WO2018105803A1 - 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증을 위한 조성물 - Google Patents

미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증을 위한 조성물 Download PDF

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composition
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inflammatory
skin whitening
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김진철
박종국
정용하
전동하
천정윤
박상미
정다운
한협우
김명준
박동우
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(주)튜링겐코리아
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a composition containing an unripe apple extract and baicalin, more specifically skin whitening, antioxidant, wrinkle improvement, antibacterial and A composition for anti-inflammatory.
  • Plant-derived materials such as olive oil, palm oil and saponins, wheat germ oil, rice bran oil or phospholipids; Water-soluble components containing amino acids, proteins or sugars;
  • Various natural products such as rosemary leaves, willow bark extracts, rapeseed roots, honey or carrots, are used as moisturizers, film formers, skin protectants, lipsticks, and perfumes.
  • melanin is a skin pigment factor, which is produced against skin damage caused by UV rays, and protects the skin.Melanin production begins with oxidation of tyrosine by tyrosinase, which causes DOPA and DOPA chrome (chrome). ) Is produced through DHICA and DHI, and until now, three species such as DHI-eu melanin, DHICA-eu melanin, and pheomelanin are known to be produced.
  • Nitric Oxide which is a part of reactive oxygen species, is detrimental to the function of the antioxidant system in the situation where the function of the antioxidant system is deteriorated, causing inflammation and other diseases.
  • NO is a highly toxic, unstable gas, one of the free radicals that causes cellular damage to cells at high concentrations, which in turn causes various normal cells to cause inflammation, tissue damage, genetic variation, and nerve damage. Cause back.
  • the inflammatory response is a mechanism for repairing and repairing the damaged area when an invasion that causes any organic change in the living body or tissue, such as a physical action, chemical substance, or bacterial infection, is applied.
  • Vascularly active substances such as serotonin, bradykinin, prostagridin and leukotriene are released to increase inflammation and cause vascular permeability.
  • Macrophages play an important role in bioprotection early in infection by producing nitric oxide and cytokines during inflammatory reactions.
  • Lipopolysaccharides well known as endotoxins, are present in the outer membrane of Gram-negative bacteria and are known to increase inflammatory cytokines in microphage or monocytes, such as RAW 264.7.
  • the formation of such inflammatory mediators leads to a process of converting arachidonic acid to frostgladin and NO formation due to the activity of phospholipase A2.
  • excess NO and prostaglandin E 2 (PEG 2 ) such as inflammatory factors are formed by iNOS and COX-2.
  • NO has various physiological functions such as body defense function, signal transduction function, neurotoxicity, and vasodilation.
  • Normal NO formation plays an important role in killing bacteria or removing tumors, but NO produced by iNOS in inflammatory conditions not only promotes inflammatory responses such as vascular permeability and edema, but also promotes biosynthesis of inflammatory mediators. It is known to deepen it.
  • unripe apple unripe apple
  • flavan-3-ol flavan-3-ol
  • Korean Patent No. 10-1065558 No. discloses that the extract of the unripe fruit family can be used as a pharmaceutical composition for improving the skin condition because the content of the active ingredient is higher than that of the ripe fruit fruit and the skin whitening effect is excellent.
  • baicalin is a type of flavonoid (flavonoid) that is a plant of the plant Lamiaceae Scutellaria ( Scutellaria) baicalensis It is mainly contained in the root of Georgi ), and is known to have pharmacological effects such as anti-infection, anti-allergic, antihypertensive and the like.
  • the present inventors have continued to develop natural substances having the effect of improving the skin condition and less side effects to the human body, and when immature apple extract is used with a mixture of baikal and immature apple extract without cytotoxicity
  • the present invention has been completed by discovering that it has an excellent effect on skin whitening, antioxidant, anti-wrinkle, antibacterial and anti-inflammatory compared to the use.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a material having excellent human stability without skin toxicity derived from natural materials while having skin whitening, antioxidant, wrinkle improvement, antibacterial and anti-inflammatory effects.
  • the present invention provides a composition for improving skin conditions having antioxidant, skin whitening, anti-wrinkle, antibacterial and anti-inflammatory effects, including immature apple extract and Baikalin as an active ingredient.
  • the composition comprising immature apple extract and Baikal in the present invention may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition or a food composition.
  • mature apple of the present invention means apples that have been loaded 1 to 3 weeks after flowering fertilization.
  • the immature apple extract of the present invention can be extracted using a conventional extraction solvent known in the art, the extracted liquid can be used in liquid form or concentrated and / or dried.
  • the extraction solvent is, for example, (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, propanol, butanol, etc.), (c) mixing the lower alcohol with water A solvent, (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform or (g) 1,3-butylene glycol can be obtained as an extraction solvent.
  • the extraction is performed using methanol, ethanol or butane.
  • the extraction degree and loss degree of the active ingredient of the extract may vary, so select an appropriate extraction solvent.
  • the extraction method is not particularly limited, and examples thereof include cold needle extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, and the like.
  • the immature apple extract can be obtained through a conventional purification process in addition to the extraction method by the extraction solvent. Obtained by various additional purification methods, such as separation using an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity). Immature apple extract can also be obtained through the fraction.
  • the immature apple extract is pulverized immature apple and then extracted with a solvent selected from the group consisting of an extraction solvent, such as water, anhydrous or hydrous lower alcohols having 1 to 3 carbon atoms and mixed solvents thereof. It can be extracted using, the amount of the extraction solvent may be in a volume ratio of 2 to 4 relative to the immature apple.
  • an extraction solvent such as water, anhydrous or hydrous lower alcohols having 1 to 3 carbon atoms and mixed solvents thereof. It can be extracted using, the amount of the extraction solvent may be in a volume ratio of 2 to 4 relative to the immature apple.
  • the immature apple extract is ground to 20 to 30 hours, preferably 22 to 20 hours at room temperature by adding 60 to 80% of ethanol (EtOH) in a volume ratio of 2 to 4 times after grinding the immature apple After immersion extraction for 26 hours and recovered, it can be concentrated by filter paper to obtain an immature apple extract.
  • EtOH ethanol
  • Boicalin of the present invention is a kind of flavonoids, which may be isolated and purified from plants, commercially produced, or produced by microorganisms.
  • the plant for isolating and purifying the Baikallin is Lamiaceae plant Koganevana ( Scutellaria baicalensis) Georgi ), preferably Scutellaria baicalensis .
  • the Baikal is extracted from the root of Lamiaceae plant ( Scutellaria baicalensis ).
  • Baikal is 68 to 76 hours, preferably 70 to 74 hours, even more preferably at room temperature by crushing the gold evenly and adding 60 to 80% ethanol at a volume ratio of 2 to 4 times. After extracting for 72 hours, the final extract was solubilized with water (H 2 O), passed through a refiner, and concentrated under reduced pressure using a vacuum evaporator at a temperature of 35 to 45 ° C., preferably 40 ° C., followed by temperature It is possible to obtain crystallization Baikal of high purity by inducing crystallization from the powder obtained by utilizing the change.
  • water H 2 O
  • the composition of the present invention when the use of the composition of the present invention is skin whitening, antioxidant or anti-wrinkle, the composition of the present invention preferably contains 3 to 10 parts by weight of bicalin per 100 parts by weight of immature apple extract, more preferably immature It is preferable that 5-7 weight part of Baikallins per 100 weight part of apple extracts. At this time, if the amount of Baikal per 100 parts by weight of immature apple extract is less than 3 parts by weight, the skin whitening, antioxidant and antiwrinkle effect of the present invention can not be remarkably obtained, and the amount of Baikal per 100 parts by weight of immature apple extract exceeds 10 parts by weight. The difference in the effect of increasing the content is insignificant.
