KR101437997B1

KR101437997B1 - 생캐비어 발효추출물 및 이를 함유하는 피부화장료

Info

Publication number: KR101437997B1
Application number: KR1020120095852A
Authority: KR
Inventors: 이충우; 강영기; 김미애; 양수옥; 유병국
Original assignee: 주식회사 유로코스텍
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-09-05
Also published as: KR20130089137A

Abstract

본 발명은 생캐비어(Caviar) 발효추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 (1) 생캐비어와 80로 가온된 물을 혼합한 후, 교반하는 단계; (2) 상온까지 자연 냉각시키는 단계; (3) 상기 단계에 고초균 및 발효 미생물을 접종하여 발효하는 단계; (4) 발효물을 숙성하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효방법으로서, 상기 방법에 의하여 제조된 발효물 및 이를 유효성분으로 함유하는 보습, 탄력, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
(색 인 어)
생캐비어 발효추출물, 보습, 탄력, 항아토피, 미백, 피부주름 개선효과, 항염증, 항산화, 화장료 조성물

Description

생캐비어 발효추출물 및 이를 함유하는 피부화장료 {Fermented caviar extract and its cosmetic usage}

본 발명은 생캐비어(Caviar) 발효추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 생캐비어 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 보습, 탄력, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 화장품 분야에서는 천연소재들을 이용한 발효 식품 및 화장품에 대한 관심이 증가되면서, 보습, 탄력, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부 주름 개선 등의 다양한 연구들이 활기를 띠고 있다.

발효는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해 또는 합성시키는 과정을 의미하며, 대표적인 발효 미생물로는 고초균, 유산균, 누룩균, 효모, 곰팡이, 초산균 등이 있다. 특히, 고초균은 Bacillus속 세균의 대표적인 균종으로 자연계의 토양, 물, 마른 풀 등에 널리 분포하고 내생 포자 형성능이 있으며, 장간균의 형태를 가지고 있는 Gram 양성균이다. 또한, 호기성 또는 통성혐기성 균주로서 카탈라아제 생산, 카제인과 젤라틴 분해능 및 전분 분해능이 있어 글루코오스, 아라비노오스, 크실로오스, 만니톨 등 다수의 탄수화물을 분해하여 산을 생성할 수 있는 특징을 갖는다. 증식 최적온도는 30~40℃, 최적 pH는 5.0 내지 7.5에서 생장이 활발하다.

발효액 추출물은 다른 어떠한 용매를 사용하지 않고, 발효와 숙성과정을 거쳐 천연소재가 함유하고 있는 당성분을 알콜로 변화시키고, 천연소재 속에 들어있는 플라보노이드, 비타민C, 비타민P, 아미노산, 카테킨 등의 유효성분에 대한 추출효율을 높일 수 있다. 미생물 발효에 의해서 천연소재의 효능을 높이고, 안전성 문제를 해결하기 위한 시도는 다양한 식품, 화장품, 약품 등의 개발에 있어서 중요한 의미를 갖는다. 고초균 , 유산균 및 효모 등의 발효공정에 의해 흡수가 용이한 저분자 물질로의 전환, 불안정하거나 불활성인 형태에서 활성 형태로 전환되는 과정에서 천연소재의 보습 및 탄력성 증진, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부주름 개선 효과를 극대화 시킬 뿐 아니라 추출된 이후에 발생될 수 있는 자극적이거나 독성이 나타날 수 있는 천연소재를 안정화 시키거나 독성을 줄임으로써, 효과적으로 안정한 유도체로 전환시킬 수 있다.

철갑상어(Acipenser sinensis)는 담수어류 중에서 가장 크며, 뼈가 없고 연골로 되어 있으며, 4억 5천년~3억 5천년 전에 기원된 어종으로 Acipenseridae과에 속한다. 철갑상어는 주로 러시아의 카스피해, 흑해, 아좁해, 발틱해, 유럽, 이란에 넓게 분포되어 자생하는 어종으로, 현재 26종이 알려지고 있다. 산란은 매년하지 않고, 일생에 몇 번만 산란하며 산란기 전에 채집하고, Beluga, Ossetra 및 Sevruga가 생산하는 알을 상품으로 인정한다.

