KR20240002803A - 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 함유한 화장료 조성물 - Google Patents
발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 함유한 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀의 혼합물을 포함하는 조성물에 대한 것으로 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 또는 석류 유래 엑소좀을 단독으로 사용하는 것과 비교하여 우수한 피부 보습, 항염증, 항노화 및 주름 개선 효과를 지닌 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 포함하는 피부 보습, 항염증, 항노화 또는 주름 개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.
사람들에게 있어 항염, 미백, 피부 보습 및 주름 방지는 아름다움 및 노화 억제의 상징으로써 지속적인 관심의 대상이 되어 왔다. 이러한 관심으로 현재 화장품 시장에서는 미백, 피부 보습 및 항노화 제품들이 활발하게 출시되고 있으며, 이에 따른 소비자들의 관심도 증가에 따라 수요는 꾸준히 증가하고 있고, 관련 화장품 산업은 고부가 가치 산업으로 성장하고 있다.
최근, 많은 연구들에 의해 항염 효과, 피부 보습력 촉진뿐 아니라 주름을 생성하는 콜라겐 합성 관련 요소들의 활성 변화를 통한 주름 방지 효과를 모두 극대화할 수 있는 소재 개발이 많이 진행되고 있으며, 연구 및 소비자들의 요구도 증가하는 실정이다.
소포체란, 작게는 직경 약 20nm부터 크게는 직경 약 5㎛의 크기를 갖는 막 구조 미세 소낭체로서, 그 크기와 구성에 따라, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로 소낭(microvesicle), 마이크로 입자(microparticle) 등으로 분류된다. 이 중, 엑소좀(exosome)이란 동물 세포, 미생물, 식물, 체액 등 살아있는 모든 세포에서 세포 간 의사소통의 수단으로 세포 밖으로 분비되는 물질로서 50~200nm 나노 크기의 물질이다. 세포막과 유사한 인지질 이중층으로 이루어져 있는 엑소좀은 단백질을 표적세포에 전달하여 효율적으로 세포 내 해당 신호 전달을 용이하며, 다양한 2차 대사 산물 및 유전정보와 관련된 물질을 한번에 수송함으로써 복합적으로 신호를 전달할 수 있다. 하지만 제조단가가 고가이며, 가격경쟁력이 떨어지는 단점이 있다.
한편, 식물성 자원 중 에델바이스로부터 배양한 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 이용하는 것 뿐만 아니라 발효 과정을 통한 화장품 소재 개발이 선행되어 왔지만, 이러한 선행연구들과는 달리, 엑소좀과의 혼합 비율에 의한 효능 차이가 존재한다는 연구가 미미한 상황이다.
이에, 본 발명에서는 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀을 혼합하여 복합물을 제조할 경우, 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 또는 석류 유래 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선, 피부 보습, 항염 효능을 촉진 및 증대시키는 것을 확인하고 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부의 보습, 항염증, 항노화 및 주름 개선 효과를 개선시키는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀을 일정 비율로 혼합하여 사용한 결과, 주름 개선, 피부 보습 및 항염 효능 등의 효능이 모두 나타날 뿐만 아니라, 에델바이스 캘러스 배양 추출물 또는 석류 유래 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선, 피부 보습 및 항염 효능이 개선됨을 확인하고 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 에델바이스(Leontopodium alpinum) 캘러스 배양 추출물 및 석류 과육 유래 엑소좀의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 천연 유래의 추출물을 유효성분으로 포함하여 생체 안전성이 우수할 뿐만 아니라 피부 자극이 최소화될 수 있다. 특히, 상기 에델바이스 식물세포 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀이 피부에 동시에 작용하므로 상승 효과로 인해 항염증, 항노화 주름 개선 및 피부 보습 등 기능성이 현저히 증대될 수 있다.
상기 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀의 혼합물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 10중량%로 혼합될 수 있다.
또한, 상기 혼합물은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀이 1:9 내지 9:1 의 중량 비로 혼합된 것일 수 있으며, 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀을 9:1, 7:3, 5:5, 3:7 중량비로 혼합하여 테스트한 결과, 혼합물 내 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물이 석류 과육 유래 엑소좀과 동일하거나 더 많이 함유된 경우 주름 개선, 피부 보습 및 항염 효능이 더 우수함을 확인하였다.
상기 에델바이스 캘러스 배양 추출물에서 용어 "캘러스"는 식물 세포 또는 부정근의 배양물로써, 에델바이스 식물 세포의 분열에 의해 형성된 식물 세포 덩어리를 의미할 수 있다.
상기 에델바이스 캘러스 배양 추출물은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 접종하여 수득된 발효 추출물일 수 있다.
상기 발효는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미한다. 발효를 거친 대사물질은 피부에 좋은 각종 아미노산, 유기산, 항산화 물질을 함유하여 피부대사를 촉진시켜 피부 결을 탄력 있고 매끄럽게 가꿔준다. 또한, 발효과정을 거치면서 입자가 작아지면서 흡수율이 좋을 뿐 아니라 피부트러블이나 알레르기 부작용을 완화해줄 수 있다.
상기 발효 추출물은 상기 추출물을 자연적으로, 또는 장치, 구체적으로 회전감압농축기 및 동결건조기를 사용하여 건조시킨 후, 상기 배양물 또는 추출물을 용매, 바람직하게는 정제수에 일정 농도로 희석한 후 발효용 미생물, 즉, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 접종하고 발효시켜 제조할 수 있다.
