CN105073089B

CN105073089B - Q碱的化妆用途

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Publication number: CN105073089B
Application number: CN201480009942.4A
Authority: CN
Inventors: 安托万·当尚; 阿格尼斯兹卡·塞科夫斯卡
Original assignee: Emma Bio
Current assignee: Emma Bio
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2014-02-18
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2034-02-18
Also published as: CN105073089A; US20160008252A1; FR3002139A1; FR3002139B1; CA2901525C; JP2016509040A; HK1217646A1; WO2014128126A3; WO2014128126A2; EP2958547B1; CA2901525A1; BR112015020182A2; EP2958547A2; BR112015020182B1; JP6430408B2; US9610236B2; ES2772126T3

Abstract

本发明涉及Q碱的化妆用途，尤其是控制皮肤衰老的化妆用途。本发明还涉及包含Q碱作为活性成分的化妆品组合物。

Description

Q碱的化妆用途

技术领域

本发明涉及化妆品领域，尤其是防止或对抗皮肤和皮肤附属物的衰老的产品。

背景技术

作为保护性组织和交换的边界，皮肤在整个一生中快速更新。时光流逝不可避免地引起皮肤衰老。作为多种环境攻击的结果，甚至可能出现过早衰老。由于与外部环境相互作用，皮肤不断经受由所有类型的物理化学攻击引起的损伤：温度变化，湿度，光，污染等。皮肤细胞老化，变得衰老并在约80次分裂后死亡。在整个这一过程中，皮肤失去其厚度和弹性，造成皱纹的出现，但是它也失去其保护性作用，尤其是对抗日间UV辐射的保护性作用。它也可能具有不规则的色素沉着(老年斑)。

皮肤衰老的分子原因涉及皮肤的所有区划。与在其他组织中相同，由胁迫诱导的一些蛋白质发挥了关键性的保护作用，尤其是允许蛋白质适合地折叠并校正这种折叠的缺陷的伴侣蛋白，以及降解化学变质或错误折叠的蛋白质的蛋白酶。随着细胞衰老，翻译和折叠过程逐渐变得低效，从而导致意外氧化修饰和糖基化的出现和高敏感性。反应性氧物质改变氨基酸(尤其是半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸)和蛋白质骨架。它们也导致引起新蛋白质合成的过程的上游劣化。

在衰老过程中蛋白质聚集体的积累渐进性地淹没控制细胞蛋白质质量的机制。皮肤的这种衰老必然导致在表皮和真皮层两者处的细胞外基质的降解，在皮肤表面上留下可见的衰老迹象并改变其物理性质。

总体结果也是正常酶活性的劣化和全部蛋白质的聚集，引起可见的迹象例如皮肤的不规则干燥、不规则色素沉着、深层皱纹、蜡状和/或羊皮纸肤色、松垂等。

三种过程能够使细胞克服衰老：新合成，修复和降解后重新合成。在更长时期内，后两种过程是必不可少的，因为它们允许细胞恢复青春。

因此，对于对抗皮肤衰老的新的化妆护理产品，存在着需要和强烈需求。

发明详述

本发明人以完全令人吃惊的方式发现，Q碱(queuine)的外源供应补救了皮肤不可避免地经历的胁迫的有害效应，从而延迟了衰老迹象的出现。Q碱对细胞维护做出巨大贡献。Q碱具有针对多次重复胁迫的保护效果。更具体来说，本发明聚焦于通过向细胞提供Q碱来优化蛋白质重新合成过程的需求。事实上，这种分子对于蛋白质合成的最适进行是必需的，并且身体不能生产这种分子。在本发明的背景中，已发现Q碱的外源供应令人吃惊地对皮肤细胞的抗性有贡献。因此，本发明涉及包含Q碱、其前体或衍生物作为活性成分的化妆品组合物。更具体来说，本发明的主题是用于局部施用的化妆品组合物。

本发明还涉及Q碱、其前体或衍生物的用途，其作为活性成分用于化妆品组合物，最具体为用于局部施用的化妆品组合物。

本发明的另一个主题是Q碱或其前体或衍生物的化妆用途，其作为活性成分用于减少或阻止皮肤和/或皮肤附属物的衰老迹象。皮肤附属物优选地意味着毛发和指甲。

最具体来说，本发明的用途或组合物旨在减少或阻止皮肤的皱纹和细纹和/或松垂、和/或缺乏弹性和/或皮肤紧张性、和/或皮肤变薄、和/或蜡状和/或羊皮纸样肤色、和/或肤质的不规则以及色素沉着不规则例如老年斑。

