KR20130107386A

KR20130107386A - 달팽이 발효추출물을 함유하는 피부화장료

Info

Publication number: KR20130107386A
Application number: KR1020120029091A
Authority: KR
Inventors: 이충우; 양수옥; 유병국; 강영기; 김미애
Original assignee: 주식회사 유로코스텍
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2013-10-02

Abstract

본 발명은 달팽이 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 달팽이 추출물에 고초군, 유산균, 효모 중에서 선택된 1종 이상의 균주를 접종하여 얻은 발효액을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부보습, 피부 탄력강화, 미백, 피부 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
[색인어]
달팽이 발효추출물, 보습, 탄력강화, 미백, 주름개선, 화장료

Description

달팽이 발효추출물을 함유하는 피부화장료{Fermented snail extract and its cosmetic usage}

본 발명은 달팽이 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부에서부터 순서대로 크게 표피, 진피, 피하지방 조직의 3개 층으로 구분되며, 자외선 및 외부 환경의 물리적, 화학적 자극으로부터 보호해 주는 기능을 한다. 특히 피부는 인체가 갖고 있는 약 65~70%의 수분이 체외로 증발되는 것을 조절해 주는 중요한 역할을 함으로써 피부가 부드럽고 촉촉한 상태를 유지할 수 있도록 한다. 그러나, 각종 스트레스, 환경오염, 생활 패턴의 변화, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가, 자외선에 의한 광노화, 폐경 등의 내인성 요인, 유전적인 요인, 환경적인 요인에 의해 섬유아세포의 분열 감소, 콜라겐 생합성 감소, MMP 생성의 증가 등이 발생하고, 피부의 탄력이 감소할 뿐만 아니라 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 윤기를 잃어 칙칙하게 보이는 등의 피부의 노화가 촉진된다. 상기 요인들에 의한 피부 노화로 유발되는 수분 보유력 감소, 콜라겐 합성의 감소와 MMP생성의 증가로 인해 피부 건성화 및 탄력 저하 현상이 초래된다.

이러한 피부 고민들을 해결하기 위해서, 최근화장품 분야에도 천연소재의 사용이 두드러지고 있으나, 통상의 방법으로 추출한 소재들은 원하는 피부 보습 효과가 미미할 뿐 아니라, 이러한 추출물을 얻기 위해서는 장시간이 소요되는 등의 문제점이 있어 실용성이 높지 않았다. 그러나, 발효액 추출물은 다른 어떠한 용매를 사용하지 않고, 발효와 숙성과정을 거쳐 천연소재가 함유하고 있는 당성분을 알콜로 변화시키고, 천연소재 속에 들어있는 플라보노이드, 비타민C, 비타민P, 아미노산, 카테킨 등의 유효성분에 대한 추출효율을 높임으로써, 천연소재의 효능을 높이고, 안전성 문제를 해결할 수 있다. 고초균, 유산균 및 효모 등의 발효공정에 의해 흡수가 용이한 저분자 물질로의 전환, 불안정하거나 불활성인 형태에서 활성 형태로 전환되는 과정에서 천연소재의 효능을 극대화 시키고, 이에 따라 훨씬 뛰어난 피부 보습 효과를 얻을 수 있다. 또한, 추출된 이후에 발생될 수 있는 자극적이거나 독성이 나타날 수 있는 천연소재를 안정화 시키거나 독성을 줄임으로써, 효과적으로 안정한 유도체로 전환시킬 수 있다.

