KR20200013304A - 마늘뿌리 추출물을 포함하는 항노화용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마늘(Allium sativum L.) 뿌리 추출물을 함유하는 피부노화 방지를 위한 조성물에 관한 것으로, 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 총 페놀함량이 높으며, DPPH 및 ABTS 자유 라디칼 소거활성이 우수하고 콜라게나제 및 엘라스타제 저해활성이 우수할 뿐만 아니라 콜라겐 생합성 효과 및 상처치유 효과를 가짐으로써 피부노화 개선 및 예방을 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 마늘뿌리 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 마늘(Allium sativum L.) 뿌리 추출물을 함유하는 항노화용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선 및 예방을 위한 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 관한 것이다.
노화의 원인으로써 반응성 산화종(reactive oxygen species, ROS)을 들 수 있는데 세포 및 조직에서 생성되어 생체 내에 존재하는 수퍼옥사이드 디스티무타제(superoxide distimutase, SOD), 퍼옥시다제(peroxidase), 카탈라제(catalase) 등에 의해 대부분 소멸된다. 그러나 ROS가 제대로 제거되지 않을 경우 자유 라디칼(free radical)로 인한 산화적 스트레스를 받게 되므로 생체는 노화를 비롯한 각종 질병이 유발되기도 한다. 또한, 광노화의 주요인자인 자외선에 의해서도 ROS가 생성되는데, 이는 콜라겐 감소, 엘라스틴 변성, 단백질 산화 등을 유발하거나, 세포외기질(extracellular martix)의 주요 구성성분인 콜라겐(collagen)은 섬유아세포에 의해 합성되며, 피부의 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착, 세포 분할과 분화유도 등의 역할을 한다.
피부에 높은 농도로 존재하는 콜라겐은 트립신과 같은 단백질 분해효소의 작용은 받지 않으나 콜라게나제(collagenase)에 의해 분해된다.
광노화로 인한 피부 주름은 진피의 콜라겐을 포함한 결합 조직 성분을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테나제(matrix metalloproteinases, MMPs)의 활성이 증가하여 피부 조직 내의 콜라겐 함량이 저하되기 때문이며, 자외선 조사량이 증가할수록 MMPs의 활성이증가하는 것으로 보고되어 있다
특히, 많은 양의 자외선에 노출이 되어 발생하는 광노화는 높은 농도의 ROS의 생성이 원인이 된다. 피부는 ROS에 대한 체내 방어 체계가 발달되어 있지만 계속된 활성산소 영향은 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어체계를 붕괴시킨다.
결과적으로 증가된 활성산소는 지질 과산화 반응을 개시하며, 단백질 및 DNA의 산화뿐만 아니라 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합을 유발시킨다. 콜라겐은 피부 진피층에서 매트릭스를 이루는 주성분으로 피부의 강도와 장력을 부여하여 외부의 자극으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 따라서 콜라겐의 분해는 피부의 노화와 밀접한 관련이 있어 탄력 저하, 색소 침착, 주름생성 등의 피부질환의 원인이 된다.
또한, 엘라스틴(elastin) 섬유는 콜라겐과 가교 결합을 형성하며 피부 탄력에 관여하고 있는 주름 생성에 중요한 피부 구성성분이다. 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스틴 분해 효소인 엘라스타제(elastase)의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름생성 요인 중의 하나로 밝혀지고 있다. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해할 수 있는 유일한 효소로서 이에 대한 저해는 피부 주름 개선을 근본적으로 줄여줄 수 있다고 알려져 있다.