本发明还涉及制备化妆品组合物的方法，所述方法包括向所述化妆品组合物的一些或所有组分添加Q碱、其前体或衍生物，并回收获得的化妆品组合物。

本发明还涉及预防和/或处理皮肤和/或皮肤附属物的衰老迹象的化妆处理方法，所述方法包括向皮肤和/或皮肤附属物施用本发明的化妆品组合物。

在一种特定实施方式中，所述Q碱、其前体或衍生物选自Q碱、Q苷(queuosine)、环氧Q苷和环氧Q碱。在这些衍生物中还包括Q碱和Q苷的糖基化衍生物，例如甘露糖基Q碱、半乳糖基Q碱和氨基酰基化衍生物例如谷氨酰基Q碱。Q碱、其前体或衍生物可以采取纯化的形式或细菌提取物或植物提取物或液汁的形式，所述提取物或所述液汁富含或富集有Q碱、其前体或衍生物。在一种特别优选的实施方式中，所述化妆品组合物包含Q碱。

优选地，Q碱、其前体或衍生物以每ml或每g化妆品组合物0.1μg至100μg、优选地每ml或每g化妆品组合物0.5至10μg、更优选地每ml或每g化妆品组合物1μg至5μg的量包含在所述化妆品组合物中。对于缓慢释放衍生物来说，对浓度进行计算以便在所有时间点的释放速率满足上述符合物理化学释放过程的条件。任选地，所述化妆品组合物可以以每ml或每g化妆品组合物至少0.1μg至100μg、优选地每ml或每g化妆品组合物至少0.5至10μg、更优选地每ml或每g化妆品组合物至少1μg至5μg的量包含Q碱、其前体或衍生物。

化妆品组合物可以为精华液、洗液、乳霜、乳液、水或油性凝胶、水凝胶、微乳液、纳米乳液、面膜、棒剂(stick)、贴剂、油、油膏、蜡、泡沫、紧肤水、护理液、香脂、粉底、喷剂、眼影、苗条霜、唇膏、糊剂、软膏或香波或护发素的形式，或为允许使用Q碱及其衍生物的任何适合的均质或非均质形式。

Q碱、其前体和衍生物

Q碱也用下列化学名称呼：2–氨基–5–((((1s,4s,5r)–4,5–二羟基–2–环戊烯–1-基)氨基)甲基)–1,7–二氢–4h–吡咯并(2,3–d)嘧啶–4-酮。(CAS编号：72496–59–4)

环氧Q碱也用下列化学名称呼：7–(5–[(3,4–环氧–2,5–二羟基环戊–1-基)氨基]甲基)–7–去氮杂鸟嘌呤

2–氨基–5–({[(1R,2R,3R,4R,5S)–3,4–二羟基–6–氧杂二环[3.1.0]己-2-基]氨基}甲基)–3,7–二氢–4H–吡咯并[2,3–d]嘧啶–4-酮(CID编号56927905)

Q苷也用下列化学名称呼：2–氨基–5–[[[(1S,4S,5R)–4,5–二羟基–1–环戊–2–烯基]氨基]甲基]–7–[(2R,3R,4S,5R)–3,4–二羟基–5–(羟基甲基)–2–四氢呋喃基]–1H–吡咯并[3,2–e]嘧啶–4-酮(CAS编号：57072–36–3)

环氧Q苷也用下列化学名称呼：7–(5–[(3,4–环氧–2,5–二羟基环戊–1-基)氨基]甲基)–7–去氮杂鸟嘌呤，2–氨基–5–({[(1R,2R,3R,4R,5S)–3,4–二羟基–6–氧杂二环[3.1.0]己-2-基]氨基}甲基)–7–(β–D–呋喃核糖基)–3,7–二氢–4H–吡咯并[2,3–d]嘧啶–4-酮(CID编号：56927875)

在本申请的上下文中，Q碱的衍生物是指包含Q碱的任何分子或大分子，其采取适合被皮肤或皮肤附属物使用的形式。具体来说，Q碱可以采取游离形式，或者它可以是共价或离子复合物的一部分。例如，它可以与核糖复合以形成Q苷、半乳糖基Q苷、甘露糖基Q苷或谷氨酰基Q苷。它也可以被当作采取tRNA–Q苷或包含Q苷的寡核苷酸的形式。在这些衍生物中包括Q碱和Q苷的糖基化衍生物例如甘露糖基Q碱、半乳糖基Q碱，以及氨基酰基化衍生物例如谷氨酰基Q碱。