달팽이(Acusta despecta sieboldiana)는 복족류 또는 달팽이과(Fruticiola sieboldiana)에 속하는 육산패류로 세계에 약 2만 종이 알려져 있다. 이동력이 타 생물에 비하여 현저하게 낮아 이동될 수 있는 가능성이 거의 없음에도 불구하고 국내 전 지역에 걸쳐 고루 분포하고 있다. 달팽이의 주요 영양성분은 단백질(54.29%), 지질(4.18%), 탄수화물(30.45%), 회분(4.07%) 등으로 알려져 있으며, 특히 단백질과 칼슘이 풍부하다. 달팽이에서 분비되는 끈끈한 점액을 구성하는 성분을 뮤신(Mucin)이라 하며 뮤신을 구성하고 있는 주성분은 콘드로이친황산(chondroitin sulfate)이다. 그 외에도, 달팽이 점액의 주요 함유물질인 알란토인(Allantoin)은 피부진정 및 모공수축작용이 있으며 글리콜산(Glicolic Acid)은 피부트러블 예방 효과가 있고 콜라겐(Collagen)과 엘라스틴(Elastin)은 피부탄력을 유지시켜주는 것으로 알려져 있다. 그 중, 콘드로이친황산은 글루쿠로네이트, 아세틸 갈락토사민(D-glucuronic acid, N-acetyl-D-galactosamine)과 황산기로 결합되어 있는 뮤코폴리사카라이드(mucopolysaccharide)의 한 종류이면서. 콘드로이친황산은 동물 등의 세포 간조직이나 신경 및 연골 조직 등에서 발견되어 왔으며 대부분 다른 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)과 함께 단백질에 공유결합하여 프로테오글리칸(proteoglycan)의 형태로 존재하고 있다. 주요 기능으로는 피부노화 방지, 윤기 나는 피부로 가꿀 수 있어 각종 피부 질환에 효과적이며, 조직 중의 수분을 유지시켜 주는 힘이 있어 고온에도 피부의 세포 조직의 수분유지와 재생 및 피부, 혈판, 내장의 탄력을 높이며, 혈액청정 작용으로 동맥경화 억제 및 예방, 성인병 예방 및 치료에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 또, 항 혈액응고, 관절조직 보호, 석회화 작용에 의한 뼈 형성, 항염증 및 진통효과, 각막보호, 세포전해질 조절, 세균감염 억제, 피로억제 작용, 항돌연변이 및 항암효과, 천식, 장기, 소갈, 구강염, 후두염 등에 효과를 보인다. 연령이 증가함에 따라 콘드로이친황산의 감소를 보이게 되며 특히 20대 이후부터는 급격히 부족하게 되어 각 생체조직 세포의 손상, 연결조직 약화, 세포 위축, 수분 감소 등이 일어나며 이로 인해 피부탄력성이 감소한다. 그러나, 콘드로이친황산을 충분히 공급해 주면 세포가 젊어지고 노화 방지나 강장 강정 효과가 생기는데, 발효공정을 통한 달팽이 발효추출물을 이용함으로서 뮤신과 콘드로이친황산의 수율 및 품질을 높일 수 있다.

최근에는 콘드로이친황산 및 달팽이의 생리활성에 관한 특징이 부각되면서 의약품, 화장품, 및 기능성 식품 소재로서 많은 연구가 진행되고 있다. 일예로, 달팽이의 조성 및 성분분석과 그것의 약리활성 연구로는 달팽이와 우렁이의 지방산 조성(1992), 진흙달팽이로부터 콘드로이친 황산염의 분리와 동정(1998), 거대 아프리카 달팽이, 알카티나풀리카에서 분리된 새로운 글루코사미노글리칸, 아카란황산의 약리활성(2002), 식용 달팽이로부터 항균성 물질의 분리 및 정제(2006), 달팽이 엑스분이 streptozotocin 유발 당뇨성 쥐의 혈중지질 성분에 미치는 영향(1994) 등이 있으며, 그 외 식용 달팽이를 주제로 한 건강보조식품의 제조방법(국내특허출원번호:10-1991-0006918; 10-1991-10000717; 10-1994-0002193; 10-1991-0018658; 10-1997-0005126; 10-2008-0068247), 달팽이 통조림 및 가공식품조성물의 제조방법(국내특허출원번호: 10-1995-0024592; 10-2000-0000542; 10-1999-0065355), 식용달팽이를 주재료로한 엑기스 제조방법(국내특허출원번호: 10-1992-0017219; 10-1993-0006708; 10-1994-0008032; 10-1993-0012924;10-1995-0046690) 등이 있다. 그 중, 특히 화장료에 관한 특허로는 보습과 미백효과를 위한 산 달팽이로부터 추출한 생진액에 함유된 콘드로이친황산을 이용한 비누제조방법(국내특허출원번호: 10-1999-0013201), 달팽이로부터 추출한 뮤신성분을 이용한 화장품의 제조방법(국내특허출원번호: 특1993-0012590), 천연소재를 이용한 마사지 크림 및 그의 제조방법(국내특허출원번호: 10-2001-0041777), 달팽이 생진액을 이용한 화장료 제조방법(국내특허출원번호: 10-1999-0055371), 홍삼 먹인 달팽이 점액의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물(국내특허출원번호: 10-2010-0085003), 피부건조방지용 보습화장료 조성물(국내특허출원번호: 특1993-0011219), 미백 및 항산화 효과가 있는 콘드로이친과 상황버섯추출물을 함유한 화장품 조성물(국내특허출원번호: 10-2000-0060868), 달팽이의 추출물에 의한 미용 마스크팩의 제조(국내특허출원번호: 10-1993-0023332) 등이 있다.