힌편, 마늘(Allium sativum L.)은 백합과의 파속에 속하는 식물로서 식품의 맛과 건강을 증신시키는 대표적인 식품 중 하나이다. 마늘은 세계에서 우리나라가 가장 많은 양을 소비하는 우리나라의 대표적인 향신료로 국내 전체 농가의 약 1/3이 마늘을 재배하고 있으며 1년에 약 300,000톤이 재배되는 농가의 주력 상품이다. 마늘에는 체내 신진대사를 촉진시키는 스코르디닌(scordinine), 항암 및 혈전 생성의 예방효과가 있는 아조엔(ajoene) 등이 있으며 마늘의 주요 생리활성으로는 항균, 항암, 항바이러스, 항산화, 면역 증강, 항응고 기능과 관련해서 성인병 예방, 간기능 회복, 피부 미용, 혈당 감소, 고지혈증 및 동맥경화증 개선 등이 보고되고 있다. 마늘은 강력한 항산화 효과로 인해 혈액 순환을 촉진하고 피부의 탄력성을 부여하는 기능이 있어 기능성 화장품 소재로의 가능성을 보이고 있다. 마늘의 효능을 나타내는 주요 성분은 황화합물들로 알려져 있고(Ariga & Seki, 2006), 마늘의 생리적 활성은 식물체 내에서 불활성인 전구체로부터 세포가 파괴되면서 효소적으로 생성된 알리신(allicin) 때문이며, 이러한 알리신은 생리활성이 잘 알려진 성분이다.
최근 이러한 마늘의 다양한 생리활성이 보고되면서 마늘에 대한 관심이 고조되고 있으며 마늘 소비가 급증하고 있다. 그러나 마늘의 기능성에 대한 연구는 주로 생마늘 또는 흑마늘 위주로 이루어져 조리시 폐기되는 마늘뿌리의 가치를 확인함으로써 마늘뿌리의 기능성 원료의 방안을 제시하고자 한다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항노화 효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 개선을 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 마늘뿌리 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항노화"는 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 항산화, 모공 수축 또는 축소, 피부 보호, 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 콜라게나제 및 알라스타제 저해활성능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념일 수 있으며, 특히 본 명세서에서는 항산화, 콜라게나제 및 알라스타제 저해활성능, 및 콜라겐 생합성 촉진을 통한 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진능을 가지는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
본 발명의 마늘뿌리 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 마늘뿌리 추출물은 음건한 마늘뿌리를 분쇄한 후 추출용매, 예컨대 물, 탄소수 1~3개의 무수 또는 함수 저급 알콜 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 용매를 추출용매로 사용하여 추출할 수 있으며, 상기 추출 용매의 양은 생약 건조 중량의 2 내지 25 중량배, 바람직하게는 5 내지 18 중량배로 할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시태양에서는, 마늘뿌리 추출물은 에탄올을 사용하여 실온에서 20 내지 30시간 동안 추출한 다음, 여과지로 여과하여 마늘뿌리 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 마늘뿌리 추출물이 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.005 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 이 때 마늘뿌리 추출물의 함량이 0.005 중량% 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 항노화 효과를 수득할 수 없으며, 50 중량%를 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 총 페놀함량이 높으며, DPPH 및 ABTS 자유 라디칼 소거활성이 우수하고 콜라게나제 및 엘라스타제 저해활성이 우수할 뿐만 아니라 콜라겐 생합성 효과 및 상처치유 효과를 가짐으로써 피부노화 개선 및 예방을 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 마늘뿌리 추출물을 함유하는 조성물은 항노화 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 마늘뿌리 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따른 약학적 조성물은 마늘뿌리 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 마늘뿌리 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 마늘뿌리 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 총 페놀함량이 높으며, DPPH 및 ABTS 자유 라디칼 소거활성이 우수하고 콜라게나제 및 엘라스타제 저해활성이 우수할 뿐만 아니라 콜라겐 생합성 효과 및 상처치유 효과를 가짐으로써 피부노화 개선 및 예방을 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 마늘뿌리 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 총 페놀함량이 높으며, DPPH 및 ABTS 자유 라디칼 소거활성이 우수하고 콜라게나제 및 엘라스타제 저해활성이 우수할 뿐만 아니라 콜라겐 생합성 효과 및 상처치유 효과를 가짐으로써 피부노화 개선 및 예방을 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 마늘뿌리 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 마늘뿌리와 마늘껍질의 DPPH 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 마늘뿌리와 마늘껍질의 ABTS+ 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 마늘뿌리와 마늘껍질의 콜라게나제 저해효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마늘뿌리와 마늘껍질의 엘라스타제 저해효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 마늘뿌리 추출물의 HS-68 cell에서의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물의 HS-68 cell에서의 콜라겐 합성률을 측정한 결과이다.
