KR20060083295A

KR20060083295A - 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20060083295A
Application number: KR1020050003764A
Authority: KR
Inventors: 한송희; 김광수; 최근호; 이승화
Original assignee: 나드리화장품주식회사
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2006-07-20
Also published as: KR100675753B1

Abstract

본 발명은 안정화된 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 바이칼린과 Octadecenedioic acid 및/또는 옥타코사놀과 Thioctic acid(보다 정확하게는 1,2 Dithiolane-3-pentanoic acid)가 코클레이트의 인캡슐레이션됨으로써 종래의 리포좀보다 분리 및 변색이 거의 일어나지 않고 시간 및 온도에 따른 포집효율 감소도 최소화되어 매우 안정성이 뛰어나며, 미백 및 주름개선에 매우 우수한 기능성 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다. 이를 위해 본 발명은 미백효과 및 주름개선효과가 탁월한 화장료 조성물에 있어서, 바이칼린 및 Octadecenedioic acid 중 적어도 하나의 미백원료를 포함하고, 옥타코사놀 및 thioctic acid 중 적어도 하나의 주름개선원료를 포함하며, 상기 미백원료 및 상기 주름개선원료를 코클레이트(chochleate)에 포집하여 안정화시킨 것을 특징으로 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

코클레이트, 미백, 주름개선, 안정성, 포집효율, 리포좀

Description

기능성 화장료 조성물{FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION}

도 1은 본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물에 사용되는 코클레이트를 제조하기 위한 모식도.

도 2는 본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물에 사용되는 코클레이트의 구조 모식도 및 Cryo-TEM 촬영사진.

도 3은 본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물에 사용되는 코클레이트 안정성 시험 결과를 나타낸 그래프.

도 4는 종래 리포좀의 구조 모식도 및 Cryo-TEM 촬영사진.

도 5는 종래 리포좀의 안정성 시험결과를 나타낸 그래프.

도 6은 Thioctic acid, 옥타코사놀의 섬유아세포 증식능 비교실험 결과를 나타낸 그래프.

도 7은 Thioctic acid와 옥타코사놀의 콜라겐 생합성 효과 실험결과를 나타낸 그래프.

도 8은 제조예 3과 비교제조예 2의 포집효율의 감소정도를 나타낸 그래프.

본 발명은 안정화된 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 바이칼린과 Octadecenedioic acid 및/또는 옥타코사놀과 thioctic acid가 코클레이트의 인캡슐레이션됨으로써 종래의 리포좀보다 분리 및 변색이 거의 일어나지 않고 시간 및 온도에 따른 포집효율 감소도 최소화되어 매우 안정성이 뛰어나며, 미백 및 주름개선에 매우 우수한 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 여성들의 화장품의 기능에 대한 욕구가 높아짐에 따라 화장품의 기본 기능인 청결 및 미적 기능뿐만 아니라, 밝고 흰 피부로의 미백 효과, 피부의 주름 개선 및 억제 효과 등을 가진 고기능성 제품이 등장하고 있다.

그러나 기능성으로 고시된 원료는 한정적일 뿐만 아니라 화학적 불안정성, 사용상의 난이성, 제형기술의 복잡성 및 피부 자극성 등으로 인해 화장료의 원료로 이용하기에 어려운 것들이 많다. 이에 따라 안정성을 향상시키기 위한 캡슐레이션에 대한 중요성이 부각되고 있다. 이러한 캡슐레이션은 산소, 수분, 빛, 열 등에 불안정한 기능성 원료들의 안정화나, 피부에 침투되어 좋은 효과를 나타내기 위해 delivery system이 필요하게 되었다.

화장품에서 가장 널리 사용되는 delivery system으로 리포좀이 있다. 리포좀은 phosphatidyl : choline, ethanolamine, serine, sphingomyelins, cardiolipins, plasmalogens, phosmalogens 등과 같은 다양한 인지질로 구성되어 2분자 막을 형성하는 폐쇄 소포체이다. 이러한 리포좀은 생체막 모델 시스템을 이용하여 체내에서 분해가 가능하고 세포 독성이 없으며, 화학적 결합없이 생리활성 물 질을 포집할 수 있고, 화학적으로 민감한 분자를 보호하고 선택적 투과성과 지연성이 우수하다. 리포좀의 분포와 특성을 상황에 따라 지질의 성분, 크기, 전하투과성, 표면리간드 변화 등을 조절가능하며, 친수성 부분과 소수성 부분이 동시에 존재하여 수용성 약물과 지용성 약물 모두를 포집할 수 있다.