상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 또는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습, 항염증, 항노화 또는 피부 주름 개선용으로사용될 수 있다.
상기 "피부 보습"은 피부의 수분 손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 피부조직의 항상성을 유지하는 모든 행위를 의미한다. 상기 피부 보습 효과는 각질 개선효과, 피부자극 감소효과 등 다양한 측면의 추가적인 피부 개선 효과를 수반할 수 있다.
상기 "항염증"은 염증을 억제하는 작용을 의미하며, 염증반응의 조절은 매우 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시킨다. 그러나 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 ROS가 과다 생성되고 영구적인 유전자의 변형이 야기될 수 있다. 즉, ROS는 생체 내 여러 가지 세포의 작용을 조절하는 염증 반응과 깊이 관련되어 있다.
상기 "주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화되는 현상을 의미한다.
또한, 본 발명은 에델바이스 캘러스 배양 추출물을 제조하는 단계; 에델바이스 캘러스 배양 추출물을 발효하는 단계; 석류 과육에서 엑소좀을 제조하는 단계; 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 과육에서 분리한 엑소좀을 일정 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 를 포함하는 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀의 혼합물의 제조방법을 제공한다.
상기 석류 과육에서 엑소좀을 분리하는 단계는 석류 과육 부위를 분쇄한 후, 증류수를 용매로 사용하여 60~70℃에서 2~3시간 동안 열처리를 통해 열수 추출한 후 냉각 및 여과하여 수득할 수 있다. 구체적으로, 상기 석류 과육 유래 엑소좀은 (a)석류 과육 원물에 증류수를 넣고 분쇄하는 단계; (b) 상기 분쇄물을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 죽은 세포 및 이물질을 분리 및 제거하는 단계; (c) 여과된 상등액을 초고속 원심 분리하여 엑소좀이 포함된 1차 펠렛층을 형성하는 단계; (d) (c)의 원심 분리 후 상등액을 재 원심분리 후, 엑소좀이 포함된 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및 (e) 1차 및 2차 펠렛층을 정제수에 재부유시켜 석류 과육으로부터 엑소좀을 분리하는 단계에 의하여 수득될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 석류 과육 유래 엑소좀은 (a)석류 과육 원물에 중량비 20배의 증류수를 넣고 분쇄한 후, 4℃에서 24시간 동안 분쇄물을 안정화시키는 단계; (b) 분쇄물을 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 분쇄액의 상등액만을 취하여 죽은 세포 및 이물질을 분리 및 제거하는 단계; (c) 상기 상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d) 상기 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 후, 엑소좀을 가라앉혀 1차 펠렛층을 형성하는 단계; (e)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 재원심분리 후, 추가 엑소좀을 가라앉혀 2차 펠렛층을 형성하는 단계; (f) 고순도의 엑소좀 분리를 위하여 상기 (d) 및 (e)단계를 2-3회 반복하는 단계; 및 (g) 상기 단계에서 형성된 펠렛층들을 정제수에 재부유시켜 석류 과육으로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 에 의해 수득될 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀의 혼합물은 통상의 방법을 통하여 다양한 형태의 화장료 조성물로 제형화될 수 있다.
상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 아이에센스, 에센스, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디에센스, 보디세정제, 염모제, 샴푸, 린스, 정발제, 양모제, 연고, 젤, 크림, 패취, 분무제, 분말제 및 피부 접착타입 등의 제형을 가질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
또한, 각각의 제형에 있어서 상기한 필수성분 이외에 다른 성분들은 기타 제형의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 배합할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 마이크로 니들, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 명세서에 따른 화장료 조성물에는 본 명세서의 화합물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 본 명세서에 따른 화장료 조성물은 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 명세서의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
본 발명의 실시예들은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 제조함으로써 우수한 피부 보습, 항염증, 항노화 및 주름 개선 효과를 지닌 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명으로부터 제공되는 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 또는 석류 유래 엑소좀 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해, 주름 개선 및 항염증 효과뿐 아니라 피부 보습 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명에 따른 제형예 2 및 비교제형예 1 내지 3의 보습 및 지속 보습력을 평가한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 제형예 1 내지 6의 보습 및 지속 보습력을 평가한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 제형예 8 및 비교제형예 4 내지 6의 보습 및 지속 보습력을 평가한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 제형예 7 내지 12의 보습 및 지속 보습력을 평가한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제형예 2 및 비교제형예 1 내지 3의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 제형예 1 내지 6의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따라 제형예 8 및 비교제형예 4 내지 6의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제형예 7 내지 12의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 염증 관련 인자인 산화질소(Nitric oxide; NO)의 활성 변화를 확인한 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 염증 관련 인자인 TNF-α 생성 저해 활성 변화를 확인한 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 피부 탄력 관련 단백질인 pro-collagen type 1의 활성 변화를 확인한 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 피부 탄력 관련 단백질인 MMP-1의 활성 변화를 확인한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 제형예 1 내지 6의 보습 및 지속 보습력을 평가한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 제형예 8 및 비교제형예 4 내지 6의 보습 및 지속 보습력을 평가한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 제형예 7 내지 12의 보습 및 지속 보습력을 평가한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제형예 2 및 비교제형예 1 내지 3의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 제형예 1 내지 6의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따라 제형예 8 및 비교제형예 4 내지 6의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제형예 7 내지 12의 경피수분 손실량 개선을 평가한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 염증 관련 인자인 산화질소(Nitric oxide; NO)의 활성 변화를 확인한 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 염증 관련 인자인 TNF-α 생성 저해 활성 변화를 확인한 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 피부 탄력 관련 단백질인 pro-collagen type 1의 활성 변화를 확인한 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2의 피부 탄력 관련 단백질인 MMP-1의 활성 변화를 확인한 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예의 상세한 설명은 첨부된 도면들을 참조하여 설명할 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록, 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 하기에서 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.
