KR101299658B1

KR101299658B1 - 말태반을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101299658B1
Application number: KR1020100093969A
Authority: KR
Inventors: 박덕훈; 김영수; 황왕택; 강은주; 이종성
Original assignee: 바이오스펙트럼 주식회사
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2013-08-26
Also published as: KR20120032366A

Abstract

본 발명은 말태반을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 말태반을 포함하는 줄기세포 증식촉진용 조성물, 말태반을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 및 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 무혈청 줄기세포 배양용 조성물은 고가의 동물성 혈청을 사용하지 않으므로 제조비용을 현저히 낮출 수 있다. 또한, 본 발명의 말태반을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 말태반을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포증식 촉진능 및 활성화능을 가지므로 다양한 피부 상태의 개선 효과를 나타낸다.

Description

말태반을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물{Composition for Promoting Stem Cell Proliferation Comprising Equidae Placenta extracts}

본 발명은 말태반을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포배양용 배지, 말태반을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 및 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

생물의약품의 여러 생산기술 가운데 하나인 동물세포 산업화 기술은 유전자가 조작된 인간 및 동물세포를 대량으로 배양하여 고부가가치의 생물의약품을 생산하는 기술로 각광받고 있으며, 최근 유전자 치료(gene therapy) 및 세포 치료(cell therapy) 기법의 개발로 인해 산업화 기술로서의 중요성이 더욱 강조되고 있다. 일반적으로 동물세포 유래 의약품 생산 공정 개발은 생산 제품의 안전성 확보와 세포 생산성에 의한 높은 생산비의 절감 등에 역점을 두고 있다. 현재까지 사용되고 있는 동물세포 배양법은 성장을 위하여 반드시 세포배양배지에 혈청을 공급해 주어야 하며 가장 널리 사용되는 혈청으로 Fetal Bovine Serum (FBS) 나 Fetal Calf Serum (FCS)이 있다. 이들 첨가 성분의 기능은 명확하진 않지만 성장 증진 작용, 영양분의 공급, 산화나 독소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들 성분이 배제된 경우에는 세포배양 자체가 거의 안 되는 필수 성분이다. 그러나 고가의 혈청은 배지가격을 상승시키고 또한 그 복잡한 성분으로 인해 재조합 단백질의 정제를 어렵게 할 뿐 아니라, 생산되는 과정마다 성분 차이가 있어서 실험을 할 때마다 다른 결과를 초래할 우려가 있다. 또한, 혈청은 동물 유래이기 때문에 배양과정 중에 세포들이 바이러스나 감염성 프리온 등에 오염될 가능성이 상존한다. 소혈청에 감염된 프리온은 사람에게 그대로 전이될 수 있으므로 동물세포 배양은 여러 가지 안전장치를 하고 있음에도 여전히 감염가능성은 존재한다고 해야 할 것이다. 통상 혈청 사용시 다음과 같은 문제점을 수반한다: i) 혈청의 조성 변이 때문에 세포에 대한 성장촉진 능력에 있어서 변이가 크다; ii) 인간에게 사용될 세포 생산물의 제조 시, 혈청이 감염물질에 의한 오염 잠재성을 가지고 있다; iii) 상업적으로 제조된 FBS나 FCS에서 박테리오파아지(bacteriophage)와 보바인 바이러스(bovine virus)가 검출된다; iv) 박테리아 오염 때문에 생긴 각종 독소(toxin)로 인해 세포배양 억제 물질도 함유된다; v) 여과(filtration) 전에는 오염으로 인한 세균성 독소(bacterial toxin)가 존재한다; vi) 세포배양에 있어 생물학적 오염원(mycoplasmas, bacteriophages, viruses)이 되기도 한다; vii) 감마-글로불린 분획에 배양액과 교차반응(cross reaction)하는 항체 및 세균이 분비한 독소를 함유한다; viii) 열 불활성화(heat inactivation)은 면역글로불린의 세포독성(cytotoxin) 작용을 감소시키지만 불안정한 구성 물질까지 파괴되어 열처리하지 않은 혈청보다 만족한 결과가 항상 나타나는 것은 아니다; ix) 혈청 단백질의 흡착/결합에 의한 세포표면의 변형이 유도된다; x) 세포생산물의 분리 시 방해의 원인이 된다; xi) 1차 배양시에 섬유아세포의 과도한 성장이 조장된다.

1950년대에 합성배지로 자연배지를 부분적으로 대치할 수 있다고 보고된 이후로 혈청없이 세포배양을 하려는 시도를 하게 되었고, 현재는 특정목적을 위하여 일부의 경우에 혈청없이 세포배양을 하고 있다. 그러나, 이들 무혈청배지는 특정세포만 잘 자라게 하고 혈청 대신에 사용하는 단백질성 세포성장인자 등이 너무 고가인데다 혈청을 포함한 배지에서보다 성장 및 산물생산이 안정적이지 못하다고 보고되고 있다. 또한 무혈청배지는 줄기세포의 배양에는 적용이 불가능한 것으로 알려져 있다. 줄기세포를 상업적으로 이용한 분야에서 가장 중요한 분야가 세포치료제로써 인체에서 얻어진 줄기세포를 시험관에서 배양한 후 다시 환자에게 투입하는 방식의 치료기술이다. 이러한 분야에서는 반드시 줄기세포 배양과정을 거치게 되는데 가능한한 동물성배지나 혈청을 피하는 것이 중요하다. 질병 치료 목적으로 줄기세포 이식하는 경우 얻는 치료 이득을 고려할 때 이에 따르는 감염 위험은 감수될 수 있으나, 미용목적의 시술인 경우에는 줄기세포 등의 이식으로 얻어지는 이득보다 감염위험에 노출되는 위험이 더 크게 부각될 수 있다. 따라서 줄기세포 배양분야에서 동물성 혈청대체제를 찾는 일은 상업적으로 매우 의미있다.