그러나 리포좀은 화장품 원료의 필수인 계면활성제 존재 하에서 불안정하여 안정화 시스템이 필요하며, 포집 효율 등의 문제점이 있다.

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 기존 리포좀을 이용한 화장료 중 그 포집효율을 높이기 위하여 레시틴을 이용한 특이 구조의 코클레이트를 개발하여 포집효율을 극대화 하였으며 미백에 탁월한 효과가 있는 것이 밝혀진 바이칼린, Octadecenedioic acid 및 주름개선 및 항산화, 탄력 등의 효능이 있는 thioctic acid , 옥타코사놀 등을 내부에 포집하여 용도에 따라 주름개선 및 미백에 우수한 효과를 나타내는 기능성 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물은 미백효과 및 주름개선효과가 탁월한 화장료 조성물에 있어서, 바이칼린 및 Octadecenedioic acid 중 적어도 하나의 미백원료를 포함하고, 옥타코사놀 및 thioctic acid 중 적어도 하나의 주름개선원료를 포함하며, 상기 미백원료 및 상기 주름개선원료를 코클레이트(chochleate)에 포집하여 안정화 시킨 것을 특징으로 한 다.

바람직하게는 상기 미백원료는 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%이거나 상기 주름개선원료는 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것을 특징으로 한다.

더욱 바람직하게는 상기 미백원료 및 주름개선원료는 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

상술한 바와 같이, 리포좀은 화장품 원료의 필수인 계면활성제 존재 하에서 불안정하여 안정화시스템이 필요하며, 포집 효율 등의 문제점이 있어서, 포집효율을 극대화하는 여러 가지 리포좀에 대한 연구가 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로 안정하고 포집효율도 뛰어난 코클레이트(cochleate)에 대하여 연구하였다. Cochleate란 "달팽이 껍질 같은"이라는 의미를 가진 것으로서, 이를 이용한 기술은 Biodelivery sciences International 업체의 Mannino박사가 처음 개발한 것으로 현재 제약 분야에서 일부 사용되고 있다. 코클레이트는 일반 리포좀이 포스포 리피드의 헤드부분을 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)을 사용하는 대신 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine)을 이용하여 만든다. 콜린은 (+)차지를 가지고 있는 반면, 세린은 (-)차지를 가지고 있는데 여기에 2가의 칼 슘(Ca⁺⁺)이 더해지면 세린의 (-)차지와 칼슘의 (+)차지가 네트워킹 되면서 결정성의 스크롤(scroll)같은 독특한 구조의 코클레이트가 형성된다. 일단 이 결정 구조가 형성되면 칼슘이 충분히 존재하는 한 이 구조는 안정되어 열리지 않는다. 또한 산(acid)에 의해 더욱 안정화되어 편리한 경구 투여도 가능하다. 이러한 코클레이트 결정은 무수성(anhydrous)으로서 수용성 환경에 놓여지더라도 물이 안으로 들어오지 않으며 산소도 이 결정 구조에 들어갈 수 없다. 따라서 리포좀 보다 월등한 안정성을 가지고 있으며 리포좀의 경우, 냉동건조시 구조가 파괴되지만 코클레이트는 기본 구조를 유지하기 때문에 오랜 기간 저장도 가능하다. 코클레이트는 세포막-융합 중간체 구조로서 표적 세포막에 가까이 다가가면 코클레이트 바깥층과 세포막 사이에서 융합이 일어난다. 이러한 융합을 통해 코크리트 구조내에 포함된 일부 성분이 표적 세포의 세포질로 전달되며 이것은 생체내 자연적인 융합 기작을 이용하여 약물을 표적에 전달하는 기술이다. 코클레이트는 면역학적으로 아무런 활성이 없으며 단지 중성의 전달체 역할을 할 뿐 약물 전달에 있어서는 생체 프로세스를 그대로 이용하고 있어 고유의 장점을 제공하고 있다.