  • the composition of the present invention when the use of the composition of the present invention is antimicrobial or anti-inflammatory, preferably comprises immature apple extract and Baikal in a weight ratio of 7: 0.5 to 1.5, more preferably 7: 1 It is preferably included in the weight ratio.
  • the antimicrobial and anti-inflammatory effects which are the objective effects of the present invention, cannot be obtained remarkably, and the content is included in the immature apple extract in excess of the weight ratio of 7: 1.5. The rate of increase of the effect of increasing the value of may be inefficient.
  • composition comprising the immature apple extract and Baikal of the present invention exhibits skin whitening, antioxidant, anti-wrinkle, antibacterial or anti-inflammatory effect, there is little cytotoxicity as a natural substance.
  • a cosmetic composition comprising immature apple extract and Baikalin as an active ingredient is provided.
  • cosmetic compositions include ingredients typically added to cosmetic compositions in addition to immature apple extracts and Baikal as active ingredients, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. Adjuvants and carriers may be further added.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, sprays, emulsions, multiple emulsions and liquid crystals, and the like, but are not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a nourishing cream, astringent lotion, a flexible lotion, a lotion, an essence, a nourishing gel or a massage cream.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant gum, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
  • animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant gum, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
  • animal oil vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant gum, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide
  • tracant gum cellulose derivative
  • polyethylene glycol silicone
  • bentonite silica
  • talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as the carrier component when the formulation of the present invention is a powder or a spray, and in particular in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Castle cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant gum can be used.
  • the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide.
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the immature apple extract and Baikal.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and is preferably applied by topical application by parenteral administration, more preferably by application.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is in the range of 0.001-100 mg / kg on an adult basis.
  • the dosage does not limit the scope of the present invention.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form or in multidose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It may be prepared by incorporation into a container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or may be in the form of excirs, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the food composition comprises immature apple extracts and bicalin as active ingredients, as well as ingredients commonly added in food preparation, such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents. It may further include.
  • Such carbohydrates are monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol.
  • natural flavoring agents tauumatin, stevia extract (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food composition of the present invention is prepared with a drink, in addition to citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, tofu extract, jujube extract, licorice extract, etc., in addition to the mature apple extract and baikalline of the present invention It can be included as.
  • the present invention provides a method and use thereof for obtaining skin whitening, antioxidant or antiwrinkle effect of an individual by administering to the individual a composition comprising immature apple extract and Baikalin as an active ingredient. .
  • the present invention provides a method and use thereof for obtaining an antimicrobial or anti-inflammatory effect of a subject by administering to the subject a composition comprising immature apple extract and Baikalin as an active ingredient.
  • the present invention is administered to a subject a composition comprising immature apple extract and Baikalin as an active ingredient to enhance the skin whitening, antioxidant, anti-wrinkle, antibacterial or anti-inflammatory effect of the subject It provides a method for improving the skin condition and its use.
  • composition to be administered to the subject of the present invention has the effect of improving the skin condition of the subject or a disease, disease or abnormality caused by them due to skin whitening, antioxidant, anti-wrinkle, antibacterial or anti-inflammatory effects as described above.
  • the term "individual” refers to monkeys, cows, horses, pigs, sheep, dogs, cats, rats, mice, chimpanzees, including humans with skin conditions whose symptoms can be improved by administering the composition of the invention. It means a mammal such as.
  • the term "improvement” means pigmentation, skin aging, wrinkle formation, suppression of (a) development, (b) alleviation, and (c) elimination of skin diseases or inflammatory diseases caused by bacteria in an individual. do.
  • the immature apple extract and Baikal of the present invention is a natural substance harmless to the human body, there is little toxicity and side effects, so can be used safely even in the long-term use, especially in the cosmetic composition, pharmaceutical composition and food composition as described above It can be safely applied.
  • the composition comprising the immature apple extract and Baikalin of the present invention as an active ingredient has an excellent effect on skin whitening, antioxidant, anti-wrinkle, antibacterial and anti-inflammatory, there is no cytotoxicity and skin side effects cosmetic composition, pharmaceutical It can be usefully used as a composition and a food composition.
  • cosmetic composition pharmaceutical It can be usefully used as a composition and a food composition.
  • agricultural processing by-products that are disposed of in large quantities, it is useful not only for environmental conservation but also for economic aspects.
  • Figure 1 shows the manufacturing process and yield of the mature apple extract.
  • Figure 2 shows the production process and yield of immature apple extract.
  • Figure 3 is a photograph of the antimicrobial activity of the mixture of immature apple extract and Baikal in a weight ratio of 7: 1 to measure the antibacterial activity against E. coli.
  • Figure 4 is a photograph of antimicrobial activity against epidermal staphylococci of the mixture of immature apple extract and Baikal in a weight ratio of 7: 1, measured by growth inhibition ring.
  • Figure 5 is a photograph of the antimicrobial activity of Staphylococcus aureus of the mixture of immature apple extract and Baikal in a weight ratio of 7: 1 measured by growth inhibition ring.
  • FIG. 6 is a photograph showing the antimicrobial activity of candida albicans of the mixture of immature apple extract and Baikal in a weight ratio of 7: 1.
  • Figure 7 is a photograph of the antimicrobial activity of prepionibacterium acne of the mixture of immature apple extract and Baikal in a weight ratio of 7: 1 measured by growth inhibition.
  • 9 is a graph showing the iNOS inhibitory activity of the mixture of immature apple extract and Baikal in a weight ratio of 7: 1.
  • the immature apples used in this experiment were obtained from Osan-ri, Hwabuk-myeon, Yeongcheon-si, Gyeongsangbuk-do, Korea.
  • Example 1 immature apple extract and Baikalin Mixture manufacturing
  • Sample 1 is a mixture of 100 parts by weight of immature apple extract and 1 part by weight of Baikal
  • Sample 2 is a mixture of 100 parts by weight of immature apple extract and 3 parts by weight of Baikal
  • Sample 3 is 100 parts by weight of immature apple extract and 5 wt.
  • a mixture of parts Sample 4 is a mixture of 100 parts by weight of immature apple extract and 7 parts by weight of Baikal
  • Sample 5 is a mixture of 100 parts by weight of immature apple extract and 10 parts by weight of Baikal
  • Sample 6 is 100 parts by weight of immature apple extract and Baikal 12
  • Each weight part means a mixture.
  • Test Example One Skin whitening To verify effectiveness Tyrosinase Inhibition activity measurement
  • Tyrosinase is an enzyme that contains copper and L-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) in L-tyrosine, an early stage of melanin synthesis. , Acts on the transition from DOPA to L-dopaquinone. Ultraviolet mitosis of melanocytes occurs followed by activation of melanocytes. In activated melanocytes, tyrosinase synthesis is promoted and melanin is produced and transported out of the epidermis, causing pigmentation such as blemishes and freckles. Therefore, tyrosine activity inhibitors can effectively inhibit the synthesis of melanin polymers in the skin.
  • DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine
  • Tyrosinase activity inhibition experiments have been recognized as useful evaluation methods in the development of skin whitening agents. Therefore, tyrosinase plays an important role in melanin biosynthesis, so tyrosinase inhibitors can be used as substances that can control the production of melanin in the skin.
  • Tyrosinase inhibitory activity was measured according to the Yagi method.
