KR20160043551A - 에델바이스 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

에델바이스 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에델바이스(Leontopodium alpinum) 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 에델바이스 식물체로부터 유도된 식물 세포 배양물, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 항염, 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 주름개선, 창상 치유, 모공수축, 피지분비 억제, 여드름 개선 등의 효능을 가지고 있다.

Description

에델바이스 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 {Anti-inflammation and Anti-aging composition for skin external application comprising Leontopodium alpinum Cell Culture Extract and Methods for preparing the Same}
본 발명은 에델바이스(Edelweiss, Leontopodium alpinum) 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염, 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 에델바이스 식물체로부터 유도된 식물 세포 배양물, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 항노화, 미백, 창상 치유, 항염, 피지억제, 여드름 억제, 자외선으로부터의 피부 손상 보호 효과, 피부장벽보호 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다
인간의 피부는 시간이 지남에 따라 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 생기는 내인성 노화(intrinsic aging)와, 외적으로는 각종 오염물질과 자외선에 의한 광노화(photoaging)에 의해, 피부가 얇아지며 (내인성 노화의 경우), 탄력이 감소하게 되며 자외선 조사에 노출됨에 따라 표피 내 각질형성세포와 멜라닌세포가 UVB에 의해 세포손상을 받게 된다. 피부 노화는 태양광선에 노출되지 않는 부위에서 나타나는 연대학적 노화 (chronologic aging)와 태양광선의 노출부에서 일어나는 퇴행성 변화가 연대학적 노화와 복합되어 일어나는 광인성 노화 (actinic ageing) 로 구분된다. 연대학적 노화에서는 특징적인 임상 피부소견으로 미세한 주름, 진피의 위축, 피하지방층의 감소 등이 관찰된다. 광노화 과정에서는 거칠고 깊은 주름 (coatse wrinkling and furrowing)이 나타나고 비정상적인 탄력질양 물질(elastotic material)이 축적되어 피부가 가죽같이 두터워지며 느슨해진다. 만성적 일광손상을 입은 피부에서 볼 수 있는 현상은 진피의 상부 쪽 교원질의 비정상적인 탄력질양 물질의 침착 (solar elastosis)과 프로테오글리칸 (proteoglycan)이 증가되고 진피의 주단백질인 콜라겐이 현저히 감소되는 것이다. 콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부와 노화와 밀접한 관계를 가지고 있다.피부를 구성하는 세포에서는 내인성 노화나, 광노화에 의해 세포활성이 떨어지고, 신호전달체계가 불완전해지면서 피부조직을 분해하는 효소인 MMPs (matrix metalloproteinases)의 생합성이 증가하고, 콜라겐의 생합성이 감소하여 주름살이 생기고 탄력이 감소하고, 피부흑화를 초래하는 멜라닌생성이 증가하는 것으로 알려져있다. 따라서 피부 세포를 증식시키거나, 피부를 구성하는 기질물질을 증가시킴으로써 피부를 두껍게 할 수 있는 물질, 피부를 구성하는 기질 물질인 콜라겐을 분해하는 MMPs의 생합성을 억제할 수 있는 물질, 멜라닌 생합성을 억제할 수 있는 물질 등이 주름, 탄력 상실, 피부흑화 등의 피부 증상을 완화시키는 것으로 밝혀져 있다.
창상 치유, 노화방지, 항염 효과를 가진 물질들에 관한 연구가 활발히 진행되었으나, 기존의 화학물질들은 독성, 저활성, 용도의 한계성 및 과량복용에 따른 부작용 등의 여러 가지 문제로 사용에 제한을 받고 있어 부작용 가능성이 적은 소재를 개발하려는 일환으로 천연 식물에서의 유효 성분 추출하는 연구가 활발하다. 하지만 천연물 경우에도 안전성, 안정성 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있으며, 만족할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다.