在本申请的上下文中，Q碱的前体是指例如它的中间前体环氧Q碱，不论是采取游离形式还是采取与分子或大分子的共价复合物的形式。

Q碱的衍生物也可以是化学修饰的Q碱，其可以被酶例如存在于皮肤表面上的酶容易地代谢成Q碱。Q碱的其他衍生物是当施用到皮肤或皮肤附属物表面并经历物理化学处理(例如天然或人造UV光)时释放Q碱的衍生物。

优选地，Q碱、其前体和衍生物可以通过化学合成来制备。Q碱的化学合成是已知的。具体来说，两种主要的合成途径已被描述(Barnett和Grubb，2000,Tetrahedron 56,9221–9225；Brooks等，2010,Tetrahedron Letters 51,4163–4165)并且可以由本领域技术人员来执行。

或者，Q碱及其前体和衍生物可以使用合成这样的分子的细菌来获得。

因此，Q碱可以通过对微生物、尤其是细菌微生物的提取物进行纯化来获得。

或者，Q碱及其前体和衍生物为细菌提取物的形式，其可能富集有Q碱、其前体或衍生物。

优选地，细菌提取物是选自下列的细菌的提取物：可食用厚壁菌门细菌的菌株，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其近邻解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquifaciens)，但是也可以是非致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、产Q碱的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、非致病性表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和总的来说在食品中优选使用的非致病性厚壁菌门细菌。在革兰氏阴性细菌中，γ–变形菌门益生菌例如大肠杆菌(E.coli)Nissle 1917或在食品中使用的变形菌例如运动发酵单胞菌(Zymononas mobilis)是优选的。非产毒蓝细菌也是Q碱的优选来源，尤其是可食用物种节旋藻(Arthrospira)(螺旋藻)。

在另一种实施方式中，Q碱及其前体和衍生物可以从已从其环境提取了这些分子的植物，在确认了它们的Q碱含量或衍生物含量后获得。具体来说，具有含有α-变形菌门细菌、尤其是根瘤菌属(Rhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)物种的根瘤的植物，是出色的Q碱来源。此外，如果植物生长确保在富含适应于根围的细菌的微生物环境中进行，或者如果它们已被合成Q碱的附生和内生微生物、尤其是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门微生物(例如但不限于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)定植，则植物液汁也是重要的Q碱来源。所使用的植物的提取物(叶、根、果实、树皮……)可以是在食品、化妆品或传统医学中常规使用的生物体，例如各种不同的植物：印度铁苋菜(Acalypha indica)，小花老鼠簕(Acanthus ebracteatus)，真芦荟(Aloe vera)，燕麦(Avena sativa)，椰子树(Cocosnucifera)，咖啡树(Coffea arabica)，芋头(Colocasia esculenta)，姜黄(Curcumalonga)，沙棘(Hippophae rhamnoides)，茉莉(Jasminum sambac)，胡桃楸(Juglansmandshurica)，母菊(Matricaria recutita)，冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)，梨果仙人掌(Opuntia ficus indica)，水稻(Oryza sativa)，Pittocaulonpraecox，长根金星蕨(Plagiochila beddomei)，香脂杨(Populus balsamifera)，番石榴(Psidium guajava)，黄芩(Scutellaria baicalensis)，越橘属物种(Vaccinium spp.)，葡萄(Vitis vinifera)，关于它们的Q碱含量待评估。可以选择由于它们对于繁育目的的正面效果而传统上使用的植物，其通常来自于豆科、茄科或菊科，但包含非常大量的被认识到对皮肤品质和抗性具有效果的植物。没有微生物或Q碱供应的无土栽培，仅仅在添加分子的外源供应的情况下使用。然而，在实验室中生长的稀有或受保护的植物例如高山火绒草(Leontopodium alpinum)，如果它们在产Q碱微生物存在下培养并且在评估了它们捕获和浓缩分子的能力后，也可以被选择。

Q碱、其前体和衍生物以及细菌或植物提取物的含量优选地得到保证。因此，由于与从集约栽培获得的植物提取物相伴的微生物区系的降解，这些提取物优选地仅用于具有外源Q碱供应的制备物中。一般来说，细菌或植物提取物可以富集有Q碱、其前体和衍生物。

化妆品组合物

根据本发明，Q碱、Q碱的前体和/或衍生物可以作为活性成分用于化妆品组合物中，所述组合物旨在预防或治疗随时间和/或光诱导的皮肤衰老迹象，尤其是影响年龄为25-30岁的人的早期衰老迹象，最通常表现为细纹和/或晦暗和/或肤色的非均质外观。