  • the reaction zone was 0.2 mL of mushroom tyrosinase (110 U / mL) in a mixture of 0.2 mL of substrate solution dissolved in 10 mM DOPA in 0.5 mL of 1/15 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) and 0.1 mL of sample solution.
  • the reaction was added and reacted at 25 ° C. for 2 minutes, and the DOPA chromium produced in the reaction solution was measured under light having a wavelength of 475 nm.
  • the tyrosinase inhibitory activity was expressed by the decrease in absorbance of the added and non-added samples. Comparative analysis was performed using Nurukic acid as a positive control.
  • Table 1 shows the tyrosinase inhibitory activity of the mixture (samples 1 to 6) in which Baikal was mixed at a concentration of 1, 3, 5, 7, 10 and 12 parts by weight based on 100 parts by weight of immature apple 70% ethanol extract. . As the content of the bicalin in the sample increased, it was confirmed that the tyrosinase inhibitory activity of the mixture was strongly expressed.
  • DPPH which is used for measuring electron donating ability, is a substance with chemically stabilized free radicals, which is very stable in organic solvents, and has a maximum absorbance around 515 ⁇ 520nm. When it encounters a substance with antioxidant activity, the radicals are dissipated and discolored while giving out electrons, so it is easy to observe the antioxidant activity with the naked eye. After initiation of oxidation, the scavenging activity of free radicals is measured by absorbance by each sample. If the ability to reduce or offset free radicals is high, scavenging activity for high radicals can be expected, which can also be used as a measure of inhibiting aging by free radicals in the human body.
  • Electron donating ability was measured by modifying the method of Blois. 1 mL of 0.2 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) was added to 2 mL of each sample solution, stirred for 30 minutes, and then absorbed at 517 nm. It was. The electron donating ability was expressed as the absorbance reduction rate of the sample solution addition and no addition solution.
  • DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
  • the IC 50 value of Table 2 means a concentration value for reducing the DPPH by 50% at the time 10 minutes after the start of the reaction, measured as the highest IC 50 value of Sample 1 as shown in Table 2 below And the IC 50 value of Sample 6 was the lowest. Therefore, it was confirmed that the antioxidant effect was excellent as the content of Baikal in the immature apple extract increased.
  • Sample IC 50 (ug / mL) Immature Apples 70% EtOH ext. 115.4 ⁇ 6.4 Sample 1 117.5 ⁇ 5.4 Sample 2 78.9 ⁇ 3.1 Sample 3 64.8 ⁇ 4.3 Sample 4 51.2 ⁇ 1.9 Sample 5 49.7 ⁇ 2.1 Sample 6 49.5 ⁇ 2.2 (+)-Catechin 4.6 ⁇ 0.3
  • a commonly used ABTS radical cation scavenging activity such as the scavenging activity of DPPH radicals, is the reaction of 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) with potassium persulfate
  • ABTS + radicals When ABTS + radicals are produced, they have a distinctive index of turquoise, which is a method of measuring the discoloration of light green with the addition of a sample. ) Can be measured.
  • Antioxidant activity using ABTS radicals was determined by ABTS + cation decolorization assay (Roberta, et al., 1999). 7 mM 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) and 2.4 mM potassium persulfate were mixed for 24 hours in the dark at room temperature to form ABTS + and diluted with ethanol to ABTS + 100 ul of sample was added to 100 ul and left for 1 minute, and then absorbance was measured at 732 nm.
  • ABTS radical scavenging activity was measured to determine the antioxidant effects of the extracts of immature apples and samples 1 to 6, and the results are shown in Table 3 below.
  • the IC 50 value of Table 3 means a concentration value for reducing the ABTS by 50% at 6 minutes after the start of the reaction. As shown in Table 2, the IC 50 value of Sample 1 was determined to be the highest. And the IC 50 value of Sample 6 was the lowest. Therefore, it was confirmed that the antioxidant effect was excellent as the content of Baikal in the immature apple extract increased.
  • Elastase present in human neutrophil granulocytes is an enzyme that breaks down elastin, an important substrate protein that maintains skin elasticity in the dermis, and a nonspecific hydrolase that can break down collagen, another important substrate protein. Therefore, elastase inhibitors have an effect of improving skin wrinkles, and ursolic acid is used as an elastase inhibitor.
  • one of the leukocyte granule enzymes that break down the elastin in the body the abnormal tissue is extremely high activity of the enzyme directly causes tissue destruction, causing wrinkles and loss of elasticity of the skin.
  • the mixture exhibits a tendency to exhibit an elastase inhibitory activity of the mixture as the content of the Baikallin increases.
  • the amount of bacalin is less than 3 parts by weight, the elastase inhibitory activity was weaker than that of using immature apple extract alone. The effect was slowed down.
  • Collagen a major component of the extracellular matrix, is the major substrate protein produced in fibroblasts of the skin. In addition, it is an important protein that accounts for about 30% of the total weight of biological proteins, and has a strong triple helix structure. Collagen forms most of the organic matter in the skin, tendons, bones and teeth, especially in the dermis of bone and skin.
  • the main functions of collagen are known as mechanical firmness of skin, resistance of connective tissue and binding of tissue, support of cell adhesion, induction of cell division and differentiation. This collagen is reduced by photoaging by age and UV irradiation, which is known to be closely related to the wrinkle formation of the skin.
  • collagen is reported to be degraded by collagen without being affected by protease such as trypsin.
  • Collagen inhibitory activity was measured according to the method of Wnsch et al.
  • the reaction zone was prepared by adding 4 mM CaCl 2 to 0.1 M tris-HCl (pH 7.5) to dissolve 4-phenylazobenzyloxycarbonyl l-proline-leucine-glycine-proline-D-arginine (0.3 mg / mL).
  • 0.15 mL of collagen (0.2 mg / mL) was added to a mixed solution of 0.25 mL of solution and 0.1 mL of sample solution. The mixture was left at room temperature for 20 minutes, and then 0.5 mL of 6% citric acid was added to stop the reaction. 1.5 mL of acetate was added to measure absorbance at 320 nm. Collagen inhibitory activity was expressed by the decrease in absorbance of the added and non-added samples.
  • the mixture showed a tendency to strongly exhibit the collagenase inhibitory activity of the mixture as the content of the Baikallin increased.
  • the content of the baccalin is less than 3 parts by weight, the collagenase inhibitory activity was weaker than that of the immature apple extract alone. It was confirmed that the slowdown.
  • Example 2 immature apple extract and Baikalin Mixture manufacturing
  • the immature apple extract prepared in Preparation Example 1 and the baikal prepared in Preparation Example 2 were 7: 0.2 (sample 7), 7: 0.4 (sample 8), 7: 0.6 (sample 9), 7: 0.8 (sample). 10), 7: 1 (sample 11), 7: 1.2 (sample 12), 7: 1.4 (sample 13), 7: 1.6 (sample 14), and 7: 1.8 (sample 15) Prepared.
  • the antimicrobial activity of skin pathogens such as Staphylococcus epidermis, S. aureus, E. coli, and B. subtilis was verified. Antibacterial activity was measured by a paper disc method. In other words, take one platinum equivalent of each strain cultured in a plate medium, incubate for 22 hours in 10 mL of liquid medium, activate it, and inoculate 0.1 mL of the solution in 10 mL of the liquid medium, and incubate for 5 hours, and then culture the bacteria solution per plate medium. Inoculated to 10 7 cells and evenly spread with a sterile swab.