한편, 피부에서 줄기세포가 자리하고 있는 곳은 크게 두 세 곳이다. 첫째는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)라고 불리우는 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)에 존재한다. 둘째는 모낭(hair follicle)이다. 이 곳은 세포분화가 일어나기 전의 세포로 표피의 재생과 관련해 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 세포가 존재한다. 셋째는 피하지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다. 이처럼 피부에 존재하는 줄기세포는 피부의 건강과 직결된 전체적인 역할을 담당하고 있어 피부건강과 관련하여 가장 중요한 세포군이라 할 수 있다. 줄기세포들은 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포 활성화물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제하고 문제가 있는 부위를 재생하거나 복구한다고 알려져 있다. 그러나 줄기세포 역시 세포군이기 때문에 나이에 따라 점차 그 기능을 서서히 소실하게 된다. 즉 피부의 줄기세포도 노화에 따라 그 활성이 점차 감소하기 때문에 세포분열능력이 떨어지고 점차 비활성화 됨으로써 노화에 따른 주름, 검버섯, 더딘 상처치유, 더딘 복구 등의 여러 문제들이 발생하게 된다. 따라서 피부에 존재하는 줄기세포를 활성화시킬 수 있다면 줄기세포의 노화를 막고 활성을 다시 복원할 수 있을 것이다.

현재까지 태반 추출물을 화장품이나 의약용 그리고 식품에 적용하려는 시도는 많이 있어왔다. 선행 특허로서 일본 특개소 35-15399호에서는 태반추출물과 코지산 또는 코지산 유도체를 화장료 기제에 배합한 색백 화장료로서 미백효과를 제시하였으며, 대한민국 공개특허 제10-2004-0082144호 에서는 태반추출물, 유기게르마늄 및 유비퀴논(Coenzyme-Q10)을 포함하는 피부도포용 조성물로서 미백, 멜라닌 생성 억제, 보습, 주름억제 및 항산화 등의 작용을 제시하였으며, 태반추출 방법에 대한 특허로서 자하거(사람태반), 돈태반, 말태반을 대상으로 하여 종래의 태반 추출 방법을 개선시키기 위한 특허들이 나와 있다(대한민국 공개특허 10-2009-0002444, 10-2006-0131262, 10-2008-0103490).

본 발명은 말태반을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것으로, 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포배양용 배지, 말태반을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 및 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있는 물질을 찾기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과 말태반 추출물이 동물성 혈청을 대체 가능한 정도로 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 말태반 추출물을 포함하는 무혈청 줄기세포배양용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 말태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 말태반을 포함하는 무혈청(serum free) 줄기세포배양용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 말태반을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 말태반을 포함하는 무혈청 배지에 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있는 물질을 찾기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과 말태반이 동물성 혈청을 대체 가능한 정도로 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 말태반을 포함하며 동물성 혈청을 포함하지 않는 무혈청 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

상기 말태반은 줄기세포의 증식 촉진능이 매우 우수하므로 동물성 혈청이 포함되지 않은 무혈청 줄기세포 배지에서 동물성 혈청 대체제로 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 상기 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포 배양용 조성물에 감소된 양의 동물성 혈청이 추가로 포함된다.

본 발명의 조성물에는 혈청대체제로서 말태반이 포함되어 있기 때문에 줄기세포 배지에 첨가되는 동물성 혈청의 통상적인 양 보다 감소된 양이 포함되어도 줄기세포 배양에 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 감소된 양은 줄기세포 배양용 배지에 포함되는 통상적인 동물성 혈청의 양의 1/2 이하의 양이다.

태반(placenta)은 임신 중의 태아를 감싸는 막과 자궁을 연결하는 곳에 위치하는 원반형태의 장기이다. 태반의 주요성분으로는 필수 아미노산 외에 수십 종류의 아미노산과 약리 활성의 중심인 각종 활성 펩타이드, 각종 비타민, 당류, 핵산, 미네랄 그리고 수백 종의 효소로 이루어져 있다 (M.L. Pacor etal., Clin. Exp. Allergy, 2004;34:639-645). 그 외에는 HGF, FGF, IGF 등 여러 세포와 장기의 분화를 유도하는 각종 성장인자와 우리 몸의 면역기전에 필수적인 IL(1-4)등을 생성하여 신체의 여러 세포와 조직들을 활성화 시키고 면역력을 강화시켜 각종 신체 기능을 정상화 시키는 역할을 한다고 알려져 있다(M.L. Pacor etal., Clin. Exp. Allergy, 2004;34:639-645, 박노준, 대한의사협회지, 2005;58(10):1013-1021).

현재까지 보고 되어 지고 있는 태반의 효능은 신체의 면역력 강화, 항산화력, 항염증, 체내균형 유지, 인터페론 생산, 부신기능 강화작용 등이 보고 되고 있으며, 간질환, 통증질환, 류마티즘 관절염, 퇴행성 관절염, 갱년기 장애, 미용치료 등에 응용되고 있다.

특히 태반에 의한 미백작용이 알려져 있다(M.L. Pacor etal., Clin. Exp. Allergy, 2004;34:639-645). 태반은 티로시나제 효소의 반응을 억제해 티로신이 도파로 전환되는 것을 억제해 준다. 멜라닌의 전단계인 도파크롬(dopachrome)의 생성을 80~90% 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한 각질 융해작용도 있어 5%의 태반 추출용액으로 임상 실험한 결과 대조군에 비해 약 10.6% 가량 차이가 난다고 한다.

태반이 미백효과를 준다는 또 다른 근거는 말초 혈액 순환 촉진작용으로 피부의 신진대사 작용이 높아져, 멜라닌 과립 물질이나 부산물들의 체외배출이 촉진되기 때문이라고 한다.

또한 태반에는 표피증식인자(EGF)와 진피에서 콜라겐을 합성하는 섬유아세포를 증식시키는 성장인자(FGF)들이 함유되어 있다. 태반의 또 다른 장점으로는 다양한 성장인자들이 종합적으로 복합되어 있어 세포의 신진대사 작용 개선과 균형 회복은 물론, 피부의 재생 작용에도 매우 중요한 효과를 줄 수 있다(M.L. Pacor etal., Clin. Exp. Allergy, 2004;34:639-645, 박노준, 대한의사협회지, 2005;58(10):1013-1021), 김현진, 대한피부과학회지, 2003;41(12):1612-1618.)

