KR101716428B1 - 해마 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해마(Hippocampus coronatus) 발효 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 해마 발효 추출물을 유효 성분으로 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 해마 발효 추출물은 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 피부 주름개선 효과, 피부 탄력 개선, 보습효과, 항산화 효과, 피부 항노화 효과가 있어 각종 기능성 화장료로서 제공될 수 있다.

Description

해마 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING FERMENTATIVE EXTRACT OF HIPPOCAMPUS CORONATUS AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 해마 발효 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 자유 라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다.

좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성 물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부 노화 현상이 생겨나는 것이다.

특히, 단백질의 산화는 피부의 결합 조직인 콜라겐(collagen), 히아루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증 반응과 피부의 탄력에 지장을 주고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역 기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 자유라디칼이나 자외선 조사, 염증 반응에 의해 매개되어 발생하는 자유라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 이러한 자유라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다.

그러므로, 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현량 및 활성을 조절하고자 하였다.

한편, 색소 침착에 의한 피부 변화가 생긴다. 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은, 부분 또는 전체적인 색소 침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강 상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소 침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라노이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데, 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로서, 이 멜라닌의 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다.

멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대 흡수 파장이 없고 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성 산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성 산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌 형성 세포의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화 과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다.

이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포 내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 각질 세포의 식세포 작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 각질 세포의 핵 주변에 축적된다.

멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 각질 세포로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다.

이미 아스코르빈산 (일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논 (일본특개평-192062), 코직산 (일본특개소 56-7710), 알부틴 (일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 낮으므로 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 상기한 물질들은 그 티로시나제 억제 효과가 입증되었으나 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체 레벨과 유사한 흑색종 세포 배양에 의한 저해효과 평가가 요구되고 있는 실정이다. 또한, 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 화장품에서는 그 사용이 금지 또는 제한되고 있다. 코직산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 상기 성분들을 소량 함유한 화장료는 실온에서 수 주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다.

이러한 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학 물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐만 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발 가치가 한층 늘어나고 있다.

한국 공개특허 제10-2009-0043656호는 해마 추출물을 함유한 항산화용 조성물에 관한 것으로, 해마 추출물의 DPPH 라디칼, 히드록실 라디칼, 슈퍼옥사이드 라디칼 및 페록실 라디칼 제거 활성을 개시하고 있다.

이에, 본 발명자들은 해마 발효 추출물의 화장품으로의 응용 가능성을 확인하기 위해 해마 발효 추출물을 제조하여 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 항산화효과, 보습효과, 피부 주름개선 효과, 피부 탄력 개선효과, 피부 항노화 효과를 측정한 결과, 그 효능이 매우 우수하므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명의 목적은 해마 발효 추출물을 함유하여 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 항산화 효과, 보습효과, 피부 주름개선 효과, 피부 탄력 개선효과, 피부 항노화 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 해마 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 이용하는 화장 방법을 제공하는데 있다.

따라서, 상기와 같은 본 발명의 목적은 해마 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 의해 달성된다.

또한 바람직하게는, 상기 해마 발효 추출물은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824)로 발효시켜 얻은 것일 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 유산균은 락토바실러스, 비피도박테리움, 스트렙토코커스, 류코노스톡, 페디오코커스, 락토코커스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로 발효시켜 얻은 것일 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 바실러스균은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 폴리퍼멘티커스, 바실러스 메센테리커스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물로 발효시켜 얻은 것일 수 있다.

바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부주름 개선용인 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 항산화용인 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 보습용인 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부 탄력 개선용인 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부노화방지용인 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 해마 발효 추출물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 생합성효과, 멜라닌 생성억제효과, 보습효과, 피부 주름개선 효과, 피부 탄력 개선효과, 항산화 효과, 피부 항노화 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 해마 발효 추출물은 MMP-1 생성 억제 효과(실험예 1), 콜라겐 합성 증진 효과(실험예 2), 멜라닌 생성 억제 효과(실험예 3), 항산화효과(실험예 4), 보습 효과(실험예 5), 주름개선 효과(실험예 6) 및 피부 탄력 개선 효과(실험예 7)를 갖는다.