일반적으로 사용되는 캐비어는 철갑상어의 알을 소금에 절인 것으로써, 갓 잡은 상어에서 떼어낸 알 덩어리를 정교한 체에 조심스럽게 걸러 알로부터 기타 조직과 지방을 제거함과 동시에 4~6%의 소금을 뿌리고 조미한다. 캐비어는 알의 크기가 크고 은회색 빛깔이 연하면 연할수록 질 좋은 것으로 인정하며, 짠맛과 쓴맛이 없고 연하고 순한 맛을 가져야 제대로 된 품질이다. 신선한 캐비아는 1~3℃ 정도에서 저장해야 하는데, 그렇지 않으면 품질이 급속히 떨어지게 되므로 저온살균이 보다 효과적인 저장방법이다.

철갑상어의 알인 캐비어는 단백질, 지방, 당, 비타민, 미네랄 등의 영양 성분으로 구성되어 있고, 특히 칼로리가 낮으며 단백질 함량이 높은 완벽한 영양식품으로 보고되어 있다. 캐비어에 함유된 단백질은 필수 아미노산인 루신, 이소루신, 라이신, 아르기닌 등과 알라닌, 세린, 글루타믹 애씨드, 아스파틱 애씨드 등의 아미노산들이 안정적으로 균형을 이루고 있어 세포 대사의 필수 요소로서 작용하며, 인간의 피부 단백질 구조와 유사하여 여타 성분보다 피부 흡수가 빠름은 물론이고, 흡수된 후에도 피부에 지속적인 영양을 보급하는 데 탁월한 효과를 발휘하여 피부 및 모발과 강한 친화력을 가지고 있다. 또한, 캐비어는 단백질 함량이 높고 소화가 용이하기 때문에 수술환자의 회복, 수술환자의 조혈작용, 임산부, 어린이 기관발달, 소아의 구루병을 예방 및 치료에 이용하기도 한다. 또한, 오메가3 지방산이 다량 함유되어 있어 노화방지제로 이용되는 등 식용 및 건강식품으로 이용되고 있다. 캐비어에 함유된 비타민은 지용성인 비타민인 A, D는 물론, 수용성 비타민인 B2, B6, B12 및 C등이 모두 포함되어 있고, 지방은 대부분 콜레스테롤과 레시틴으로 구성되어 있어 진피의 지질막을 재생시키는데 작용한다고 밝혀져 있다.

본 실험에서 사용된 캐비어는 품질보존을 위해 일반적으로 거쳐야 하는 염장과정을 거치지 않은 신선한 생캐비어를 사용함으로써, 캐비어의 영양성분 및 기능성 성분의 손실 없이 이용할 수 있는 장점이 있다.

캐비어 및 철갑상어에 관한 연구로는 캐비어 발효추출물을 이용한 뉴트리티브 젤 타입 화장품의 제조방법, 캐비어, 굴껍질, 해감(해양침전물)으로부터 추출한 미네랄 복합 성분을 함유하는 항노화 피부외용제 조성물, 캐비어 발효추출물을 포함하는 나노좀의 유액 조성물 및 그를 포함하는 화장료 조성물, 캐비어, 음이온수 함유 나노 리포좀 화장료 조성물, 해삼추출물을 이용하여 주름개선 효과를 가지는 기초화장용 영양크림의 제조방법, 피부노화방지용 화장료 조성물, 캡슐형의 고품질 인조캐비어의 제조, 철갑상어를 이용한 통조림의 제조방법 등 식품 뿐만 아니라 화장품 분야까지 확장되고 있지만, 아직 도입 단계이고, 발효 공정을 통해 유효성분을 극대화 시킬 수 있는 생캐비어의 발효추출물에 관한 연구는 없는 실정이다.

이에 본 발명은 생캐비어 발효추출물이 가지는 생리활성물질 탐색하고, 발효공정을 통한 생캐비어 발효추출물의 유효성분의 함량을 증진시킨 화장료 조성물에 관한 것으로서, 생캐비어 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 보습, 탄력, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 개발하게 되었다.

본 발명은 생캐비어 발효추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 고초균과 발효미생물(유산균, 효모) 중 하나 또는 둘 이상을 통한 발효공정에 의한 발효추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 보습, 탄력, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 발효공정을 통한 생캐비어 발효추출물을 만들고, 이를 함유한 보습, 탄력, 항염증, 항산화, 항아토피, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물이다.