한편, 에델바이스는 외떡잎식물 백합목 에델바이스과의 여러해살이풀이다. 에델바이스 화피조각은 6개이고 흰색이며, 부화관은 높이 4mm 정도로서 노란색이다. 부화관의 모양은 품종에 따라 다르며, 흰색, 주황색, 노란색이 있다.
최근 들어 식물성 자원을 이용한 기능성 식품 개발 및 화장품 소재로써의 활용에 많은 연구가 이루어지고 있으나, 에델바이스에 관해서는 에델바이스 추출물을 포함하는 피부 재생 및 모발 성장 촉진제 (특허문헌 1)에 관한 선행문헌이 있을 뿐, 에델바이스로부터 배양한 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물 자체에 관한 화장품 소재로써의 연구는 전무한 수준이다.
특허문헌 1: PCT 국제특허출원공개공보 WO2013180526
본 발명자들은 에델바이스의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물이 항염, 항노화, 창상 치유 등에 효능이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 에델바이스(Edelweiss , Leontopodium alpinum)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 주름 개선용, 창상 치유용, 피부 염증 완화, 억제, 개선용, 피지 분비 억제, 여드름 억제 또는 개선, 자외선에 의한 피부 손상 방지, 완화, 경감, 회복용, 피부 장벽 보호, 개선, 미백용, 피부보습용을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 에델바이스의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 에델바이스(Edelweiss , Leontopodium alpinum)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에델바이스(Edelweiss)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 억제 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에델바이스(Edelweiss)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 창상 치유용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에델바이스(Edelweiss)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부의 염증 완화 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에델바이스(Edelweiss)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 모공 축소용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에델바이스(Edelweiss)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피지 억제용, 피부보습용, 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에델바이스(Edelweiss)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 여드름 억제 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 에델바이스(Edelweiss)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상 방지, 완화, 경감, 회복용, 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 에델바이스 (Edelweiss) 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 에델바이스 식물의 잎, 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포 또는 부정근으로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 에델바이스 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계는,
(i) 상기 에델바이스 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 6-벤질아미노푸린(6-Benzylaminopurine, 6-BAP), 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)을 함유한 배지에서 배양함으로써 식물 세포 배양물을 얻는 단계이거나,
(ii) 상기 에델바이스 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 인돌부티르산(IBA)을 함유한 배지에서 배양함으로써 부정근 배양물을 얻는 단계,
인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 에델바이스 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 미백, 피부 주름 개선, 모공 축소, 피부 창상 치유, 피지 억제, 여드름 억제, 자외선에 의한 피부 손상 방지 효능, 피부 장벽 보호능, 보습 효과, 염증 완화 등을 가지고 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 에델바이스 식물세포 배양 (캘러스) 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 에델바이스 식물세포 배양물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 에델바이스 식물세포 배양추출물의 보습 효과를 확인하기 위해 AQP3 mRNA relative intensity를 확인한 그래프이다.
도 4는 에델바이스 식물세포 배양추출물의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 MMP-2 mRNA relative intensity를 확인한 그래프이다.
도 5는 에델바이스 식물세포 배양추출물의 Wound healing Assaym를 통한 창상 치유 효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 에델바이스 식물세포 배양추출물의 자외선 조사에 따른 보호효과 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 에델바이스 식물세포 배양물의 고주파 처리에 활용될 수 있는 고주파 처리 장치의 구조를 나타낸 그림이다.
본 발명은 에델바이스(Edelweiss , Leontopodium alpinum)의 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 에델바이스(Edelweiss)의 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "피부 개선용"이란, 피부의 상태를 개선, 예컨대, 항염의 경우, 염증의 완화, 방지, 경감, 항노화, 피부 주름 개선, 억제, 창상 치유, 모공 축소, 피부 탄력 증진, 자외선에 의한 피부 손상 억제, 피지억제, 여드름 억제, 미백, 피부 장벽 보호 또는 개선, 보습 등을 모두 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는" 의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 상기와 같은 다양한 피부 개선 효과, 예를 들어, 주름 개선, 항산화능을 통한 창상 치유, 항염 등의 효능을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 에델바이스 식물 세포 배양물은 에델바이스 식물체의 일부, 예컨대, 줄기, 또는 잎의 전체 또는 일부를 잘라 유도 배지에서 배양을 통해 얻어지는 것이다.