현재까지 달팽이에 관한 연구들이 활발하게 진행되어 왔으나, 발효 공정을 통해 유효성분을 극대화 시킬 수 있으면서 자극적이거나 독성이 나타날 수 있는 천연소재를 안정화 시킬 수 있는 달팽이 발효추출출물에 관한 연구는 전무하다.

이에 본 발명은 발효공정을 통한 달팽이 발효추출물이 가지는 유효성분의 함량을 증진시킨 화장료 조성물에 관한 것으로서, 달팽이 발효추출물을 함유하는 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 개발하게 되었다.

본 발명은 달팽이 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 고초균, 유산균 및 효모 중에서 선택된 1종 이상의 균주를 접종하여 얻은 발효액을 함유하는 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 발효공정을 통한 달팽이 발효추출물을 만들고 달팽이 발효추출물을 함유한 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선용 화장료를 제공함을 목적으로 한다.

본 발명에 사용된 달팽이는 5% 소금물로 세척한 한 후, 약간의 식초를 탄 5% 소금물에 20-30초 담근 다음 건져내기를 3-4회 반복함으로써, 오물이나 불순물을 완전히 제거한다. 상기와 같은 전처리 과정을 거침으로써 달팽이 체내에 서식하는 기생충을 살균하고, 체내에서 분비되는 점액의 표출을 막을 수 있다. 달팽이를 한번 더 깨끗한 물에 세척하여 소금과 식초성분을 제거시켜 준 후, 추출공정에 들어간다. 달팽이 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, 80℃에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 추출하였다.

발효방법은 고초균, 유산균, 효모를 이용하여 달팽이 추출물을 혼합 발효시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 배양액을 pH 4.0-5.0 내지 5.0-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 고초균, 유산균, 효모를 각각 107- 108 CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 25℃ 내지 50℃ 온도에서 18시간 내지 120시간 배양하였다. 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 발효를 종료하기 위해 80℃에서 10분간 열을 가하여 고초균, 유산균, 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다. 상기 방법으로 얻어진 발효물은 숙성하는 단계를 거칠 수 있으며, 이로부터 얻은 발효물 또는 그 발효물을 다시 일부 또는 전부 감압농축 및 동결건조하여 얻은 농축물, 또는 발효물 및 농축액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않고 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 상기 달팽이 발효추출물은 조성물 전체에 대하여 동결건조 중량 기준 0.001 내지 95 중량%로 조성물에 존재할 수 있다.

만약 상기 달팽이 발효추출물이 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노좀 등의 제형으로 용액 또는 파우더 형태로 존재한다면 당업자는 상기 농도 범위 내에서 본 발명에 따른 조성물 내에 이 용액 또는 파우더의 양을 조절할 수 있을 것이다. 상기한 바와 같이 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선 활성을 갖는 조성물로 가공된 화장품, 식품, 의약품 등에 제공된다.