<비교예 1: 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물의 제조>
에델바이스의 줄기, 꽃 또는 잎, 에델바이스 종자의 발아된 유묘에서 배양된 식물세포를 세척하고 탈수 및 건조하여 수득한 건조된 에델바이스 캘러스 분말 100g을 정제수 1L에 넣고, 50℃에서 8시간 동안 교반하면서 1차 추출하고, 98℃에서 10분간 열수 추출하였다. 필터로 추출물을 여과한 후 30℃온도에서 감압농축하고 동결건조하여 고형분을 수득하였다. 수득한 에델바이스 캘러스 배양 추출물을 정제수를 이용하여 혼합한 후, 발효 균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 3일 동안 15~25℃에서 발효하였다. 발효 공정이 종료된 후 필터로 여과하고 1,2-헥산다이올을 첨가하여 발효 추출물을 수득하였다. 하기 표 1은 본 발명에 따른 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 제조를 위한 조성을 나타낸 것이다.
| 성분 | 비교예1 (중량%) |
| 에델바이스 캘러스 배양 추출물 | 0.1 |
| 락토바실러스발효물 | 0.1 |
| 1,2-헥산다이올 | 2 |
| 정제수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
<비교예 2: 석류 유래 엑소좀의 제조>
석류 과육으로부터 엑소좀을 분리하기 위해 분쇄기를 이용하여 석류 과육 부위에 정제수를 중량비 20배를 가하여 불린 후, 분쇄기로 분쇄한 후, 엑소좀의 순도를 높이기 위해 석류 분쇄물을 원심분리기를 이용하여 3,000~4,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿층을 제외하고 상등액만을 취하여 잔여물을 분리 및 제거하였다. 본 과정에서 수득된 상등액을 초고속 원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하여 10,000~15,000 x g로 20~30분 동안 원심분리하고, 수득된 상등액의 순도를 더욱 높이기 위해 상등액을 여과하여 잔여물을 분리 및 제거함으로 더욱 순도를 높이고자 하였다. 순도가 높은 상등액에 존재하는 엑소좀을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000 x g에서 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 침전시켰다. 최종 펠렛층인 엑소좀을 멸균 증류수에 재부유시켜 분산시켜 엑소좀을 제조하였다.
<실시예 1~4: 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류엑소좀 혼합물의 제조>
상기 비교예 1 및 2에서 얻은 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래엑소좀을 혼합하여 최종 혼합물을 제조하였다. 표 2는 본 발명에 따른 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물 제조를 위한 조성을 나타낸 것이다.
| 비교예 1 (중량%) |
비교예 2 (중량%) |
|
| 실시예 1 | 9 | 1 |
| 실시예 2 | 7 | 3 |
| 실시예 3 | 5 | 5 |
| 실시예 4 | 3 | 7 |
<제형예 1~6 및 비교제형예 1~3: 에센스의 제조>
다이소듐이디티에이, 글리세린, 프로판다이올, 카보머를 정제수에 분산시켜 70℃ 내지 75℃로 가열한 수상에 용해된 유화계를 첨가한 후 아지믹서로 5분간 교반하였다. 60℃ 내지 65℃에서 트로메타민을 첨가한 후 아지믹서로 3분간 교반하여 중화하였다. 45℃에서 1,2-헥산다이올, 에틸헥실글리세린을 투입하고 3분간 교반한 후 30℃까지 냉각하였다. 그 후 실시예 1 내지 3의 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 포함하는 화장료(제형예 1 내지 6), 비교예 1, 2의 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀을 각각 단일로 포함하는 화장료(비교제형예 1, 2)를 투입하고, 3분간 교반 및 탈포하여 에센스 제형을 제조하였다. 하기 표 3은 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3 및 비교예 1, 2를 함유하거나 모두 함유하지 않은 에센스 제조를 위한 조성을 나타낸 것이다.