본 발명에 사용된 캐비어는 (1) 생캐비어와 80℃로 가온된 물을 혼합한 후, 교반하는 단계; (2) 상온까지 자연 냉각시키는 단계; (3) 상기 단계에 고초균 및 발효 미생물을 접종하여 복합 발효하는 단계; (4) 발효물을 숙성하는 단계; 로부터 얻은 발효물, 또는 그 발효물을 다시 일부 또는 전부 감압농축 및 동결건조하여 얻은 농축물, 또는 발효물 및 농축액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

캐비어 발효추출물은 생캐비어를 80℃로 가온된 물에 혼합하고, 상온까지 자연 냉각시킨 후 고초균 및 발효 미생물(유산균, 효모) 중 하나 또는 둘 이상을 접종하여 단독 또는 혼합한 발효공정을 통해 발효물을 수득하였으며, 발효 후 발효물을 감압농축 및 동결건조하여 사용하거나, 발효공정 수행 후 저온 숙성 또는 고온 숙성하는 공정을 포함할 수 있다.

상기의 발효공정은 고초균 및 발효 미생물(유산균, 효모) 중 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 한다. 배양액은 pH 4.0-5.0 내지 5.0-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 고초균, 유산균, 효모를 각각 10⁷- 10⁸ CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 25℃ 내지 50℃ 온도에서 18시간 내지 120시간 배양하였다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 발효물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않고 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 상기 생캐비어 발효추출물은 조성물 전체에 대하여 동결건조 중량 기준 0.001 내지 95 중량%로 조성물에 존재할 수 있다.

만약 상기 생캐비어 발효추출물이 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노좀 등의 제형으로 용액 또는 파우더 형태로 존재한다면 당업자는 상기 농도 범위 내에서 본 발명에 따른 조성물 내에 이 용액 또는 파우더의 양을 조절할 수 있을 것이다. 상기한 바와 같이 보습, 탄력개선, 항산화, 항염증, 항아토피 효과가 있는 미백 및 피부주름 개선 활성을 갖는 조성물로 가공된 화장품, 식품, 의약품 등에 제공된다.

본 발명의 생캐비어 발효추출물은 피부외용제로서 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 유연화장수, 영양화장수, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 오일, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디 오일 등의 기초 화장료 및 페이스 파우더, 파운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 화장료를 세정제로 사용할 경우, 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다. 이하 본 발명을 하기 위해 실시예와 실험예를 통하여 상세하게 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 생캐비어 발효추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 생캐비어 발효추출물은 고초균 및 발효 미생물(유산균, 효모) 중 하나 또는 둘 이상을 이용한 발효공정을 통하여 생캐비어 발효추출물을 생성하고, 이는 발효공정 과정에서 생성되는 효소에 의해 고분자 화합물의 저분자 화합물로의 전환으로 피부에 유용한 물질이 증가하여 보습력, 탄력증진, 항염증, 항아토피, 미백 효과에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 생캐비어 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화 활성, 콜라겐의 생성, MMP-1(Matrix metalloproteinase; 콜라겐의 분해를 촉진하는 효소)의 저해 효과가 우수하여 피부 주름 개선 효과를 발휘한다.

<실시예 1> 생캐비어 고초균 발효추출물의 제조

생캐비어에 10배 양의 80℃ 증류수를 혼합 및 교반하여 용해한 후, 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 배양액 pH를 5.0-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 고초균을 10⁷- 10⁸ CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 25℃ 내지 50℃ 온도에서 18시간 내지 120시간 배양하였다. 발효를 종료하기 위해 80℃에서 10분간 열을 가하여 고초균의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<실시예 2> 생캐비어 발효 미생물(유산균과 효모) 발효추출물의 제조

생캐비어에 10배 양의 80℃ 증류수를 혼합 및 교반하여 용해한 후, 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 배양액 pH를 4.0-5.0 내지 5.0-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 유산균과 효모를 각각 10⁷-10⁸CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 25℃ 내지 50℃ 온도에서 18시간 내지 120시간 배양하였다. 발효를 종료하기 위해 80에서 10분간 열을 가하여 유산균 및 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<실시예 3> 생캐비어 복합 발효추출물의 제조

생캐비어에 10배 양의 80℃ 증류수를 혼합 및 교반하여 용해한 후, 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 배양액 pH를 4.0-5.0 내지 5.0-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 고초균, 유산균, 효모를 각각 10⁷-10⁸CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 25℃ 내지 50℃ 온도에서 18시간 내지 120시간 배양하였다. 발효를 종료하기 위해 80℃에서 10분간 열을 가하여 고초균, 유산균, 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<비교예 1> 생캐비어 일반추출물의 제조

대조군으로 사용된 생캐비어 일반추출물은 발효 공정 없이 동일한 추출 공정을 통해 수득하였다. 즉, 생캐비어의 10배 양의 80℃ 증류수를 혼합 및 교반하여 용해한 후, 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나 여과된 상등액을 생캐비어 일반추출물로 사용하였다.