본 발명의 달팽이 발효추출물은 피부외용제로서 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 유연화장수, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디 오일 등의 기초 화장료 및 파운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 화장료를 세정제로 사용할 경우, 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 위해 실시예와 비교예 및 실험예를 통하여 상세하게 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 달팽이 발효추출물을 함유하는 조성물의 피부보습, 피부탄력 강화, 미백, 피부 주름 개선 효과를 확인하였으며, 인체 피부 자극시험 평가를 통해 목적을 달성하였다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 달팽이 발효추출물를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 달팽이 발효추출물은 콘드로이친황산을 포함한 유효성분을 포함하고, 고초균, 유산균, 효모 중에서 선택되는 1종 이상의 균주를 이용한 발효공정을 통하여 생성된 발효액은 발효공정 과정에서 생성되는 효소에 의한 고분자 화합물의 저분자 화합물로의 전환 및 피부에 유용한 물질이 증가하여 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 효과에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 달팽이 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화 활성, 콜라겐의 생성, MMP-1(Matrix metalloproteinase - 콜라겐의 분해를 촉진하는 효소)의 저해 효과가 우수하여 피부 주름 개선 효과를 발휘한다.

<실시예 1> 달팽이 발효추출물의 제조

달팽이를 5% 소금물로 세척한 것을 약간의 식초를 탄 5% 소금물에 20-30초 담근 다음 건져내기를 3-4회 반복함으로써, 오물이나 불순물을 완전히 제거한다. 소금성분으로 달팽이 체내의 기생충이 소독되며, 식초성분에 의해 달팽이 체내에서 분비되는 점액의 표출을 막을 수 있다. 상기와 같은 전처리 과정을 거친 달팽이는 한번 더 깨끗한 물에 세척하여 소금과 식초성분을 제거시켜준다. 달팽이 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, 80℃에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 추출하였다. 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 배양액 pH를 4.0-5.0 내지 5.0-7.5 로 조정하고, 미리 배양된 고초균, 유산균, 효모를 각각 107- 108 CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 25℃ 내지 50℃ 온도에서 18시간 내지 120시간 배양하였다. 발효를 종료하기 위해 80℃에서 10분간 열을 가하여 고초균, 유산균, 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<비교예 1> 달팽이 일반추출물의 제조

대조군으로 사용된 달팽이 일반추출물은 발효 공정 없이 동일한 열수 추출 공정을 통해 수득하였고, 전처리 공정은 달팽이 발효추출물과 동일하다. 건조 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, 80℃에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 추출하였다. 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<실험예 1> 달팽이 발효추출물에 함유된 콘드로이친황산의 함량 측정

콘드로이친황산은 건강기능식품공전에 따라 측정하였다. 즉, 시료 3g을 물을 가하여 혼합하고 100mL로 하여, 이 액 4mL를 정확히 취하여 물을 가해 20mL로 하고, 정량분석용 여지(Adventec. 5C)를 사용하여 여과한 것을 검액으로 하였다. 별도로 두 개의 비색관에 붕산나트륨황산 시약 5mL를 각각 넣고 얼음물로 충분히 냉각한 후 검액과 표준용액을 1mL를 시약 위에 주의하여 가하고 얼음물 속에서 냉각하였다. 각각에 카바졸시액 0.2mL를 정확히 가하여 혼합하고 수욕상에서 15분간 가열하고 얼음물로 실온까지 냉각한다. 이들의 액에 대하여 물 1mL를 사용하여 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여, microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 530nm에서 흡광도를 측정하였다.

콘드로이친황산 함량

시료명	콘드로이친황산 함량(%)
달팽이 발효추출물	42
달팽이 일반추출물	28

<실험예 2> 항산화 활성

달팽이 발효추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여, DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 라디칼 소거능을 사용하였다.