본 발명의 화장료 조성물 중 유효 성분으로 사용되는 해마는 영문표기가 학명으로는 Hippocampus coronatus로 표기되고 있다. 해마는 실고기과에 속하는 경골어류로서 세계적으로 36종이 서식하는 것으로 알려져 있다. 몸길이 6∼10.5cm이다. 눈의 가시가 뚜렷하고 등지느러미의 기저(base:기관 또는 부속기관과 몸통과 연결되는 부위) 길이가 매우 짧은 것이 가장 큰 특징이다. 가늘고 긴 주둥이는 눈 뒤쪽의 머리 길이와 같고 머리가 다른 어류에 비하여 거의 직각으로 구부러져 있으며 몸은 많은 골판으로 구성되어 있다. 머리에는 관처럼 생긴 돌기가 뚜렷하게 튀어나와 있고 목에 해당되는 부분에 돌기 모양의 갈고리가 있다. 해안 가까이에 서식한다. 한국·일본 등 아열대 해역에 분포한다.

본 발명의 해마는 깨끗이 세척하여 건조시킨 해마를 100 ~ 500 메쉬로 미세하게 분쇄한 것을 사용하며, 해마의 다양한 기관 또는 부분을 사용한다.

본 발명에 있어서, 해마 발효 추출물은 해마 추출물을 발효하여 얻은 것을 의미한다. 해마 추출물은 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1 ~ 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법, (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법, 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다.

또한, 통상의 미생물 배양 배지에 상기 해마 추출물을 첨가한 것을 배양배지로 하고, 여기에 미생물을 접종하여 발효시켜 얻은 해마 발효 추출물을 사용한다.

본 발명에 따른 해마 발효 추출물은 배양 배지에 해마 추출물을 1 ~ 30 중량%로 첨가하고, 여기에 발효 미생물을 100,000 ~ 10,000,000 cfu/L의 양으로 접종한 뒤 20 ~ 40℃, 바람직하게는 25 ~ 35℃에서 12 ~ 168시간, 바람직하게는 12 ~ 72시간 동안 배양하여 얻을 수 있다.

발효에 사용되는 배양배지에서 해마 추출물의 양은 1 ~ 30 중량%를 첨가하여 사용할 수 있다. 해마 추출물이 1 중량% 미만이면 미생물에 의한 발효액의 양이 적어 효과가 나타나기 어렵고, 30 중량%를 초과하면 해마 추출물이 배지에 잘 녹지 않아 발효 효율이 떨어진다.

또한, 본 발명에서 사용하는 발효 미생물로는 효모, 버섯균사체, 유산균류, 바실러스 속 균류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces)속을 사용하고, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824)를 사용한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 유산균은 바람직하게는 락토바실러스, 스트렙토코커스, 비피도 박테리움, 류코노스톡, 페디오 코커스, 락토 코커스 및 이들의 혼합물을 포함하며, 가장 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus)이다. 락토바실러스 중에서도 본 발명의 안개나무를 발효시키는데 사용하기에 가장 바람직한 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이다.

또한 본 발명에서 사용될수 있는 바실러스균은 바람직하게는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 폴리퍼멘티커스, 바실러스 메센테리커스 및 이들의 혼합물을 포함하며, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이다.

발효 배양 후, 배양액을 원심분리하여 상등액만을 분리하여 해마 발효 추출물을 얻는다. 이렇게 해서 얻어진 발효 추출물은 그대로 사용하거나, 또는 발효액을 건조하여 사용한다. 건조하여 사용 시에는 건조중량의 1 ~ 20배의 추출용매를 첨가하여 4 ~ 30℃에서 3 ~ 20일간 침적시켜 유효성분을 추출한다. 추출 용매에 의한 추출은 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출용매도 이용될 수 있다.

상기 추출물을 와트만(whatman)#10 여과지로 여과하고, 이 여과액을 0.25 um의 여과지를 이용하여 최종 여과한 뒤 60℃이하에서 감압농축 동결건조하여, 이 감압농축물 또는 동결건조물을 0.001 ~ 70 중량% 함유되도록 추출용매를 사용하여 발효 추출물을 최종 획득한다.

