KR20100088463A - 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 이를 이용한 화장 방법에 관한 것이다. 본 발명의 아로니아 추출물은 티로시나아제 활성 억제 효과 및 DOPA 자동산화 억제효과가 우수하고 멜라닌 세포에서 멜라닌의 생성을 저해하는 효과가 있으며, 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 피부에 거의 자극을 주지 않아 안정성이 우수한 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

아로니아 추출물, 티로시나아제 활성, DOPA 자동산화, 멜라닌, 피부 미백

Description

아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Whitening the Skin Comprising the Extract of Aronia melanocarpa as Active Ingredient}

본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 화장료 조성물을 이용하는 화장방법에 관한 것이다.

일반적으로 사람의 피부, 모발 및 눈 등의 색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈 등에 의해 결정된다. 특히 멜라닌은 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인으로서, 멜라닌의 양과 성질 및 분포의 정도에 따라 피부색이 결정된다. 사람의 피부나 모발의 색소는 햇빛, 특히 자외선의 유해한 영향으로부터 피부나 모발을 보호해 주는 역할을 한다. 예컨대, 이러한 색소가 부족한 사람은 햇빛에 매우 민감하여 화상을 입기 쉬우며 어린 나이에도 피부암의 발생 확률이 높다. 단파장의 자외선 (290-320 nm) 및 발암 물질은 피부에서 유해 라디칼, 예컨대, 산소 라디칼을 형성하며, 이러한 산소 라디칼이 피부 세포를 공격하여 피부를 노화시키는 것으로 알려져 있다.

멜라닌의 주요한 기능은 이러한 유해 라디칼을 제거하여 이에 의한 손상으로부터 피부를 보호하는 것이다. 따라서 멜라닌의 양이 많다는 것은 물리적 또는 화학적 독성 물질로부터 피부를 보호할 수 있는 효과적인 대응 체계를 가지고 있다는 것을 의미한다.

한편, 멜라닌은 티로시나아제(tyrosinase)라는 효소에 의해 티로신(tyrosine)이 도파(DOPA), 도파퀴논(Dopaquinone)으로 전환되고, 비효소적인 산화반응을 거쳐서 생성된다. 이때 생성된 멜라닌은 피부 세포에 전달되고 표피 박리와 함께 멜라닌이 상실되어 소멸되는 순환 과정을 가진다.

이러한 멜라닌 생성 과정은 자연적으로 일어나는 현상으로서, 정상 상태의 사람 피부에서는 멜라닌이 과다 생성되지 않으나, 피부가 자외선, 환경오염 또는 스트레스 등의 외부의 자극과 반응하면 멜라닌이 과다 생성된다. 이렇게 과다 생성된 멜라닌이 피부 밖으로 배출되지 못하고 피부 속에 남아 있게 되면 색소 침착이 일어나 기미 및 주근깨 등으로 나타나게 된다.

피부 미백은 멜라닌 과다 생성의 억제를 통해 이루어질 수 있는데, 대표적인 멜라닌 과다 생성 억제의 방법으로는, 자외선과 같은 외부자극을 차단하는 방법, 멜라닌 형성과 관련된 티로시나아제의 활성을 억제하는 방법, 멜라닌 생성을 주관하는 멜라닌 세포의 분열을 방해하는 방법, 비타민 C 유도체를 이용하는 방법 등이 있다.