도 7은 마늘뿌리의 80% 에탄올 추출물의 HS-68 cell에서의 콜라겐 합성률을 측정한 결과이다.
도 8은 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물의 상처치유 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마늘뿌리의 80% 에탄올 추출물의 상처치유 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 마늘뿌리와 마늘껍질의 ABTS+ 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 마늘뿌리와 마늘껍질의 콜라게나제 저해효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마늘뿌리와 마늘껍질의 엘라스타제 저해효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 마늘뿌리 추출물의 HS-68 cell에서의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물의 HS-68 cell에서의 콜라겐 합성률을 측정한 결과이다.
도 7은 마늘뿌리의 80% 에탄올 추출물의 HS-68 cell에서의 콜라겐 합성률을 측정한 결과이다.
도 8은 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물의 상처치유 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마늘뿌리의 80% 에탄올 추출물의 상처치유 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 마늘뿌리 추출물 제조
마늘뿌리와 껍질은 경상북도 의성 지역에서 생산된 마늘을 지역 농협에서 시판 중인 것을 구입하여 사용하였다. 마늘뿌리 추출물은 마늘뿌리 각 100g에 16배의 50% 및 80% 에탄올을 각각 가하고, 마늘껍질 추출물은 마늘껍질 각 100g에 8배의 50% 및 80% 에탄올을 각각 가하여 실온에서 24시간씩 2회 반복하여 추출한 후 추출액을 여과지(No. 20 filter paper, Hyundai micro Co., Ltd., Korea)로 여과, 농축 및 동결건조하여 분말화하였다. 마늘뿌리 50% 에탄올 추출물의 수율은 9.24%이었고, 80% 에탄올 추출물의 수율은 7.67%이었으며, 마늘껍질 50% 에탄올 추출물의 수율은 2.47%이었고, 80% 에탄올 추출물의 수율은 2.48%이었다. 각각의 추출물은 4℃ 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
<시험예 1> 총 폴리페놀(total polyphenol, TPC) 함량 측정
총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법으로 측정하였으며, 시료를 1%로 증류수에 희석한 다음 200 μL Folin-Ciocalteu reagent를 첨가하여 잘 혼합한 후 3분간 실온에 방치하였다. 3분 후 Na2CO3 포화용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 mL로 만든 후 실온에서 1시간 방치하고, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 총 폴리페놀 화합물은 탄닌산(tannic acid)을 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
플라보노이드는 페닐기 2개가 C3사슬을 매개하여 결합한 형태로 C6-C3-C6의 탄소 골격구조로 되어있다. 담황색 또는 노란색을 띄는 폴리페놀 화합물로서 야채, 과일, 종실류 등 식물계에 널리 분포되어있다.
탄닌산을 지표물질로 하여 작성한 표준곡선에 의해 마늘부산물의 폴리페놀 함량을 측정하였다. R50은 232.73mg/g, R80은 237.35mg/g, GP50은 380.59mg/g, GP80은 361.23mg/g으로 마늘뿌리 추출물이 마늘껍질 추출물보다 폴리페놀 함량이 더 높은 것으로 나타났다. Shin 등이 보고한 마늘 육질과 껍질의 건문 및 에탄올 추출물 분말에 함유된 폴리페놀과 비교시 마늘뿌리에 가장 많은 폴리페놀이 함유되어있음을 확인하였으며, 마늘부산물의 재활용 가능성을 제시하는 결과이다.
<시험예 2> 항산화 활성 측정
시료의 항산화 활성을 검증하기 위하여 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 측정을 수행하였다.