500 uM DPPH (2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1:1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 20 분간 방치하였다. Microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1를 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출하였다. 이때 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 1 mM의 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

수학식 1

DPPH 라디칼 제거율(scavenging, %) = (A - B) / A x 100

상기 식에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도임

달팽이 발효추출물의 항산화 활성

농도(%)	항산화력(%)
농도(%)	달팽이 발효추출물	달팽이 일반추출물
0.005	47%	36%
0.01	72%	65%
0.1	93%	88%

<실험예 3> 피부주름 개선 효과

<3-1> 콜라겐 생합성 평가

시료에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay 를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃ , 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio Inc. MK101) 를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. Antibody-POD conjugate solution 100ul를 각 well에 첨가하고, sample이나 standard를 20ul씩 넣은 뒤 잘 섞어서 37℃에서 3시간 방치하였다. 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400ul로 4번 세척하였다. 제거 후 기질용액 100ul를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 stop solution 100ul 첨가하여 부드럽게 섞어주었다, microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한 후 표준 농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다(표 3).

표 3 에 나타난 바와 같이 추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 달팽이 발효추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 달팽이 일반추출물을 함께 비교하였다. 달팽이 일반추출물 보다 달팽이 발효추출물로 처리하였을 때, 새로 생성되는 콜라겐양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

달팽이 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 콜라겐 생합성

시험군	procollagen conc.(ug/ml)
시험군	0.04%	0.2%
UV(+)	77
AS 25uM	101
달팽이 발효추출물	125	138
달팽이 일반추출물	115	123

<3-2> MMP-1 저해 평가

Collagen 을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 collagen type I을 분해하는 MMP-1 (Matrix metalloproteinase I, collagenase)으로 이를 측정하기 위해 MMP-1 assay 를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 MMP-1 측정 키트 (RPN 2610, Amersham Bioscience, UK) 를 이용하여 ELISA reader 로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Anti-MMP1 antibody로 코팅된 96 well plate에 buffer를 well 하나에 첨가하여 blank로 삼고, 배지 중에 유리된 샘플과 표준액 100ul를 각각의 well 에 넣는다, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 3회 반복해서 세척 한 후 물기를 완전히 제거한다. 100ul peroxide conjugate를 첨가하고, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 30분간 shaking 하면서 반응시킨다. 100ul 1M H₂SO₄로 반응을 중지시킨 후 microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다(표 4).

표 4 에 나타난 바와 같이 달팽이 발효추출물과 달팽이 일반추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴본 결과, 달팽이 일반추출물에 비해 달팽이 발효추출물 로 처리했을 때 새로 MMP-1 활성이 저해되었고, 이는 콜라겐 생합성 결과(표 4)와 일치하는 양상을 보인다.

달팽이 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 MMP-1 활성 저해도

시험군	MMP-1 (% of control)
시험군	0.04%	0.2%
UV(+)	100
AS 50uM	71
달팽이 발효추출물	92	78
달팽이 일반추출물	112	88

<실험예 4> 데시게이터를 이용한 보습력 측정

본 발명에 따른 달팽이 일반추출물 및 달팽이 발효추출물 5 mL를 플레이트에 넣은 후 완전건조 된 CaCl₂를 흡습제로 하여 35℃ 데시케이터에서 무게를 측정하였다. 무게는 총 144시간 동안 측정하였다. 화장품 배합의 보습성분으로서 일반적으로 사용되는 1,3-부틸렌 글리콜(BG)과 혼합추출물을 비교하여 실험결과를 나타내었다. 그 결과를 표 5 에 나타내었다.

수학식 2

보습력(%) = ( 1 - S/S) x 100

여기서, S는 초기 표본의 무게이고, S는 초기 표본의 무게에서 최종 표본의 무게를 차감한 값이다.

달팽이 발효추출물의 데시게이터를 이용한 보습력 측정

시간(hr)	보습력 (%)
시간(hr)	BG	달팽이 일반추출물	달팽이 발효추출물
24	100	100	100
48	92	91	95
72	85	85	93
120	82	78	90
144	74	65	85

표 5 에 나타낸 바와 같이, 달팽이 일반추출물과 BG에 비해 본 발명에 따른 달팽이 발효추출물의 보습력이 시간 경과에 따라 유의적으로 높은 것을 알 수 있다.

