KR102000688B1 - 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선을 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미성숙 사과(unripe apple) 추출물 및 바이칼린의 혼합물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린의 혼합물 유효성분으로 포함하는 조성물은 티로시나제, 엘라스타제 및 콜라겐아제 억제활성이 우수하여 피부 주름개선에 효과가 있으며, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 미성숙 사과(unripe apple) 추출물 및 바이칼린(baicalin)을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선을 위한 조성물에 관한 것이다.
근래 유럽, 미국, 일본 등의 선진국에서는 광우병의 발병으로 동물에서 유래한 화장품 소재들이 대부분 식물에서 유래한 소재로 급격히 대체되고 있다. 식물에서 유래한 소재로 올리브유, 야자유와 사포닌, 소맥배아유, 미강유 또는 인지질 등과 같은 계면활성성분; 아미노산, 단백질 또는 당류 등을 함유한 수용성 성분; 로즈메리 나뭇잎, 버드나무껍질 추출액, 나래지처뿌리, 꿀 또는 당근 등 다양한 천연물이 보습제, 피막형성제, 피부보호제, 립스틱, 향류 등으로 이용되고 있다.
최근에는 엘라스타제 및 매트릭스 메탈로프로테인아제-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)의 활성을 억제하는 소재, 히알루론산의 합성을 촉진하는 소재, 활성산소 제거능을 가진 소재 또는 각화세포 및 섬유아세포의 증식을 촉진하는 소재 등이 연구개발 중이거나 기능성 화장품의 원료로 사용되고 있으며, 여러 가지 형태의 천연소재를 첨가한 화장품이 쏟아져 나오고 있으나 그 효능에 대한 과학적, 체계적인 연구 및 검증이 미비한 실정이다.
천연자원 중 농산물의 가공부산물은 현재 대부분이 산업 폐기물로 분류되어 처리되어 이용되지 못하고 있는 실정이고, 그 중 사과는 경북지방 특산물로서 생산량이 연간 61만 톤으로 전체과일의 30%를 점유하고 있으나, 적과되는 사과는 이들 양의 약 4배에 연간 약 240만 톤이 폐기되고 있다.
한편, 미성숙 사과(unripe apple)는 성숙 사과에 비하여 다양한 생리활성을 나타내는 플라반-3-올(flavan-3-ol)계의 화합물을 다량으로 함유하고 있다고 알려져 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1065558호는 미숙사과의 추출물이 완숙사과에 비하여 활성성분 함량이 높고 피부미백효과가 우수하여 이를 피부상태 개선용 약제학적 조성물로 이용할 수 있음을 개시하고 있다. 따라서, 대량으로 폐기처분되고 있는 농산가공부산물의 효율적인 활용과 지역경제 활성화를 위하여 성숙한 사과보다 10배 이상의 폴리페놀을 함유하고 있는 미성숙 사과(적과된 사과)를 이용하여 피부미백, 항산화, 및 주름개선 효능 등의 기능성을 검증하여 기능성 바이오 소재를 개발할 경우, 고부가가치의 화장품 또는 약품을 생산할 수 있다.
또한, 바이칼린(baicalin)은 플라보노이드(flavonoid)의 일종으로 꿀풀과 식물인 코가네바나(Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리 등에 주로 함유되어 있으며, 항감염, 항알레르기, 항고혈압 등의 약리효과가 있다고 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 피부 주름개선 효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 미성숙 사과 추출물과 함께 바이칼린을 혼합하여 사용할 경우 세포 독성이 없으면서도 미성숙 사과 추출물만을 사용한 것에 비하여 피부 주름개선에 탁월한 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 피부 주름개선 효과를 가지면서 천연 소재로부터 유래한 세포 독성이 없는 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선을 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 용어“미성숙 사과”는 개화 수정 후 1주 내지 3주 후에 적과된 사과를 의미한다.