  • Sample 7 Sample 8
  • Sample 9 Sample 10
  • Sample 11 Sample 12
  • Sample 13 Sample 14
  • Sample 15 Escherichia coli - - 2 mm 8 mm 11 mm 13 mm 15 mm 16 mm 16 mm 16 mm
  • Candida albicans - - 3
  • Samples were mixed with icarous apple extract and immature apple extract in a weight ratio of 7: 1, using 70% ethanol, respectively, 10 ug / ml, 25 ug / ml, 50 ug / ml, 75 ug / ml and 100 Prepared to be at a concentration of ug / ml.
  • Nitrogen dioxide (NO 2 ) present in the cell culture was measured using a grease reagent, 100ul of the cell culture supernatant in which nitrogen dioxide was produced by treating lipopolysaccharide (LPS) with the cultured cells to induce inflammation. After mixing 100ul of grease reagent and reacting for 10 minutes, the samples prepared according to the concentrations were added and reacted for 10 minutes, and then absorbance was measured in light of 540 nm wavelength.
  • LPS lipopolysaccharide
  • iNOS is not normally present in cells, but once induced, it produces a large amount of NO for a long time, and the generated NO not only promotes inflammatory reactions such as vascular permeability and edema, but also intensifies inflammation by promoting biosynthesis of inflammatory mediators.
  • inflammatory reactions such as vascular permeability and edema, but also intensifies inflammation by promoting biosynthesis of inflammatory mediators.
  • Samples were prepared so that the concentration of 5 ug / ml, 10 ug / ml and 25 ug / ml by using 70% ethanol, respectively, by mixing the Baikal with a weight ratio of 7: 1 immature apple extract.
  • the expression of iNOS was measured using Western blot of Tobin as follows. After treating lipopolysaccharide (LPS) and samples of each concentration to Raw 264.7 cells, the cells were lysed using lysis buffer and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes to obtain protein. . The concentration of protein was quantified by the Bradford method. The obtained protein was electrophoresed using SDS-polyacrylamide gel (SDS-polyacrylamide gel), followed by transblotting with a Nitrocellulose membrane.
  • LPS lipopolysaccharide
  • SDS-polyacrylamide gel SDS-polyacrylamide gel
  • Anti-rabbit IgG Secondary antibody anti-rabbit IgG with horseradish peroxide attached after treatment to membrane using anti-iNOS polyclonal antibody as primary antibody (anti-rabbit IgG) was added to measure the expression of iNOS using enhanced chemiluminescence detection (Enhanced chemiluminescence detection).
  • FIG. 9 Nor is a measure of cultured cells that do not induce inflammation without treatment of lipopolysaccharide, and Con does not add a sample mixed with bicalin to the immature apple extract prepared above in cultured cells that induce inflammation. Cultured cells were measured. As can be seen in Figure 9 it was confirmed that the sample mixed with Baikal to the immature apple extract has the effect of inhibiting inflammation by inhibiting iNOS.

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Abstract

본 발명은 미성숙 사과(unripe apple) 추출물 및 바이칼린의 혼합물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린의 혼합물 유효성분으로 포함하는 조성물은 티로시나제, 엘라스타제 및 콜라겐아제 억제활성이 우수하여 피부미백, 항산화 및 주름개선에 효과가 있고, 피부상재균을 억제하고 iNOS 및 NO의 발현을 저해 효과가 우수하여 항균 및 항염증 효과가 있으며, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증을 위한 조성물
본 발명은 미성숙 사과(unripe apple) 추출물 및 바이칼린(baicalin)을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증을 위한 조성물에 관한 것이다.
근래 유럽, 미국, 일본 등의 선진국에서는 광우병의 발병으로 동물에서 유래한 화장품 소재들이 대부분 식물에서 유래한 소재로 급격히 대체되고 있다. 식물에서 유래한 소재로 올리브유, 야자유와 사포닌, 소맥배아유, 미강유 또는 인지질 등과 같은 계면활성성분; 아미노산, 단백질 또는 당류 등을 함유한 수용성 성분; 로즈메리 나뭇잎, 버드나무껍질 추출액, 나래지처뿌리, 꿀 또는 당근 등 다양한 천연물이 보습제, 피막형성제, 피부보호제, 립스틱, 향류 등으로 이용되고 있다.
최근에는 엘라스타제 및 매트릭스 메탈로프로테인아제-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)의 활성을 억제하는 소재, 히알루론산의 합성을 촉진하는 소재, 활성산소 제거능을 가진 소재 또는 각화세포 및 섬유아세포의 증식을 촉진하는 소재 등이 연구개발 중이거나 기능성 화장품의 원료로 사용되고 있으며, 여러 가지 형태의 천연소재를 첨가한 화장품이 쏟아져 나오고 있으나 그 효능에 대한 과학적, 체계적인 연구 및 검증이 미비한 실정이다.
피부미백 관련 인자로서 멜라닌은 피부색소인자로서 자외선 등으로 인한 피부의 손상에 대항하여 생성되며 피부를 보호하는 작용을 하며, 멜라닌의 생성은 티로시나제에 의한 티로신의 산화로 시작되어 DOPA 와 DOPA 크롬(chrome) 등이 생성된 후 DHICA와 DHI를 거쳐 이루어지며 현재까지 DHI-eu멜라닌, DHICA-eu멜라닌, pheo멜라닌 등의 3종이 생성 되는 것으로 알려져 있다.
자외선 노출 등의 원인으로 인한 피부의 멜라닌 색소 과침착은 기미 주근깨 검은반점 등을 일으키는 요인이 되며 이러한 피부의 흑화를 예방 및 개선하기 위하여 누룩산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 비타민 C 유도체 등이 피부미백제로 개발되어졌으나, 누룩산의 경우는 생체 외에서의 티로시나제(tyrosinase) 억제효과에 비해 세포상이나 생체 내에서의 멜라닌 생성 억제효과가 미비하며 또한 장기 사용 시 간암을 유발할 수 있다고 최근에 보고되었다. 또한, 알부틴은 히드로퀴논(hydroquinone)계열이 갖는 세포독성의 문제점이 있으며, 비타민 C 역시 화학적 안정성에 대한 문제가 있어 장기 보관이 어려운 문제점이 있다.
상기와 같은 피부미백 활성물질의 부작용 등이 알려짐에 따라 그 대체원료로 여러 천연물추출물을 이용한 기능성 피부미백 화장품 또는 약품에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔으나, 그 효능이나 독성에 대한 확실한 검증이 충분치 못하고 아직까지 임상적 효과가 만족스럽지 못하여 새로운 대체원료의 개발과 과학적이고 체계적인 효능검증이 절실하다.
또한, 인간을 비롯한 모든 호기성 호흡을 하는 생물들은 산소를 이용하여 생명유지에 필요한 에너지를 발생시킨다. 이 과정에서 활성산소가 생성되고 이들은 생체 내에서 위해작용을 일으킨다고 알려져 있으며 이와 관련된 직접 또는 간접적인 다양한 생체장애가 보고되어왔다.
활성 산소종의 일부인 NO(Nitric Oxide)는 항산화 시스템의 기능이 저하되는 상황에서 세포는 활성 산소종에 의해 유해 작용을 받고 염증 등의 발생 및 여러 질환을 유발한다. 또한, NO는 독성을 가진 매우 불안정한 기체이며 고농도에서 세포의 기질적 손상을 초래하는 자유 라디칼 중의 하나이며 이들에 의해서 다양한 정상세포의 손상을 초래하여 염증을 유발시키며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경손상 등을 유발한다.
그 중 염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민, 세로토닌, 브래디키닌, 프로스타글리딘, 류코트리엔과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다.