본 발명에 따르면, 상기 해마 발효 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 해마 발효 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 피부 개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

따라서, 이러한 다양한 기능을 가진 해마 발효 추출물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 콜라겐 합성 증진 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 항산화 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 탄력 개선 효과, 피부 미백 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 보습효과, 피부노화방지 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 해마 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 이용하는 화장방법을 수행하면, MMP-1 생성 억제 효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 보습효과, 피부 주름 개선 및 탄력 개선 효과를 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1 내지 2. 해마 발효 추출물 제조

세척하여 음건한 해마를 분쇄한 뒤 70% (v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하여 해마 추출물을 얻었다.

효모용 미생물 배양배지는 YPD 배지(Difco, USA)를 사용하였고, 유산균용 배양배지는 Lactobacillus MRS Broth (DIFCO, USA)를 사용하였으며 여기에 각각 상기 해마 추출물을 10 중량% 첨가하여 제조하였다.

상기 YPD 배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824)를 10,000,000 cfu로 접종한 후 30℃에서 72시간 동안 배양하였다.

배양 후, 배양액을 원심분리하여 균을 제거하여 해마 발효물을 얻은 뒤 여기에 에탄올을 최종 70%(v/v)가 되도록 첨가한 뒤 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 발효 추출물을 다시 0.25 um 여과지로 여과한 후 이를 60℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하여 해마 발효 추출물(제조예1)을 얻었다.

또한, Lactobacillus MRS 배지에 해마 추출물을 10 중량% 첨가하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum ATCC 10012)를 10,000,000 cfu로 접종한 후 37℃에서 72시간 동안 배양하였다.

배양 후, 배양액을 원심분리하여 균을 제거하여 해마 발효물을 얻은 뒤 여기에 에탄올을 최종 70%(V/V)가 되도록 첨가한 뒤 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 발효 추출물을 다시 0.25 um 여과지로 여과한 후 이를 60℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하여 해마 발효 추출물(제조예 2)을 얻었다.

비교제조예 1. 해마 용매 추출물

해마 발효 추출물의 비교예로서 해마 추출물을 제조하였다. 해마 추출물은 세척하여 음건한 해마를 분쇄한 뒤, 70% (v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하였다.

실험예 1. 해마 발효 추출물의 MMP -1 생성 억제 효과

본 실험예 1은 제조예 1 내지 비교제조예 1에서 수득한 해마 발효 추출물이 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과를 측정하였다.

인간 정상 피부 세포인 섬유아세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1× 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1내지 2의 해마 발효 추출물 또는 비교제조예 1에 의해 제조된 해마 추출물을을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 해마 발효 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.

배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 1에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

처리 농도	MMP-1 생성 억제율(%)
	제조예 1	제조예 2	비교제조예 1
50ppm	33.23	34.92	25.92
100ppm	54.34	52.81	47.81
500ppm	76.15	75.93	63.93
1000ppm	91.08	88.59	81.59
200nM TGF-β	85.8

상기 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 해마 발효 추출물은 농도 의존적으로 MMP-1의 생성을 억제(MMP-1 활성 억제)시키는 것을 확인할 수 있었다. MMP-1 생성 억제효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(200nM)와 본원발명의 해마 발효 추출물의 농도(500ppm) 차이를 감안해도, 여러 종류의 물질이 혼합된 추출물 수준에서 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본원발명의 해마 발효 추출물은 MMP-1 생성 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.

실험예 2. 해마 발효 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과

인간 정상 상피 세포인 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1 x 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 제조예 1내지 2에 의해 제조된 해마 발효 추출물 또는 비교제조예 1에 의해 제조된 해마 추출물을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 해마 발효 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 수학식 2에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

처리 농도	콜라겐 생합성 증가율(%)
	제조예 1	제조예 2	비교제조예 1
5ppm	25.4	24.5	13.5
10ppm	44.3	45.1	27.5
25ppm	98.2	100.3	88.1
50ppm	168.4	167.8	145.5
200nM TGF-β	165.5

표 2에 따르면, 본 발명의 제조예 1 내지 2에 의해 제조된 해마 발효 추출물의 콜라겐 생합성율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 제조예 1에 의해 제조된 발효 추출물의 효과가 비교 제조예 1 보다 효과가 더 좋은 것을 확인하였다.