상술한 바와 같이 코클레이트는 리포좀의 장점은 모두 가지고 있으면서 리포좀의 단점인 안정성과 포집효율 면에서 보완 가능하다. 옥타코사놀은 소맥배아유, 알팔파, 사과, 포도과피, 쌀겨 등에 극소량 함유된 물질로 미국 일리노이 대학의 크래톤 박사에 의해 생리활성물질로 발견되었다. 20년 동안 42개 항목의 평가시험에 의해 옥타코사놀은 에너지를 방출하는 활성인자로써 체력증진, 근육기능의 향 상, 기초대사의 향상 등에 주요한 영향을 주는 것으로 확인되었으며 최소한 이의 효능을 얻기 위해서는 6주간의 지속적인 섭취가 필요하다고 하였다. 옥타코사놀은 극히 미량으로 생리작용을 나타내는 물질이고, 천연계에도 미량으로 밖에 존재하지 않기 때문에 추출하기 어려워 가격도 고가이다. 옥타코사놀의 생리활성에 관한 연구결과를 출판한 사례에 의하면 여러 기능성을 보고 하였다. 옥타코사놀은 긴 탄소사슬에 알콜기를 가진 왁스류의 물질이며, 백색 결정으로 식물잎의 여러 기능에 대해 보호막의 기능, 내구력, 정력, 체력의 증진, 반사신경, 예민성의 향상, 스트레스의 영향에 대한 저항성의 향상, 성호르몬의 자극, 근육경련의 감소, 심장근육을 포함한 근육기능의 향상, 수축기 혈압의 저하, 기초대사율의 향상을 가지고 있다. 황금의 플라보노이드 성분인 바이칼린, 바이칼레인은 항알러지, 항박테리아 및 항바이러스와 같은 다양한 생물학적 활성을 가지며, 그밖에 lipoxygenase의 저해, 마이크로솜의 지질과산화 반응 억제, 산소라디칼 생성의 저해, 그리고 활성산소로 인한 섬유아세포 손상 억제 등의 항산화 활성이 보고되었다.

이에 본 출원인들은 리포좀의 불안정성과 포집효율이 낮은 문제점을 해결하기 위하여 부단히 노력한 결과, 리포좀의 장점을 모두 살리고 안정성과 포집효율을 높인 구조를 구성하여 화장품에 사용할 경우, 피부에 유용한 성분의 포집효율을 극대화 시켜 자극이 거의 없으면서도 안정하고 지속적인 효과가 있음을 알아내어 본 발명을 완성하게 되었다.

바이칼린은 생약재 황금(黃芩)에서 추출한 융용성 물질로서 한방에서 기관지 천식, 아토피성 피부염, 고지혈증 및 동맥경화증과 같은 알러지성 염증질환을 치료 하기 위한 치료제로 사용되고 있는 물질이다(Zhuing Miao외, 1997, BBB).

[실시예]

[시험예 1]

시험예 1은 코클레이트의 유용성 물질의 내부 포집 방법에 대한 것이다. 먼저, 포집 물질로서 바이칼린(Baicalin), Octadecenedioic acid, Thioctic acid(보다 정확히는 1,2 Dithiolane-3-pentanoic acid), 옥타코사놀을 택하였다. 각각의 원료를 함유하는 코클레이트 형성 과정 도 1에 나타내었다. 포스파티딜 세린500mg, 콜레스테롤 300~100mg과 바이칼린, Octadecenedioic acid, Thioctic acid, 옥타코사놀을 각각 200~400mg을 메탄올과 클로로포름(chloroform)의 1:1 비율의 혼합물에 용해한 후 증발건조기(evaporator)로 용매를 제거하여 lipid 필름을 형성시켰다. 이 지질 필름을 버퍼(buffer ; PBS, TES) 혹은 물을 넣어 40~45℃로 가온한 상태에서 스웰링(swelling)하여[10mg lipid/㎖] 반투명의 ㎖V (Multilamellar Vesicles)를 형성시킨 후 초음파 분쇄기를 이용하여 SUV(Small- unilamellar Vesicles)로 만든다. 이 리포좀 용액에 100mM 염화칼슘(CaCl₂) 수용액을 지질과 염화칼슘 수용액의 비율이 2:1로 하여 천천히 첨가하고 여분의 3mM 칼슘 수용액을 넣어 코클레이트를 형성시켜 본 발명에 사용하였다.

[실험예 1]

바이칼린, Thioctic acid, Octadecenedioic acid, 옥타코사놀을 함유한 코클레이트의 크기를 측정한다. 시험예 1의 코클레이트를 각각 Water, TES[N- Tris[hydroxymethyl]- methyl-2-aminoethane-sulforic acid]buffer, PBS[Phosphatidyl saline]buffer를 이용하여 스웰링 시켜 바이칼린 코클레이트의 입자 크기를 측정하였다. 그 측정 결과를 표 1에 나타내었다. 사용한 buffer 종류에 따른 사이즈의 크기가 가장 작게 나타내어 피부 침투 등에 효과적일 수 있으므로 본 발명에 물을 buffer로 사용한다.