本发明的组合物包含生理上可接受的介质，即与皮肤和/或皮肤附属物相容的介质。它优选为化妆品中可接受的介质，即具有令人喜爱的颜色、气味和稠度，并且不产生不适例如刺痛、发红或可能使消费者厌恶而不使用它的其他不适。

根据本发明，化妆品组合物是护理或化妆产品，例如为精华液、洗液、乳霜、乳液、水或油性凝胶、水凝胶、面膜、棒剂、贴片、油、油膏、蜡、泡沫、紧肤水、护理液、香脂、粉底、喷剂、眼影、唇膏、糊剂、软膏、香波或护发素的形式。

化妆品组合物也可以用作瘦身组合物，其除了Q碱、Q碱的前体和/或衍生物之外还包含瘦身剂。

由于所述组合物旨在用于局部给药到皮肤和/或皮肤附属物，因此它可以采取惯常用于局部施用的任何制剂的形式。具体来说，采取水性溶液、水醇性溶液、水包油乳液(O/W)或油包水乳液(W/O)或多重乳液(三重：W/O/W或O/W/O)或微米或纳米乳液的形式，可能是有利的。

当所述组合物采取水性形式，尤其是分散系、乳液或水性溶液形式时，它可以包含可能含有水、花水和/或矿泉水的水性相。

这样的组合物也可以含有通常的、适合的制药或化妆品中可接受的载体或稀释剂，尤其是例如稀释剂，分散剂，胶凝剂，固体软化剂，树胶，树脂，溶剂，填充剂例如改性和聚合淀粉、二氧化钛或金属硬脂酸盐，防腐剂，精油，珠光剂，着色剂，气味吸收剂，pH调节剂或中和剂，增稠剂，吸收促进剂和尤其是乙醇和/或磷脂类，香料或芳香剂，无机颜料例如氧化铁，油料例如植物来源的油类或脂肪、动物来源的脂肪、合成油类、硅油(环甲基硅油)、含氟油类、脂肪醇酯(鲸蜡醇)，蜡，改性粘土，膨润土，脂肪酸金属盐，疏水化二氧化硅，聚乙烯，云母和/或在化妆品中使用的其他物质。

本发明的化妆品组合物还可以包含其他活性分子，例如维生素、遮光剂和滤光剂、抗衰老活性物质、抗皱剂尤其是肽类、抗氧化剂、增亮剂、仿晒(self–tanning)成分、晒黑(tanning)加速剂、提升成分、瘦身剂、紧实成分、水化成分、去角质成分、皮脂控制剂、控油剂等。优选地，化妆品组合物可以包含抗衰老活性物质、抗皱和/或抗氧化剂、提升成分、紧实成分和/或水化成分。一般来说，本领域技术人员能够选择和改变添加的活性分子的量，以便通过其添加不使本发明的组合物的性质劣化。

在一种优选实施方式中，Q碱、其前体或衍生物与辅因子或维生素例如维生素C或生育酚一起包含在化妆品组合物中。

在阅读了下面的实验和实施例并查看附图后，本发明将被更好地理解。提供它们是出于说明的目的，并且不以任何方式限制本发明。

图1、2和3示出了在DMEM，2.5％FCS中温育的成纤维细胞培养物中，在0小时(图1)和24小时(图2)时，或在DMEM，10％FCS中温育的成纤维细胞培养物中，在24小时(图3)时的细胞迁移。

图4和5示出了在2.5％FCS中与10μg/ml Q碱温育的成纤维细胞培养物中，在24小时(图4)时，或在2.5％FCS中与30μg/ml Q碱温育的成纤维细胞培养物中，在24小时(图5)时的细胞迁移。

图6和7示出了在2.5％FCS中与10μg/ml甲醇温育的成纤维细胞培养物中，在24小时(图6)时，或在2.5％FCS中与30μg/ml甲醇温育的成纤维细胞培养物中，在24小时(图7)时的细胞迁移。

实验

在这些实验中，在正常成年人类皮肤成纤维细胞中评估了Q碱的影响(细胞毒性、增殖、细胞迁移)。

材料和方法

选择胎小牛血清FCS(Dutscher，P30–8100M，批号P130903)与Q碱一起使用，其不污染培养基。

在这里使用甲醇作为活性分子的载体。

Q碱的储用溶液使用甲醇制备成15mg/ml，并且在可变浓度的胎小牛血清(FCS)存在下，在DMEM培养基(Dulbecco改良的基本培养基)中获得稀释液(DMEM+2.5％FCS+抗生素(青霉素/链霉素)+谷氨酰胺)：含有2.5％FCS的剥夺培养基用于生存力、增殖和细胞迁移实验。