(1) 1,1-다이페닐-2-피크릴하이드라질 (DPPH) 라디칼 소거능 측정
전자공여능(EDA: electron donating ability)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 100 ul에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) 50 ul 가하고 차광 상태에서 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH를 이용한 항산화 활성은 안정된 자유 라디칼을 갖는 주로 페놀성 구조와 방향족 아민 화합물에서 많이 사용되는 방법으로 보라색의 DPPH가 환원되어 탈색되는 특성을 이용하여 항산화 활성을 측정할 수 있는 방법으로(Blois, 1958), 생체 내 활성 라디칼에 의한 노화 저해효과를 측정할 수 있는 기준으로도 활용될 수 있다.
도 1은 마늘뿌리와 마늘껍질의 DPPH 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 R50: 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물, R80: 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물, GP50：마늘껍질의 50% 에탄올 추출물, GP80: 마늘껍질의 80% 에탄올 추출물80%, BHA: 부틸화 하이드록시 아니솔(Butylated hydroxy anisol)이다. 도 1에서 보듯이, 마늘부산물인 뿌리와 껍질의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 500 mg/L 농도에서 R50, R80, GP50 및 GP80 추출물은 각 61.27%, 67.25%, 33.17% 및 55.91%로 나타났으며, 이로부터 마늘뿌리 추출물이 마늘껍질의 효능에 비해 우수함을 알 수 있다.
<시험예 2> ABTS+ 라디칼 양이온 소거작용 측정
ABTS+ 라디칼 양이온 소거작용 측정은 Roberta 등의 방법으로 측정하였다. 이 실험에서, ABTS+ 라디칼 양이온은 7 mM ABTS와 2.4 mM 과황화칼륨(K2S2O8)을 1:1로 혼합하여 암실에서 실온으로 24시간 동안 반응하였다. 사용 전에 ABTS+ 용액을 에탄올에 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.706 ㅁ 0.001이 되게 하여 사용하였다.
ABTS 라디칼 소거 활성법은 in vitro 및 in vivo 항산화능을 측정하기 위한 방법으로 널리 이용되고 있다. ABTS를 퍼옥시다제, H2O2와 반응시켜 활성 양이온인 ABTS 자유 라디칼이 형성되면 추출물의 항산화력에 의해 ABTS 자유 라디칼이 소거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는데 이를 흡광도 수치로 나타내어 추출물의 항산화 활성을 평가할 수 있다.
도 2는 마늘뿌리와 마늘껍질의 ABTS+ 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, ABTS+ 라디칼 소거능 측정결과 10, 100, 500, 1000 mg/L로 농도가 높아질수록 유의적으로 활성이 증가하였으며, 100 mg/L 농도에서 R50, R80, GP50, GP80 추출물은 각 27.52%, 52.20%, 76.22%, 61.61%로 나타났으며 G50의 경우 500mg/L의 농도에서는 대조군인 BHA와 유사한 활성도를 나타내었다.
<시험예 3> 콜라게나제(Collagenase) 저해활성 측정
콜라게나제 저해활성 측정은 W㎻nsch 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여, 4-페닐아조벤질옥시카보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3mg/ml)를 녹인 기질액 0.25 ml 및 시료용액 0.1 ml의 혼합액에 콜라게나제 (0.2mg/ml) 0.15 ml를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% 시트릭산 0.5 ml을 넣어 반응을 정지시킨 후, 에틸 아세테이트 1.5 ml을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
자외선 및 활성산소 등에 의해 유발되는 피부 진피층에 존재하는 메트릭스-메탈로프로테나제 (MMPs)는 피부노화, 특히 주름생성과 밀접한 관계가 있다. MMPs를 이루는 주요성분으로 콜라게나제, 젤라티나제 및 엘라스타제 등이 있으며, 피부의 탄력감소 및 주름생성에 있어서 엘라스타제 및 콜라게나제의 활성 감소는 매우 중요하다.
피부 진피의 노화가 진행되면 콜라겐 양이 현저하게 감소되며, 콜라겐을 분해하는 콜라게나제의 발현이 더욱 증가되어 피부 탄력 저하를 야기시켜 피부의 주름과 피부 처짐의 원인이 된다.