| 성분 | 제형예 1 | 제형예 2 | 제형예 3 | 제형예 4 | 제형예 5 | 제형예 6 | 비교제형예 1 | 비교제형예 2 | 비교제형예 3 |
| 중량 (%) | |||||||||
| 실시예 1 | 10.0 | - | - | 5.0 | - | - | - | - | - |
| 실시예 2 | - | 10.0 | - | - | 5.0 | - | - | - | - |
| 실시예 3 | - | - | 10.0 | - | - | 5.0 | - | - | - |
| 비교예 1 | - | - | - | - | - | - | 10.0 | - | - |
| 비교예 2 | - | - | - | - | - | - | - | 10.0 | - |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 |
| 프로판다이올 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 |
| 글리세린 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 1,2-헥산다이올 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 카보머 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 트로메타민 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 |
| 에틸헥실글리세린 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 다이소듐이디티에이 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 합계 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
<제형예 7~12 및 비교제형예 4~6: 크림의 제조>
세틸에틸헥사노에이트, 세테아릴알코올, 글리세릴스테아레이트를 75℃ 내지 80℃로 가열 용해하여 투명 유화계를 제조하였다. 다이소듐이디티에이, 글리세린, 프로판다이올, 세테아릴올리베이트, 솔비탄올리베이트, 카보머를 정제수에 분산시켜 70℃ 내지 75℃로 가열한 수상에 용해된 유화계를 첨가한 후 호모믹서로 3500 내지 5000 rpm 조건 하에서 5분간 유화하였다. 60℃ 내지 65℃에서 트로메타민을 첨가한 후 호모믹서로 3000 내지 3500 rpm 조건 하에서 3분간 교반하여 중화하였 다. 45℃에서 1,2-헥산다이올, 에틸헥실글리세린을 투입하고 3분간 교반한 후 30℃까지 냉각하였다. 그 후 실시예 1 내지 3의 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류엑소좀 혼합물을 포함하는 화장료(제형예 7 내지 12), 비교예 1, 2의 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀을 각각 단일로 포함하는 화장료(비교제형예 4, 5)를 투입하고, 3분간 교반 및 탈포하여 크림 제형을 제조하였다. 하기 표 4는 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3 및 비교예 1, 2를 함유하거나 모두 함유하지 않은 크림 제조를 위한 조성을 나타낸 것이다.
| 성분 | 제형예 7 | 제형예 8 | 제형예 9 | 제형예 10 | 제형예 11 | 제형예 12 | 비교제형예 4 | 비교제형예 5 | 비교제형예 6 |
| 중량 (%) | |||||||||
| 실시예 1 | 10.0 | - | - | 5.0 | - | - | - | - | - |
| 실시예 2 | - | 10.0 | - | - | 5.0 | - | - | - | - |
| 실시예 3 | - | - | 10.0 | - | - | 5.0 | - | - | - |
| 비교예 1 | - | - | - | - | - | 10.0 | - | - | |
| 비교예 2 | - | - | - | - | - | - | 10.0 | - | |
| 정제수 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 | 잔량 |
| 글리세린 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 프로판다이올 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
| 세틸에틸헥사노에이트 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
| 세테아릴알코올 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 세테아릴올리베이트 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 솔비탄올리베이트 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 1,2-헥산다이올 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 글리세릴스테아레이트 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 카보머 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 트로메타민 | 0.24 | 0.24 | 0.24 | 0.24 | 0.24 | 0.24 | 0.24 | 0.24 | 0.24 |
| 에틸헥실글리세린 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 다이소듐이디티에이 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 합계 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
<실험예 1. 피부 첩포 시험 평가>
본 발명에 따른 제형예 1 내지 12, 비교제형예 1 내지 6을 피부에 첩포한 뒤 육안 평가를 통해 시험 제품의 인체피부 일차 자극의 유무 평가 및 객관적 검증을 위해 피부 첩포 시험을 수행하였다. 건강한 성인 10명을 대상으로 실험을 실시하였고, IQ Ultra 챔버에 시료 25 mg 도포 후 이를 시험부위인 팔 하박부 안쪽에 24시간 폐쇄 첩포하였다. 첩포 제거 후 1시간, 24시간, 48시간 경과 후 피부반응을 관찰하였다. ICDRG(The International Contact Dermatitis Research Group)의 기준에 준하여 인체에 대한 피부 자극 시험을 평가한 결과, 하기 표 5과 같이 제형예 1 내지 12, 비교제형예 1 내지 6 모두 피부 자극을 유발하지 않으며, 피부 적용에 안전한 것을 확인할 수 있었다.
| 제품명 |
반응
자수 |
1 시간 | 24 시간 | 48 시간 |
평균피부
반응도 |
자극
판정 |
|||||||||
| ± | + | ++ | +++ | ± | + | ++ | +++ | ± | + | ++ | +++ | ||||
| 제형예 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 11 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 제형예 12 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 비교제형예 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 비교제형예 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 비교제형예 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 비교제형예 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 비교제형예 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
| 비교제형예 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 무자극 |
<실험예 2. 보습력 및 지속보습력 평가>
준비 단계에서 피험자들의 측정 조건을 동일하게 하고자 시험 부위를 깨끗하고 마른 상태로 유지하였으며 최소 30분간 항온 항습 (22±2℃ R.H. 40~60%)이 유지되는 곳에서 피부 안정을 취한 후 진행하였다. 측정 단계에서 시험 제품을 전완부의 선정된 시험부위(5cm X 4cm)에 Micro pipette을 사용하여 2mg/cm2의 양으로 도포하였다. 측정은 제품 사용 전, 사용 후, 3시간 후로 총 3회 측정하며 3개의 값을 이용해 평균값을 구하였다. 피부 수분 측정은 Aphrodite moisture checker MC-1000를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 6 및 도 1 내지 4에 나타내었다.