[표 1]

	Water	PBS	TES
	Size(nm)	Size(nm)	Size(nm)
바이칼린	80.7	121.6	158.1
Octadecenedioic acid	82	132.5	174.2
thioctic acid	95	154	168
옥타코사놀	71.2	108.5	120.6

[실험예 2]

코클레이트의 구조를 확인한다. Cryo-TEM은 수용액 상태의 샘플의 구조를 그대로 관찰할 수 있다는 큰 장점을 갖고 있기 때문에 cryo-TEM을 이용하여 시험예 1의 코클레이트의 구조를 관찰하였다. 샘플은 holey carbone이 coating된 grid에 로딩하고, blotting에 의해 얇은 수용액 필름을 형성시킨 후 coolant안으로 빠르게 떨어뜨려 입자가 포함되어 있는 얇은 수용액 필름의 시료를 얼려서 고정시켰다. 얼려진 그리드(grid)는 cryo-holder로 보호하여 cryo-TEM안으로 넣고, 전자빔에 의한 radiation의 피해를 최소화하기 위해서 낮은 dose의 전자빔에 의해 관찰하고 촬영하였다. 도 2에 나타난 바와 같이 내부가 돌돌 말린 양탄자 같은 모양의 코클레이트가 형성됨을 확인할 수 있었다.

[실험예 3]

기능성원료를 포함하는 제법의 안정성을 시험한다. 시험예 1의 코클레이트를 사용하여 Water로 교반한 각각의 코클레이트를 HPLC를 이용하여 포집 효율을 정량 하였다. 시험예 1의 코클레이트 서스펜션 100㎕ 취하여 6000rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리(Heraeus, Labofuge 400R)하였다. 원심분리 후 상층액은 버리고 위와 같은 방법으로 원심분리하여 3회 버퍼로 세척을 반복하여 순수한 코클레이트만 남긴다. 여기에 EDTA (pH 9.5)와 100㎕ 트리톤 엑스 100(Triton X-100, 10%)을 첨가하여 코클레이트의 구조를 해체시켜 기능성 원료들이 떨어져 나오도록 한 후 HPLC를 이용하여 그 양을 계산한다. HPLC의 칼럼은 C-18 revese phase column을 사용하고 이동상은 MeOH : CH₃COOH : H₂O = 48 : 1 : 52 (v/v/v) 혼합용액을 사용하였다. 각각의 코클레이트를 50℃ 인큐베이터에서 1 내지 3개월간 보관하면서 그 포집효율을 관찰하여 그 결과를 도 3에 표시하였다. 제조 직후 70%에 이르던 기능성 원료의 내부포집도는 3개월 후에도 50~60%이상의 안정성을 나타내었다.

[비교예 1]

비교예 1에서는 리포좀을 제조하였다. 염화칼슘 수용액을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 시험예 1과 동일한 방법으로 리포좀을 제조하였다.

[비교예 2]

비교예 1의 리포좀을 실험예 2와 같은 방법에 의하여 cryo-TEM으로 리포좀의 구조를 관찰하고 촬영하였다. 도 4에 cryo-TEM으로 촬영한 리포좀의 구조와 그 모식도를 나타내었다.

[비교예 3]

비교예 3에서는 리포좀의 포집 효율 및 안정도 실험을 행하였다. 비교예 1의 리포좀을 사용하고 물을 이용하여 교반하여 만든 리포좀을 실온과 50℃ 인큐베이터에서 1~3개월간 보관하면서 HPLC를 이용하여 그 포집효율을 각각의 코클레이트와 비교 관찰하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 리포좀의 포집효율은 코클레이트가 50~70%의 포집효율을 나타내는 것에 비해 10 ~15% 정도로 매우 낮은 효율을 나타내었고, 3개월 후에 50℃에서 10%이하로 떨어져 코클레이트에 비해 포집량이 매우 적다는 것을 알 수 있어, 안정성이 매우 떨어지는 것으로 확인할 수 있었다.

[실험예 4]

실험예 4에서는 바이칼린, Octadecenedioic acid의 타이로시나제 저해 시험을 행하였다. 바이칼린과 Octadecenedioic acid 및 기존에 화장품에 상용하고 있는 미백 원료인 알부틴과의 타이로시나제 저해 효과를 측정하였다.