현재까지 피부 미백과 관련하여 많은 화장품 회사에서 다양한 연구개발이 이루어지고 있으며, 미백제로 함유되는 물질은 크게 2가지로 나눌 수 있는데, 첫 번 째는 멜라닌 세포내에서 멜라닌색소를 만드는 과정에 작용하여 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 물질로 대표적인 물질로는 알부틴(일본특개평 4-93150), 비타민 C(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평-192062) 등 여러 가지 미백효과가 있는 식물추출물이 있다. 이 중 하이드로퀴논은 탈색효과가 가장 강력하여 화장품보다는 피부과 연고에 포함되며 알부틴은 하이드로퀴논 제제보다는 탈색효과가 약하다. 그리고 최근에 유전 독성 등으로 사용이 제한되고 있어서 그 소재의 다양성이 다른 화장품소재에 비해 매우 부족한 실정이다. 비타민 C의 작용은 티로시나아제제와 반응하여 멜라닌 중간체인 도파퀴논을 환원하여 멜라닌 생성을 억제하는 작용과 진한색의 산화형 멜라닌을 환원하여 엷은 색의 환원형 멜라닌으로 하는 작용의 2가지가 있다. 비타민 C가 색소세포의 기능을 억제하여 색소생성을 억제한다는 것은 널리 알려진 사실로 여러 미백제품에 쓰이고 있다. 비타민 C는 안전성이 높으나, 제형 및 제제의 안정성은 나쁘기 때문에 불안정한 물질로서 단순히 피부에 바르는 것으로 피부에 흡수가 어려운 문제가 있다. 그러므로 비타민 C는 제형 및 제제의 안정화를 위해 다양한 유도체가 개발되고 있다. 미백효과가 있다고 알려진 식물추출물로는 닥나무, 상백피(뽕나무 뿌리 껍질 추출물), 감초 추출물 등이 있으나, 아로니아에 의한 피부 미백 작용 또는 피부 미백제로서의 용도와 관련하여서는 전혀 알려진 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 화장료의 안정성, 부작용 및 미백 효과의 약화 등의 종래의 피부 미백용 화장료 조성물의 문제점을 극복하기 위해 예의 노력한 결과 아로니아 추출물이 우수한 미백효과 및 피부 안정성을 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부 미백 효과가 우수한 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 명확하게 된다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 아로니아(Aronia melanocarpa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 아로니아 추출물은 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌 글리콜, 부틸 아세테이트 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 사용하여 추출된 것이다.

또한, 바람직하게는, 상기 아로니아 추출물은 상기 화장료 조성물의 총중량에 대해서 0.0001-30.0 중량% 로 포함되는 것이다.

또한, 바람직하게는 상기 아로니아추출물은 멜라닌 생성을 억제하고, 티로시 나아제 활성을 저해하며, DOPA 자동산화를 저해하며, 미백효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 이용하는 화장 방법에 의해 달성된다.

본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 아로니아 추출물은 종래의 미백 성분에 비하여 향상된 티로시나아제 활성 억제 효과(실험예 1), DOPA 자동산화 저해 효과(실험예 2) 및 뛰어난 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 억제 효과(실험예 3)가 있으며, 본 발명의 아로니아 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 탁월한 피부 미백 효과(실험예 5, 6)를 나타낸다. 또한, 본 발명의 아로니아 추출물은 세포 독성 완화 효과(실험예 4)가 뛰어나, 피부에 거의 자극을 주지 않으므로 화장료 조성물의 유효성분으로서 유효하게 사용될 수 있다.

본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 사용되는 “아로니아”는 장미과(Rosaceae)에 속하는 다년생 낙엽관목이다, 아로니아의 원산지는 북아메리카 동부지역으로 대부분 음지의 숲이나 늪지에 자생하고 있으며, 이 속에는 아로니아 아르부티폴리아(A. arbutifolia)와 아로니아 멜라노카르파(A. melanocarpa) 2종류가 있다. 본 발명에서는 이들 중 아로니아 멜라노카르파를 사용한다. 아로니아 멜라노카르파는 작고 검은 자줏빛의 신맛이 나는 열매로 큰 블루베리나 검은 로완베리를 연상시킨다. 아로니아 멜라노카르파는 3-5인치 정도 성장하는데, 늦여름에 열매가 익고 곧바로 떨어진다. 잎은 부드럽고 윤이 나며 연한 녹색이다.

아로니아에는 다량의 당류(20%)와 안토시아닌(1%), 비타민 B1, B2, 판토텐산, 플라보노이드(flavonoid) 등을 함유하고 있다. 아로니아에 들어있는 안토시아닌의 총 함유량과 안토시아닌 성분은 TLC, HPLC, UV/VIS 방법에 의해 결정되어진다. 에탄올 추출법(알코올 70%와 염화수소 1%)과 정제를 최적화하여 실험한 결과, 아로니아에는 건조중량 100g당 650-850mg에 이르는 안토시아닌이 함유되어 있음이 발견되었다.

이러한 아로니아는 중세 유럽의 왕족들이 각종 질병의 치유 또는 예방의 목적으로 추구했고, 아로니아 자체를 “만병통치약”으로 애용했을 만큼 매우 귀한 약용열매였다. 아로니아 열매는 심혈관 질환, 각종 암, 치매, 당뇨질환, 간질환, 위장질환, 신경질환, 시력장애, 비만, 불임증, 류머티즘, 성기능, 비뇨기질환, 바이러스성 질환 등에 탁월한 효능이 밝혀졌다.