본 명세서에서 용어 “말태반”은 말태반 전체로부터 산처리, 염기처리, 효소처리, 고압처리, 열처리 또는 물리적 처리에 의해 분해되어 얻은 분해 산물을 의미한다. 상기 물리적 처리는 예컨대 그라인딩(grinding)이다.

본 발명에서의 말태반의 분해 산물로서, 아스파틱산 (aspartic acid), 글루타믹산(glutamic acid), 프롤린(proline)과 같은 단분자인 아미노산 뿐만 아니라, 수개 내지 수십개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드와 온전한 단백질 분자가 모두 포함되고, 시알릭산(sialic acid)과 갈락토사민(galactosamine), 글루코사민(glucosamine), 갈락토스(galactose), 푸코스(fucose)등의 당 성분을 포함하고 있으며, 성장촉진인자, HGF, FGF, IGF 등의 생리활성물질을 포함하고 있다.

본 발명의 태반이 얻어지는 원천은 특별히 한정되지 않으며, 줄기세포 증식을 촉진하는 능력을 갖는다면 어떠한 태반이라도 모두 포함된다.

본 발명은 말태반을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

말태반은 매우 우수한 줄기세포 증식 촉진능을 갖기 때문에 이를 인체에 적용하는 경우 피부에 존재하는 성체 줄기세포의 증식을 촉진하거나 활성화시킴으로써 피부 상태를 개선시킬 수 있다. 피부에 존재하는 성체 줄기세포는 예를 들어, 모낭과 모낭사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 말태반은 상기 조성물 전체에 대해 0.01-30 중량％로 함유된다. 말태반의 함유량이 전체 조성물에 대해 0.01 중량％ 미만이면 피부 상태 개선 효과를 볼 수 없고, 30 중량％를 초과하여 포함되면 증가되는 함유량에 비해 증가된 개선 효과를 얻기 어려우며 제조비용이 증가하는 단점이 있다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물에 유효성분으로 포함되는 말태반은 본 발명의 상기에서 설명된 다른 발명인 무혈청 줄기세포 배양용 조성물에서 설명된 것과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 상기 피부상태의 개선은 염증성 피부질환의 완화, 피부주름의 개선, 피부노화의 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 효능, 피부 재생 효능을 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 염증성 피부질환은 아토피성 피부염, 피부습진(eczema), 여드름, 또는 건선이다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명이 기능성 식품 조성물의 형태로 제공되는 경우 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분인 말태반 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 피부상태 개선 용도로 매우 유용하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 기능성 식품 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 바, 캔디, 아이스크림, 오일, 및 분말 유탁액 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부에 직접 적용되는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태이다.

본 발명은 말태반을 포함하며 동물성 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 후에, 배양된 줄기세포를 배양액으로부터 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

상기 배양하는 줄기세포는 특정 타입의 줄기세포로 한정되지 않으나, 바람직하게는 포유동물 유래의 성체 줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 성체줄기세포이며, 가장 바람직하게는, 피부 유래 줄기세포, 또는 인간 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cells, ADSCs) 이다.

성체줄기세포와 배아줄기세포를 비교할 때 기능적 면에서 차이는 있으나 배아줄기세포나 성체줄기세포 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있어 각종 질병에 걸렸을 때 장기를 재생하는 목적으로 사용한다는 점에서 공통점이 있다. 성체줄기세포는 비교적 특정한 장기를 보다 잘 만들어 낼 수 있는 세포가 따로 정해져 있는 경우가 많다. 예를 들어 신경계 세포를 잘 생산할 수 있는 것은 신경줄기세포이며, 혈액을 잘 생산해 낼 수 있는 것은 조혈줄기세포 등이다. 그렇다고 이들의 분화능력이 각각 제한된 것은 아니다. 조혈줄기세포의 경우 심장근육이나 뇌신경, 간장 등으로의 분화도 일어나며, 성체를 구성하는 거의 모든 조직으로 분화 가능하다는 것이 이미 밝혀져 있다. 신경계 줄기세포의 경우도 신경계 이외의 다른 다양한 조직으로 분화할 능력이 있다는 것이 밝혀져 있다. 따라서 성체줄기세포는 분화능력이 제한되었다기 보다는 특성화되었다고 보는 것이 더 정확한 이해라고 할 수 있다. 무엇보다 성체줄기세포는 의학적으로 적용하기에 대단히 안전한 것이 특징이다. 장기재생을 위해 몸 안에 이식하여도 부작용이 낮으며, 주변조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직특이적 분화능력(site-specific differentiation)이 있다. 즉, 어떤 줄기세포를 이식하였을 때 골수로 들어가서는 혈액을 만들고, 뼈로 간 세포는 뼈를, 신경으로 간 세포는 신경조직으로 분화하면서 주변 조직과 잘 어울려서 융화되는 능력이 있다. 뿐만 아니라, 신체조직에 어떤 손상이 발생하면, 다른 장기에 있던 줄기세포가 몰려와서 응급상태에 빠진 조직으로 변하는 분화의 유연성을 가지고 있다. 성체줄기세포가 가지고 있는 또 하나의 특징은 주입된 몸 속에 서 자가재생산을 할 수 있다는 것이다. 미분화 상태에서 이식한 후 당장 필요한 세포를 만들어내는 것 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어서 저장하는 자가재생산능력이 있다.

또 하나의 특징은 성인의 몸속에 있기 때문에 자기 자신의 세포를 사용하는 자가이식(autologous transplantation)이 가능하다는 점이며 따라서 면역거부반응이 발생하지 않을 수 있다는 점이다. 또한 자가이식이 아닌 타인의 줄기세포를 이식받을 때에도 자신과 조직적 합성이 맞는 사람을 탐색하여 이식받을 수 있으므로, 체세포 복제와 같은 과정 없이도 비교적 쉽게 면역거부반응을 피해갈 수 있는 것도 중요한 특징이다.