대식세포는 염증반응 시에 NO(Nitric Oxide)와 사이토카인을 생산하여 감염 초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다. 내독소로 잘 알려진 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)는 그람 음성균의 세포 외막에 존재하며, RAW 264.7과 같은 마크로파지(microphage) 또는 단핵구(monocyte)에서 염증성 사이토카인들을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제 A2의 활성으로 인해 아라키돈산이 프로스트글라딘으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다. 체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 프로스타글라딘E2(PEG2) 등의 염증인자가 iNOS 및 COX-2에 의해 형성된다. 이 중 NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 과잉 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.
이러한 기전의 작용으로 현재까지 항염증 약물의 사용으로 인해 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용되기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭게 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련하여 최근에는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.
한편, 미성숙 사과(unripe apple)는 성숙 사과에 비하여 다양한 생리활성을 나타내는 플라반-3-올(flavan-3-ol)계의 화합물을 다량으로 함유하고 있다고 알려져 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1065558호는 미숙사과의 추출물이 완숙사과에 비하여 활성성분 함량이 높고 피부미백효과가 우수하여 이를 피부상태 개선용 약제학적 조성물로 이용할 수 있음을 개시하고 있다.
또한, 바이칼린(baicalin)은 플라보노이드(flavonoid)의 일종으로 꿀풀과 식물인 코가네바나(Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리 등에 주로 함유되어 있으며, 항감염, 항알레르기, 항고혈압 등의 약리효과가 있다고 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 피부상태 개선의 효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 미성숙 사과 추출물과 함께 바이칼린을 혼합하여 사용할 경우 세포 독성이 없으면서도 미성숙 사과 추출물만을 사용한 것에 비하여 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증에 탁월한 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증 효과를 가지면서 천연 소재로부터 유래한 세포 독성이 없는 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백, 주름개선, 항균 및 항염증 효과를 갖는 피부상태 개선을 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 용어 "미성숙 사과"는 개화 수정 후 1주 내지 3주 후에 적과된 사과를 의미한다.
본 발명의 미성숙 사과 추출물은 당분야에 공지된 통상적인 추출용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 이때, 상기 추출용매는 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 추출용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 추출용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
또한, 상기 미성숙 사과 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 미성숙 사과 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 미성숙 사과 추출물은 미성숙 사과를 분쇄한 후 추출용매, 예컨대 물, 탄소수 1~3개의 무수 또는 함수 저급 알콜 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 용매를 추출용매로 사용하여 추출할 수 있으며, 상기 추출 용매의 양은 미성숙 사과에 대해 2 내지 4의 부피비로 할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 미성숙 사과 추출물은 미성숙 사과를 분쇄한 후 2 내지 4배의 부피비로 60 내지 80%인 에탄올(EtOH)을 첨가하여 실온에서 20 내지 30시간, 바람직하게는 22 내지 26시간 동안 침지추출한 후 회수한 후, 여과지로 농축하여 미성숙 사과 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 “바이칼린”은 플라보노이드의 일종으로, 상기 바이칼린은 식물로부터 분리 정제되거나, 상업적으로 생산되거나, 또는 미생물에 의해 생성될 수 있다.
상기 바이칼린을 분리 정제하기 위한 식물은 꿀풀과 식물인 코가네바나(Scutellaria baicalensis Georgi)일 수 있으며, 바람직하게는 황금(Scutellaria baicalensis)일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 양태로, 상기 바이칼린은 꿀풀과 식물인 황금(Scutellaria baicalensis)의 뿌리로부터 추출한 것이다.
하나의 구체적 양태로, 바이칼린은 황금을 고르게 분쇄한 후 2 내지 4배의 부피비로 60 내지 80%인 에탄올을 가하여 상온에서 68 내지 76시간, 바람직하게는 70 내지 74시간, 보다 더 바람직하게는 72시간 동안 추출한 후 최종 추출물을 물(H2O)로 가용화 한 후 정제기에 통과시켜 35 내지 45℃ 온도, 바람직하게는 40℃ 온도에서 진공 증발기(vacuum evaporator)를 활용하여 감압농축 한 후, 온도 변화를 활용하여 얻어진 분말로부터 결정화를 유도하여 고순도의 결정 바이칼린을 획득할 수 있다.
하나의 구체적 양태로 본 발명의 조성물의 용도가 피부미백, 항산화 또는 주름개선인 경우 본 발명의 조성물은 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린 3 내지 10 중량부를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린 5 내지 7 중량부인 것이 바람직하다. 이때 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린이 3 중량부 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 피부미백, 항산화 및 주름개선 효과를 현저하게 수득할 수 없으며, 미성숙 사과 추출물 100 중량부당 바이칼린이 10 중량부를 초과할 경우 함량의 증가에 따른 효과의 차이가 미미하다.
하나의 구체적 양태로 본 발명의 조성물의 용도가 항균 또는 항염증용인 경우 본 발명의 조성물은 미성숙 사과 추출물과 바이칼린이 7:0.5 내지 1.5의 중량비로 포함된 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 7:1 중량비로 포함된 것이 바람직하다. 이때, 바이칼린이 미성숙 사과 추출물에 7:0.5 중량비 미만으로 포함될 경우 본 발명의 목적효과인 항균 및 항염증 효과를 현저하게 수득할 수 없으며, 미성숙 사과 추출물에 7:1.5의 중량비를 초과하여 포함될 경우 함량의 증가에 따른 효과의 증가율이 미미하여 비효율적일 수 있다.
본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 포함하는 조성물은 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 또는 항염증 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이, 에멀젼, 다중 에멀젼 및 액정 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 약학적 조성물은 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 식품 조성물에는 유효성분으로서 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 성숙 사과 추출물 및 바이칼린 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 본 발명은 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 개체의 피부미백, 항산화 또는 주름개선 효과를 얻기 위한 방법 및 그 용도를 제공한다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 본 발명은 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 개체의 항균 또는 항염증 효과를 얻기 위한 방법 및 그 용도를 제공한다.
본 발명의 하나의 구체적 양태로, 본 발명은 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 개체의 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 또는 항염증 효과를 증진시켜 개체의 피부상태를 개선하는 방법 및 그 용도를 제공한다.
본 발명의 개체에 투여하는 조성물은 상술한 바와 같이 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 또는 항염증 효과로 인하여 개체의 피부상태 또는 이들로부터 발생하는 질환, 질병 또는 이상을 개선시키는 효과가 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 개선될 수 있는 피부상태를 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "개선"은 개체에서 색소침착, 피부노화, 주름생성, 세균에 의해 발생하는 피부질환 또는 염증질환의 (a) 발전의 억제, (b) 경감, (c) 제거를 의미한다.
한편, 본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증에 우수한 효과가 있으며, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 대량으로 폐기되는 농산가공부산물을 활용하는 것으로 환경보존뿐만 아니라 경제적인 측면에서도 유용하다.
도 1은 성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다.
도 2는 미성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다.
도 3는 미성숙 사과 추출물과 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 대장균에 대한 항균활성을 생육저해환으로 측정한 사진이다.
도 4는 미성숙 사과 추출물과 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 표피 포도상구균에 대한 항균활성을 생육저해환으로 측정한 사진이다.
도 5은 미성숙 사과 추출물과 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 황색포도상구균에 대한 항균활성을 생육저해환으로 측정한 사진이다.
도 6은 미성숙 사과 추출물과 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 칸디다 알비칸스에 대한 항균활성을 생육저해환으로 측정한 사진이다.
도 7은 미성숙 사과 추출물과 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 프리피오니박테리움 아크네에 대한 항균활성을 생육저해환으로 측정한 사진이다.