<실험예 5> 에멀젼 베이스 제조

달팽이 발효추출물 및 달팽이 일반추출물을 함유한 화장료를 포함한 에멀젼 베이스를 제조하였다. 본 실험에 사용된 화장료는 유화형 화장액 형태이고, 그 조성은 표에 나타낸 바와 같다. 우선 표에 기록되어 있는 달팽이 발효추출물 또는 달팽이 일반추출물 및 기타 함량을 중량별로 첨가한 후 (가)상을 가열하여 90℃로 유지하고 정제수(30%)를 90℃까지 가열한 후 (가)수상 중에 천천히 첨가하여 호모믹서로 균일하게 유화한다. 그 후 실온까지 냉각하고 남은 (나)상의 정제수를 첨가하고 균일하게 교반하여 화장액을 제조하였다.

에멀전 베이스 제조

구분	성분	중량%
가	달팽이 일반추출물 및 달팽이 발효추출물	3
	글리세린	3.00
	디소듐이디티에이	0.02
	폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.5
	세테아릴알코올	0.5
	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.0
	폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.60
	방부제	적량
나	정제수	to 100

<실험예 6> 피부 보습 평가

<6-1> 피부소분 증가효과

본 발명에 따른 피부의 보습력 효과를 측정하기 위하여, 설문조사로 피부가 건조하다고 느끼는 20-40세의 여성 20명을 대상으로 상기 실험예 5에서 제조된 화장료를 1일 2회씩 얼굴에 도포하게 한 후 1개월간 사용하게 하였다. 도포 시작 전 항온, 항습 조건(온도 20-22℃, 상대습도 40%)에서 수분보유측정기(corneometer CM825, courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 기본 값을 삼고, 1주, 2주, 4주 경과 후의 피부 전도도를 측정하여 보습의 증가율을 평가하였다. 이때, 달팽이 발효추출물에 대한 음성대조군으로서 달팽이 일반추출물을, 양성대조군으로서 추출물 대신 지질혼합물(세라마이드: 콜레스테롤:

지방산=2: 1: 1)물을 사용하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었으며, 그 결과값은 평균값으로 나타내었다.

피부수분 증가율(%)

시험군	1주 경과	2주 경과	4주 경과
달팽이 발효추출물	57	62	78
달팽이 일반추출물	40	45	50
양성대조군	43	50	62

<6-2> 피부건조개선 평가(설문)

상기 실험예 6-1의 시험 대상자에 대한 설문지 조사를 통하여 주관적인 효능 평가를 시행하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 그 결과, 피검자들의 주관적 건조감 개선평가에서 달팽이 발효추출물이 우수한 결과를 얻었다.

피부건조개선 평가

시험군	응답자수
시험군	매우양호	양호	보통	미흡
달팽이 발효추출물	17	2	1	0
달팽이 일반추출물	5	10	5	0
양성대조군	2	5	11	2

<실험예 7>피부 탄력 효과에 대한 측정

본 발명에 따른 화장품의 피부 탄력 효과에 대한 검사를 측정하기 위하여, 건강한 20-30대 성인 남녀 20명을 대상으로 하였다. 실험예 5에서 제조된 화장품을 이용하였으며, 시험 초기(baseline), 2주, 4주, 6주에 항온항습실(온도 20-22℃, 상대습도 40%)에서 피검자는 세안 후 1시간 동안 피부를 안정화한 다음, 측정을 수행하였다. 피부의 탄력도는 cutometer SEM 474(Courage+Khasaka, Germany)로 피부 왼쪽안면을 측정하였으며, 측정시 음압은 500 mbar, 흡입시간은 2sec, 반복 측정 횟수는 5회로 측정하여 평균 수치를 이용하였다.