본 발명의 말태반 함유 무혈청 배지에 줄기세포를 배양한 후 줄기세포를 제거하는 방법은 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 말태반 함유 무혈청 배지에 일정기간 줄기세포를 배양한 다음 세포배양액을 포획하여 0.2 um 규격의 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과한 다음 사용하였다..

상기 줄기세포를 배양한 후 이를 제거한 배양액에는 동물성 혈청으로부터 유래될 수 있는 다양한 생물학적 오염물, 예를 들어 동물성 세균, 동물성 바이러스 뿐만 아니라 프리온(prion)이나 독소(toxin)와 같은 단백질 등이 포함되어 있지 않으므로 배양액을 인체에 적용하는 경우 상기 오염물에 의한 감염 또는 독성 문제를 원천적으로 해결할 수 있다.

본 발명의 줄기세포를 배양한 배양액에는 줄기세포로부터 분비되어 다양한 생리활성물질(예를 들어 줄기세포 증식 또는 활성화 촉진능을 갖는 사이토카인)이 함유되어 있으므로, 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 인체에 적용하는 경우 인체에 존재하는 성체 줄기세포의 증식 촉진 또는 활성화를 통해 피부 상태를 개선하는 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물이 활성화 또는 증식 촉진시키는 피부 존재 성체 줄기세포는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포를 포함한다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물에 유효성분으로 포함되는 말태반은 본 발명의 상기 설명한 다른 발명인 무혈청 줄기세포 배양용 조성물에서 설명된 것과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 상기 피부상태의 개선은 염증성 피부질환의 완화, 피부주름의 개선, 피부노화의 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 및 피부 재생 효능 등을 포함한다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명이 기능성 식품 조성물의 형태로 제공되는 경우 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 피부상태 개선 용도로 매우 유용하다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 말태반을 포함하는 무혈청 줄기세포 배양용 조성물은 고가의 동물성 혈청을 사용하지 않으므로 제조비용을 현저히 낮출 수 있고, 동물성 혈청을 배지에 사용함으로써 발생되는 동물성 물질의 오염을 원천적으로 차단함으로써 보다 안전한 줄기세포를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 말태반을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 말태반을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포의 증식촉진능 및 활성화능을 가지므로, 염증성 피부질환의 완화, 피부 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 및 피부 재생 효능 등의 피부 상태의 개선 효과를 나타낸다.

[도 1a, 1b]은 인간 지방유래 줄기세포(ADSCs)와 탯줄혈액유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs)의 생존능에 대한 말태반(EPE)의 영향을 측정한 결과이다. 성체줄기세포를 말태반을 포함하는 조합 배양배지에서 3일간 성장시켰다. 무혈청 조건은 세포 배지를 혈청이 포함되지 않은 DMEM으로 교체하였다. 양성대조군으로서는 대조군 배지(10％ FBS를 포함하는 DMEM)에서 배양하였다. 세포 생존능은 MTT 분석법에 의해 결정하였다. 각 그룹에서의 측정값은 3개의 샘플(n=3)에 대해 얻은 평균값으로 나타내었다.
[도 2]는 말태반의 섬유아세포와 hair follicle dermal papilla 세포의 증식 촉진 효과를 보여주는 결과이다. 말태반을 포함하는 배지에서 각 세포를 3일간 배양하였다. 72 시간이 경과한 후에, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청 배지로 교체하여 3시간 배양한 후 O.D 값을 측정하였다.
[도 3]은 말태반의 섬유아세포 콜라겐 합성 촉진 효과를 보여주는 결과이다. 사람의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 X 10⁵ 세포/웰) 5％ 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 농도별로 시료를 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양하였다. 24 시간 후, 세포 배지를 수집하여 샘플을 제조하였고, 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit (MK101), Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 실험은 Takara의 키트 설명서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 측정된 표준치는 평균± 표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC⁺ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. (-) : 무혈청 조건, RA: Retinoic Acid
[도 4]는 말태반이 인체의 경피에 존재하는 피부줄기세포를 활성화시키는 실험결과를 보여준다. CM: 10％ FBS 및 1％ 항생제를 포함하는 DMEM; SF: 무혈청 DMEM; BN/SF: 말태반이 0.1% 첨가된 무혈청 DMEM; BN/SF/MSC: 말태반이 0.1% 첨가된 무혈청 DMEM에 인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs를 배양한 배양액.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상에 의식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

말태반 함유 무혈청배지에서 줄기세포의 세포생존능 측정

세포, 배지 및 배양방법

본 발명자들은 줄기세포배양용 혈청대체제를 찾기 위해 혈청이 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하면서 배지에 실험 물질을 첨가하여 양호한 줄기세포 성장이 이루어지는 물질들을 스크리닝하였다.

본 발명자들은 말태반의 기원, 아미노산 함량 및 올리고펩티드 분자량 분포에 기초하여 말태반추출물을 실험에 사용하였다.

줄기세포로는 인간 지방유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ADSCs)와 탯줄혈액유래 중간엽줄기세포 (human cord blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs) 을 사용하였다.

인간 지방유래 줄기세포는 Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였고, 동결보존된 세포들을 37℃에서 녹인 후 곧 바로 MesenPRO RS^TM 배지(Gibco, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 이어서, 세포들을 MesenPRO RS^TM 배지를 이용하여 증식시켰다. 탯줄혈액유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs)는 포천 차병원으로부터(Korea) 분양받아 FBS를 15% 포함하는 DMEM(low glucose) 배지에서 배양하였다.

말태반은 앞서 기술한 여러 처리 과정(산처리, 열처리, 효소처리)을 거쳐 제조될 수 있으며 대표적으로 상용되어 판매되는 효소(예: Protamex, Novozymes, Denmark)를 이용하여 말태반 분해산물을 얻었다. 용매에 녹인 말태반은 0.2μm 직경을 가진 멤브레인 필터를 통해 여과한 후, 0.1% 말태반의 무혈청 DMEM 배지를 제조하는데 사용하였다. 음성 대조군인 무혈청 조건 시험군에서는 세포 배양 배지를 무혈청 DMEM (Cat. 11885, Invitrogen)으로 교체하였다. 양성 대조군으로는 세포를 10％ FBS를 포함하는 DEME 배지에서 배양하였다.