본 발명에 있어서, 아로니아 추출물은 아로니아의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 열매, 줄기, 가지, 뿌리 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 아로니아의 열매, 뿌리, 줄기 또는 가지로부터 얻은 추출물이고, 가장 바람직하게는 열매로부터 얻은 추출물을 의미한다.

본 발명의 아로니아 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용한 용매 추출법, (b) 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한 다.

본 발명에서는 바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용하였다.

본 발명에서 아로니아 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70% 에탄올 수용액을 이용하여 얻어진 것이다.

한편, 본 발명의 아로니아 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결 건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서 아로니아 추출물은 티로시나아제 활성을 저해하거나 또는 멜라닌 세포의 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 유효량의 아로니아 추출물을 포함한다.

본 발명의 조성물에서 상기 아로니아 추출물의 함량은 화장료 조성물의 총 중량기준으로 0.0001-30.0 중량%, 바람직하게 0.001-10.0 중량% 이다. 아로니아 추출물의 함량이 화장료 조성물의 총 중량기준으로 0.0001 중량% 미만일 경우에는 티로시나아제 활성 저해 및 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 억제를 통한 피부미백효과의 개선이 다소 미흡한 문제점이 있고, 아로니아 추출물의 함량이 화장료 조성물의 총 중량기준으로 30 중량%를 초과할 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 미백효과는 증가하지 않고 피부 민감성이 증가하는 문제점이 있다.

본 발명의 특징은 아로니아 추출물을 피부 미백 성분으로 사용하는 것이다. 상기 아로니아 추출물은 티로시나아제의 활성을 억제함으로써 티로신으로부터 멜라닌이 생성되는 것을 저해하고, 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있다. 또한 본 발명의 아로니아 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 우수한 피부 미백효과를 나타내며, 피부에 대한 자극이 거의 없으므로 뛰어난 피부 안전성을 가진다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 아로니아 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 피부 미백 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누 및 계면활성제 함유 클렌징 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 밀크 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더 워시, 클렌징 오일, 마스크 및 팩 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 에스테르오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 카보머, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글라이콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에 스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 이용하여 티로시나아제 활성 억제, DOPA 자동산화 저해 및 멜라닌 생성 억제하는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 미백 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 아로니아 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 이용하는 화장방법을 수행하면, 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성을 억제하고, 피부 색소 침착을 개선하여 우수한 피부 미백 효과를 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한 본 실시예에서 사용되는 부, %, 비는 특별히 언급되지 않는 한 중량 기준에 해당한다.

제조예 1. 아로니아 추출물의 제조

먼저 세척한 아로니아 열매를 잘 말려서 건조한 다음 잘게 파쇄하여 분말 형태로 준비하였다. 100 g의 아로니아 열매를 70% 에틸알코올 600 ml에 넣고 5일간 상온에서 추출한 후 와트만 여과지(No. 5)를 이용하여 여과하였다. 냉각 콘덴서가 장착된 추출기에 넣고 70℃에서 감압 농축기로 농축 및 건조하여 건조중량 10.56g을 얻었다. 건조된 아로니아 추출 분말을 50%(v/v) 1,3-부틸렌 글리콜 수용액에 최종 농도 1%(w/v)가 되게 용해하여 아로니아 추출물을 제조하였다.

실험예 1: 아로니아 추출물의 티로시나아제 활성 저해 실험

상기 제조예 1에 따른 아로니아 추출물의 티로시나아제 활성 저해도를 알아보기 위하여 티로시나아제 활성 저해 실험을 실시하였다. 티로시나아제 활성 저해 기질로는 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)에 용해한 1.5 mM의 티로신 (시그마사, 미합중국)을 사용하였다. 아로니아 추출물은 0.05 M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)을 이용하여 농도(0.01 내지 1.0%)별로 희석하여 시료액을 제조하였다. 상기 농도별 시료액 240 ㎕에 티로신 40 ㎕를 각각 첨가하여, 티로시나아제 (시그마사, 1500 U/ ㎖) 20 ㎕을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 반응시킨 다음, 490 nm에서 흡광도(실험군 흡광도)를 측정하였고, 대조군으로는 아로니아 추출물을 첨가하지 않은 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)을 사용하였고, 비교군으로 통상적으로 사용되는 미백제인 알부틴을 사용하였다. 각 시료액의 티로시나아제 활성 저해도는 하기 수학식 1에 따라 계산하였으며, 결과는 하기 표 1에 기재하였다.