<비교예 2> 염장 캐비어 일반추출물의 제조

대조군으로 사용된 염장 캐비어 일반추출물은 발효 공정 없이 염장과정만 추가한 후, 동일한 추출 공정을 통해 수득하였다. 즉, 생캐비어에 5%의 소금을 뿌려 조미하고, 10배 양의 80℃ 증류수를 혼합 및 교반하여 용해한 후, 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나 여과된 상등액을 염장 캐비어 일반추출물로 사용하였다.

<실험예 1> 항산화 활성

생캐비어 발효추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여, DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 라디칼 소거능을 사용하였다.

500 uM DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1:1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 20 분간 방치하였다. Microplate reader (Chromate, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1을 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출하였다. 이때 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 1 mM의 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

표 1 에 나타난 바와 같이 비교예 1의 염장과정을 거치지 않은 일반추출물은 비교예 2의 염장과정을 거친 일반추출물에 비해 항산화 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 1 - 실시예 3의 염장 과정을 거치지 않은 발효물을 비교해 볼 때, 실시예 1과 실시예 2는 비슷한 수준으로 항산화 활성을 보이는 한편, 실시예 3의 고초균, 유산균, 효모의 혼합 균주로 이용한 발효물은 각각의 발효물보다 강한 항산화능이 높음을 알 수 있었다.

[수학식 1]

DPPH 라디칼 제거율(scavenging, %) = (A - B) / A x 100

상기 식에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도임

생캐비어 발효추출물의 항산화 활성

농도(%)	항산화력(%)
농도(%)	비교예1	비교예2	실시예1	실시예2	실시예3
0.001	22%	13%	33%	30%	45%
0.01	47%	35%	70%	71%	85%
0.05	65%	60%	85%	88%	98%

<실험예 2> 피부주름 개선 효과

<2-1> 콜라겐 생합성 평가

시료에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 g/mL)과 10% Fetal bovine serum(FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)와 F12 Nutrient mixture(Gibco)를 3:1로 혼합한 후, 37℃ , 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, DMEM: F12 Nutrient mixture를 3:1로 섞은 무배지에 시료를 농도 별로 처리하여 48-72시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 200 uM을 positive control로, UV(+)군을 Negative control로, 배지만 처리한 그룹을 control로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 시료 처리 후 48-72시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였고, 수거한 배지는 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio Inc. MK101)를 이용하여 새로 생성된 콜라겐 양을 측정하였다. Antibody-POD conjugate solution 100ul를 각 well에 첨가하고, sample 이나 standard를 20ul씩 넣은 뒤 잘 섞어서 37℃에서 3시간 방치하였다. 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400ul로 4번 세척하였다. 제거 후 기질용액 100ul를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 stop solution 100ul 첨가하여 부드럽게 섞어주었다, microplate reader(Chromate, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한 후 표준 농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다(표 2).

표 2 에 나타난 바와 같이 생캐비어 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 생캐비어 발효추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 캐비어 일반추출물을 함께 비교하였다. 캐비어 일반추출물의 경우 비교예 2의 염장 캐비어 일반추출물 보다 비교예 1의 생캐비어 일반추출물에서 새로 생성되는 콜라겐양이 증가하였으며, 실시예 1 - 실시예 3의 생캐비어 발효추출물의 경우 캐비어 일반추출물보다 매우 강한 콜라겐 합성능을 보임으로써 자외선에 의한 항노화 및 주름 개선의 효과를 확인할 수 있었다

생캐비어 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 콜라겐 생합성

농도(%)	콜라겐 합성 (%)
농도(%)	UV (-)	UV(+)	As 200uM	비교예1	비교예 2	실시예1	실시예2	실시예3
0.0004	100	46	65	52	48	68	65	85
0.002	100	46	65	61	54	78	80	93