이와 같은 배양 유도는 식물 조직 배양에 관한 것으로, 식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.
"식물 세포 배양물"은 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다. 보통 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있다. 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다.
따라서, 본 발명에 따른 에델바이스의 줄기, 잎 등의 어느 부위로부터 유도된 것이든 모두 가능하나, 일 구체예로, 에델바이스의 줄기와 잎의 조직 일부, 또는 에델바이스 종자의 발아된 유묘로부터 자엽을 절취하여 유도시킨 식물세포일 수 있고, 에델바이스의 어느 조직이든지 일부 잘라내어 옥신 및 사이토키닌의 함량을 조절한 배지에 놓아두면 식물세포가 형성될 수 있다. 부정근 배양의 경우는 식물 세포 배양 과정과 동일하게 진행되나, 다만, 부정근이 유도될 수 있도록 식물 호르몬의 조합을 달리한다.
본 발명에 있어서, 상기 에델바이스의 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.
이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 0.1, 0.5, 1 중량%,또는 2중량%의 경우를 실험한 결과를 포함하고 있으나, 5%, 10%에서도 우수한 효능을 가지고 있는 것을 확인하였으며, 세포 생존율 또한 10%에서도 영향이 없음을 확인하였다. 이 이외에 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 피부개선효과, 주름개선, 창상 치유, 항염 기능 등을 가짐은 당업자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 항염, 항노화, 피부 주름 개선, 창상 치유, 피부 탄력 증진, 자외선에 의한 피부 손상 억제, 피지억제, 여드름 억제용, 미백용, 피부장벽 보호 또는 개선용 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 에델바이스의 식물 세포 또는 부정근 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 에델바이스의 식물 세포 또는 부정근 배양물 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올, 호호바오일 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.
본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출, 호호바오일 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.
냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15~25℃)에 상기 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.
또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 에델바이스(Edelweiss, Leontopodium aplinum) 식물의 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 에델바이스 식물의 잎, 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포 또는 부정근으로 배양하는 단계; 및
(b) 상기 에델바이스 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계.
상기 (a)단계는 에델바이스 식물로부터 분리된 일부 조직을 가지고, 식물 조직배양물, 즉, 식물 세포 배양물, 또는 부정근 배양물을 얻는 과정이다.
본 발명에 있어서, 상기 에델바이스 식물체의 잎, 또는 줄기 조직을 분리하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분리한 조직으로부터 식물 세포 배양물, 부정근 배양물을 유도를 위해서 적절한 배지를 선택할 수 있다. 상기 (a)단계에서, 구체적으로는 에델바이스 식물 세포 또는 부정근 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH4NO3 1650 mg, KNO3 1900 mg, CaCl2.2H2O 440 mg, MgSO4.7H2O 370 mg, KH2PO4 170 mg, KI 0.83 mg, H3BO3 6.2 mg, MnSO4.4H2O 22.3 mg, ZnSO4.7H2O 8.6 mg, Na2MoO4.2H2O 0.25 mg, CuSO4,5H2O 0.025 mg, CoCl2.6H2O 0.025 mg, FeSO4.7H2O 27.8 mg, Na2EDTA.2H2O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.
식물 잎 유래, 식물 줄기 유래 등으로부터의 식물 세포 배양 유도시, 기본적인 MS 배지 조성의 차이는 거의 없으나, 식물 세포, 부정근 유도에 있어서 가장 중요한 식물 생장 호르몬의 종류는 상이하다.
본 발명에 따른 식물 세포 배양의 경우, 잎 또는 줄기 유래의 식물 세포 배양의 경우, 6-Benzylaminopurine (6-BAP), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4 D)을 함유시켜 배양함으로써 식물 세포 배양물을 얻을 수 있다.