稀释范围

准备用于毒性/生存力测定的稀释范围如下：

表1：用于毒性/生存力测定的稀释范围

Q碱浓度(μg/ml)	最终甲醇百分率(％)
		100	0.6
10	0.06
		1	0.006
0.1	0.0006

该第一种测定法允许精细调节所施用的浓度范围。

用于细胞增殖动力学测定的稀释范围如下：

表2：用于细胞增殖动力学测定的稀释范围

Q碱浓度(μg/ml)	最终甲醇百分率(％)
		30	0.18
10	0.06
		3	0.018
1	0.006
		0.3	0.0018

准备用于评估迁移的稀释范围与用于评估动力学的范围相一致，区别在于不包含0.3μg/ml浓度。

使用的产品：

表3：所使用的产品的列表

实验流程

1.细胞系

细胞类型：HDFa，成年人类皮肤成纤维细胞，年龄为39岁的女性，在第4次和第6次传代之间使用。

对于所有进行的实验来说，系统性地添加下列三种FCS对照：

-无血清DMEM；

-剥夺血清的培养基(增补有2.5％FCS的DMEM)；和

-完全培养基(增补有10％FCS的DMEM)。

2.细胞毒性和细胞增殖的评估

将所使用的成年人HDF以5x10³个细胞/孔的比例接种到96孔板中的200μl不含FCS的培养基(增补DMEM+0％FCS)中(第4次传代)。接种24h后，更换培养基，并在每个孔中添加200μl的产物或其载体(甲醇)的不同稀释液，每种培养条件3个孔。

也对3个对照进行评估(3个孔/对照)：

-无血清DMEM；

-剥夺血清的培养基(增补DMEM+2.5％FCS)；和

-完全培养基(增补DMEM+10％FCS)。

3.细胞迁移

将所使用的成年人HDF在允许产生校准的无细胞区域的预先灭菌的培养插片存在下接种。将600μl中的100 000个HDFa和150μl中的30000个细胞在DMEM+2.5％FCS中，分别添加到插片外部和内部。在37℃温育5h后，取出插片并将孔用PBS 1X清洗两次，以消除尚未吸附的每个细胞。然后以在DMEM 2.5％FCS中30、10、3或1μg/ml的浓度添加Q碱分子，并且也实验等同的甲醇范围，每种条件两个孔。在t＝0h时对孔进行照相，然后将板温育24h。在24h时获取照片之前，将细胞用聚甲醛固定。

测量和结果的分析

1.细胞毒性的定量：MTT测定法

细胞增殖在1、2和3天的培养时间后使用比色测定法(MTT测定法)来评估。这种测定法是基于倘若细胞是活的，则它们的线粒体NADPH还原酶将黄色的四唑鎓盐(MTT)[3–(4,5–二甲基)噻唑溴化物]还原成蓝紫色甲臜产物。然后将晶体溶解在100％乙醇–DMSO混合物(v/v)中。通过在分光光度计上在570nm波长处读取光密度(OD)，来测量与活细胞数目成正比的上清液的颜色。该测定在D1、D2和D3进行(D0对应于添加待测定溶液的时间)。

在每个动力学时间图上给出了三份平行样的平均OD值。标准偏差被标出。

2.细胞增殖的定量：BrdU测定法

细胞增殖在培养1、2和3天后使用ELISA类型的测定法(BrdU测定法，溴代脱氧尿苷)来评估。

BrdU是合成的核苷并且是胸苷的类似物，其可以被抗BrdU抗体识别。它在增殖细胞的DNA复制期间被掺入。将抗BrdU抗体偶联到在底物存在下将降解底物的酶。因此，BrdU的检测通过比色酶测定法来进行。

酶底物的降解以与掺入的BrdU的量成比例地将上清液染色。然后通过使用分光光度计在450nm波长处读取光密度(OD)来进行测量。所述测定在D1、D2和D3进行(D0对应于添加待测定溶液的时间)。

对于每个动力学时间，平均OD值、标准偏差和剂量响应图在下面详细描述。

3.细胞迁移的定量：相对于对照的迁移图像的比较

图像使用ImageJ软件进行分析以提高其对比。检查所有视野，并且为每个时间指标选择每种条件的两个最具代表性的视野。通过与对照进行比较来进行分析。

结果

细胞生存力

表4：24h接触时间后的细胞生存力

表5：48h接触时间后的细胞生存力

表6：72h接触时间后的细胞生存力

结果的解释

阴性和阳性对照相符，并允许确认实验。事实上，对于MTT测定来说，在24h时，2.5％FCS对照的得分总是高于10％FCS对照。

在48h时，2.5％FCS对照与10％FCS对照相当，并且在72h时低于后者。

对于单独的载体对照(0.6％至0.0006％的甲醇范围)来说，该对照表现出轻微的细胞毒性效应，但没有剂量效应并保持极小。因此，它的存在不妨碍细胞生理学，并且将不妨碍剩余的实验，即使在其最高浓度下。此外，已知甲醇在前几天内促进细胞增殖。