도 3은 마늘뿌리와 마늘껍질의 콜라게나제 저해효과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 마늘부산물인 뿌리와 껍질의 농도별 추출물을 이용하여 피부의 주름과 처짐을 유발하는 콜라게나제 저해효과를 측정한 결과 500 mg/L 농도에서 R50, R80, GP50, GP80 추출물은 각 39.12%, 56.41%, 11.88%, 8.39%로 나타났으며, 마늘뿌리 추출물은 농도에 따라 유의하게 저해 효과가 증가하는 것으로 나타났으며, 마늘뿌리 추출물이 가지는 콜라게나제 저해력을 이용한 주름개선을 위한 화장품 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
<시험예 4> 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정
엘라스타제 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법으로 측정하였다. 0.4 M Tris-HCl 완충액 (pH 8.6)을 50 ul, 농도별 추출물을 50 ul, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 0.6 U/ml이 되도록 희석한 효소 (ex-porcine pancreas)을 50 ul을 넣고 37℃ 에서 30분간 반응시킨 후 기질 (methoxysuccinyl-L-Ala-L-Val-5-nitroanilide)을 100 ul를 넣은 후 37℃에서 30분간 반응시킨 후 다시 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.
엘라스틴은 진피 내 피부 탄력을 유지하는데 중요한 단백질이며 피부의 결합조직에 존재하여 조직의 신축성, 유연성에 크게 관여하고 있다. 엘라스타제는 이러한 엘라스틴을 분해하는 효소이며 피부가 처지고 주름이 생기는 등의 피부노화를 발생시키는 원인중 하나이다. 따라서 엘라스타제 저해제는 피부 주름개선을 통한 노화를 방지하는 작용을 하게 되는데 마늘부산물의 엘라스타제 저해 활성 효과를 측정하였다.
도 4는 마늘뿌리와 마늘껍질의 엘라스타제 저해효과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 마늘부산물의 실험농도구간에서 15%미만의 엘라스타제 저해활성을 나타내어 마늘부산물의 엘라스타제 저해활성을 미미한 것으로 판단되었다.
<시험에 5> MTT 분석에 의한 세포 생존률 측정
(1) 세포 배양
본 실험에 이용한 HS-68 cell(Human skin fibroblast, ATCC: CRL-1635)은 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(100 unit/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에 적응시켜 계대 배양하였다.
(2) MTT 분석에 의한 세포 생존률 측정
세포주 HS-68(Human skin fibroblast, ATCC: CRL-1635)을 96 웰 플레이트에 2.5 x 105 cells/well이 되도록 접종하고 96 웰 플레이트에 1 x 104 cells/well이 되도록 접종하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 48 h 동안 배양시켰다. 그 뒤에 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환하고 각 시료용액을 농도별로 처리한 뒤 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 h 동안 배양시켰다. 그 뒤에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액을 0.02 mL/well로 첨가하여 4 h 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 0.1 mL/well으로 첨가하여 실온에서 10 min 동안 반응 시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 계산하였다.
도 5는 마늘뿌리 추출물의 HS-68 cell에서의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, HS-68 cell에 마늘뿌리 추출물을 각각 4,000 ug/mL 농도에서 1:1 희석하여 최저 62.5 ug/mL 농도로 48 h 동안 처리한 결과 GR50은 2,000ug/mL, GR80은 250ug/mL 농도 까지 사용 가능한 것으로 나타났다. 이후의 항주름 세포 실험에서 세포에 안전하게 사용 가능한 마늘뿌리 추출물 최고 농도를 200μg/mL로 설정하였다.
<시험에 6> 콜라겐 타입-I 생합성 측정
HS-68 cell 2.5 x 105 cells/well 을 96 웰 플레이트에 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 H2O2를 500uM의 농도로 처리한 후 각 웰에 시료를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양한 세포의 배양액을 채취하여 인간 콜라겐 타입-I EIA Kit(EH7533, FineTest Biotech, Wuhan, China)를 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 진행하여 총 양을 측정하였다.
HS-68 cell에 콜라게나제 억제활성 측정결과 우수한 효능을 나타낸 마늘뿌리를 이용하여 c콜라겐 타입-I의 합성량을 평가하기 위해 Fine Test EIA kit를 이용하여 콜라겐 타입-I 생성량을 검출하였다.