각각의 호르몬의 조합 비율은 6-Benzylaminopurine (6-BAP) 및 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)이 1:0.4-0.8, 또는 1:0.5~0.6인 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 6-벤질아미노푸린 (6-BAP) 100 중량부에 대하여, 2,4-디클로로페녹시아세트산 40 내지 80중량부, 또는 50 내지 60중량부인 것을 특징으로 할 수 있다.
예컨대, 6-벤질아미노푸린(6-Benzylaminopurine, 6-BAP) 및 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)은 각각 0.5-1mg/ml, 및 0.3-0.6mg/ml 함유될 수 있다.
한편, 부정근 배양의 경우에는, 인돌부티르산(Indole-3-butyric acid, IBA)을 함유시켜 배양함으로써 부정근 배양물을 얻을 수있다. 예컨대, 0.2-1mg/ml IBA를 함유시켜 부정근 배양물을 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 배양시, UVA를 3 내지 6시간 처리하거나, 시킴산을 150uM~400uM 배지에 추가하여 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 창상 치유, 항노화, 항염, 피지억제, 여드름 개선, 자외선에 의한 피부 손상 방지, 피부 장벽 보호, 개선, 미백, 보습 등의 효능을 증가시키기 위해, 유인제 처리하는 과정을 포함할 수 있다.
좀 더 상세히, 이러한 유인제 처리는 UVA 처리, 시킴산 처리, 고주파 처리를 포함하며 페놀성 화합물, 카로티노이드, 플라보노이드 함량 증가 또한 가능하다. 상세 조건은 다음과 같다.
1. UVA: 물리적 유인제인 UV-A 형광 램프(20W, Sankyo Denki, Japan)를 매일 0.5h ~ 8h 씩 처리하며 배양한다.
2. 시킴산: 200 ~ 600 M 시킴산(Shikimic acid)을 MS배지에 넣어서 배양한다.
3. 고주파 처리: 배양된 식물세포 또는 부정근을 50 내지 500 kHz로 5~30분 간격으로 2~6회 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 본 발명에 있어서, 고주파 처리는 본 기술분야에 잘 알려진 상용화된 기기 (아이티시 (주), 네오(주) 등), 또는 한국특허출원 제10-2012-0127017호(대한민국특허공개 10-2014-0060201호)에 개시된 형태의 고주파 처리장치를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 이러한 고주파 처리장치는 200-1500kHz의 고주파를 발생,처리할 수 있는 것이면 적용 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 후, 고주파 파형 발생장치를 이용하여 바람직하게는, 100 또는 400 kHz로 하루동안 15분 간격으로 4번 처리하고 이를 일주일 또는 이주일간 반복 처리할 수 있다.
구체적으로, 상기 한국특허출원 제10-2012-0127017호에 공개된 고주파 처리 장치의 구성은 도 7에 나타난 바와 같으며, 그 제작과정 및 고주파 처리 과정을 상세하게 설명하면 다음과 같다:
먼저, 소정의 크기를 가지고 형성되는 케이스(210)와, 상기 케이스(210)의 상부에 착탈 가능하게 장착되는 상부 덮개(220)와, 상기 케이스(210)의 양측 동일선상에 장착되는 고주파 단자(230)와, 상기 케이스(210)를 지지하는 수평 지지판(240)과, 소정의 높이를 가지며 상기 수평 지지판(240)을 지지하는 고정봉(250)으로 구성되는 바이오 리액터(200)를 준비한다. 그리고 상기 바이오 리액터(200)와 간격을 두고 고주파를 발생시키는 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 고주파를 조절하는 조작부(310)와, 현재상태 및 작동상태를 나타내는 표시부(320)와, 주파수의 상태를 표시하는 레벨메타(330)로 구성되는 고주파 공급기(300)를 설치한다. 다음으로 상기 고주파 공급기(300)와 간격을 두고 소정의 크기를 가지며, 내부에 공기 생성부(미도시)가 장착되고, 전방에는 공기를 배출하는 배출구(420)가 형성되며, 상기 배출구(420)에는 공기를 전달하는 공기 호스(440)가 장착되는 공기 공급기(400)를 설치한다. 그리고 상기 공기 공급기(400)의 일 측으로 진동을 변환 및 기록하는 진동 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 각종 기능을 조절하는 진동 조작부(510)와, 현재상태를 나타내는 진동 표시부(520)와, 상기 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(530)으로 구성되는 진동기록기(500)를 장착하면 고주파 세포 배양기(100)의 조립은 완료되는 것이다. 여기서 상기 고주파 세포 배양기(100)의 조립 순서는 상기와 다르게 구성될 수도 있다.