효소 타이로시나제는 버섯류(Mushroom)로부터 추출된 것으로, 시그마(SIGMA T7755)사의 것을 사용하였다. 먼저 기질인 타이로신을 증류수에 0.3mg/㎖의 용액으로 만들고, 이 용액을 1.0㎖씩 시험관에 넣고, 여기에 인산칼륨(potassium phosphate) 완충용액(0.1M, pH 6.8) 1.0㎖와 미백 효능 바이칼린 및 octadeceneoctadecenedioic acid 코클레이트의 단계별 희석용액 0.9㎖씩을 반응용액에 넣은 뒤 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 희석용매는 에탄올과 물을 6:4로 사용하며, 대조군으로 미백 효능 바이칼린 및 Octadecenedioic acid대신 알부틴 0.9㎖ 넣은 것을 사용하였다. 이 반응액에 2,500unit/㎖의 티로시나제 용액 0.1㎖씩을 넣고 다시 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시킨 후 반응액이 든 시험관을 얼음속에 넣어서 급냉하여 반응을 중지시키고, 흡광 광도계로 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하여 다음의 수학식 1에 의거하여 각 추출물을 타이로시나제 저해 효과를 구하였다.

[수학식 1]

실험예 1에서 확인된 미백 효능 바이칼린 및 Octadecenedioic acid의 티로시나제 저해율은 표 2와 같이 실험농도 각각 0.1%와 0.05%에서 97.67%와 98%이며, 미백화장료로 널리 쓰이고 있는 알부틴의 경우 동일 농도에서 35.87%만을 나타내었다.

[표 2]

구분 농도(Conc./㎖)	티로시나제 저해율(%)
구분 농도(Conc./㎖)	Baicaline	Octadecenedioic acid	Arbutin
5		48.53	-
1	57.21		45.32
0.5		75.68	45.21
0.1	97.67		35.87
0.05		98.02	32.11
0.01	87.21		20.15
0.005		95.32	11.02
0.001	35.12		6.01
0.0005			2.31

[실험예 5]

실험예 5에서는 Thioctic acid, 옥타코사놀의 섬유아세포 증식능 비교실험을 행하였다. Thioctic acid와 옥타코사놀을 Sigma사(O3379, 1-Octacosanol)와 화장품 원료 업체로부터 공급받아 실험예 5에 사용하였다. 사람 피부 유래 섬유아세포를 이용하여 그 세포 증식을 실험하였다. 섬유아세포는 -70℃ 또는 액체질소에 보관된 세포를 증식시켜 사용하였다. T-75 플라스크에 배양되어진 섬유아세포를 PBS로 2-3회 세척하고, 트립신을 이용하여 부착된 세포를 떨어뜨린 후, 1500rpm에서 5분간 원심분리(Heraeus, Labofuge 400R)하여 세포를 모았다. 원심분리 후 상층액은 버리고 침전세포에 10㎖의 DMEM(10% FBS)을 첨가하여 고르게 섞어준다. 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정하여 10⁴ea/well 정도의 세포를 96well의 각 well에 200㎕씩 분주 한다. 37℃, 5% CO₂에서 배양하면서 well 면적의 약 50%정도의 세포가 자라면 새로운 DMEM(FBS10%)으로 배지를 교환해 주면서, 각각을 농도별로 각 well에 2반복으로 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 각 시간대 별로 세포를 배양하였다.

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma)를 PBS에 2㎎/㎖가 되도록 녹여 냉장고에 보관해서 사용하였으며, 각 well에 MTT시약(5㎎/㎖ in PBS)을 20㎕씩 처리하고 2시간 더 배양한 후 상등액을 버리고 150㎕의 디엠에스오(DMSO)를 넣고 잘 섞어주거나 또는 0.04N-HCl 100㎕를 넣고 섞어준다. 모든 단계가 끝난 후 ELISA leader(μQuant, Bio-Tek instrument INC.)를 이용해 560nm에서 측정한다(Reference : 650nm). 그 측정결과를 도 6에 표시하였으며 thioctic acid와 옥타코사놀의 효과는 처리구 0.01%에서 48시간 후 Control 대비 각각 70% 및 82%정도의 세포 증식효과를 보였다.