실험예 3: 해마 발효 추출물의 B16F1 멜라닌형성세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과

본 실험예 3는 상기 제조예 1 내지 2에서 수득한 해마 발효 추출물의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다. 본 실험예 3에 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다.

이 세포의 인공 배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라닌 형성 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 X 10⁵ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 제조예 1 내지 비교 제조예 1을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율을 (%)은 하기 수학식 3에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 3에 기재하였다.

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

처리농도(%)	멜라닌 생성 저해효과 (%)
	제조예1	제조예2	비교 제조예1
0.001	23.17	22.54	15.75
0.005	39.67	38.12	30.19
0.01	54.14	50.54	47.24
0.05	74.16	74.05	65.01
200ppm 알부틴	68.25

상기 표 3의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 제조예 1내지 2에 의해 제조된 정제된 해마 발효 추출물은 B16F1 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 알 수 있었다. 또한 제조예 1의 멜라닌 생성 저해효과는 비교제조예 1보다 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 4 : 해마 발효 추출물의 항산화 효과

제조예 1 내지 2에서 수득한 해마 발효 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH법을 이용하여 항산화 효과(자유라디칼 소거율)를 측정하였다. DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 자유라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 피검 물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율(%)을 측정한다. 사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 자유라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1 mM DPPH 용액 0.15 ml에 시료 용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 시료 용액의 블랭크 (Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.

④ 공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

자유라디칼 소거율(%)의 결과는 수학식 4에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기의 표 4와 같다.

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 514nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 514nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 514nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 514nm에서의 흡광도

시료명	SC 50 (%)
제조예 1	0.06
비교 제조예 2	0.08
비교 제조예 2	0.015

DPPH 자유라디칼을 50% 소거하는데 필요한 시료의 농도인 SC₅₀을 확인한 결과 제조예 1 내지 2에서 항산화 효과를 보였으며 특히 비교 제조예1보다 우수한 효과를 보였다.

제형예 1 :해마 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조

해마 발효 추출물을 포함하는 화장료는 제조예 1 내지 2의 해마 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 (제형예 1, 2)을 제조하였으며, 효능의 비교를 위해 해마 발효 추출물 대신에 비교제조예 1의 해마추출물을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 1), 해마발효 추출물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 2), 해마발효 추출물 대신에 주름개선 원료로서 아데노신을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 3), 해마 발효 추출물이나 보습제를 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 4)을 하기 표 5에 나타내었다.

구분	성분	제형예 1	제형예 2	비교제형예 1	비교제형예 2	비교제형예 3	비교제형예 4
A	해마 발효 추출물 (제조예 1)	5.0	-	-	-	-	-
	해마 발효 추출물 (제조예 2)	-	5.0	-	-	-	-
	해마 추출물 (비교제조예 1)	-	-	5.0	-	-	-
	글리세린	-	-	-	5.0	-	-
	1,3부틸렌글리콜	-	-	-	5.0	-	-
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	adenosine	-	-	-	-	0.04	-
	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100
B	세토스테아릴알코올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7
	스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
	유동파라핀	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
	폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
	사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
	BHT	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
C	향,방부제	적량	적량	적량	적량	적량	적량

실험예 5: 해마 발효 추출물의 보습 효과

상기 제형예 1 내지 2의 화장료 조성물에 대한 임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 125 명을 무작위로 25 명씩 5개 그룹 (A, B, C ,D 및 E)으로 나눈 후, A그룹에는 제형예 1의 화장료 조성물을, B그룹에는 제형예 2의 화장료 조성물을, C그룹에는 비교제형예 1의 화장료 조성물을, D 그룹에는 비교제형예 2의 화장료 조성물을, E 비교제형예 4의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 안면에 도포하게 하였다. 보습 효과는 실사용 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 실험 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