다음으로 상기와 같이 구성되는 고주파 세포 배양기(100)의 사용상태를 살펴보면 다음과 같다.먼저 상기 바이오 리액터(200)를 구성하는 케이스(210)의 주입구(211)를 폐쇄하고 있는 상부 덮개(220)를 개방한 후 상기 케이스(210)의 내부에 배양액과 세포배양을 공급한 상기 주입구(211)를 상부 덮개(220)를 이용하여 폐쇄한다.
그리고 상기 고주파 공급기(300)를 구성하는 조작부(310)를 이용하여 고주파의 설정 값을 조절한 후 연결선(233)을 이용하여 바이오 리액터(200)의 고주파 단자(230)에 고주파를 전달한다.
동시에 상기 공기 공급기(400)에서 발생하는 공기를 공기 호스(440)를 이용하여 상기 바이오 리액터(200)의 공기 주입부(213)에 공급한다. 다음으로 상기 케이스(210)의 내부에 수용된 세포배양은 고주파 단자(230)를 통해 전달되는 고주파의 영향을 전달받게 되고, 사용자는 표시부(320)와 레벨메타(330)를 통해 실시간으로 공급되는 고주파의 정보를 확인하게 된다.
더불어 상기 고주파 공급기(300)에 전달되는 바이오 리액터(200)의 진동을 진동기록기(500)를 통해 기록하면 되는 것이다.
상기의 고주파 세포배양기(100)는 바이오 리액터(200)에서 배양한 후 물리적 유인제인 고주파를 고주파공급기(300)를 통해 조작부(310)로 조작하고 진동기록부(500)에 진동표시부(520)를 확인하여 처리한다.
식물세포, 부정근 배양에 있어, 이러한 고주파 세포배양기를 이용할 시에, 예컨대, 바이오 리액터의 반응 부피는 1L, 전력은 20W, 세포 배양 배지의 조성은 MS 배지 파우더 4.4g, 수크로오스 30g, 벤질 아데닌 2mg, IAA2mg, 버퍼용 MES(pH 5.8)으로 하고, 상기 배지에서 일주일간 배양하며 고주파 처리된 상기 샘플은 회수한 후 6 내지 10시간 동안 진공 건조한다.이후, 50% 에탄올을 용매로 1시간 초음파 추출하고 30분간 볼텍싱(vortexing)하며, 충분하게 이차대사산물이 나온 상등액을 원심분리한 후 수득하고, 모든 샘플은 HPLC(Waters 650E Advanced Protein Purification System)를 이용하여 분석하며, Gemini 5u C18 110A(4.6*250mm, 5 micron, Phenomenex 사) 컬럼을 사용한다. 이동상 용매의 농도구배는 물(0.1% TFA(Trifluoro acetic acid)함유): 아세토니트릴(Acetonnitrile, 0.1% TFA(Trifluoro acetic acid)함유)를 초기 0-45분에는 10:0, 45-50분에는 1:9로 변화시키며 유속 1ml/min으로 하여 분석하고, 검출기는 UV 검출기(230nm)를 이용한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 식물 세포 또는 부정근 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조할 수 있다.