| 시료 | 도포 직후 보습력 (%) | 도포 3시간 후 보습력 (%) |
| 제형예 1 | 127.2 | 70.4 |
| 제형예 2 | 139.0 | 80.3 |
| 제형예 3 | 119.8 | 56.7 |
| 제형예 4 | 116.7 | 52.8 |
| 제형예 5 | 122.2 | 60.6 |
| 제형예 6 | 112.0 | 50.1 |
| 제형예 7 | 121.6 | 53.5 |
| 제형예 8 | 138.1 | 65.0 |
| 제형예 9 | 95.1 | 56.9 |
| 제형예 10 | 104.1 | 50.5 |
| 제형예 11 | 121.1 | 59.5 |
| 제형예 12 | 80.9 | 23.5 |
| 비교제형예 1 | 109.6 | 47.4 |
| 비교제형예 2 | 90.5 | 34.0 |
| 비교제형예 3 | 61.9 | 7.2 |
| 비교제형예 4 | 84.4 | 38.6 |
| 비교제형예 5 | 53.7 | 15.5 |
| 비교제형예 6 | 30.6 | 4.0 |
상기 표 6 및 도 1 내지 4를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 함유한 제형예 1 내지 12는 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 단일 함유한 비교제형예 1, 2, 4 및 5에 비하여 도포 직후 보습력 및 도포 3시간 후 보습력이 증가하여 지속되는 것으로 나타났다. 특히, 실시예 2를 10% 함유한 제형예 2 및 8의 도포 직후 보습력 및 도포 3시간 후 보습력이 가장 우수하였다. 따라서 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀을 혼합하는 것이 각각 단독으로 함유하는 것 보다 바람직하고, 그 중에서도 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 비율이 7:3 일 때, 보습 효과가 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 3. 경피수분손실량 평가>
준비 단계에서 피험자들의 측정 조건을 동일하게 하고자 시험 부위를 깨끗하고 마른 상태로 유지하였으며 최소 30분간 항온 항습 (22±2℃ R.H. 40~60%)이 유지되는 곳에서 피부 안정을 취한 후 진행하였다. 측정 단계에서 시험 제품을 전완부의 선정된 시험부위(5cm X 4cm)에 Micro pipette을 사용하여 2mg/cm2의 양으로 도포하였다. 측정은 제품 사용 전, 3시간 후 총 2회 측정하며 3개의 값을 이용해 평균값을 구하였다. 경피 수분 손실량 측정은 Tewameter® TM 300 기기를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 7 및 도 5 내지 8에 나타내었다.
| 시료 | 도포 직후 경피수분손실량 개선 (%) |
도포 3시간 후 경피수분손실량 개선 (%) |
| 제형예 1 | 15.6 | 7.0 |
| 제형예 2 | 17.6 | 8.6 |
| 제형예 3 | 12.1 | 5.2 |
| 제형예 4 | 12.8 | 4.1 |
| 제형예 5 | 15.4 | 6.2 |
| 제형예 6 | 11.1 | 3.5 |
| 제형예 7 | 30.5 | 20.2 |
| 제형예 8 | 33.1 | 22.2 |
| 제형예 9 | 20.2 | 12.8 |
| 제형예 10 | 22.1 | 15.9 |
| 제형예 11 | 28.5 | 19.2 |
| 제형예 12 | 18.2 | 11.2 |
| 비교제형예 1 | 9.3 | 3.9 |
| 비교제형예 2 | 4.5 | 1.9 |
| 비교제형예 3 | 2.6 | 0.9 |
| 비교제형예 4 | 17.8 | 13.3 |
| 비교제형예 5 | 15.1 | 11.5 |
| 비교제형예 6 | 11.6 | 7.8 |
상기 표 7 및 도 5 내지 8를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 함유한 제형예 1 내지 12는 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 단일 함유한 비교제형예 1, 2, 4 및 5에 비하여 도포 직후 및 도포 3시간 후 경피 수분 손실량이 개선되었음을 알 수 있다. 특히, 실시예 2를 10% 함유한 제형예 2 및 8의 도포 직후 및 도포 3시간 후 경피 수분 손실량 개선 효과가 가장 우수하였다. 따라서 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀을 혼합하는 것이 각각 단독으로 함유하는 것 보다 바람직하고, 그 중에서도 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 비율이 7:3 일 때, 경피 수분 손실량 개선 효과가 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4. 세포독성 평가>
96well plate에 NHF를 6 Х 103cells/well씩, HaCaT을 1.5 Х 104cells/well, RAW 264.7을 1 Х 105cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 버리고 PBS로 세척한 다음 NHF는 supplement를 함유하지 않은 FBM 배지를, HaCaT, RAW264.7 세포는 FBS를 함유하지 않은 DMEM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어주었다. 다음 날, 일정 농도의 시험물질을 처리하여 24시간 배양하였다. 배지에 10배 희석시킨 WST-1 시약을 각 well에 100 μl씩 넣고 2시간 배양 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포독성 시험을 위해 시험물질을 최소 0.1%부터 최고 10%까지의 농도로 하여 시험을 진행하였다. 그 결과, 비교예 1 및 2, 실시예 1 내지 4를 각각 NHF, HaCaT, RAW264.7에 처리한 결과, 최고 농도인 10%에서 세포생존율이 90% 이상으로 나타났다.