도 8는 미성숙 사과 추출물과 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 NO 저해활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9은 미성숙 사과 추출물과 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 iNOS 저해활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1: 미성숙 사과 추출물의 제조
본 실험에서 사용한 미성숙 사과는 2011년 5월에 경북 영천시 화북면 오산리 지역에서 얻어진 것으로 개화 수정 후 2주 후 적과된 미성숙 사과를 재료로 사용하였다.
미성숙 사과를 분쇄한 후 미성숙 사과 분쇄물의 3배의 부피비로 70%인 에탄올(EtOH)을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침지추출을 3회 반복한 후, 와트먼(Whatman) No. 1 여과지로 여과하였으며, 각 추출물은 감압농축기 (rotary vacuum evaporator)로 40℃이하에서 농축한 다음 동결건조 후 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다. 도 1은 성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다. 도 2는 미성숙 사과 추출물의 제조 공정 및 수율을 나타낸 것이다.
제조예 2: 바이칼린의 제조
영천시 임고면에서 2010년 7월에 생산된 황금(Scutellaria baicalensis)을 고르게 분쇄하여 얻어진 분말에 에탄올(EtOH)을 가하여 상온에서 3일간 반복추출한 후 최종 추출물을 물(H2O)로 가용화 하고 정제기에 통과시켜 40℃ 온도에서 진공 증발기(vacuum evaporator)를 활용하여 감압농축 한 후, 온도 변화를 활용하여 얻어진 분말로부터 결정화를 유도하여 고순도의 결정 바이칼린을 제조하였다.
실시예 1: 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린의 혼합물 제조
상기 제조예 1에서 제조한 미성숙 사과 추출물 100 중량부에 상기 제조예 2에서 제조한 바이칼린 1, 3, 5, 7, 10 및 12 중량부를 첨가하여 혼합물을 제조하였다.
이하, 시료 1은 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 1 중량부의 혼합물, 시료 2는 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 3 중량부의 혼합물, 시료 3은 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 5 중량부의 혼합물, 시료 4는 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 7 중량부의 혼합물, 시료 5는 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 10 중량부의 혼합물, 시료 6은 미성숙 사과 추출물 100 중량부와 바이칼린 12 중량부의 혼합물을 각각 의미한다.
시험예 1: 피부미백 효과 검증을 위한 티로시나제 저해 활성 측정
티로시나제(Tyrosinase)는 구리를 함유한 효소로서 멜라닌(melanin) 합성의 초기단계인 L-티로신(L-tyrosine)에서 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-3,4-dihydroxyphenylalanine: DOPA), DOPA에서 L-도파퀴논(L-dopaquinone)으로의 전이에 작용한다. 자외선에 의하여 멜라노사이트(melanocyte)의 유사분열이 일어나고 이어서 멜라노사이트가 활성화된다. 활성화된 멜라노사이트에서는 티로시나제 합성이 촉진되고 멜라닌이 생성되어 이를 표피 밖으로 운반 배출하게 되어 기미, 주근깨와 같은 색소침착이 일어나게 된다. 그러므로 티로신 활성 억제제는 피부 내에서의 멜라닌 폴리머 합성을 효과적으로 저해할 수 있어 피부 미백제의 개발에 있어서 티로시나제 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다. 따라서 티로시나제는 멜라닌 생합성 과정에서 중요한 역할을 하므로 티로시나제 억제제를 피부의 멜라닌 색소생성을 조절할 수 있는 물질로 사용할 수 있다.
티로시나제 저해활성 측정은 야기(Yagi) 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 1/15M 소듐 포스페이트 완충용액(sodium phosphate 완충용액, pH 6.8) 0.5mL에 10mM의 DOPA을 녹인 기질액 0.2mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 머쉬룸 티로시나제(mushroom tyrosinase, 110U/mL) 0.2mL 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA 크롬을 475nm 파장의 빛에서 측정하였다. 티로시나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 양성대조군으로 누룩산을 사용하여 비교 분석하였다.
하기 표 1은 미성숙 사과 70% 에탄올 추출액 100 중량부에 대해 바이칼린을 1, 3, 5, 7, 10 및 12 중량부의 농도로 혼합한 혼합물(시료 1 내지 6)의 티로시나제 저해활성을 측정한 것이다. 상기 시료의 바이칼린의 함량이 증가할수록 혼합물의 티로시나제 저해활성을 강하게 나타내는 경향을 확인할 수 있었다.
그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우(시료 1) 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 티로시나제 저해활성이 약하게 나타났고 10 중량부를 초과하는 경우(시료 6) 티로시나제 저해활성의 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다. 하기 표 1에서 누룩산은 양성대조구로 사용되었다.
Samples 저해활성 (%)
1000ug/mL 500ug/mL 250ug/mL 125ug/mL 62.5ug/mL 31.3ug/mL
미성숙 사과 70% EtOH ext. 100 중량부 15.9 13.5 8.4 6.3 4.0 1.2
시료 1 13.7 10.7 6.1 0.7 0.6 0.0
시료 2 17.4 14.1 9.4 6.9 4.2 1.4
시료 3 21.7 16.8 12.1 8.7 6.5 4.7
시료 4 25.5 18.7 15.8 12.4 8.1 6.1
시료 5 29.3 20.5 19.3 14.5 10.0 7.8
시료 6 30.1 21.0 19.6 14.7 10.2 7.9
누룩산(Kojic acid) 94.4 84.8 70.5 50.7 31.7 12.7
시험예 2: 항산화 효과 검증
(1) DPPH 라디칼 소거능 측정
전자공여능 측정에 사용된 DPPH는 화학적으로 안정화된 자유 라디칼(free radical)을 가지고 있는 물질로 유기용매에 매우 안정하며 515~520nm 부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색 화합물이다. 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼이 소멸되고 탈색이 되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있어 다양 한 소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있는데, 이는 DPPH로 먼저 산화를 개시한 후 각 시료에 의해서 자유 라디칼에 대한 소거 활성 능력을 흡광도로 측정하여 확인한다. 자유 라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크면 높은 라디칼에 대한 소거 활성을 기대할 수 있으며, 이는 인체 내에서 자유 라디칼에 의한 노화를 억제하는 척도로도 이용할 수 있다.
전자공여능(EDA: electron donating ability)은 블로이스(Blois)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 2mL에 0.2mM의 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl: DPPH) 1mL를 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
상기 방법에 따라 미성숙 사과의 추출물과 시료 1 내지 6의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 소거활성을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
하기 표 2의 IC50 값은 반응이 시작 후 10분이 경과한 시점에서 DPPH가 50% 감소되도록 하기 위한 농도 값을 의미하며, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 시료 1의 IC50 값이 가장 높은 것으로 측정되었으며, 시료 6의 IC50 값이 가장 낮게 측정되었다. 따라서, 미성숙 사과 추출액에 대한 바이칼린 함량이 증가할수록 항산화 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우(시료 1) 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 IC50 값이 높게 나타나 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 황산화 효과가 낮은 것을 알 수 있었고, 10 중량부를 초과하는 경우(시료 6) 시료 5의 IC50 값과의 차이가 미미하여 바이칼린 함량의 증가에 따른 황산화 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다. 하기 표 2에서 (+)-Catechin는 양성대조구로 사용되었다.