실험 시료(%)	티로시나아제 활성 저해도(%)
대조군	0.0
아로니아 추출물 0.01	68.2
아로니아 추출물 0.02	72.5
아로니아 추출물 0.05	76.2
아로니아 추출물 0.10	76.3
아로니아 추출물 0.50	81.4
아로니아 추출물 1.00	82.1
알부틴 0.10	56.8

상기 표 1의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 아로니아 추출물을 0.01%~1.00% 처리했을 때 티로시나아제 활성 억제에서 탁월한 효과를 나타내었으며, 또한 상기 활성 저해도는 아로니아 추출물 농도에 의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 그리고 동일 농도의 알부틴과 비교했을 때에도 본 발명의 아로니아 추출물의 티로시나아제 활성 저해도가 알부틴의 티로시나아제 활성저해도보다 높게 나타난 것으로 보아 아로니아 추출물의 미백 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

실험예 2: 아로니아 추출물의 DOPA 자동산화 저해효과

아로니아 추출물의 티로시나아제의 DOPA 자동산화반응에 대한 활성억제효과를 측정하기 위하여 DOPA 자동산화 저해 시험을 실시하였다.

멜라닌의 생성경로에서 활성부위에 한 쌍의 구리이온을 함유하고 있는 금속함유 단백질인 tyrosinase에 의해 속도 결정 단계인 L-tyrosine이 hydroxylation 반응을 거쳐 3,4-dihydroxy phenylalanine(L-DOPA)로 전환되고, 이것이 다시 phenylalanine-3,4-quinone(dopaquinone)으로 산화되며, 그런 후 dopachrome, indole-5,6-quinone 등의 여러 중간체를 거쳐 멜라닌이 합성된다. 그러므로 멜라닌 색소의 생합성 과정에 관여하는 tyrosine의 활성은 dopachrome의 생성량과 직접적인 연관성이 있다. DOPA 자동산화 저해 시험은 멜라닌 합성과정의 속도결정단계를 촉매하는 타이로시나제의 DOPA 산화반응에 대한 활성저해율을 측정하여 미백 성분의 효과를 평가하는 것이다.

아로니아 추출물은 0.05M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)을 이용하여 농도별로 희석하여 시료액을 제조하고, 시험관에 상기 농도별 시료액 50 ㎕에 DOPA 자동산화 저해 기질로 0.05M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)에 용해한 500μM의 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine, 시그마사, 미합중국)를 각각 첨가하고, 티로시나아제(2,000 U/㎖, 시그마사, 미합중국) 50 ㎕를 순서대로 첨가하여 전체 반응액의 부피를 2 ml로 하여, 37℃에서 1 분 동안 반응시킨 후 475nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로는 아로니아 추출물을 첨가하지 않은 0.05M 인산나트륨 완충용액을, 비교군으로 통상적으로 사용되는 미백성분인 알부틴을 사용하였다. 각 농도별 아로니아 추출물의 DOPA 자동산화 저해효과는 하기 수학식 2에 따라 계산하였으며, 결과는 하기 표 2에 기재하였다.

실험 시료(%)	DOPA 자동산화 저해율(%)
대조군	0.0
아로니아 추출물 0.01	46.9
아로니아 추출물 0.02	49.2
아로니아 추출물 0.05	51.3
아로니아 추출물 0.10	52.2
아로니아 추출물 0.50	58.5
아로니아 추출물 1.00	69.5
알부틴 0.10	32.8

상기 표 2의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 아로니아 추출물은 티로시나아제의 DOPA 자동산화반응에 대한 활성 억제에 탁월한 효과를 나타내었으며, 또한 상기 활성 저해도는 아로니아 추출물 농도에 의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 동일 농도의 비교군인 알부틴과 비교했을 때 더 우수한 DOPA 자동산화 저해효과가 있음을 확인하였다.

실험예 3: 아로니아 추출물의 멜라닌 생성 저해 실험

생쥐 유래의 흑색종 세포 B-16 F1(Melanocyte, B16-F1 한국세포주은행)를 12-웰 플레이트(Falcon, 미합중국)에 1× 10⁴ cell/well이 되도록 접종한 후에 하루 동안 배양하여 세포를 안정화 시킨 다음, 제조예 1에 따른 아로니아 추출물을 각 웰당 0.1 내지 1.0%의 농도별로 처리하여 3-4 일 동안 배양하였다. 배양한 플레이트는 원심분리한 후 배양액을 제거하고, 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해한 1N NaOH 용액 500 ㎕로 세포를 용해한 후 90℃ 수조 (water bath)에서 10분간 가열하였다.