본 효력 시험의 농도는 세포독성이 없는 농도를 선정하여 효력의 농도의존성을 확인하였고, 이를 표 8에 나타내었다.
| 시험물질 | 농도 | 세포 생존율 (%) | ||
| NHF | HaCaT | RAW 264.7 | ||
| Control | 100.0±1.8 | 100.0±0.4 | 100.0±0.8 | |
| 비교예 1 | 10 | 92.0±3.1 | 96.8±3.9 | 102.5±2.5 |
| 5 | 94.2±3.9 | 105.4±4.4 | 101.8±2.6 | |
| 1 | 102.4±1.4 | 102.4±2.7 | 102.1±3.6 | |
| 0.1 | 99.4±1.3 | 98.7±0.6 | 98.4±0.7 | |
| 비교예 2 | 10 | 94.5±4.3 | 99.4±4.7 | 94.5±4.3 |
| 5 | 101.2±3.8 | 104.4±2.0 | 101.2±3.8 | |
| 1 | 100.2±2.0 | 108.2±6.3 | 100.2±2.0 | |
| 0.1 | 99.4±1.3 | 98.7±0.6 | 104.1±3.7 | |
| 실시예 1 | 10 | 101.6±2.5 | 101.5±1.3 | 100.0±1.2 |
| 5 | 97.6±7.6 | 103.3±2.7 | 98.7±0.6 | |
| 1 | 99.5±2.9 | 98.4±4.3 | 97.5±2.3 | |
| 0.1 | 99.4±1.3 | 98.7±0.6 | 97.5±2.3 | |
| 실시예 2 | 10 | 101.6±2.6 | 104.0±0.5 | 98.9±1.4 |
| 5 | 102.2±2.5 | 101.1±3.2 | 98.6±0.8 | |
| 1 | 104.1±3.9 | 98.7±3.8 | 98.6±1.3 | |
| 0.1 | 102.3±1.2 | 99.5±0.8 | 98.6±1.3 | |
| 실시예 3 | 10 | 98.8±2.5 | 95.9±2.9 | 103.3±0.7 |
| 5 | 105.7±3.0 | 104.4±4.4 | 101.0±1.9 | |
| 1 | 104.6±4.0 | 104.7±4.2 | 103.0±1.4 | |
| 0.1 | 98.2±2.2 | 101.0±1.9 | 100.7±1.4 | |
| 실시예 4 | 10 | 104.8±2.9 | 96.6±1.7 | 104.1±3.7 |
| 5 | 99.7±4.0 | 102.2±3.1 | 107.0±3.3 | |
| 1 | 101.7±3.0 | 98.2±4.2 | 108.0±1.5 | |
| 0.1 | 98.2±2.2 | 101.0±1.9 | 104.0±1.5 | |
<실험예 5. NO 생성 억제능 평가>
96well plate에 RAW 264.7을 5 Х 104cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS를 함유하지 않은 DMEM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어주었다. 다음 날, 5 μg/ml의 LPS(Lipopolysaccaride)와 함께 일정 농도의 시험물질을 처리하여 배양하였다. 24시간 후, 세포 배양액과 griess reagent를 동량 넣어 혼합 후, 15분간 상온에서 반응시켰다. 560nm에서 흡광도를 측정하였으며, 염증매개물질인 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)의 양은 Sodium nitrite로부터 얻은 표준곡선을 이용하여 결정하였다. 최종 NO의 양은 일정 단백질 당 NO의 양으로 환산하여 음성 대조군과 비교하였고, 도 9에 나타내었다.
실험 결과, 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀을 혼합한 경우, NO 저해 활성이 우수한 것을 확인하였다. 특히, 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀의 혼합 비율이 7:3(실시예 2)일 때 NO 생성 저해 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀은 단독으로 사용하는 것에 비해 혼합하여 사용하는 것이 NO 생성 억제 효과가 더욱 우수하며, 최적의 혼합비율에 따른 효능을 확인할 수 있었고, 이를 표 9에 나타내었다.
| 시험물질 | 농도 | NO 생성량 (%) |
| Control | 100.0±1.1 | |
| LPS | 274.5±2.3 | |
| Indomethacin (uM) | 20 | 181.4±1.7 |
| 10 | 184.5±2.0 | |
| 비교예 1 | 10 | 192.8±8.6 |
| 5 | 235.7±6.2 | |
| 1 | 265.8±1.1 | |
| 0.1 | 277.5±6.3 | |
| 비교예 2 | 10 | 179.8±2.6 |
| 5 | 230.7±9.2 | |
| 1 | 257.8±5.0 | |
| 0.1 | 277.5±1.3 | |
| 실시예 1 | 10 | 255.6±2.8 |
| 5 | 267.7±2.5 | |
| 1 | 303.3±2.6 | |
| 0.1 | 308.1±2.7 | |
| 실시예 2 | 10 | 136.4±8.4 |
| 5 | 210.8±9.8 | |
| 1 | 231.6±9.9 | |
| 0.1 | 253.6±8.4 | |
| 실시예 3 | 10 | 162.8±2.7 |
| 5 | 227.7±7.9 | |
| 1 | 247.8±5.7 | |
| 0.1 | 255.5±6.8 | |
| 실시예 4 | 10 | 232.4±5.1 |
| 5 | 258.9±9.8 | |
| 1 | 275.0±4.3 | |
| 0.1 | 275.5±3.1 | |
<실험예 6. TNF-α 생성 저해 활성 평가>
대식세포인 RAW 264.7 세포를 10%(v/v) 태아소혈청, 스트렙토마이신 및 페니실린을 첨가한 Dulbecco' modified Eagle' medium(DMEM)에서 약 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하여 96 well plat에 1Х105 cell/well의 양으로 분주하였다.