对于Q碱分子来说：

-在48h时，100μg/ml的浓度表现出细胞毒性效应。获得的OD与阴性对照(0％FCS)的OD相近。

-低于100μg/ml的其他测定浓度不表现出任何细胞毒性效应。

细胞增殖

表7：24h接触时间后的细胞生存力

在48h和72h时，在底物存在下的温育时间被故意缩短，以便OD值不超出分光光度计的饱和阈值。

表8：48h接触时间后的细胞生存力

表9：72h接触时间后的细胞生存力

所使用的流程是基于不更换培养基的温育，这导致培养基中生长因子的耗尽，尤其显著的是使用为实验而选择的FCS(旨在确保它不含干扰实验的Q碱)。结果，与最短时间相比，每单位体积的OD较低。

结果的解释

阴性和阳性对照相符，并允许确认这个实验。

事实上，对于BrdU测定来说，不论分析时间如何(24、48和72小时)，2.5％FCS对照与10％FCS对照相比具有较低效果。

“甲醇”对照(已知刺激增殖)表现出下列效果：

-在24和48小时时接近Q碱的效果；

-在3μg/ml时和以后，在72小时时低于Q碱的效果。

可以得出下列结论：

-与载体相比，在短时间(24和48小时)内Q碱没有显著效果；

-在3和10μg/ml浓度下，在72小时时表现出清楚的增殖效果，在30μg/ml浓度下尤其显著。

细胞迁移

将成年人HDF在预先灭菌的培养插片存在下接种，以在合生细胞垫中产生校准的无细胞区域。细胞倾向于填充由从边缘迁移产生的间隙以封闭所述间隙。

在37℃下温育5h后，取出插片并将孔在PBS 1X中清洗两次，以消除每个未粘附的细胞。

然后在DMEM 2.5％FCS中以30、10、3或1μg/ml的浓度添加Q碱，并且也制备等同的甲醇范围，每种条件两个孔。

在t＝0h时获取孔的照片。

将细胞在37℃下培养24h，然后在聚甲醛中固定。在t＝24h时获取照片。

还评估了3种对照，每种对照2个孔：

-无血清DMEM；

-剥夺血清的培养基(增补DMEM+2.5％FCS)

-完全培养基(增补DMEM+10％FCS)。

图1和2分别示出了在0小时(图1)和24小时(图2)时DMEM 2.5％FCS对照(对应于0μg/ml的待测定分子——阴性对照)对成纤维细胞的影响。

图3示出了在24小时时DMEM 10％FCS对照(对应于阳性对照)对成纤维细胞的影响。

图4和5分别示出了在24小时时，2.5％FCS中浓度为10μg/ml(图4)和30μg/ml(图5)的Q碱对成纤维细胞的影响。

图6和7分别示出了在24小时时，DMEM 2.5％FCS中浓度为10μg/ml(图6)和30μg/ml(图7)的甲醇对成纤维细胞的影响。

可以在所有图中看到的黑线对应于施加到培养皿背面，用于鉴定在0h和24h时将要照相的区域的记号。

对照片进行相互比较，以评估不同测定条件之间细胞向间隙的迁移的差异。

可以观察到，与0h条件相比，在2.5％FCS中的细胞与10％FCS的情况一样在24h后开始定植在间隙中。细胞转向相反边缘的方向并在这个方向上迁移，而在可见的合生细胞垫处，成纤维细胞的胞质伸展不具有任何确定取向。此外，在这些图中可以观察到，在10％FCS中更多的细胞已迁移到间隙中，并且值得注意的是，从两个相反边缘到达的细胞在间隙的中央汇合。

10μg/ml和30μg/ml Q碱的照片的观察显示出比在2.5％FCS中更好的迁移。在间隙中可以看到更多细胞，同时在朝向相反边缘的迁移前沿处维持可以在2.5％FCS中看到的穿梭取向。最后，在30μg/ml下，两个边缘的细胞在间隙的中央汇合，正如可以在10％FCS存在下看到的。