이를 다시 원심분리한 후 그 상등액을 570 ㎚의 파장에서 흡광도(실험군의 흡광도)를 측정하였다. 이때 아로니아 추출물을 첨가하지 않은 무첨가군을 대조군으로 하고, 비교군으로 통상적으로 사용되는 미백성분인 알부틴을 사용하여 하기 수학식 3에 따라 멜라닌 생성 저해도(%)를 계산하였으며, 그 결과를 표 3에 기재하였다.

실험 시료(%)	멜라닌 생성 저해도(%)
대조군	0.0
아로니아 추출물 0.1	15.6
아로니아 추출물 0.2	36.8
아로니아 추출물 0.5	65.4
아로니아 추출물 1.00	88.7
알부틴 0.5	46.8

상기 표 3의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 아로니아 추출물은 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 알 수 있다. 멜라닌 생성 저해도(%)는 아로니아 추출물의 농도(%)에 의존적으로 증가하는 양상을 보였다. 따라서 본 발명의 아로니아 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 멜라닌 생성 억제에 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 4: 아로니아 추출물의 세포 독성 억제 효과

제조예 1에 따른 아로니아 추출물의 세포 독성 억제 효과를 알아보기 위하여 MTT 분석법을 통하여 독성여부를 확인하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) assay는 세포의 성장을 알아보는 방법 중 하나로, 수용성의 노란색 tetrazolium salt MTT는 살아있는 세포에서 청자색의 비수용성인 formazan crystal로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. 그리고, 세포 증식율이 95% 이상일 경우 세포에 안정하기 때문에 적정 사용농도를 확인하기에 적당한 것이다. 섬유아세포(Fibroblast, 한국세포주은행)를 48-웰 플레이트에 각 웰당 1× 10⁵ cells/well로 접종하여 1.0㎖의 DMEM (Dulbecco Minimum Essential Medium) 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 각 웰당 0.1 내지 1.0%의 농도별로 아로니아 추출물을 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양한 플레이트는 0.5 ㎎/㎖ MTT 용액(시그마, 미합중국)을 첨가한 후 4 시간 후에 배지를 제거하고 1.0 ㎖의 DMSO 용액으로 세포를 용해하였고 그 반응액을 ELISA Reader(Molecular Device, 미합중국)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 아로니아 추출물을 처리하지 않은 무처리군을 대조군으로 하여 하기 수학식 4 에 따라 세포의 증식율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4 에 기재하였다.

실험 시료(%)	세포 증식율(%)
대조군	100.0
아로니아 추출물 0.1	113.5
아로니아 추출물 0.2	115.5
아로니아 추출물 0.5	119.2
아로니아 추출물 1.0	113.6

상기 표 4의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 추출물은 상대적으로 고농도에서도 섬유아세포에 대하여 세포 독성을 나타내지 않으므로, 아로니아 추출물을 함유한 조성물은 본 발명의 아로니아 추출물은 처리 농도에 상관없이 세포증식율에 영향을 미치지 않았으며(모두 100% 이상), 이러한 결과로서, 본 발명의 아로니아 추출물은 세포 독성에 대해서 상당히 안전함을 확인할 수 있었다.

이하, 상기한 실험예들의 결과를 근거로 하여 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료를 조성하여 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물이 하기의 제형예에 제한되는 것은 아니다.

제형예 1: 유연 화장수

상기 제조예 1의 방법으로 획득한 아로니아 추출물을 포함하는 유연화장수의 제형예는 통상의 방법에 따라 표 5의 조성으로 제조하였다.

성분	함량
아로니아 추출물 초산 토코페롤 올레일 알코올 에탄올 벤조페논-9 카르복실비닐 폴리머 셀룰로오스검 향 방부제 정제수	2.0 5.2 1.5 3.2 2.0 1.0 3.5 미량 미량 잔량
계	100

제형예 2: 영양화장수

상기 제조예 1의 방법으로 획득한 아로니아 추출물을 포함하는 영양화장수의 제형예는 통상의 방법에 따라 표 6의 조성으로 제조하였다.