본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
본 발명의 미성숙 사과 추출물은 당분야에 공지된 통상적인 추출용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 이때, 상기 추출용매는 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 추출용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 추출용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
또한, 상기 미성숙 사과 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 미성숙 사과 추출물 또는 황금 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 미성숙 사과 추출물은 미성숙 사과를 분쇄한 후 추출용매, 예컨대 물, 탄소수 1~3개의 무수 또는 함수 저급 알콜 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 용매를 추출용매로 사용하여 추출할 수 있으며, 상기 추출 용매의 양은 미성숙 사과에 대해 2 내지 4의 부피비로 할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 미성숙 사과 추출물은 미성숙 사과를 분쇄한 후 2 내지 4배의 부피비로 60 내지 80 %인 에탄올(EtOH)을 첨가하여 실온에서 20 내지 30시간, 바람직하게는 22 내지 26시간 동안 침지추출한 후 회수하여, 여과지로 농축하여 미성숙 사과 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 “바이칼린”은 플라보노이드의 일종으로, 상기 바이칼린은 식물로부터 분리 정제되거나, 상업적으로 생산되거나, 또는 미생물에 의해 생성될 수 있다.
상기 바이칼린을 분리 정제하기 위한 식물은 꿀풀과 식물인 코가네바나(Scutellaria baicalensis Georgi)일 수 있으며, 바람직하게는 황금(Scutellaria baicalensis)일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 양태로, 상기 바이칼린은 꿀풀과 식물인 황금(Scutellaria baicalensis)의 뿌리로부터 추출한 것이다.
하나의 구체적 양태로, 바이칼린은 황금을 고르게 분쇄한 후 2 내지 4배의 부피비로 60 내지 80%인 에탄올을 가하여 상온에서 68 내지 76시간, 바람직하게는 70 내지 74시간, 보다 더 바람직하게는 72시간 동안 추출한 후 최종 추출물을 물(H2O)로 가용화 한 후 정제기에 통과 시켜 35 내지 45℃ 온도, 바람직하게는 40℃ 온도에서 진공 증발기(vacuum evaporator)를 활용하여 감압농축 한 후, 온도 변화를 활용하여 얻어진 분말로부터 결정화를 유도하여 고순도의 결정 바이칼린을 획득할 수 있다.
본 발명의 조성물은 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린 3 내지 10 중량부를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린 5 내지 7 중량부인 것이 바람직하다. 이때 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린이 3 중량부 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 피부 주름개선 효과를 현저하게 수득할 수 없으며, 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린이 10 중량부를 초과할 경우 함량의 증가에 따른 효과의 차이가 미미하다.
본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 포함하는 조성물은 피부 주름개선 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이, 에멀젼, 다중 에멀젼 및 액정 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 약학적 조성물은 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 식품 조성물에는 유효성분으로서 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 성숙 사과 추출물 및 바이칼린 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 주름개선에 우수한 효과가 있으며, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 대량으로 폐기되는 농산가공부산물을 활용하는 것으로 환경보존 뿐만 아니라 경제적인 측면에서도 유용하다.
도 1은 성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다.
도 2는 미성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다.
도 2는 미성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예
1: 미성숙 사과 추출물의 제조
본 실험에서 사용한 미성숙 사과는 2011년 5월에 경북 영천시 화북면 오산리 지역에서 얻어진 것으로 개화 수정 후 2주 후 적과된 미성숙 사과를 재료로 사용하였다.
미성숙 사과를 분쇄한 후 미성숙 사과 분쇄물의 3배의 부피비로 70%인 에탄올(EtOH)을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침지추출을 3회 반복한 후, 와트먼(Whatman) No. 1 여과지로 여과하였으며, 각 추출물은 감압농축기 (rotary vacuum evaporator)로 40℃이하에서 농축한 다음 동결건조 후 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다. 도 1은 성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다. 도 2는 미성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다.