피부 탄력성 측정

시험군	피부탄력도(%)
달팽이 발효추출물	45
달팽이 일반추출물	23

Cutometer SEM 474로 측정하여 피부탄력도를 측정한 결과, 달팽이 일반추출물에 비해 달팽이 발효추출물이 피부탄력도가 2배 정도 더 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 8> 인체 피부에 대한 미백 효과 시험

연구대상은 건강한 30-40대 성인 남녀 10명을 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다. 조사 후 시험물질 각 1% , 대조군으로 알부틴 2%, 용매(vehicle)만을 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 10 주 동안 상태 변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다. 도포 개시시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(L*)를 하기 수학식 3에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 L*의 비교로 판정하는데, L* 값이 2 정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5 정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

수학식 3

L* = 도포완료시점에서의 L* 값 - 도포개시 할 때 L* 값

피부에 대한 미백 효과

시험군	멜라닌 생성 억제율(%)
달팽이 발효추출물	2.00±0.11
달팽이 일반추출물	1.23±0.15
용매(Vehicle)	0.50±0.23
알부틴	1.56±0.17

상기 표 10의 결과로부터, 본 발명에 의한 달팽이 발효추출물은 달팽이 일반추출물뿐만 아니라 양성대조군인 알부틴 보다 우수한 미백 효과를 보이는 것을 확인하였다

<실험예 9> 인체 피부 자극시험 평가

본 발명에 따른 화장품의 안전도를 평가하기 위해 인체 피부 자극시험 평가를 실시하였다. 시험평가는 인체의 피부 1차 자극 시험으로서 첩포시험(팻치테스트)으로 판별하였다. 연구대상은 건강한 10~30대 피험자 30명을 대상으로 CTFA 가이드 라인(The Cosmetic Toiletry and Frangrance association, Safety testing guidelines)에 따라 실시하였다. 실험예 5 에서 제조된 화장액을 각각을 1g씩 적하 시킨 후, 시험 부위인 좌측 상완 내측에 첩포검사를 실시하였다. 첩포는 24시간 도포하며 첩포를 제거한 후는 마킹 펜(marking pen)으로 시험부위를 표시하며 24시간 간격으로 24시간, 48시간, 72시간 후에 각 시험 부위의 염증 및 피부반응을 관찰하여 국제 접촉 피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG)의 규정에 따라 판정하도록 하였다(표 11, 12). 최종 판독 결과는 모두 음성반응을 보여 피부 안전성이 우수한 것으로 나타났다(표 13).

피부 안전성 판독의 판정기준

반응	가중치	판정의 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진 형성
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포 형성
+++	3	대수포 형성

피부 반응도에 따른 평가 기준(계산값)

시험물질 (Sample)	판정기준
	0.0~0.9	1.0~2.9	3.0~4.9	5.0이상
	무자극	경자극	중자극	강자극

1차 자극 실험 결과

	실시예 1	비교 예 1
적용 농도(%)	3%	3%
의양성 반응(±)	-	-
약양성 반응(+)	-	-
접촉성 피부염 유발확률(%)	0.00	0.00

(-:무자극)

수학식 4

(Grade x No. of respones)

피부반응도 = ----------------------------------------------- X 100

3(Maximum. grad) x n(No. of total subjects)

Claims

달팽이 발효추출물을 함유한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 달팽이 발효추출물의 건조 중량을 기준으로 조성물 전체에 대해 0.001 내지 95 중량% 를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 내지 2항에 있어서, 달팽이 추출물에 고초균, 유산균, 효모로 단독 또는 2종 이상을 통한 발효공정으로 발효시킨 것을 특징으로 하는 피부보습, 피부 탄력강화, 미백, 주름개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 달팽이 발효추출물이 함유하는 유효성분에 대한 추출수율 증가 및 발효과정을 통한 생리활성 기능을 갖는 고분자 화합물의 저분자 화합물로의 전환을 특징으로 하는 보습, 탄력개선 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 또는 화장학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 추가로 함유하여 단위투여 제형으로 제형화 되는 조성물.
제 1항 내지 2항에 있어서, 유연 화장수, 영양 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 수중유(O/W) 또는 유중수(W/O)형의 에멀젼, 페이스크성 또는 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 또는 비이온성 형태의 지질 소포체의 형태, 연고, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩 또는 보디오일 등의 기초 화장료, 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 등의 색조 화장료 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부보습, 피부 탄력강화, 미백, 주름개선용 화장료 조성물.
제 1항에 내지 2항에 있어서, 달팽이 발효추출물로 제조된 화장품, 식품, 의약품 또는 생활용품