[실험예 6]

실험예 6에서는 Thioctic acid와 옥타코사놀의 콜라겐 생합성 효과를 실험하였다. T-75 플라스크에 배양되어진 섬유아세포를 PBS로 2~3회 세척하고, 트립신을 이용하여 부착된 세포를 떨어뜨린 후, 1500rpm에서 5분간 원심분리(Heraeus; Labofuge 400R)하여 세포를 모았다. 원심분리 후 상층액은 버리고 모아진 세포에 10㎖의 DMEM(10% FBS)을 첨가하여 고르게 섞어준다. 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정하여 10⁴ea/well 정도의 세포를 96well의 각 well에 200㎕씩 분주 한다. 37℃, 5% CO₂에서 배양하면서 well 면적의 약 50%정도의 세포가 자라면 새로운 DMEM(FBS10%)으로 교환해 준다. 콜라겐 합성능 측정키트(Procollagen Type-I C-peptide EIA kit (Takara, MK 101))를 사용하였다. 면역학적 방법을 이용한 측정법을 위하여 100㎕의 Ab-POD conjugate 용액을 하나의 웰에 옮겨 분주하고 , 20㎕의 세포배양액 또는 표준용액을 첨가한다. 호일 등으로 96well 플레이트를 싸서 37℃에서 3시간 정도 배양한다. 3시간 경과 후 각 well에 들어있는 용액을 모두 걷어 내고 PBS로 4번정도 씻어준다. 세척 단계 후에 100㎕의 기질용액을 각 웰에 첨가하여 20~30℃에서 15분간 배양한다. 최종 단계로 반응종료용액 인 1N H₂SO₄를 100㎕ 첨가하여 부드럽게 섞어준다. ELISA leader로 흡광도를 측정하여 그 결과를 사용하게 되는데 반응종료용액이 첨가되어진 플레이트를 약 1시간 정도 실온에서 보관한 후 450nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 7에 표시하였으며 세포증식능력의 결과와 마찬가지로 그 증강효과가 크게 나타남을 볼 수 있다.

[제조예 1 내지 10, 비교제조예 1 내지 6]

제조예 1 내지 10 및 비교제조예 1 내지 6은 하기 표 3-1 및 3-2의 원료를 사용하여 통상적인 화장료의 제조방법에 따라 에멀젼을 제조하였다.

[표 3-1]

제조예 원료명	제조예 1	제조예 2	제조예 3	제조예 4	제조예 5	비교제조예 1	비교제조예 2	비교제조예 3
폴리솔베이트-60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄스테아레이탄	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스테아린산	1	1	1	1	1	1	1	1
스쿠알란	5	5	5	5	5	5	5	5
세토스테아릴알콜	2	2	2	2	2	2	2	2
세틸 옥타노에이트	5	5	5	5	5	5	5	5
카보머	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
트리에탄올 아민	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
글리세린	5	5	5	5	5	5	5	5
바이칼린/Octadecenedioic acid 코클레이트	0.1	1	5	10	15	-	-	-
바이칼린/Octadecenedioic acid 리포좀	-	-	-	-	-	1	5	10
향	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량
방부제	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
총합	100	100	100	100	100	100	100	100

[표 3-2]

제조예 원료명	제조예 6	제조예 7	제조예 8	제조예 9	제조예 10	비교제조예 4	비교제조예 5	비교제조예 6
폴리솔베이트-60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄스테아레이탄	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스테아린산	1	1	1	1	1	1	1	1
스쿠알란	5	5	5	5	5	5	5	5
세토스테아릴알콜	2	2	2	2	2	2	2	2
세틸 옥타노에이트	5	5	5	5	5	5	5	5
카보머	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
트리에탄올 아민	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
글리세린	5	5	5	5	5	5	5	5
옥타코사놀/thioctic acid코클레이트	0.1	1	5	10	15	-	-	-
옥타코사놀/thioctic acid 리포좀	-	-	-	-	-	1	5	10
향	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량
방부제	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량	적당량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
총합	100	100	100	100	100	100	100	100

[실험예 7]

실험예 7은 미백효과를 측정하는 실험을 행하였다. 건강한 남녀 30명의 실험대상자의 양팔 하박에 2×2㎠의 부위를 설정하고 실험 부위에만 자외선이 조사되도록 알루미늄 호일을 팔에 두르고, 10cm의 거리에서 UVGL-58(Upland, USA)램프를 이용하여 0.5 × 10^-7erg/㎤/회로 1일 1회씩 연속 3회 조사하였다. 조사 전에 실험대상 부위를 70% 알콜 수용액으로 잘 세척하였고 조사 후 자외선 조사 부위에 미백 효능 펩타이드를 함유한 제조예 1-5를 1일 3회씩 3주 도포 하였다. 3주 도포 후에 육안으로 색소 침착도를 판정하고, 실험군이 대조군(비교제조예 1-3)에 비해 색소침착을 얼마나 억제하였는가를 효과좋음, 보통, 효과 없음의 3단계로 평가하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 4]