해마 발효 추출물의 피부 보습 효과

구분	사용전	사용 2주 후	사용 4주 후
제형예 1	23.6	39.5	48.1
제형예 2	23.8	38.1	49.8
비교제형예 1	24.3	33.1	42.9
비교제형예 2	23.5	35.3	45.7
비교제형예 4	23.7	24.1	23.9

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 일반 다른 보습제를 함유한 화장료(비교제형예 2)와 비교하여도 본 발명의 해마 발효 추출물 함유한 화장료(제형예 1, 2)의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 해마 발효 추출물의 피부 주름 개선효과

본 발명의 해마 발효 추출물을 함유하는 화장료의 피부 주름 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

즉, 임상실험은 40-60세 여성 125 명을 무작위로 25 명씩 5개 그룹 (A, B, C ,D 및 E)으로 나눈 후, A그룹에는 제형예 1의 화장료 조성물을, B그룹에는 제형예 2의 화장료 조성물을, C 그룹에는 비교제형예 1의 화장료 조성물을, D그룹에는 비교제형예 2의 화장료 조성물을, D 비교제형예 3의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 안면에 도포하게 하였다. 8주 후의 주름 개선 효과를 육안으로 평가하여 주름 개선 정도를 확인하였다. 이 평가를 토대한 주름 개선 효과 결과는 하기의 표 7에 나타내었다.

실험 완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 3개월간 사용 후의 각 피검자의 주름 개선 효과를 숙련된 의사의 육안 관찰 및 기기측정(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co.,Germany)을 통하여 평가하였으며, 실험 결과는 하기의 표 7에 나타낸 바와 같다.

해마 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 주름 개선 효과 (육안 평가 및 기기평가)

	주름 개선 효과			유효율(%)
	우수	약간	없음
제형예 1	22	5	3	90.0
제형예 2	21	6	3	90.0
비교제형예 1	20	5	5	83.3
비교제형예 2	5	5	20	33.3
비교제형예 3	20	6	4	86.7

상기 표 7의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 해마 발효 추출물을 함유한 제형예 1 내지 2의 화장료 조성물은 보습제를 함유하는 비교제형예 2에 비하여 약 2.7배 높은 주름개선 효과를 보여주었다.

또한, 해마 발효 추출물 대신 주름 개선 효과가 있는 것으로 알려진 아데노신을 함유하는 비교 제형예 3의 화장료와 유사한 결과가 나타나, 해마 발효 추출물이 우수한 주름 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 7: 피부 탄력 개선 효과 측정

본 실험예 7은 제조예 1 내지 2에서 수득한 해마 발효 추출물을 포함하는 제형예 1, 2 및 비교제형예에 따른 화장료 조성물의 피부 탄력 개선 효과를 알아보기 위하여, 30~40대의 탄력이 감소한 여성 40명을 대상으로 측정하였다. 10명씩 A, B, C, D의 4그룹으로 나눈 뒤, A 그룹에는 제형예 1을, B그룹에는 제형예 2를, C그룹에는 비교 제형예 1을, D그룹에는 비교 제형예 4를 안면에 매일 아침, 저녁으로 2회씩 12주간 도포하게 한 후, 12주 후 피부 탄력을 측정하였다. 얼굴 부위의 탄력을 cutometer SEM575 (MPA 580, Courage+Khazaka GmbH, Germany)를 이용하여 측정하였으며, 피부 탄력을 나타내는 R2(biological elasticity)를 도포 전과 도포 후를 측정한 뒤 개선도(%)로 평가하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었으며, 결과는 각 군에 대한 개선도의 평균치이다.

실험제품	피부 탄력 개선도(%)
제형예1	26.4
제형예2	25.7
비교 제형예1	23.4
비교제형예4	2.6

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 해마 발효 추출물이 함유된 제형예 1, 2 는 비교제형예 4에 비하여 피부 탄력이 매우 향상됨을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 해마(Hippocampus coronatus)를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisisae ATCC 18824) 또는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum ATCC 10012)로 발효시킨 해마 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 해마 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 해마 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 해마 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 보습용 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 해마 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 해마 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물.
9. 삭제
10. 제1항에 있어서, 상기 해마 발효 추출물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.