세포생존능 ( cell viability ) 측정

세포생존능은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)분석을 통해 측정하였다. MTT 분석은 테트라졸륨환(tetrazolium ring)을 포함하는 기질이 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 청색의 포르마잔(formazan)으로 변환되는 것에 기초한 분석방법이다. 청색 포르마잔의 수준을 분광학적으로 측정한 후 이를 세포밀도의 간접적인 지표로 사용하였다. 간략하게 설명하면, 세포들을 37℃에서 MTT (1 mg/㎖)에 3 시간 동안 노출시킨 후, 배지를 제거하고 세포들을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 용해시켰다. 완전 용해된 후 청색 포르마잔의 존재는 파장 540 nm에서의 흡광도를 측정함으로서 분광학적으로 측정하였다.

MTT 분석법을 사용하여 성체 줄기세포의 증식에 미치는 말태반의 영향을 평가한 결과, 여러 처리를 통해 얻어진 말태반이 성체줄기세포의 증식을 현저히 유도함을 확인하였다(도 1a, b). 말태반 처리군에서 지방 유래 줄기세포(ADSCs)의 세포 성장률이 농도의존적으로 증가하였다(도 1a).말태반 처리군에서 CB-MSCs의 세포 성장률이 농도의존적으로 증가하였다(도 1b).

실험 결론

상기 결과들을 종합하면, 말태반이 동물성 기원의 성분이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 배양되는 줄기세포의 증식에 효과적으로 기여할 수 있다는 것을 제시하였다.

말태반의 조성과 특성

본 발명에서 선발된 말태반의 물리화학적인 특성을 조사하였다. 물리적 특성은 통상의 실험실에서 사용하는 방법에 준하여 실시하였으며 미생물실험 역시 통상의 방법에 따라 수행하였다.

말태반 ( Equidae placenta extract )

a. 물리적 특성(Physical properties)은 다음과 같았다: 외양(appearance)은 연한 살색 파우더이고, 안정성(stability)은 2％ 용액에서 안정적이었으며, 용해성(solubility)으로서 전체 용액의 5％ 이내에서 용해되었다.

b. 미생물학적 특징 (Microbiological controls)은 호기성/중온성 flora(total aerobic mesophilic flora) ≤ 5000 cfu/g 이었다.

c. 말태반이 함유하는 아미노산으로는 L-아스파라긴산, L-세린, L-글루타민산, L-아르기닌, L-트레오닌, L-알라닌, L-프롤린, L-발린, L-리신, L-로이신, 아미노초산 등이 있다.

d. 말태반이 함유하는 당(carbohydrate)으로는 sialic acid, galactosamine, glucosamine, galactose, fucose등이 있다.

f. 말태반은 성장촉진인자, HGF, FGF, IGF 등의 생리활성물질을 포함하고 있다.

e. 말태반은 마그네슘, 아연, 망간과 철 등 미네랄 성분을 포함하고 있다.

말태반 함유 무혈청배지에서 동물세포의 세포생존능 측정

본 실시예에서는 말태반이 다른 동물세포들의 증식도 촉진할 수 있는지를 알아보기 위해, Hair follicle dermal papillar cell과 인체유래섬유아세포(Human normal fibroblast)에서 말태반이 함유된 무혈청 배지에 배양하여 이들 세포 생존능에 미치는 효과를 관찰하였다. Hair follicle dermal papillar cell은 Cell Application 사로부터 구입하였고, Hair Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium (Cell Apllications, Inc. USA)배지를 이용해 배양하였다.

본 실시예의 실험은 다음과 같이 실시하였다. 5％ CO₂ 및37℃ 하에서 10％의 FBS, 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 섬유아세포와 Hair Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium을 이용해 배양한 hair follicle dermal papillar cell을 3 x 10⁵을 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 각각 무혈청조건과, 말태반이 첨가된 무혈청 조건으로 실험군을 나누어 배양하였다. 72 시간이 경과한 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청배지로 교체하여 3시간 후 O.D 값을 측정하여 백분율로 환산하였다.

하기 도 2a 2b에 나타낸 바와 같이, 정상군(혈청 포함)을 100％로 환산하였을 시, 무혈청조건에 비해 말태반이 각각 첨가된 조건에서 70％ 이상의 세포생존율 증가를 보여 말태반이 줄기세포뿐만 아니라 일반 세포의 세포증식을 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 말태반 Hair follicle dermal papillar cells의 세포 성장률이 농도의존적으로 증가하였다(도 2a).말태반 처리군에서 섬유아세포의 세포 성장률이 농도의존적으로 증가하였다(도 2b)

말태반의 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진효과

섬유아세포의 콜라겐 생합성 촉진은 피부에 있어 주름을 방지하고 완화하는 주요 지표이다. 주름은 통상적으로 콜라겐의 생합성이 감소하고 만들어진 콜라겐이 분해되면서 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 진피층에 존재하는 섬유아세포의 콜라겐 합성이 촉진되면 주름억제는 물론 생성된 주름도 개선될 수 있다.

사람의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 X 10⁵ 세포/웰) 5％ 농도의 CO₂ 배양기에서 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 농도별로 시료를 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양하였다. 24 시간 후, 세포 배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit; MK101; Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 실험은 키트 설명서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 측정된 표준치는 평균± 표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC⁺ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 실험 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 말태반은 양성대조군인 레티노산(RA, Retinoic Acid)을 사용한 경우보다 우수하게 섬유아세포의 콜라겐 합성을 증가시켰다.

말태반 함유 줄기세포배양액을 이용한 피부줄기세포의 활성화 측정

말태반이 첨가된 무혈청배지에서 배양한 줄기세포 배양액을 피부줄기세포에 처리하여 피부줄기세포의 활성화 정도를 측정하였다.