효과 제조예	효과있음	보통	효과없음
제조예 1	19명	8명	3명
제조예 2	25명	5명	0명
제조예 3	28명	2명	0명
제조예 4	27명	3명	0명
제조예 5	24명	6명	0명
제조예 6	18명	10명	2명
비교제조예 1	6명	5명	19명
비교제조예 2	10명	8명	12명
비교제조예 3	2명	4명	24명

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 바이칼린 및 Octadecenedioic acid 코클레이트의 미백 효능이 1중량% 내지 10중량% 함유된 화장료의 경우 90%이상의 미백효과를 볼 수 있다.

[실험예 8]

실험예 8은 보습, 탄력효과 측정실험을 행하였다. 보습효과 측정실험은 고주 파 임피던스법을 이용하기 위하여 SKICON-200(피부표면 수분량 측정기, IBS)을 이용하여 측정하였다. 건강한 남녀 20명에게 시험개시 2주전에 이들의 다리에 보습제 또는 로숀 사용을 금지시킨 후 15일간 제조예 3-4 및 비교제조예 2를 매일 도포하였다. 약간 건조한 피부 또는 벗겨질 정도로(flaking and peeling)심하게 건조한 피부를 갖는 시험대상을 시험에 도입시켰다. 시험대상을 하루에 두번씩 3주간 한번은 아침에 또 한번은 저녁에 조성물로 처리한다. 2 내지 3일후에 상당한 개선이 이루어지고, 21일간 방치시킨다. 21일후에 시험대상 20명의 평균값은 하기한 기준에 따랐다.

점수	판정기준
0	심하게 건조한 피부(flaking, peeling)
1	약간 건조한 피부
2	가볍게 건조한 피부
3	매끄러움, 건조한 증거가 전혀없음

탄력효과 측정 실험은 상기 제조예 1-5 및 비교제조예 1-3 에서 제조된 화장수에 대하여 피부 탄력회복 효과를 비교하기 위하여, 30 ~ 40대 여성 100명을 대상으로 20명을 1개군으로 하여 5개군으로 나누어 측정하였다. 실험 방법은 비교제조예 2 및 제조예 3 내지 4를 매일 1회 1개월간 도포한 후, 1개월 뒤 피부탄력을 측정할 수 있는 큐토미터(cutometer; SEM575, Courage+Khazaka electronic GmbH. Germany)를 이용하여 얼굴 부위의 탄력을 측정하여 도포하기 전과 비교하였다. 보습 및 탄력효과에 대한 판정 기준에 의해 표 5에 그 결과를 나타내었다.

[표 5]

효과 제조예	보습력		피부탄력개선도(%)
효과 제조예	처리전	처리후	피부탄력개선도(%)
제조예 3	1.2점	2.7점	72
제조예 4	1.2점	2.6점	70
비교제조예 2	1.2점	2.0점	44

[실험예 9]

실험예 9는 주름완화 측정실험을 행하였다. 각 제조예 별로 20-40세의 건강한 여성 20명을 대상으로 1일 2회 비교제조예 2와 제조예 3을 눈가에 도포한 후, 눈꼬리 부위를 측정대상으로 하였다. 실리콘고무(Silflo사)를 이용하여 레플리카를 제작하고 0, 30, 60일 되는 당일에 Skin Visiometer(C+ K사)를 이용하여 영상 분석을 실시 하였다. 평가방법은 주름이 확실히 개선(1), 약간의 주름개선(2), 주름개선 없음(3)의 3가지 주름 측정치를 기준으로 하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6]

효과 제조예	주름완화(1)	약간의 주름완화(2)	효과없음(3)
제조예 3	20명	0명	0명
비교예 2	0명	2명	18명

표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제조예 3에서 비교제조예 2에 비하여 90%의 주름개선 효과를 보였다.