제조예
2:
바이칼린의
제조
영천시 임고면에서 2010년 7월에 생산된 황금(Scutellaria baicalensis)을 고르게 분쇄하여 얻어진 분말에 에탄올(EtOH)을 가하여 상온에서 3일간 반복추출한 후 최종 추출물을 물(H2O)로 가용화 하고 정제기에 통과 시켜 40℃ 온도에서 진공 증발기(vacuum evaporator)를 활용하여 감압농축 한 후, 온도 변화를 활용하여 얻어진 분말로부터 결정화를 유도하여 고순도의 결정 바이칼린을 제조하였다.
실시예
1: 미성숙 사과 추출물 및
바이칼린의
혼합물 제조
상기 제조예 1에서 제조한 미성숙 사과 추출물 100 중량부에 상기 제조예 2에서 제조한 바이칼린 1, 3, 5, 7, 10 및 12 중량부를 첨가하여 혼합물을 제조하였다.
이하, 시료 1은 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 1 중량부의 혼합물, 시료 2는 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 3 중량부의 혼합물, 시료 3은 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 5 중량부의 혼합물, 시료 4는 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 7 중량부의 혼합물, 시료 5는 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 10 중량부의 혼합물, 시료 6은 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 12 중량부의 혼합물을 각각 의미한다.
시험예
1:
피부미백
효과 검증을 위한
티로시나제
저해 활성 측정
티로시나제(Tyrosinase)는 구리를 함유한 효소로서 멜라닌(melanin) 합성의 초기단계인 L-티로신(L-tyrosine)에서 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-3,4-dihydroxyphenylalanine: DOPA), DOPA에서 L-도파퀴논(L-dopaquinone)으로의 전이에 작용한다. 자외선에 의하여 멜라노사이트(melanocyte)의 유사분열이 일어나고 이어서 멜라노사이트가 활성화된다. 활성화된 멜라노사이트에서는 티로시나제 합성이 촉진되고 멜라닌이 생성되어 이를 표피 밖으로 운반 배출하게 되어 기미, 주근깨와 같은 색소침착이 일어나게 된다. 그러므로 티로신 활성 억제제는 피부 내에서의 멜라닌 폴리머 합성을 효과적으로 저해할 수 있어 피부 미백제의 개발에 있어서 티로시나제 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다. 따라서 티로시나제는 멜라닌 생합성 과정에서 중요한 역할을 하므로 티로시나제 억제제를 피부의 멜라닌 색소생성을 조절할 수 있는 물질로 사용할 수 있다.
티로시나제 저해활성 측정은 야기(Yagi) 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 1/15M 소듐 포스페이트 완충용액(sodium phosphate 완충용액, pH 6.8) 0.5mL에 10mM의 DOPA을 녹인 기질액 0.2mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 머쉬룸 티로시나제(mushroom tyrosinase, 110U/mL) 0.2mL 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA 크롬을 475nm 파장의 빛에서 측정하였다. 티로시나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 양성대조군으로 누룩산을 사용하여 비교 분석하였다.
하기 표 1은 미성숙 사과 70% 에탄올 추출액 100 중량부에 대해 바이칼린을 1, 3, 5, 7, 10 및 12 중량부의 농도로 혼합한 혼합물(시료 1 내지 6)의 티로시나제 저해활성을 측정한 것이다. 상기 시료의 바이칼린의 함량이 증가할수록 혼합물의 티로시나제 저해활성을 강하게 나타내는 경향을 확인할 수 있었다.