<2-2> MMP-1 저해 평가

Collagen을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 collagen type I을 분해하는 MMP-1(Matrix metalloproteinase I, collagenase)으로 이를 측정하기 위해 MMP-1 assay를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 g/mL)과 10% Fetal bovine serum(FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium(DMEM, Welgene, Korea)와 F12 Nutrient mixture(Gibco)를 3:1 로 혼합한 후, 37℃ , 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다.2x10⁵농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate 에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, DMEM 배지: F12 Nutrient mixtur를 3:1로 섞은 무혈청 배지에 시료를 농도별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 200uM을 positive control로, UV(+)군을 Negative control로, 배지만 처리한 그룹을 control로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 시료 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 MMP-1 측정 키트(RPN 2610, Amersham Bioscience, UK)를 이용하여 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Anti-MMP1 antibody로 코팅된 96 well plate에 buffer를 well 하나에 첨가하여 blank로 삼고, 배지 중에 유리된 샘플과 표준액 100ul를 각각의 well에 넣는다, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 3회 반복해서 세척 한 후 물기를 완전히 제거한다. 100ul peroxide conjugate를 첨가하고, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 30분간 shaking 하면서 반응시킨다. 100ul 1M H₂SO₄로 반응을 중지시킨 후 microplate reader(Chromate, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다(표 3).

표 3 에 나타난 바와 같이 생캐비어 발효추출물들의 자외선의 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 생캐비어 발효추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 캐비어 일반추출물을 함께 비교하였다. 실시예 1 - 실시예 3의 생캐비어 발효추출물로 처리했을 때, 캐비어 일반추출물에 비해 매우 강하게 MMP-1 활성이 저해되었고, 이는 콜라겐 생합성 결과(표 2)와 일치하는 양상을 보인다.

생캐비어 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 MMP-1 활성 저해도

농도(%)	MMP-1 (% of control)
농도(%)	UV(+)	As 200uM	비교예1	비교예 2	실시예1	실시예2	실시예3
0.0004	100%	73%	92%	96%	70%	77%	62%
0.002	100%	73%	80	84%	53%	56%	41%

<실험예 3> 염증반응 억제효과

사람 피부각질세포(human keratinocyte)를 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신 (100 g/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고, 37℃를 유지하면서 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 수득된 피부각질세포를 6 well plate에 각 웰당 3x0⁵개로 분주한 다음 세포배양 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 25 mJ/Cm₂ 량의 자외선을 조사한 후, 시료를 첨가하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후 배양액을 회수하여 염증성 사이토카인인 TNF-a의 분비량을 측정하였다. 측정결과는 표 4 에 나타내었다.

표 4 를 참조하면, 생캐비어 발효추출물의 경우 자외선에 의해 분비가 증가되는 염증성 사이토카인인 TNF-a(Tumor necrosis factor a)의 분비를 감소시키며, 캐비어 일반추출물 뿐만 아니라 양성 대조군으로 사용한 Dexamethason 보다 훨씬 효과가 우수함을 알 수 있다.

생캐비어 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 TNF-a의 분비량 측정

농도(%)	TNF-a (% of the untreated control)
농도(%)	UV(+)	Dexa 1mM	비교예1	비교예2	실시예1	실시예2	실시예3
0.0004	100	68	88	90	76	71	62
0.002	100	68	72	78	41	45	33

* Dexa: Dexamethason

<실험예 4> 항아토피 활성 측정

(1) 디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스의 유도

5 내지 6주령이 된 Nc/Nga 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후, 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하여 1% DNCB용액 200ul를 등 부위에 도포하고, 4일 후, 1주일에 2 내지 3번씩 4 내지 5주 동안 0.2% DNCB용액 150ul를 등 부위에 도포하여 디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스를 유도하였다. 상기 유도된 디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스에 대하여 스테로이드 제제인 덱사메타손(dexamethasone), 비교예 1 내지 비교예 2와 실시예 1 - 실시예 3에 따라 캐비어 일반추출물 및 생캐비어 발효추출물을 10mg/kg 으로 하여 3주일간 매일 경구로 투여하였으며, 관능평가를 실시한 다음 혈액을 취하고 등 부위의 피부를 절제하여 10% 포르말린 용액에 담아 보관한다. 혈액은 혈구를 침전한 뒤, 혈청만을 취하여 -80℃에 냉동 보관하였다.