본 실시예에서 사용한 피부줄기세포는 대한피부연구학회지(2006;13(1):1-4)에 게재된 표피성체줄기세포 분리방법에 따라 분리하였다. 즉, 피부줄기세포(ESC)는 피부조직 또는 피부에서 수득한 세포들로부터 제4형 콜라겐에 부착성을 갖는 세포를 분리하여 얻었다. 이렇게 얻은 피부줄기세포를 3 X 10⁵개로 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1 회 세척한 다음, 통상적인 양의 혈청이 포함된 배지인 정상군 조건(CM), 무혈청조건(SF), 말태반이 첨가된 무혈청조건(BN/SF), 말태반이 첨가된 무혈청 배지에서 인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs 를 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액(BN/SF/MSC)의 실험군으로 나누어 배양하였다. 72 시간 배양한 후에, MTT 분석을 행하고, 세포배양액을 수집하여 CCK 분석법(Cell viability 측정방법)도 시행하였다.

도 4의 결과에서 보여지는 바와 같이, 정상군(CM)을 100 ％로 환산하였을 시, 무혈청 조건이 처리된 실험군(SF)에 비해, 말태반이 첨가된 무혈청 조건이 처리된 실험군(P/SF) 및 말태반이 첨가된 무혈청 조건으로 배양한 줄기세포의 배양액을 처리한 실험군(P/SF/MSC)에서 유의성 있게 피부줄기세포의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

말태반을 함유한 피부상태 개선용 외용조성물 제조

말태반을 일반적으로 화장품이나 연고 같은 피부외용제제로 만들 경우에 이용하는 Oil in Water 타입의 에멀젼 제형으로 시험제품을 만들었다. 각 시험제품의 조성은 표 1과 같았다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하여 용해시킨 다음 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부

제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 말태반을 0.1％ 첨가하였다.

성분	함량(중량%)
말태반이 함유되지 않은 무혈청배지에서 배양된 줄기세포 배양액(대조군 1)	0.1
말태반이 함유된 무혈청배지에서 배양된 줄기세포 배양액(시험군 1)
말태반이 포함되지 않은 대조군 (대조군 2)
말태반 (시험군 2)
호호바 오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세티아릴 알콜	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
프로필렌 글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100

말태반 함유 배지에서 줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 함유하는 피부상태 개선용 외용조성물 제조

말태반이 첨가된 무혈청 배지에서 줄기세포 (인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs)를 배양한 후 줄기세포를 제거하여 얻은 배양액을 포함하는 크림의 조성은 표 1과 같다. 실시예 6에서와 같은 방법으로 크림 조성물을 제조하였다. 마지막 단계에서 말태반이 첨가된 무혈청 배지에서 배양한 줄기세포의 배양액 및 향을 첨가하여 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

말태반 또는 말태반 함유 배지에서 배양된 줄기세포의 배양액을 포함하는 조성물의 여드름 개선 효과

말태반을 함유한 배지에서 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs)를 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액과 말태반(밀 말태반 또는 완두콩 말태반) 자체의 염증성 피부개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 줄기세포배양액 또는 밀 말태반 또는 완두콩 말태반을 각각 0.1％ 함유한 크림을 여드름 피부 피검자의 얼굴 왼쪽에 도포하였다. 다른 쪽에는 세포배양액이 결여되어 있는 크림 또는 밀 말태반/완두콩 말태반이 포함되지 않은 크림을 대조군으로 각각 도포하였다. 1개월 동안 여드름의 개선정도를 면포의 개수로 확인하였다. 그 결과 줄기세포배양액이 포함된 크림과 밀 말태반 및 완두콩 말태반이 포함된 크림을 도포한 왼쪽 얼굴에서만 증세가 호전되는 것을 확인할 수 있었다.

여드름 개선의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 여드름을 가진 환자(40명)를 대상으로 표 2의 크림 4종류(시험군 1, 2, 3, 4)와 비교 제조예(대조군 1 및 2)의 크림을 각각 여드름 환자의 한쪽 얼굴에 1일/2회 1개월 동안 사용하게 한 후, 여드름 개선 효과를 측정하였다. 측정은 눈 밑 2센티미터 아랫 쪽에 가상의 3제곱 센티미터의 사각형을 그리고 그 안에 들어가는 여드름의 개수를 세서 측정하였다. 시험결과는 하기 표 2에 나타내었다.

시험항목	말태반이함유되지 않은 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (대조군 1)	말태반이 0.01%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (시험군 1)	말태반이 0.1%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (시험군 2)
여드름면포수	34 + 1.4	23 + 2.6	14 + 1.7
시험항목	말태반이함유되지 않은 크림 (대조군 2)	말태반이 0.01%함유된 크림 (시험군 3)	말태반이 0.1%함유된 크림 (시험군 4)
여드름면포수	35 + 3.1	28 + 1.9	21 + 2.2

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 크림이 대조군 1과 2의 크림에 비해 여드름 개선 효과가 있음을 확인하였다.

말태반 또는 말태반 함유 배지에서 배양된 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물의 피부 염증 개선효과

말태반을 함유한 배지에서 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs)를 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액과 말태반(밀 말태반 또는 완두콩 말태반)자체의 아토피나 건선 등과 같은 만성 염증성 피부 개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 세포배양액 또는 밀 말태반 또는 완두콩 말태반을 각각 0.1％ 함유한 크림을 여드름 피부 피검자의 얼굴 왼쪽에 도포하였다. 다른 쪽에는 세포배양액 또는 밀 말태반/완두콩 말태반이 전혀 포함되지 않은 크림을 대조군으로 각각 도포하였다. 1개월 동안 염증성 피부질환의 대표적인 아토피의 개선정도를 홍반의 진정 정도로 수치화 하여 확인하였다. 그 결과 줄기세포배양액이 포함된 크림과 밀 말태반 또는 완두콩 말태반이 포함된 크림을 사용한 그룹에서만 증세가 호전되는 것을 확인할 수 있었다.