结果显示：

-2.5％FCS和10％FCS对照表现出与所使用的FCS的％成正比的迁移；

-Q碱早在10μg/ml的浓度下就对成纤维细胞的迁移有影响，并且这种对成纤维细胞迁移的影响在30μg/ml浓度下得到证实；

-在10和30μg/ml的Q碱存在下的迁移等同于使用阳性10％FCS对照获得的迁移；

-甲醇对迁移显示出轻微影响，但是不如Q碱的影响明显。

总体结论

低于100μg/ml的Q碱浓度对成年人HDF没有表现出任何细胞毒性效应。此外，使用浓度为3、10和30μg/ml的Q碱，在72小时的温育后，增殖效应明显。使用浓度为30μg/ml的Q碱，在72小时时观察到重要的增殖效应。在10μg/ml浓度下，Q碱对成年人HDF的迁移具有影响。这一影响在30μg/ml的浓度下被证实。在10和30μg/ml的Q碱存在下的迁移等同于使用阳性10％FCS对照获得的迁移。

组合物实例

基础霜

将6体积的芦荟胶(其可以用植物或矿物浸渍液或蒸馏水代替)、2.5体积的乳木果油和霍霍巴油的混合物(可以用任何其他植物油或黄油代替)和1.5体积的乳化蜡小心地混合。将所有成分放置在热水浴上以允许蜡融化，然后剧烈混合并放置在冰上冷却。添加活性成分。最后出于防腐目的加入对羟基苯甲酸甲酯至终浓度为0.19％。

大量制造商将中性化妆基础霜投放市场(例如Neutra base

)，并且现有的主要品牌的任何基础霜都可以通过本发明改进。

向这种基础霜以每100ml 0.1mg的浓度加入Q碱。

对于“有机”制剂来说，向100ml基础霜加入100mg tRNA提取物。

含有Q碱的RNA提取物的制备

用于含Q碱提取物的生物制备的细菌生长

大量生长培养基是适合的。例如，对于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来说：

ED培养基

ED生长培养基含有：8mM K₂HPO₄；4.4mM KH₂PO₄；27mM葡萄糖；0.3mM柠檬酸三钠；15mM L–谷氨酰胺；33.5μM柠檬酸铁铵；2mM MgSO₄。从100倍浓缩的储用溶液向该基础培养基添加微量元素至终浓度为：0.61μM MgCl₂；49.5μM CaCl₂；49.9μM FeCl₃；5.05μM MnCl₂；12.4μM ZnCl₂；2.52μM CuCl₂；2.5μM CoCl₂；2.48μM Na₂MoO₄。

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)野生型菌株在37℃和恒定通气下在液体ED培养基中预培养。将新鲜的过夜培养物以0.1至600nm(OD600)光密度接种到15ml ED培养基中。将细胞在37℃培养直至OD600为1，并在等体积的-80℃的70mM pH 7.5HEPES缓冲液中的60％甲醇溶液中冷却。所有下列步骤在低温条件下进行，并且旨在用于RNA制备的溶液用焦碳酸二乙酯处理并灭菌。将细胞在4℃下离心下来，在水中清洗，并重悬浮在0.5ml 10％葡萄糖，11mM Tris–HCL pH 7.5，10mM EDTA中。将悬液转移至含有0.1g酸洗过的玻璃珠(Sigma–Aldrich,G4649)的管中。

将管置于含有50g干冰的

–24仪器(MP Biomedical)的CoolPrep适配器中。使用下列参数将细胞在三个循环中分级：6米每秒，共45s。在每个循环后，将悬液在冰上保持1min。在以10000rpm离心2min后，将上清液转移到新的Eppendorf管。加入pH 5.2的乙酸钠至终浓度为0.3M，并在酸性条件下分离总RNA。加入一倍体积的pH 4.5的酸性苯酚/氯仿和异戊醇(125:24:1)(Amresco，AM9720)。将每个样品涡旋振荡10s，并在热水浴上在65℃温育3min。通过以14000rpm离心5min进行相分离，并按照同样的热酸性苯酚程序将水性相重新萃取一次。将水性相转移到新的管，并用一倍体积的冷的酸性苯酚处理。在以14000rpm离心5min后，使用2.5倍体积的无水乙醇在-80℃下将RNA沉淀1h。将RNA在4℃下以14000rpm离心15min，并用70％乙醇清洗。将RNA沉淀物溶解在10mM Tris，1mM EDTA pH 7.5中。然后可以将它用作富集有Q碱的细菌提取物的第一个来源。