이어서, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1, 2에 따라 제조된 조성물 각각을 농도별로 처리하고, LPS(5 μg/mL)로 자극하여 24시간 동안 배양한 뒤 세포배양액을 수거하여 ELISA kit(R&D System Inc. Minneapolis, MN, USA)를 이용해 TNF-α의 양을 측정하였다. Kit에 포함된 농도별 TNF-α 표준 곡선을 이용해 TNF-α 양을 정량하였다.
한편, 양성대조군으로 시료 대신 Indomethacin (20 μg/mL)을 처리하였으며, 시료와의 TNF-α 억제활성 비교에 이용되었다.
실험 결과, LPS 처리군은 929.3 pg/mL의 TNF-α 생성을 유도하며, 음성대조군(226.3 pg/mL)과 비교하였을 때 약 4.1 배의 통계적으로 유의한 증가로 확인되었다. 실시예 2 내지 4에서 579.0 pg/mL, 644.38 pg/mL, 811.23 pg/mL의 TNF-α 생성이 나타났으며, 특히, 실시예 2는 LPS 대조군 대비 약 37.7%의 통계적으로 유의한 억제 활성이 나타나는 것으로 확인되었다. 또한, 발효된 에델바이스 캘러스 배 양 추출물과 석류 유래 엑소좀을 혼합한 원료는 농도-의존적인 경향으로 TNF-α 억제 활성이 증가하는 것으로 나타났는데, 결론적으로 실시예 2 내지 4에서 실시예 2가 가장 우수한 TNF-α 억제 활성을 확인할 수 있었다.
따라서, 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물(비교예 1)과 석류 유래 엑소좀(비교예 2)을 단독으로 사용하는 것에 비해 혼합하여 사용하는 것이 TNF-α 생성에 대한 억제 효과가 더욱 우수하며, 혼합비율이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었고, 이를 표 10에 나타내었다.
| 시험물질 | 농도 | TNF-α 생성량 (ug/ml) |
| Control | 226.3±8.1 | |
| LPS | 929.3±3.5 | |
| Indomethacin (uM) | 20 | 321.4±6.2 |
| 10 | 551.1±8.1 | |
| 비교예 1 | 10 | 836.4±8.6 |
| 7 | 844.5±6.2 | |
| 5 | 869.5±6.0 | |
| 비교예 2 | 10 | 821.8±7.6 |
| 7 | 832.9±9.2 | |
| 5 | 872.9±5.0 | |
| 실시예 2 | 10 | 579.0±7.1 |
| 7 | 721.1±9.8 | |
| 5 | 868.6±9.9 | |
| 실시예 3 | 10 | 644.4±3.7 |
| 7 | 769.3±7.9 | |
| 5 | 812.2±5.7 | |
| 실시예 4 | 10 | 811.2±5.0 |
| 7 | 844.8±8.9 | |
| 5 | 875.1±6.3 | |
<실험예 7. Procollagen Type 1 생성능 평가>
96well plate에 NHF를 6 Х 103cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 버리고 PBS로 세척한 다음 supplement를 함유하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어주었다. 다음 날, 일정 농도의 시험물질을 처리하여 24시간 배양하였다. Procollagen Type 1 Elisa kit를 이용하여 실험 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 최종 Procollagen의 양은 일정 단백질 당 Procollagen의 양으로 환산하여 음성대조군과 비교하였고, 도 11에 나타내었다.
실험 결과, 동일한 농도 및 조건에서 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀을 혼합한 경우가 단독으로 사용했을 때와 비교하였을 때, Procollagen Type 1 활성을 증가시켜 콜라겐 활성이 우수한 것을 확인하였다. 특히 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀의 혼합 비율이 7:3(실시예 2)일 경우 Procollagen Type 1 활성이 크게 증가하였다. 따라서 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해 혼합하여 사용하는 것이, 주름 개선 효과가 더욱 우수하며, 혼합비율이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었고, 이를 표 11에 나타내었다.
| 시험물질 | 농도 | Procollagen Type 1 생성량 (%) |
| Control | 100.0±6.27 | |
| TGF-β | 10 | 241.38±6.82 |
| 비교예 1 | 10 | 159.85±6.47 |
| 5 | 145.32±9.43 | |
| 1 | 123.72±1.16 | |
| 0.1 | 97.76±4.27 | |
| 비교예 2 | 10 | 180.49±3.75 |
| 5 | 164.08±5.96 | |
| 1 | 111.66±1.06 | |
| 0.1 | 89.20±5.48 | |
| 실시예 1 | 10 | 200.66±5.79 |
| 5 | 182.41±7.69 | |
| 1 | 143.05±5.84 | |
| 0.1 | 120.02±2.44 | |
| 실시예 2 | 10 | 211.68±3.24 |
| 5 | 192.44±1.26 | |
| 1 | 155.03±4.52 | |
| 0.1 | 122.75±2.40 | |
| 실시예 3 | 10 | 207.35±2.88 |
| 5 | 188.50±8.39 | |
| 1 | 145.74±3.94 | |
| 0.1 | 115.72±3.10 | |
| 실시예 4 | 10 | 206.71±4.41 |
| 5 | 187.92±4.06 | |
| 1 | 152.67±5.80 | |
| 0.1 | 114.23±1.51 | |
<실험예 8. MMP-1 생성 억제 평가>
6well plate에 HaCaT 세포를 2.5 Х 105cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 배양하였다. 24시간 후, 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지(serum free 배지)를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 UVB를 조사하여 배양하였다.