성분	함량
아로니아 추출물 글리세린 프로필렌글리콜 토코페릴 아세테이트 유동파라핀 트리에탄올아민 스쿠알란 마카다미아너트오일 폴리솔베이트 60 솔비탄세스퀴롤레이트 프로필파라벤 카르복실비닐 폴리머 향 방부제 정제수	2.0 5.1 4.2 3.0 4.6 1.0 3.1 2.5 1.6 1.6 0.6 1.5 미량 미량 잔량
계	100

제형예 3: 영양 크림

상기 제조예 1의 방법으로 획득한 아로니아 추출물을 포함하는 영양 크림의 제형예는 통상의 방법에 따라 표 7의 조성으로 제조하였고, 비교군으로서 아로니아 추출물을 포함하지 않는 영양크림(비교제형예 1)을 함께 제조하였다.

성분	제형예 3	비교 제형예1
아로니아 추출물 글리세린 바셀린 트리에탄올아민 유동파라핀 스쿠알란 밀납 토코페릴 아세테이트 폴리솔베이트 60 카르복실비닐 폴리머 솔비탄세스퀴올레이트 향 방부제 정제수	2.0 4.0 3.5 2.1 5.3 3.0 2.6 5.4 3.2 1.0 3.1 미량 미량 잔량	- 4.0 3.5 2.1 5.3 3.0 2.6 5.4 3.2 1.0 3.1 미량 미량 잔량
계	100	100

실험예 5: 화장료 조성물의 미백효과 임상실험 - 육안평가

19-40세의 특히 피부가 검은 한국 여성 30명을 대상으로 본 발명의 화장료 조성물의 미백 효과를 측정하였다. 이들에게 아로니아 추출물을 포함하는 제형예 3의 영양 크림과 제형예 3에서 아로니아 추출물을 제외한 비교제형예 1의 영양크림을 각각 얼굴의 반쪽면에 사용하게 한 후 8주 동안 꾸준히 도포하고, 8주 후에 얼굴색의 변화를 육안 평가를 통해 평가하여 미백 효과를 측정하였으며 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

피부색 개선 정도 (ΔL 값)

구분	효과 있음	약간 효과	효과 없음	개선율(%)
제형예 3	21	5	4	86.7
비교제형예 1	3	4	24	23.3

상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 8주 후의 피부색 개선 효과를 보면 아로니아 추출물를 포함하지 않은 비교제형예 1의 영양크림에 비하여 아로니아 추출물를 포함하는 제형예 3의 영양크림의 미백 효과가 3.7배 이상 월등히 높게 나타났다. 따라서 본 발명의 화장료 조성물은 매우 우수한 미백 효과를 갖고 있음을 알 수 있다. 또한, 시험 기간 동안 피부에는 특별한 부작용이 관찰되지는 않았으며, 이것은 아로니아 추출물이 피부에 매우 안전하다는 것을 보여주는 결과이다.

실험예 6 : 화장료 조성물의 미백효과 측정-기기평가

피부색이 어두운 26-45세의 여성 30명을 대상으로, 본 발명의 아로니아 추출물을 포함하는 제형예 3의 영양 크림과 제형예 3에서 아로니아 추출물을 제외한 비교제형예 1의 영양크림을 이용하여 화장료의 미백 효과를 기기로 측정하였다. 피검자의 팔의 12군데를 가로 세로 1 cm씩 표시하고, 제형예 3, 비교제형예 1의 화장료를 각각 도포한 다음, 나머지 1 곳은 아무 처치도 하지 않는 대조군으로 사용하였다. 화장료는 2달 동안 하루에 2회 적용하였다. 측정 장비인 Minolta CR 300을 사용하여 2개월 경과 후 피부색(L value, lightness)을 측정하였으며, 하기 수학식 5를 이용하여 피부색의 변화도(ΔL 값)를 계산하여 표 9에 그 결과를 나타내었다.

피부색 변화도(ΔL 값)

구분	제형예 3	비교제형예 1
ΔL값	1.48	0.35

상기 표 9의 결과에서도 알 수 있듯이, 아로니아 추출물을 함유한 제형예 3은 아로니아 추출물을 함유하지 않는 비교제형예 1에 비해 피부색 변화도(ΔL) 값이 현저하게 증가하였다. 이러한 결과로서, 본 발명의 아로니아 추출물을 함유하는 화장료의 미백효과를 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (4)

1. 아로니아(Aronia melanocarpa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 아로니아 추출물은 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대해서 0.0001-30.0 중량% 로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 아로니아 추출물은 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용한 용매 추출법, (b) 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 화장 방법.