Sample IC50 (ug/mL)
미성숙 사과 70% EtOH ext. 115.4 ± 6.4
시료 1 117.5 ± 5.4
시료 2 78.9 ± 3.1
시료 3 64.8 ± 4.3
시료 4 51.2 ± 1.9
시료 5 49.7 ± 2.1
시료 6 49.5 ± 2.2
(+)-Catechin 4.6 ± 0.3
(2) ABTS 라디칼 소거활성 측정
DPPH 라디칼의 소거활성과 같이 일반적으로 많이 사용되는 ABTS 라티칼 양이온 소거능은 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디암모늄염(ABTS)과 포타슘 퍼설페이트와의 반응으로 ABTS+·라디칼이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 시료를 첨가함에 따라 연한녹색으로 변색되는 것을 측정하는 방법이며, 수소-주개 항산화제(hydrogen-donating antioxidant)와 사슬 절단 항산화제(chain breaking antioxidant) 모두를 측정할 수 있다.
ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ 캐타이언 디칼라리제이션 어세이(ABTS+ cation decolorization assay) 방법(Roberta, et al., 1999)에 의하여 측정하였다. 7 mM 2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)과 2.4 mM 포타슘 퍼설페이트를 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 ABTS+100 ul에 시료 100 ul를 가하여 1분 동안 방치한 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 방법에 따라 미성숙 사과의 추출물과 시료 1 내지 6의 항산화 효과를 알아보기 위해 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3의 IC50 값은 반응이 시작 후 6분이 경과한 시점에서 ABTS가 50% 감소되도록 하기 위한 농도 값을 의미하며, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 시료 1의 IC50 값이 가장 높은 것으로 측정되었으며, 시료 6의 IC50 값이 가장 낮게 측정되었다. 따라서, 미성숙 사과 추출액에 대한 바이칼린 함량이 증가할수록 항산화 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우(시료 1) 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 IC50 값이 높게 나타나 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 황산화 효과가 낮은 것을 확인할 수 있었고, 10 중량부를 초과하는 경우(시료 6) 시료 5의 IC50 값과의 차이가 미미하여 바이칼린 함량의 증가에 따른 황산화 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다. 하기 표 2에서 (+)-Catechin는 양성대조구로 사용되었다.
Sample IC50 (ug/mL)
미성숙 사과 70% EtOH ext. 45.4 ± 2.3
시료 1 47.7 ± 2.8
시료 2 41.5 ± 1.6
시료 3 34.3 ± 1.5
시료 4 30.8 ± 2.1
시료 5 28.3 ± 1.5
시료 6 28.1 ± 1.4
(+)-Catechin 1.34 ± 0.2
시험예 3: 주름개선 효과 검증
(1) 엘라스타제(Elastase) 저해 활성 측정
인체의 중성구 과립구내 존재하는 엘라스타제는 진피 내 피부탄력을 유지하는 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서 엘라스타제 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우르솔산(ursolic acid) 등이 엘라스타제 저해제로 이용되고 있다. 또한, 체내의 엘라스틴을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 그 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실을 유발한다.
포르신 판크레아즈 엘라스타제(Porcine pancreas elastase)저해 활성 측정은 기질로서 N-석시닐-(L-알라닌)3-p-니트로아닐라이드를 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켜 생성된 p-니트로알라이드의 양을 405nm 파장의 빛에서 측정하였다. 즉, 각 시험액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5mL씩 시험관에 취하고 50mM tris-HCl 완충용액(pH 8.6)에 녹인 엘라스타제(2.5U/mL)용액 0.5mL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl 완충용액(pH 8.6)에 녹인 N-석시닐-(L-알라닌)3-p-니트로아닐라이드(0.5mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다.
미성숙 사과 70% 에탄올 추출액과 시료 1 내지 6에 대한 상기 실험 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 우르솔산은 양성대조구로 사용되었다.
실험 결과, 상기 혼합물은 바이칼린의 함량이 증가할수록 혼합물의 엘라스타제 저해활성을 강하게 나타내는 경향을 확인할 수 있었다. 그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 엘라스타제 저해활성이 약하게 나타났고 10 중량부를 초과하는 경우 바이칼린 함량의 증가에 따른 엘라스타제 저해활성의 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다.
Sample No. 저해활성 (%)
1000ug/mL 500ug/mL 250ug/mL 125ug/mL 62.5ug/mL 31.3ug/mL
미성숙 사과 70% EtOH ext. 100 중량부 63.1 56.2 52.2 30.3 12.0 0.0
시료 1 56.1 49.5 49.2 41.7 4.6 0.0
시료 2 65.0 57.8 52.8 30.5 15.5 0.0
시료 3 67.0 59.8 54.6 37.9 22.3 1.4
시료 4 69.5 60.6 56.2 45.5 27.2 1.8
시료 5 71.2 65.1 58.8 49.1 31.1 2.0
시료 6 71.5 65.5 59.0 49.2 31.1 1.9
우르솔산(ursolic acid) 76.1 71.3 66.4 62.8 30.2 6.5
(2) 콜라겐아제(Collagenase) 저해 활성 측정
세포외기질의 주요 구성성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서의 생성되는 주요 기질 단백질이다. 또한, 생체 단백질 총중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나성구조를 가지고 있다. 콜라겐은 피부, 건, 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부의 진피에 그 포함량이 높다. 콜라겐의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성 과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한, 콜라겐은 트립신 등의 단백질 분해효소의 작용을 받지 않으나, 콜라겐아제에 의해 분해된다고 보고가 있다.
콜라겐아제 저해활성 측정은 분쉬(Wnsch) 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1M tris-HCl (pH 7.5)에 4mM CaCl2를 첨가하여, 4-페닐아조벤질오시카보닐 l-프롤린-류신-글리신-프롤린-D-아르기닌(0.3mg/mL)을 녹인 기질액 0.25mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 콜라겐아제 (0.2mg/mL) 0.15mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% 시트릭산(citric acid) 0.5mL을 넣어 반응을 정지시킨 다음, 에틸 아세테이트 1.5mL을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라겐아제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
미성숙 사과 70% 에탄올 추출액과 시료 1 내지 6에 대한 상기 실험 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)는 양성대조구로 사용되었다.
실험 결과, 상기 혼합물은 바이칼린의 함량이 증가할수록 혼합물의 콜라겐아제 저해활성을 강하게 나타내는 경향을 확인할 수 있었다. 그러나, 바이칼린의 함량이 3 중량부 미만인 경우 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 콜라겐아제 저해활성이 약하게 나타났고 10 중량부를 초과하는 경우 바이칼린 함량의 증가에 따른 콜라겐아제 저해활성의 효과가 둔화됨을 확인할 수 있었다.
Sample No. 저해활성 (%)
1000 ug/mL 500 ug/mL 250 ug/mL 1255 ug/mL 62.5 ug/mL
미성숙 사과 70% EtOH ext. 100 중량부 54.6 35.9 29.0 20.4 15.2
시료 1 54.5 36.0 28.4 19.9 15.0
시료 2 57.3 53.1 48.3 32.6 17.8
시료 3 68.2 60.7 52.8 36.5 22.3
시료 4 82.9 78.2 72.0 61.3 28.0
시료 5 93.3 88.0 79.7 69.8 44.0
시료 6 93.4 88.2 79.6 69.8 44.1
EGCG 87.4 87.5 83.5 81.0 61.9
실시예 2: 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린의 혼합물 제조
상기 제조예 1에서 제조한 미성숙 사과 추출물과 상기 제조예 2에서 제조한 바이칼린을 7:0.2(시료 7), 7:0.4(시료 8), 7:0.6(시료 9), 7:0.8(시료 10), 7:1(시료 11), 7:1.2(시료 12), 7:1.4(시료 13), 7:1.6(시료 14), 및 7:1.8(시료 15)의 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하였다.
