가할수록 elastase 저해 활성이 증가하였으나, 대조군 Ursolic acid와 비교하였을 때 미비한 활성을 나타내었다.

(2) 콜라게나제(Collagenase) 저해활성 측정

콜라게나제 저해활성 측정은 다음과 같이 측정하였다. 즉, 반응구는 0.1 M tris-HCl 완충액 (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여, 4-페닐아조벤질옥시카보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3 mg/ml)를 녹인 기질액 0.25 ml 및 시료용액 0.1 ml의 혼합액에 콜라게나제 (0.2 mg/ml) 0.15ml를 첨가하여 실온에서 20분간 정치한 후 6% 시트르산 0.5 ml을 넣어 반응을 정지시킨 후, 에틸 아세테이트 1.5 ml을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

콜라겐은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조중량의 약 70~80%를 차지하고 있어, 세포외 기질의 대부분을 차지하면서 피부를 지지하는 역할을 한다. 그러나 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소와 같은 내적 요인에 의해 콜라겐의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해가 가속화되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있어 흑감 추출물의 콜라게나제 저해 활성을 Fig. 8과 같이 측정하였다. 비교를 위해 양성 대조군으로 우르솔산(Ursolic Acid, UA)을 사용하였다.

도 10은 흑감 추출물의 콜라게나제 저해활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 양성 대조군으로 우르솔산(Ursolic Acid, UA)을 사용하였다. 여기에서 보듯이, 흑감 추출물의 콜라게나제 저해활성을 측정한 결과 500ug/ml의 농도에서 50% 이상의 높은 콜라게나제 저해활성능을 나타내었다.

(3) 수렴(Astringent) 활성 실험

수렴 활성 측정은 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용하여, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500rpm에서 3분간 원심분리 후 407nm에서 흡광도를 측정하였다. 수렴 활성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

피부 단백질은 고분자 플라보노이드인 폴리페놀과 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되어 수렴작용을 하게 된다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있으며, 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다. 또한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈의 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과 정도를 판단할 수 있다. 이러한 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하고 그 결과 국소를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 할 수 있다.

도 11은 흑감 추출물의 수렴활성을 나타낸 그래프이다. 비교를 위해 탄닌산(Tannic Acid, TA)를 사용하였다. 여기에서 보듯이, BP의 경우 수렴활성을 나타내어 대조군인 Tannic Acid 보다 낮은 수렴 활성을 나타내었다.

Claims

흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 흑감이 감을 과습 상태에서 60 내지 90℃의 온도에서 증숙하고 증기 배출에 의해 감온하는 과정을 반복하여 제조된 것임을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 흑감 추출물이 흑감을 분쇄한 후 물, 70% 에탄올 또는 LAURETH-23 및 폴리소르베이트 20이 1:1의 중량비로 용해된 1, 5 또는 10%(v/v) 수용액을 사용하여 실온 내지 60℃의 온도에서 10 내지 35시간 동안 추출하여 수득된 것임을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물.
흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 약학적 조성물.
흑감 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 식품 조성물.