그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우(시료 1) 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 티로시나제 저해활성이 약하게 나타났고 10 중량부를 초과하는 경우(시료 6) 티로시나제 저해활성의 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다. 하기 표 1에서 누룩산은 양성대조구로 사용되었다.
| Samples | 저해활성 (%) | |||||
| 1000ug/mL | 500ug/mL | 250ug/mL | 125ug/mL | 62.5ug/mL | 31.3ug/mL | |
| 미성숙 사과 70% EtOH ext. 100 중량부 | 15.9 | 13.5 | 8.4 | 6.3 | 4.0 | 1.2 |
| 시료 1 | 13.7 | 10.7 | 6.1 | 0.7 | 0.6 | 0.0 |
| 시료 2 | 17.4 | 14.1 | 9.4 | 6.9 | 4.2 | 1.4 |
| 시료 3 | 21.7 | 16.8 | 12.1 | 8.7 | 6.5 | 4.7 |
| 시료 4 | 25.5 | 18.7 | 15.8 | 12.4 | 8.1 | 6.1 |
| 시료 5 | 29.3 | 20.5 | 19.3 | 14.5 | 10.0 | 7.8 |
| 시료 6 | 30.1 | 21.0 | 19.6 | 14.7 | 10.2 | 7.9 |
| 누룩산(Kojic acid) | 94.4 | 84.8 | 70.5 | 50.7 | 31.7 | 12.7 |
시험예
2: 항산화 효과 검증
(1) DPPH 라디칼 소거능 측정
전자공여능 측정에 사용된 DPPH는 화학적으로 안정화된 자유 라디칼(free radical)을 가지고 있는 물질로 유기용매에 매우 안정하며 515~520nm 부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색 화합물이다. 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼이 소멸되고 탈색이 되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있어 다양 한 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있는데, 이는 DPPH로 먼저 산화를 개시한 후 각 시료에 의해서 자유 라디칼에 대한 소거 활성 능력을 흡광도로 측정하여 확인한다. 자유 라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크면 높은 라디칼에 대한 소거 활성을 기대할 수 있으며, 이는 인체 내에서 자유 라디칼에 의한 노화를 억제하는 척도로도 이용할 수 있다.
전자공여능(EDA: electron donating ability)은 블로이스(Blois)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 2mL에 0.2mM의 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl: DPPH) 1mL를 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
상기 방법에 따라 미성숙 사과의 추출물과 시료 1 내지 6의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 소거활성을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
하기 표 2의 IC50 값은 반응이 시작 후 10분이 경과한 시점에서 DPPH가 50% 감소되도록 하기 위한 농도 값을 의미하며, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 시료 1의 IC50 값이 가장 높은 것으로 측정되었으며, 시료 6의 IC50 값이 가장 낮게 측정되었다. 따라서, 미성숙 사과 추출액에 대한 바이칼린 함량이 증가할수록 항산화 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우(시료 1) 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 IC50 값이 높게 나타나 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 황산화 효과가 낮은 것을 알 수 있었고, 10 중량부를 초과하는 경우(시료 6) 시료 5의 IC50 값과의 차이가 미미하여 바이칼린 함량의 증가에 따른 황산화 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다. 하기 표 2에서 (+)-Catechin는 양성대조구로 사용되었다.
| Sample | IC50 (ug/mL) |
| 미성숙 사과 70% EtOH ext. | 115.4 ± 6.4 |
| 시료 1 | 117.5 ± 5.4 |
| 시료 2 | 78.9 ± 3.1 |
| 시료 3 | 64.8 ± 4.3 |
| 시료 4 | 51.2 ± 1.9 |
| 시료 5 | 49.7 ± 2.1 |
| 시료 6 | 49.5 ± 2.2 |
| (+)-Catechin | 4.6 ± 0.3 |
(2) ABTS 라디칼 소거활성 측정
DPPH 라디칼의 소거활성과 같이 일반적으로 많이 사용되는 ABTS 라티칼 양이온 소거능은 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디암모늄염(ABTS)과 포타슘 퍼설페이트와의 반응으로 ABTS+·라디칼이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 시료를 첨가함에 따라 연한녹색으로 변색되는 것을 측정하는 방법이며, 수소-주개 항산화제(hydrogen-donating antioxidant)와 사슬 절단 항산화제(chain breaking antioxidant) 모두를 측정할 수 있다.
ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ 캐타이언 디칼라리제이션 어세이(ABTS+ cation decolorization assay) 방법(Roberta, et al., 1999)에 의하여 측정하였다. 7 mM 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)과 2.4 mM 포타슘 퍼설페이트를 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 ABTS+100 ul에 시료 100 ul를 가하여 1분 동안 방치한 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 방법에 따라 미성숙 사과의 추출물과 시료 1 내지 6의 항산화 효과를 알아보기 위해 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3의 IC50 값은 반응이 시작 후 6분이 경과한 시점에서 ABTS가 50% 감소되도록 하기 위한 농도 값을 의미하며, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 시료 1의 IC50 값이 가장 높은 것으로 측정되었으며, 시료 6의 IC50 값이 가장 낮게 측정되었다. 따라서, 미성숙 사과 추출액에 대한 바이칼린 함량이 증가할수록 항산화 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우(시료 1) 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 IC50 값이 높게 나타나 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 황산화 효과가 낮은 것을 확인할 수 있었고, 10 중량부를 초과하는 경우(시료 6) 시료 5의 IC50 값과의 차이가 미미하여 바이칼린 함량의 증가에 따른 황산화 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다. 하기 표 2에서 (+)-Catechin는 양성대조구로 사용되었다.
| Sample | IC50 (ug/mL) |
| 미성숙 사과 70% EtOH ext. | 45.4 ± 2.3 |
| 시료 1 | 47.7 ± 2.8 |
| 시료 2 | 41.5 ± 1.6 |
| 시료 3 | 34.3 ± 1.5 |
| 시료 4 | 30.8 ± 2.1 |
| 시료 5 | 28.3 ± 1.5 |
| 시료 6 | 28.1 ± 1.4 |
| (+)-Catechin | 1.34 ± 0.2 |
시험예
3: 주름개선 효과 검증
(1) 엘라스타제(Elastase) 저해 활성 측정
인체의 중성구 과립구내 존재하는 엘라스타제는 진피 내 피부탄력을 유지하는 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서 엘라스타제 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우르솔산(ursolic acid) 등이 엘라스타제 저해제로 이용되고 있다. 또한 체내의 엘라스틴을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 그 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실을 유발한다.
포르신 판크레아즈 엘라스타제(Porcine pancreas elastase)저해 활성 측정은 기질로서 N-석시닐-(L-알라닌)3-p-니트로아닐라이드를 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켜 생성된 p-니트로알라이드의 양을 405nm 파장의 빛에서 측정하였다. 즉, 각 시험액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5mL씩 시험관에 취하고 50mM tris-HCl 완충용액(pH 8.6)에 녹인 엘라스타제(2.5U/mL)용액 0.5mL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl 완충용액(pH 8.6)에 녹인 N-석시닐-(L-알라닌)3-p-니트로아닐라이드(0.5mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다.
미성숙 사과 70% 에탄올 추출액과 시료 1 내지 6에 대한 상기 실험 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 우르솔산은 양성대조구로 사용되었다.
실험 결과, 상기 혼합물은 바이칼린의 함량이 증가할수록 혼합물의 엘라스타제 저해활성을 강하게 나타내는 경향을 확인할 수 있었다. 그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 엘라스타제 저해활성이 약하게 나타났고 10 중량부를 초과하는 경우 바이칼린 함량의 증가에 따른 엘라스타제 저해활성의 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다.