아토피 개선의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 아토피를 가진 환자(각 시험당 60명)를 대상으로 표 3의 크림 4종류(시험군 1, 2, 3, 4)와 비교제조예(대조군 1 및 2)의 크림을 각각 1개월 동안 전신에 사용하게 한 후, 아토피 개선 효과를 측정하였다. 측정은 팔의 접히는 부위를 중심으로 6곳을 임의로 정해 미놀타의 CR-300 색차계를 사용하여 홍반이 진정된 정도를 측정하고 설문을 통하여 가려움 정도를 측정한 후 두 값을 보정하여 최종 피부개선 정도를 수치화 하였다.

판정기준은 전혀 변화가 없는 경우를 0, 개선정도를 1 내지 5로 정하여 상대적인 값을 비교하였다. 높은 값 일수록 홍반과 가려움이 개선된 경우이다. 악화된 경우는 -1에서 -5까지 표기하였다. 시험결과는 하기 표 3에 나타내었다.

시험항목	말태반이 함유되지 않은 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (대조군 1)	말태반이 0.01%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (시험군 1)	말태반이 0.1%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (시험군 2)
피부개선정도	-1.9 + 0.14	2.7 + 0.11	3.5 + 0.09
시험항목	말태반이 함유되지 않은 크림 (대조군 2)	말태반이 0.01%함유된 크림 (시험군 3)	말태반이 0.1%함유된 크림 (시험군 4)
피부개선정도	-1.6 + 0.12	2.2 + 0.07	2.9 + 0.10

말태반 또는 말태반 함유 배지에서 배양된 줄기세포 배양액

함유 피부개선용 외용조성물의 항노화 효과

인체에 있어 항노화 효과는 여러 가지 기준으로 판정할 수 있으나 피부에 나타나는 주름은 손쉽게 측정할 수 있는 지표이다. 말태반 또는 말태반이 첨가된 무혈청배지에서 배양한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액의 피부주름 개선효과를 측정하였다. 표 4에서 제조한 크림을 사용하였다. 피부 주름개선 효과는 피부 탄력 변화의 측정을 통해 평가하였다. 피부 탄력의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 건강한 여성 20명(25 내지 35세)을 대상으로 표 4의 크림 4종류와 비교 제조예의 크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일/2회 3개월 동안 사용하게 한 후, Cutometer SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 주름개선 효과를 측정하였으며, 판정기준은 피부 탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 시험결과는 하기 표 4에 나타내었다.

시험항목	말태반이 함유되지 않은 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (대조군 1)	말태반이 0.01%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (시험군 1)	말태반이 0.1%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 함유크림 (시험군 2)
탄력도	2.31 + 0.15	3.57 + 0.24	4.25 + 0.18
시험항목	말태반이 함유되지 않은 크림 (대조군 2)	말태반이 0.01%함유된 크림 (시험군 3)	말태반이 0.1%함유된 크림 (시험군 4)
탄력도	1.98 + 0.12	3.16 + 0.11	3.86 + 0.23

상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 말태반 함유 크림

(시험군 1, 2, 3, 4)이 비교제조예(대조군 1 및 2)의 크림에 비해 주름개선 효과가 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 즉, 말태반 함유 배지에서 배양한 줄기세포의 배양액과 말태반 자체만을 포함한 크림 모두 주름개선 효과가 있었다.

경구투여에 의한 항노화 효과

노화는 모든 생물체에 시간과 함께 나타나는 현상으로 전조직과 기관에 나타난다. 피부는 동물의 경우 개체의 최외곽을 구성하는 가장 면적이 넓은 기관으로 피부에 나타나는 주름은 노화 정도를 가장 쉽게 판별할 수 있는 지표이다. 특히 자외선을 조사할 경우 인위적으로 노화과정을 촉진할 수 있기 때문에 동물시험에서 자외선을 쬔 후 시험물질을 경구나 경피로 투여하여 그 효과를 측정함으로써 그 물질이 실제 항노화 효과가 있는 지를 확인할 수 있다.

본 발명의 조성물이 광노화 증상에 미치는 영향을 조사하고자 무모생쥐 (hairless mouse)를 동물모델로 선정하여 실험하였다. 6-7 주령의 암컷 무모생쥐(hairless mouse)(Skh: HR-1)를 그룹 당 8 마리씩 정상군, UV 대조군, UV/말태반 투여군, UV/줄기세포 배양액 투여군으로 나누어 실험기간 동안 사육하였다. 정상군과 UV 대조군은 0.5 ㎖의 생리식염수를 경구 투여하였고, UV/말태반 투여군, UV/줄기세포 배양액 투여군은 고형분 기준으로 체중 Kg당 500mg의 말태반(완두콩 말태반 또는 밀 말태반) 또는 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포) 배양액을 0.5 ㎖ 식염수에 섞어 액체 투여용 주사기를 이용하여 경구 투여하였다.

투여기간은 총 5주로 주 5일 동일한 시간에 투여하였다. 경구투여 후 2주 부터 5주까지 UV대조군, UV/말태반 투여군 및 UV/줄기세포 배양액 투여군에 주 3회 태양광과 유사하게 UV를 조사하였다. 이때 실험기간 중 총 UV 조사량이 600 mJ/cm²이 되도록 하였다. 항노화 효과의 주 현상으로 주름개선 효과의 객관적 판정을 위하여 부검 전 무모생쥐(hairless mouse)의 등쪽에서 실리콘 폴리머를 이용하여 피부주형(replica)을 채취하였고 마찬가지로 5주 후에 각 샘플 처리군으로부터 피부주형을 채취하여 항노화 효과 즉 주름개선 효과를 비교하였다. 하기 표 8에서 보여 지는 바와 같이, 주름개선정도를 나타내는 R1, R2, R3, R4, R5 모두, 말태반 및 말태반 포함 무혈청 배지를 이용한 줄기세포 배양액을 투여한 무모생쥐(hairless mouse)에서 투여하지 않은 UV/대조군에 비해 크게 감소한 것을 관찰하였다. 이 결과를 통해 본 발명의 조성물이 피부주름을 개선하는 효과를 가짐을 알 수 있었다. 즉, 경구 투여시, 말태반 자체뿐만 아니라, 말태반 포함 무혈청배지를 이용해 배양한 줄기세포 배양액도 모두 주름개선 효과가 나타나 항노화 효과가 있음을 확인할 수 있었다(표 5).