富集转运RNA

将前面描述的总RNA的制备物与一倍体积的4.5M氯化锂pH 8和乙酸钠pH 5.2混合至终浓度为0.01mM。将该RNA溶液在-80℃温育2小时。在4℃下以14000rpm离心15min后，发现tRNA在上清液中。为了除去盐污染，通过添加0.3M乙酸钠pH 5.2和2.5体积的无水乙醇，将tRNA在-80℃下沉淀1h。然后通过在4℃下以14000rpm离心15min，使tRNA沉淀，并用70％乙醇清洗。将tRNA沉淀物溶解在10mM Tris，1mM EDTA pH 7.5中。该制备物是富含Q碱的转运RNA制备物。随后，可以将该制备物作为活性成分用于制备本发明的化妆品组合物。

Claims

1.Q碱或其前体或衍生物作为活性成分在制备化妆品组合物中的用途，所述化妆品组合物包含生理上可接受的介质并旨在减轻皮肤和/或皮肤附属物的衰老迹象，其中所述Q碱的前体或衍生物选自Q苷、环氧Q碱、环氧Q苷、甘露糖基Q碱、半乳糖基Q碱、谷氨酰基Q碱、半乳糖基Q苷、甘露糖基Q苷、谷氨酰基Q苷和Q苷-tRNA。

2.权利要求1的用途，其中所述Q碱或其前体或衍生物旨在用于减少皮肤的细纹和皱纹和/或松垂、和/或皮肤缺乏弹性和/或紧张性、和/或皮肤变薄、和/或蜡黄和/或羊皮纸样肤色、和/或肤质的不规则以及色素沉着不规则。

3.权利要求1的用途，其中所述Q碱或其前体或衍生物旨在用于减少老年斑。

4.权利要求1至3任一项的用途，其特征在于所述Q碱或其前体或衍生物选自Q碱、Q苷和环氧Q碱。

5.权利要求1至3任一项的用途，其特征在于所述Q碱、其前体或衍生物为细菌提取物或植物提取物或液汁的形式，所述提取物或所述液汁富含或富集有Q碱、其前体或衍生物。

6.权利要求1至3任一项的用途，其特征在于Q碱、其前体或衍生物以每ml或每g化妆品组合物0.1μg至100μg的量包含在所述组合物中。

7.权利要求1至3任一项的用途，其特征在于Q碱、其前体或衍生物以每ml或每g化妆品组合物1μg至5μg的量包含在所述组合物中。

8.一种用于局部施用的化妆品组合物，其在生理上可接受的介质中包含Q碱或其前体或衍生物作为活性成分，其特征在于所述Q碱或其前体或衍生物以每ml或每g化妆品组合物0.1μg至100μg的量包含在所述组合物中，且其中所述Q碱的前体或衍生物选自Q苷、环氧Q碱、环氧Q苷、甘露糖基Q碱、半乳糖基Q碱、谷氨酰基Q碱、半乳糖基Q苷、甘露糖基Q苷、谷氨酰基Q苷和Q苷-tRNA。

9.权利要求8的化妆品组合物，其特征在于所述Q碱、其前体或衍生物选自Q碱、Q苷和环氧Q碱。

10.权利要求8的化妆品组合物，其特征在于它包含细菌提取物或植物提取物或液汁，所述提取物或所述液汁富含或富集有Q碱、其前体或衍生物。

11.权利要求8至10任一项的化妆品组合物，其特征在于所述Q碱、其前体或衍生物以每ml或每g化妆品组合物1μg至5μg的量包含在所述组合物中。

12.权利要求8至10任一项的化妆品组合物，其特征在于所述Q碱、其前体或衍生物与辅因子或维生素一起包含在所述组合物中。

13.权利要求12任一项的化妆品组合物，其特征在于所述Q碱、其前体或衍生物与维生素C或生育酚一起包含在所述组合物中。

14.权利要求11的化妆品组合物，其特征在于所述Q碱、其前体或衍生物与辅因子或维生素一起包含在所述组合物中。

15.权利要求14的化妆品组合物，其特征在于所述Q碱、其前体或衍生物与维生素C或生育酚一起包含在所述组合物中。

16.权利要求8至10任一项的化妆品组合物，其特征在于它为精华液、洗液、乳霜、乳液、水或油性凝胶、水凝胶、面膜、棒剂、贴剂、油、油膏、蜡、泡沫、紧肤水、护理液、香脂、粉底、喷剂、眼影、苗条霜、唇膏、糊剂、软膏或香波或护发素的形式。

17.权利要求11的化妆品组合物，其特征在于它为精华液、洗液、乳霜、乳液、水或油性凝胶、水凝胶、面膜、棒剂、贴剂、油、油膏、蜡、泡沫、紧肤水、护理液、香脂、粉底、喷剂、眼影、苗条霜、唇膏、糊剂、软膏或香波或护发素的形式。