| Sample No. | 저해활성 (%) | |||||
| 1000ug/mL | 500ug/mL | 250ug/mL | 125ug/mL | 62.5ug/mL | 31.3ug/mL | |
| 미성숙 사과 70% EtOH ext. 100 중량부 | 63.1 | 56.2 | 52.2 | 30.3 | 12.0 | 0.0 |
| 시료 1 | 56.1 | 49.5 | 49.2 | 41.7 | 4.6 | 0.0 |
| 시료 2 | 65.0 | 57.8 | 52.8 | 30.5 | 15.5 | 0.0 |
| 시료 3 | 67.0 | 59.8 | 54.6 | 37.9 | 22.3 | 1.4 |
| 시료 4 | 69.5 | 60.6 | 56.2 | 45.5 | 27.2 | 1.8 |
| 시료 5 | 71.2 | 65.1 | 58.8 | 49.1 | 31.1 | 2.0 |
| 시료 6 | 71.5 | 65.5 | 59.0 | 49.2 | 31.1 | 1.9 |
| 우르솔산(ursolic acid) | 76.1 | 71.3 | 66.4 | 62.8 | 30.2 | 6.5 |
(2) 콜라겐아제(Collagenase) 저해 활성 측정
세포외기질의 주요 구성성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서의 생성되는 주요 기질 단백질이다. 또한 생체 단백질 총중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나성구조를 가지고 있다. 콜라겐은 피부, 건, 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부의 진피에 그 포함량이 높다. 콜라겐의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성 과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한 콜라겐은 트립신 등의 단백질 분해효소의 작용을 받지 않으나, 콜라겐아제에 의해 분해된다고 보고가 있다.
콜라겐아제 저해활성 측정은 분쉬(Wnsch) 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1M tris-HCl (pH 7.5)에 4mM CaCl2를 첨가하여, 4-페닐아조벤질오시카보닐 l-프롤린-류신-글리신-프롤린-D-아르기닌(0.3mg/mL)을 녹인 기질액 0.25mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 콜라겐아제 (0.2mg/mL) 0.15mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% 시트릭산(citric acid) 0.5mL을 넣어 반응을 정지시킨 다음, 에틸 아세테이트 1.5mL을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라겐아제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
미성숙 사과 70% 에탄올 추출액과 시료 1 내지 6에 대한 상기 실험 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)는 양성대조구로 사용되었다.
실험 결과, 상기 혼합물은 바이칼린의 함량이 증가할수록 혼합물의 콜라겐아제 저해활성을 강하게 나타내는 경향을 확인할 수 있었다. 그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 콜라겐아제 저해활성이 약하게 나타났고 10 중량부를 초과하는 경우 바이칼린 함량의 증가에 따른 콜라겐아제 저해활성의 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다.
| Sample No. | 저해활성 (%) | ||||
| 1000 ug/mL | 500 ug/mL | 250 ug/mL | 1255 ug/mL | 62.5 ug/mL | |
| 미성숙 사과 70% EtOH ext. 100 중량부 | 54.6 | 35.9 | 29.0 | 20.4 | .2 |
| 시료 1 | 54.5 | 36.0 | 28.4 | 19.9 | 15.0 |
| 시료 2 | 57.3 | 53.1 | 48.3 | 32.6 | 17.8 |
| 시료 3 | 68.2 | 60.7 | 52.8 | 36.5 | 22.3 |
| 시료 4 | 82.9 | 78.2 | 72.0 | 61.3 | 28.0 |
| 시료 5 | 93.3 | 88.0 | 79.7 | 69.8 | 44.0 |
| 시료 6 | 93.4 | 88.2 | 79.6 | 69.8 | 44.1 |
| EGCG | 87.4 | 87.5 | 83.5 | 81.0 | 61.9 |
Claims (4)
- 미성숙 사과 추출물 100 중량부를 기준으로 바이칼린을 3 내지 10 중량부로 포함하는 피부 주름개선을 위한 화장료 조성물.
- 삭제
- 미성숙 사과 추출물 100 중량부를 기준으로 바이칼린을 3 내지 10 중량부로 포함하는 피부 주름개선을 위한 식품 조성물.
- 삭제
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020180091496A KR102000688B1 (ko) | 2018-08-06 | 2018-08-06 | 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선을 위한 조성물 |
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