(2) 혈중 면역글로불린-E(lgE)에 대한 분비 억제능

상기 (1)에서 유도된 디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스를 약 2주 간격으로 모세혈관을 이용해 안 점막에서 혈액을 채취하여 혈중의 혈중 면역글로불린-E(lgE)를 정량하였다. 보통 질환이 유도되어 임상적 점수가 6 내지 7점을 넘어가면 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도가 10ug/ml 이상이 되므로, 채취한 혈액을 약 200 내지 500배 희석하여 측정하였다. 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도는 ELISA 방법을 이용하여 디니트로클로로벤젠(DNCB) 처리가 끝날 때, 그리고 치료 약물의 처리가 끝날 때, 각각 2번 실시하였다. 혈청 내 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도는 약물 처리전의 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도와 처리 후의 혈중 면역글로불린-E(lgE) 농도를 비교하여 감소한 비율을 구한 다음, 약물을 처리한 군의 감소비율과 비교하여 유의성을 검증하였다.

표 5 에서도 확인 할 수 있듯이, 생캐비어 발효추출물 10mg/kg을 경구투여한 군에서 캐비어 일반추출물 뿐만 아니라 스테로이드 제제인 덱사메타손(dexamethasone)을 처리한 군 보다도 혈중 면역글로불린-E(lgE)의 분비가 억제되는 것을 확인하였다.

생캐비어 발효추출물의 혈중 면역글로불린-E(lgE)에 대한 분비 억제능

Total IgE (pg/ml)
NC	Dexa 1mM	비교예1	비교예2	실시예1	실시예2	실시예3
150	105	112	118	92	95	80

* Dexa: Dexamethason

(3) 인터페론 감마(IFN-)에 대한 분비 억제능

상기 (1)에서 유도된 디니트로클로로벤젠(DNCB)이 유발된 아토피성 마우스의 비장세포를 분리하고 ELISA를 이용하여 상층액에서 생캐비어 발효추출물에 따른 인터페론 감마(IFN-)의 양을 측정하였다.

그 결과, 표 6 에서도 확인 할 수 있듯이 생캐비어 발효추출물 10 mg/kg을 경구투여한 군에서 캐비어 일반추출물 뿐만 아니라 스테로이드 제제인 덱사메타손(dexamethasone) 처리한군 보다도 인터페론 감마(IFN-)의 분비가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

생캐비어 발효추출물의 인터페론 감마(IFN-)의 분비 억제능

인터페론 감마 (pg/ml)
NC	Dexa 1mM	비교예1	비교예2	실시예1	실시예2	실시예3
1112	2450	2950	3100	2480	2550	1980

* Dexa: Dexamethason

<실험예 5> 데시게이터를 이용한 보습력 측정

본 발명에 따른 캐비어 일반추출물 및 생캐비어 발효추출물 5 mL 을 플레이트에 넣은 후 완전 건조 된 CaCl₂를 흡습제로 하여 35℃ 데시케이터에서 무게를 측정하였다. 무게는 총 144시간 동안 측정하였다. 화장품 배합의 보습성분으로서 일반적으로 사용되는 1,3-부틸렌 글리콜(BG)과 발효추출물을 비교하여 실험결과를 나타내었다. 그 결과를 표 7 에 나타내었다.

[수학식 2]

보습력(%) = ( 1 - S/S) x 100

여기서, S는 초기 표본의 무게이고, S는 초기 표본의 무게에서 최종 표본의 무게를 차감한 값이다.

생캐비어 발효추출물의 데시게이터를 이용한 보습력 측정

시간(hr)	보습력 (%)
시간(hr)	BG	비교예1	비교예2	실시예1	실시예2	실시예3
24	100	100	100	100	100	100
48	92	92	91	96	95	97
72	85	87	86	93	92	95
120	82	78	74	91	90	93
144	74	70	68	87	86	92

표 7 에 나타낸 바와 같이, BG에 비해 본 발명에 따른 생캐비어 발효추출물의 보습력이 시간 경과에 따라 유의적으로 높았으며, 캐비어 일반추출물과 비교해 볼 때 보습력이 훨씬 높게 보존됨을 확인할 수 있다.

<실험예 6> 에멀젼 베이스 제조

위 실시예 및 비교예 실험결과 효과가 가장 높게 나타난 생캐비어 발효추출물(실시예 3)과 염장한 캐비어 일반추출물 보다 효과가 높은 생캐비어 일반추출물(비교예 1)을 함유한 화장료를 포함한 에멀젼 베이스를 제조하였다. 본 실험에 사용된 화장료는 유화형 화장액 형태이고, 그 조성은 표에 나타낸 바와 같다. 우선 표에 기록되어 있는 생캐비어 발효추출물 및 생캐비어 일반추출물과 기타 함량을 중량별로 첨가한 후 (가)상을 가열하여 90℃로 유지하고 정제수(30%)를 90℃까지 가열한 후 (가)수상 중에 천천히 첨가하여 호모믹서로 균일하게 유화한다. 그 후 실온까지 냉각하고 남은 (나)상의 정제수를 첨가하고 균일하게 교반하여 화장액을 제조하였다.