시험예 4: 항균 효과 검증
(1) 생육저해환(Clear zone)측정
표피포도상구균(Staphylococcus epidermis), 황색포도상구균(S. aureus), 대장균(E. coli), 고초균(B. subtilis) 등의 피부질환원인균 및 피부상재균들을 대상으로 항균활성을 검증하였다. 항균력 측정은 페이퍼 디스크(paper disc)법으로 측정하였다. 즉, 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10mL에서 22시간 배양하여 활성화 시킨 후 다시 액체 배지 10mL에 균액을 0.1mL 접종하여 5시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균액을 약 107 cells가 되도록 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 필터 페이퍼 디스크(filter paper disc)(Tokyo, 8mm, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 시료를 3mg/disc 농도로 흡수시켜 37℃에서 22시간 배양하여 디스크 주위의 생육저해환의 직경(mm)을 측정하였다.
본 시험예 4에서는 미성숙 사과 추출물과 황금 추출 바이칼린 혼합물의 항균 효과를 검토하기 위하여, 대장균(Escherichia coli), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 프리피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)에 대한 생육저해환 형성을 관찰한 결과를 표 6과 도 3 내지 도 7에 나타내었다. 하기 표 6에 나타난 것처럼, 테스트 농도(시료 3 mg/disc)에서 미성숙 사과 추출물을 단독으로 사용한 시료(대조구)는 5종의 균종에서 모두 항균활성을 나타내지 않았다. 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린의 혼합물을 첨가한 시료 중 시료 8 내지 15에서는 대장균, 표피포도상구균 및 칸디다 알비칸스 대한 항균활성이 관찰되었으며, 황색포도상구균 및 프리피오니박테리움 아크네에 대한 활성은 나타나지 않았다.
Strains 대조구 시료 7 시료 8 시료 9 시료 10 시료 11 시료 12 시료 13 시료 14 시료 15
대장균 - - 2 mm 8 mm 11 mm 13 mm 15 mm 16 mm 16 mm 16 mm
표피포도상구균 - 2 mm 4 mm 11 mm 14 mm 17 mm 18 mm 19 mm 19 mm 19 mm
황색포도상구균 - - - - - - - - - -
칸디다 알비칸스 - - 3 mm 9 mm 13 mm 15 mm 16 mm 18 mm 18 mm 18 mm
프리피오니박테리움 아크네 - - - - - - - - - -
시험예 5: 항염증 효과 측정
(1) 일산화질소(Nitric oxide) 저해활성 측정
항염증 유발인자인 NO 생성 억제능에 대해 평가는 Raw 264.7 cell line으로부터 생성된 일산화질소의 양은 필리쉬(Feelish)의 방법을 이용하여 다음과 같이 실험하였다.
시료는 미성숙 사과 추출물 및 미성숙 사과 추출물에 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 것을 각각 70% 에탄올을 이용하여 10 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 75 ug/ml 및 100 ug/ml의 농도가 되도록 제조되었다. 세포 배양액 중에 존재하는 이산화질소(NO2)를 그리스(Griess) 시약을 이용하여 측정하였으며, 배양된 세포에 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 처리해 염증을 유발시켜 이산화질소가 생성된 세포배양 상등액 100ul와 그리스 시약 100ul을 혼합해 10분 동안 반응시킨 후 상기 농도별로 제조된 시료를 첨가하여 10분 동안 반응시킨 다음 540 nm 파장의 빛에서 흡광도를 측정하였다.
도 8에 나타난 것처럼 미성숙 사과 추출물에 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 혼합물(시료 11)이 미성숙 사과 추출물만을 사용하는 것보다 NO 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 도 8에서 Con은 상기 제조된 추출물 시료를 첨가하지 않은 배양 세포를 측정한 것이고, NC는 리포폴리사카라이드를 처리하지 않아 염증이 유발되지 않은 배양 세포를 측정한 것이다.
(2) 웨스턴 블롯에 의한 iNOS 단백질 발현량 측정
iNOS는 평소에는 세포내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증 반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.
시료는 미성숙 사과 추출물에 바이칼린을 7:1의 중량비로 혼합한 것을 각각 70% 에탄올을 이용하여 5 ug/ml, 10 ug/ml 및 25 ug/ml의 농도가 되도록 제조되었다. iNOS의 발현 측정은 토우빈(Towbin)의 웨스턴 블롯를 이용하여 다음과 같이 실험하였다. Raw 264.7 세포에 리포폴리사카라이드(LPS)와 각 농도의 시료를 처리한 후 용균(lysis) 완충용액을 이용하여 세포(cell)를 용균하여 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 단백질(protein)을 얻었다. 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 정량하였다. 얻어진 단백질은 SDS폴리아크릴아미노 겔(SDS-polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동 시킨 후, 니트로셀룰로우즈 멤브레인(Nitrocellulose membrane)으로 트랜스블로팅(transblotting)하였다. 1차 항체로서 안티-iNOS 폴리클로날 안티바디(Anti-iNOS polyclonal antibody)를 이용하여 멤브레인에 처리한 후, 호스래디쉬 페록시다아제(horseradish peroxide)가 부착되어 있는 2차항체 안티-래빗 IgG(anti-rabbit IgG)를 가하여 인핸스드 케미루미네신스 디텍션(Enhanced chemiluminescence detection)을 이용하여 iNOS의 발현을 측정하였다.
상기 측정 결과는 도 9에 나타난 바와 같다. 도 9에서 Nor은 리포폴리사카라이드를 처리하지 않아 염증이 유발되지 않은 배양 세포를 측정한 것이고, Con은 염증이 유발된 배양 세포에 상기 제조된 미성숙 사과 추출물에 바이칼린이 혼합된 시료를 첨가하지 않은 배양 세포를 측정한 것이다. 도 9에서 알 수 있듯이 미성숙 사과 추출물에 바이칼린을 혼합한 시료는 iNOS를 저해함으로서 염증을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 미성숙 사과(unripe apple) 추출물 및 바이칼린(baicalin)을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 또는 항염증을 위한 화장료 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 피부미백, 항산화 또는 주름개선을 위한 화장료 조성물은 미성숙 사과 추출물 100 중량부를 기준으로 바이칼린이 3 내지 10 중량부로 포함된 것을 특징으로 하는 피부미백, 항산화 또는 주름개선을 위한 화장료 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 항균 또는 항염증을 위한 화장료 조성물은 미성숙 사과 추출물과 바이칼린이 7:0.5 내지 1.5의 중량비로 포함된 것을 특징으로 하는 항균 또는 항염증용 화장료 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 항균 효과는 대장균(Escherichia coli), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 항균 효과인 것을 특징으로 하는 항균 또는 항염증용 화장료 조성물.
  5. 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 또는 항염증을 위한 약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 피부미백, 항산화 또는 주름개선을 위한 약학적 조성물은 미성숙 사과 추출물 100 중량부를 기준으로 바이칼린이 3 내지 10 중량부로 포함된 것을 특징으로 하는 피부미백, 항산화 또는 주름개선을 위한 약학적 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 항균 또는 항염증을 위한 약학적 조성물은 미성숙 사과 추출물과 바이칼린이 7:0.5 내지 1.5의 중량비로 포함된 것을 특징으로 하는 항균 또는 항염증용 약학적 조성물.
  8. 제 5 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 항균 효과는 대장균(Escherichia coli), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 항균 효과인 것을 특징으로 하는 항균 또는 항염증용 약학적 조성물.
  9. 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 또는 항염증을 위한 식품 조성물.
PCT/KR2016/015027 2016-12-08 2016-12-21 미성숙 사과 추출물 및 바이칼린을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 항산화, 주름개선, 항균 및 항염증을 위한 조성물 WO2018105803A1 (ko)

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