[실험예 10]

실험예 10은 인체 첩포 실험을 행하였다. 실시예의 원료에 대한 기타의 피부자극 및 부작용이 없음을 확인하기 위하여 상기의 제조예 1-10, 비교제조예 1-6 에서 확인된 코클레이트의 미백 및 주름개선 효능 효과를 기준으로 인체에 대한 첩포실험(Patch test)을 실시하였다. 검사는 건강한 성인 남여 30명으로 등 부위에 핀 쳄버(Finn chamber)를 이용하여 알루미늄 원판속에 화장제품을 직접 넣거나 종이 disc에 묻혀서 40㎕를 처리하여 이를 스켄포어 테잎(scanpore tape)으로 피부에 고정한다. 반응은 등에 첩포 24시간 후에 피부에서 떼어내고 그 뒤 4시간 후 그 결과를 판정하였다. 홍반과 부종의 정도에 따른 수치로 나타내며, 판정기준은 아래에 있는 국제접촉피부염 연구위원회(International Contact Dermatitis Research Group;ICDRG)의 기준에 의한다(Wooding et al, 1967; Rietschell, 1982; Fischer & Maibach, 1984; Aberer et al, 1993).

점수	판 정 기 준
0	발적없음
1	발적(erythema)
2	발적 및 구진(papules)
3	발적, 구진 및 소수포(vesicles)
4	심한 부종 및 소수포

* 자극도(%) = (양성반응을 나타내는 반응도 / 자체모집단의 반응도) × 100

[표 7]

	제조예 3	제조예 4	비교제조예 2
자극도(%)	0.1	0.1	0.3

상기 표 7의 피부1차 자극성 시험결과 기타의 피부염증 또는 자극이 없었다.

[실험예 11]

본 발명에 따른 코클레이트와 리포좀을 함유한 화장료에 대한 제형의 안정성을 하기의 방법으로 측정하였다. 상기 제조예 3, 비교제조예 2를 20℃, 40℃, 50℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주동안 보관한 시료, 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 시료, -10℃에서 50℃를 순환하는 순환 챔버(1회/일)에 12주 동 안 보관한 시료에 대하여 분리, 변색 정도를, 20℃, 50℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주동안 보관한 시료의 포집 효율 감소 정도를 비교 측정하였다. 제품 분리 및 변색 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가한 시험물질의 분리 및 변색 정도를 하기 표 8에 나타내었다.

점수	제품 변색 평가 기준
0	변화 없음
1	극히 조금 분리(변색)
2	조금 분리(변색)
3	조금 심하게 분리(변색)
4	심하게 분리(변색)
5	극히 심하게 분리(변색)

[표 8]

온도	4℃	20℃	40℃	50℃	순환
제조예 3	○	○	○	○	○
비교제조예 2	○	1	2	3	3

상기 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 코클레이트를 함유한 제조예 3은 4℃, 20℃, 40℃, 50℃ 및 순환시험에서 변색이나 분리 증상이 없이 안정하였으나, 리포좀 제형을 함유한 비교제조예 2의 경우에는 분리(변색)가 일어나 불안정함을 알 수 있었다.

또한, 제조예 3과 비교제조예 2의 포집효율의 감소정도를 도 8에 나타내었다. 코클레이트 함유한 제조예 3은 처음 60%~70%에 달하던 포집효율이 50℃에서도 12주간 10%미만으로 감소하였지만, 리포좀을 함유한 비교제조예 2의 경우에는 포집효율도 작고 온도 안정성도 떨어진다. 이와 같이 일반 리포좀은 온도에 민감하여 분리나 변색이 일어난다. 그러나, 본 발명에서와 같이 활성물질을 코클레이트로 안정화시켜 제형에 적용하는 경우에는 분리 및 변색 반응이 거의 일어나지 않으며 시간 및 온도에 따른 포집효율 감소도 최소화됨을 알 수 있다.

본 명세서에서는 본 발명자들이 수행한 다양한 실시예와 분석실험 가운데 몇 개를 예만을 들어 설명하는 것이나 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고, 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물에 의하면, 바이칼린과 Octadecenedioic acid 및/또는 옥타코사놀과 thioctic acid가 코클레이트의 인캡슐레이션됨으로써 종래의 리포좀보다 분리 및 변색이 거의 일어나지 않고 시간 및 온도에 따른 포집효율 감소도 최소화되어 매우 안정성이 뛰어난 효과를 가지며, 미백 및 주름개선에 우수한 등의 효과를 가질 수 있다.

Claims

미백효과 및 주름개선효과가 탁월한 화장료 조성물에 있어서,

바이칼린 및 Octadecenedioic acid 중 적어도 하나의 미백원료를 포함하고,

옥타코사놀 및 thioctic acid 중 적어도 하나의 주름개선원료를 포함하며, 상기 미백원료 및 상기 주름개선원료를 코클레이트(cochleate)에 포집하여 안정화 시킨 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 미백원료는 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것으로 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 주름개선원료는 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 미백원료 및 주름개선원료는 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.