96well plate에 NHF를 6 Х 103cells/well씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 배양하였다. 24시간 후 supplement를 포함하지 않은 FBM 배지를 사용하여 세포를 기아상태로 만들어 준 후, 다음 날 UVB 자극을 받은 HaCaT의 배양액을 시료와 함께 인체 섬유 아세포에 처리하여 배양하였다. 24시간 배양 후, MMP-1 Elisa kit를 이용하여 실험 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 최종 MMP-1의 양은 일정 단백질 당 MMP-1의 양으로 환산하여 음성 대조군과 비교하였고, 도 12에 나타내었다.
실험 결과, 동일한 농도 및 조건에서 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 과즙 유래 엑소좀을 혼합한 경우가 단독으로 사용했을 때와 비교하여 MMP-1 저해 활성이 우수한 것을 확인하였다. 특히, 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀의 혼합 비율이 7:3(실시예 2)일 경우 MMP-1 저해 활성 증가폭이 크게 나타났다. 따라서 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물과 석류 유래 엑소좀을 단독으로 사용하는 것에 비해 혼합하여 사용하는 것이, 주름 개선 효과가 더욱 우수하며, 혼합비율이 매우 중요하다는 것을 확인할 수 있었고, 이를 표 12에 나타내었다.
| 시험물질 | 농도 | MMP-1 생성량 (%) |
| Control | 100.0±2.0 | |
| UVB | 141.6±6.1 | |
| EGCG (uM) | 10 | 48.8±2.1 |
| RA (uM) | 10 | 27.4±3.5 |
| 비교예 1 | 10 | 117.0±2.9 |
| 5 | 122.8±8.4 | |
| 1 | 135.7±2.4 | |
| 0.1 | 143.3±2.6 | |
| 비교예 2 | 10 | 102.6±1.4 |
| 5 | 111.4±4.2 | |
| 1 | 126.4±1.3 | |
| 0.1 | 134.6±0.6 | |
| 실시예 1 | 10 | 95.0±1.0 |
| 5 | 101.1±5.2 | |
| 1 | 110.0±3.0 | |
| 0.1 | 128.3±3.3 | |
| 실시예 2 | 10 | 75.8±2.4 |
| 5 | 95.1±1.9 | |
| 1 | 103.4±2.6 | |
| 0.1 | 118.3±1.3 | |
| 실시예 3 | 10 | 79.0±5.0 |
| 5 | 97.8±1.6 | |
| 1 | 107.8±2.7 | |
| 0.1 | 118.3±4.9 | |
| 실시예 4 | 10 | 83.3±4.0 |
| 5 | 101.4±3.8 | |
| 1 | 110.0±3.7 | |
| 0.1 | 118.8±5.6 | |
상기에서는 본 발명의 일 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 당업자는 이하에서 서술하는 특허 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경 실시할 수 있을 것이다. 그러므로 변형된 실시가 기본적으로 본 발명의 특허청구범위의 구성 요소를 포함한다면 모두 본 발명의 기술적 범주에 포함된다고 보아야 한다.
Claims (8)
- 에델바이스(Leontopodium alpinum) 캘러스(Callus) 배양 추출물 및
석류 유래 엑소좀의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 혼합물은 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 10.0 중량%를 포함하는 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 혼합물은 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀이 1:9 내지 9:1의 중량비로 혼합된 것인 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 에델바이스 캘러스 배양 추출물은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 접종하여 수득된 발효 추출물인 화장료 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 석류 유래 엑소좀은 하기의 방법에 의해 제조된 것인 화장료 조성물:
(a)석류 과육 원물에 증류수를 넣고 분쇄하는 단계;
(b) 상기 분쇄물을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 죽은 세포 및 이물질을 분리 및 제거하는 단계;
(c) 여과된 상등액을 초고속 원심 분리하여 엑소좀이 포함된 1차 펠렛층을 형성하는 단계;
(d) (c)의 원심 분리 후 상등액을 재 원심분리 후, 엑소좀이 포함된 2차 펠렛층을 형성하는 단계; 및
(e) 1차 및 2차 펠렛층을 정제수에 재부유시켜 석류 과육으로부터 엑소좀을 분리하는 단계. - 제 5항에 있어서,
고순도의 엑소좀 분리를 위해 상기 (c) 및 (d) 단계는 2 내지 3회 반복되는 것인 화장료 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화된 화장료 조성물. - 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 피부 보습, 항염증, 항노화 또는 피부 주름 개선을 위한 것인 화장료 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020220080851A KR20240002803A (ko) | 2022-06-30 | 2022-06-30 | 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 함유한 화장료 조성물 |
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