도 6은 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물의 HS-68 cell에서의 콜라겐 합성률을 측정한 결과이다.
도 7은 마늘뿌리의 80% 에탄올 추출물의 HS-68 cell에서의 콜라겐 합성률을 측정한 결과이다.
도 6 및 도 7에서 보듯이, HS-68 cell에 H2O2 처리시 정상군에 비해 콜라겐 합성율은 5.34-9.15%의 생합성을 나타내었으며 마늘뿌리 추출물의 농도별 처리시 R50은 73.73%, 80.59%, 82.00%, R80은 72.20%, 106.79%, 118.21%로 생합성되는 것으로 나타내어 R80의 콜라겐 생합성 촉진효과가 가장 우수하였다.
<시험에 7> 세포 이동성 검사(Migration assay)
세포의 이동성은 장시간 세포관찰 분석시스템(IncucyteZOOMㄾ, Essen BioScience)을 이용하여 시행하였다. 인간 섬유아세포인 HS-68 세포주를 배양하고 2.5 x 105 cells/ml의 세포 수로 희석한 세포현탁액을 제조하였다. 이를 96-well ImageLock™ plate (Essen BioScience, No. 4379)에 well 당 100 ㅅL 세포현탁액을 분주한 뒤(25,000 cells/well) CO2 배양기(37 ℃, 5 % CO2)에 플레이트를 넣고 18 시간 배양하였다. 이후 WoundMaker™ (Essen BioScience)를 이용하여 플레이트 각 well의 모든 세포층에 균일하게 상처를 유발하고 배양액으로 2회 세척하였다.
피부조직이 손상을 입으면 시작되는 상처치유과정은 염증간계, 증식단계 및 재형성 단계로 나눌 수 있다. 상처 발생 시 처음 나타나는 염증 단계는 여러 화학주성물질(chemotactic factor) 과 혈소판유래성장인자 (platelet -derivedgrowth factor, PDGF), 형질전환성장인자 (transforming growth factor, TGF), 등의 성장인자들이 분비되며 혈관 수축, 혈소판 응고, 혈관 형성 등이 일어나 상처치유과정의 시작 단계 에서 주요 역할을 담당한다. 또한 상처생성 직후 혈관 손상에 의한 산소결핍도 성장인자들을 촉진하여 각질세포(keratinocyte)의 이동, 섬유 모세포(fibroblast)의 증식, 혈관신생을 유도한다.
증식단계에서는 피부 상피가 재건되는 재상피화(reepithelialization)와 혈관의 신생(angiogenesis)이 일어나 상처 부위의 조직이 강화된다. 세포 외 기질, 인테그린수용체, 성장인자 등에 의해 각질 세포의 이동 및 증식이 일어나며 재형성단계에서 총교원질이 증가하여 상처전의 피부로 돌아간다. 세포손상에 있어서 마늘뿌리 추출물의 세포이동성에 미치는 효과를 상처치유 분석(wound healing assay)을 이용하여 72시간동안 관찰하였다.
도 8은 마늘뿌리의 50% 에탄올 추출물의 상처치유 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마늘뿌리의 80% 에탄올 추출물의 상처치유 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9에서 보듯이, GR50, GR80 모두 관찰 10시간에 50%이상의 상처회복력을 나타내었으며 28시간에 100% 상처회복을 하였으며, 그 이후 시간에는 세포 밀도가 증가하기 시작하였다. GR50과 GR80을 비교시 GR80 처리군이 10.89% 더 빠르게 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (3)
- 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선 및 예방을 위한 화장료 조성물.
- 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선 및 치료를 위한 약학적 조성물.
- 마늘뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 개선 및 예방을 위한 식품 조성물.
Priority Applications (1)
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| KR1020180088316A KR20200013304A (ko) | 2018-07-30 | 2018-07-30 | 마늘뿌리 추출물을 포함하는 항노화용 조성물 |
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2018
- 2018-07-30 KR KR1020180088316A patent/KR20200013304A/ko not_active Application Discontinuation
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