R-parameter	UV/대조군	UV/말태반 (시험군 1)	UV/말태반이 0.1%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 (시험군 2)
R1 value	0.53 + 0.0152	0.49 + 0.0235	0.44 + 0.0201
R2 value	0.41 + 0.0124	0.37 + 0.0194	0.33 + 0.0314
R3 value	0.34 + 0.0238	0.28 + 0.0134	0.24 + 0.0225
R4 value	0.16 + 0.0241	0.09 + 0.0311	0.05 + 0.0134
R5 value	0.29 + 0.0113	0.20 + 0.0138	0.16 + 0.0220

R1 value: Skin roughness, R2 value: Maximum roughness, R3 value: Average roughness, R4 value: Smoothness depth, R5 value: Arithmetic average roughness (International Journal of Cosmetic Science, 2005 Jun;27(3):155-60).

무모 생쥐의 경피에 존재하는 피부줄기세포에 대한 효능 평가

실시예 11에서와 같이, 총 5 주간 주 5일 동일한 시간에 밀 말태반, 완두콩 말태반, 밀 말태반 함유 무혈청 배지를 이용한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액, 완두콩 말태반 함유 무혈청 배지를 이용한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액을 무모생쥐에 경구 투여한 후, 경피로부터 피부줄기세포를 분리하였다. 피부줄기세포의 분리방법은 앞서 설명된 공지된 방법에 따라 행하였다. 분리된 피부줄기세포를 3 X 10⁵개로 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청이 포함된 배지에서 48 시간 배양한 후, CCK 분석법 (cell viability 측정방법)를 이용하여 세포활성을 측정하였다.

	UV/대조군	UV/말태반 (시험군 1)	UV/말태반이 0.1%함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포배양액 (시험군 2)
세포증가율	100%	127%	136%

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, UV/대조군에 비해 모두 줄기세포 증식 속도가 증가된 것을 관찰하였다. 이러한 결과는, 말태반 또는 말태반이 함유된 무혈청 배지로 배양된 줄기세포배양액을 경구 투여하였을 경우에도 성체줄기세포의 활성화에 효과가 있음을 의미한다.

건강식품조성물 제조

실시예 11에서 항노화 효과가 나타났기 때문에 이들 소재를 이용하여 건강식품으로 개발하였다. 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 건강식품의 조성물은 다음 각각의 제제예와 같은 조성으로 통상의 액제 제조방법으로 제

조하였다. 최종 부피는 각 액제는 양이 100㎖ 이다. 본 제제 예는 액체뿐만 아니라 정제, 산제, 과립제 등으로 통상의 식품형태로 사용되는 여러 가지 제제의 제조방법으로 제조가 가능하다.

성분	함량
말태반이 함유된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포 배양액(시험군 2)	100 mg
말태반 (시험군 2)	100 mg
벌꿀	1500 mg
비타민 C	50 mg
비타민 B6	10 mg
니코틴산아미드	10 mg
로얄젤리	80 mg
스쿠알란	10 mg
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100 ml

에너지 상승효과

실시예 12에 사용된 말태반(시험군 1) 함유 무혈청배지로 배양한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액(시험군 2)을 이용하여 무모 생쥐에서 에너지 상승효과를 관찰하였다. 총 4주간, 주 5일 동일한 시간에 상기 시험군의 조성물들을 무모 생쥐에 구강으로 삽입하고 5주 후 희생시켜 장기로부터 SP(splenocytes), PBMC(peripheral blood mononuclear cell), LN(lymph node)와 같은 면역세포들을 분리한 후 시험군이 ATP 합성에 미치는 영향을 대조군과 비교하여 관찰하였다. 각각의 세포들을 PBS로 2번 세척한 후 용해물(lysate)를 얻은 다음, 0.6 M의 과염소산(perchloric acid)를 이용하여 단백질 제거시켜 원심분리한다. 단백질 침전물(Protein pellet)이 혼입되지 않게 상등액만을 얻어서 KOH로 중화한 다음, 칼륨-과염소산염(K-perchlorate)를 제거하기 위해서 가볍게 원심분리하였다. 그 결과 얻어진 상등액을 ATP 합성에 사용하였다. ATP는 글루코오스(glucose), 헥소키나아제(hexokinase), glucose-6-phosphate dehydrogenase가 있는 상태에서 NADP⁺의 환원에 의해 측정하였다. Oligomysin은 ATPase 활성에 대한 억제자로 사용하였다. 결과는 하기 표 8에서 나타낸 바와 같다.

Content of ATP	SP	PBMC	LN
Oligomysin	86 + 2.3	89 +3.1	87 + 1.9
대조군	85 + 3.4	91 + 2.7	85 + 3.6
시험군 1	111 + 5.1	108 + 4.7	103 + 2.0
시험군 2	120 + 2.9	118 + 3.0	109 + 5.6

상기 표 8의 결과에 의해 시험군 1, 2에서 면역세포들의 에너지 상승 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 실험결과를 요약하면, 줄기세포 배양시 말태반을 사용하여 동물성 혈청의 사용을 줄이거나 대체할 수 있음을 확인하였다. 또한, 말태반이 줄기세포 촉진제로서의 역할도 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 말태반이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양한 후 얻어지는 배양액을 경피 또는 경구 투여하는 경우 피부 상태를 개선할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

없음.

Claims

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말태반의 효소처리물을 포함하는 무혈청(serum free) 배지에 탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 후 배양된 세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물로서, 상기 피부상태 개선은 염증성 피부질환의 완화, 백반증의 개선, 상처 재생 및 피부 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
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제 14 항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 아토피성 피부염, 피부습진(eczema), 여드름, 또는 건선인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 상기 기능성 식품 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 바, 캔디, 아이스크림, 오일, 및 분말 유탁액 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 말태반의 효소처리물은 세포의 증식 촉진 또는 활성화 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 14 항에 있어서, 상기 말태반의 효소처리물은 전체 무혈청 배지에 대해 0.001-30 중량％로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.