에멀전 베이스 제조

구분	성분	중량%
가	생캐비어 발효추출물 및 생캐비어 일반추출물	20
	글리세린	3.00
	디소듐이디티에이	0.02
	폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.5
	세테아릴알코올	0.5
	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.0
	폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.60
	방부제	적량
나	정제수	to 100

<실험예 7> 피부 탄력 효과에 대한 측정

본 발명에 따른 화장품의 피부 탄력 효과에 대한 검사를 측정하기 위하여, 건강한 30-40대 성인 남녀 10명을 대상으로 하였다. 실험예 6 에서 제조된 화장품을 이용하였으며, 시험 초기(baseline), 2주, 4주, 6주에 항온항습실(온도 20-22℃, 상대습도 40-60%)에서 피검자는 세안 후 1시간 동안 피부를 안정화한 다음, 측정을 수행하였다. 피부의 탄력도는 cutometer SEM 474(Courage+Khasaka, Germany)로 눈가 부위를 측정하였으며, 측정시 음압은 500 mbar, 흡입시간은 2sec, 반복 측정 횟수는 5회로 측정하여 평균 수치를 이용하였다.

피부 탄력성 측정

시험군	피부탄력도(%)
생캐비어 발효추출물	56
생캐비어 일반추출물	20

Cutometer SEM 474로 측정하여 피부탄력도를 측정한 결과, 생캐비어 일반추출물에 비해 생캐비어 발효추출물의 피부탄력도가 3배 정도 더 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 8> 피부 안전도 시험

본 발명에 따른 화장품의 피부 안전성 검사를 측정하기 위하여 통상의 패취(patch test) 테스트를 실시하였다. 연구대상은 건강한 30-40대 성인 남녀 10명을 대상으로 팔 하박부 안쪽에 실험예 6 에서 제조된 화장품을 첩포한 후 48시간 후에 첨포를 제거하여 피부의 상태(자극 정도)를 관찰하였다. 그 결과는 하기 표 10 에 나타내었다.

피부 안전도 측정

시험군	패취테스트(사람수)
시험군		***	**	*
생캐비어 발효추출물	48시간 후	0	0	15
생캐비어 일반추출물	48시간 후	0	1	14

*** : 매우 자극이 심함.

** : 약간의 자극이 있음

* : 자극이 없음(음성)

<실험예 9> 인체 피부에 대한 미백 효과 시험

연구대상은 건강한 30-40대 성인 남녀 10명을 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다. 조사 후 시험물질 각 1% (용매는 1,3-부틸렌글리콜:에탄올=7:3), 대조군으로 알부틴 2%, 용매(vehicle)만을 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 10 주 동안 상태 변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다. 도포 개시시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(L*)를 하기 수학식 3 에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 11 에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 L*의 비교로 판정하는데, L* 값이 2 정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5 정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

[수학식 3]

L* = 도포완료시점에서의 L* 값 - 도포개시 할 때 L* 값

피부에 대한 미백 효과

시험군	멜라닌 생성 억제율(%)
생캐비어 발효추출물	2.80±0.11
생캐비어 일반추출물	1.16±0.12
용매(Vehicle)	0.50±0.14
알부틴	1.56±0.13

상기 표 11 의 결과로부터, 본 발명에 의한 생캐비어 발효추출물은 생캐비어 일반추출물 뿐만 아니라 양성대조군인 알부틴 보다 우수한 미백 효과를 보이는 것을 확인하였다.

Claims

생캐비어 추출물에 고초균, 유산균 및 효모의 혼합균주로 복합발효시킨 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 생캐비어 발효추출물의 건조 중량을 기준으로 조성물 전체에 대해 0.001 내지 95중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 발효추출물이 감압농축 및 동결건조된 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 발효추출물이 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노좀의 제형으로 제형화된 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형은 유연 화장수, 영양 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 수중유(O/W) 또는 유중수(W/O)형의 에멀젼, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 또는 비이온성 형태의 지질 소포체의 형태, 연고, .클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디오일 등의 기초 화장료, 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 등의 색조 화장료 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
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