예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 에델바이스의 식물 세포 또는 부정근 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나,
(a)단계에서 얻어진 에델바이스의 식물 세포 또는 부정근 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출, 호호바오일을 비롯한 식물성 오일을 이용한 추출, 무기용매를 이용한 추출 또는 에탄올을 비롯한 알코올 등의 유기용매를 이용한 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물은 우수한 티로시나제 저해능을 가져, 미백용으로써 활용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물은 모공축소용으로써 활용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물은 피지분비억제, 여드름 억제 또는 개선, 자외선에 의한 피부 손상 방지, 창상 치유, 보습, 피부 장벽 보호 또는 개선 효능을 가진다.
또한 본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물은 iNOS 활성 저해를 통한 항염 , 즉 염증의 완화, 경감, 억제 등의 효과를 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.
특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.
피부 외용제 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 피부 수렴, 항염, 창상 치유, 항노화 등의 기능성 화장품의 형태를 포함한다.
본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.
이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 이하의 실시예에서는 에델바이스 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물에 관한 효능을 확인하였으나, 추출물이 아닌 배양물 자체에 대해서도 이러한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1-1: 본 발명에 따른 에델바이스로부터의 식물세포 유도
본 발명에 사용된 에델바이스 씨앗(인터넷 쇼핑몰에서 구입, 원산지: 네덜란드)를 70% 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30% 락스 +Tween20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하여, 발아시킨 후, 에델바이스 식물체의 잎을 날카로운 칼을 이용하여 단번에 상처를 내어 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70% 의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대배양은 2주 간격으로 수행하였다 (도 1).
실시예 1-2: 본 발명에 따른 에델바이스 식물체 부정근 유도
에델바이스 식물세포로부터 부정근을 유도하기 위하여 MS 기본배지에 Sucrose 30 g/L, Gelite 2.0 g/L 을 첨가하였고, 생장조절물질 IBA(indole-3-butyric acid) 0.5 mg/L 을 첨가하여 25±2℃ 의 배양실에서 4주간 배양하였다. 유도한 부정근의 정단부를 약 1 cm 정도 절단하여 1/2 MS 배지에 0.5 mg/L의 IBA(indole-3-butyric acid), Sucrose 50 g/L 을 첨가한 액체배지에 접종하였다. 25±2 ℃의 배양실에서 4주간 배양하였다. 수확한 부정근은 스테인레스 채로 걸러 배지를 분리해내고 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일간 건조한 후 실험에 사용하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다.
실시예 1-3: 본 발명에 따른 에델바이스 식물세포 및 부정근의 대량생산
에델바이스 식물체로부터 무균적으로 유도되어 배양된 에델바이스 식물세포 및 에델바이스 부정근을 대량생산하기 위하여, 상기와 같이, 에델바이스 식물세포의 경우, MS배지에 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D가 함유된 배지에서 배양하였고, 에델바이스 부정근의 경우, 1/2 MS 배지에 IBA(indole-3-butyric acid) 0.5 mg/L, Sucrose 50 g/L가 함유된 배지에서 25±2℃ 의 배양실에서, 습도 70% 조건으로 20L 풍선형 생물반응기((주)삼성과학)에 공기공급량 0.1 vvm 정도로 5주간 배양하였다.
실시예 1-4: 본 발명에 따른 에델바이스 식물세포 및 부정근 유인제 처리
상기 1-3에서 얻어진 식물세포, 부정근 배양물에 다음과 같은 유인제 처리를 시행하였다.
상기 얻어진 식물세포, 부정근 배양물을, 생물반응기에서 MS 기본배지에 1 mg/L , Zeatin 0.2 mg/L 의 생장조절물질을 첨가하여 25℃ 배양 온도로 5 주간 배양한 후, 고주파 파형 발생장치를 연결하여 100 또는 400kHz로 하여 하루동안 15분 간격으로 4번 처리하고 이를 일주일 또는 이주일간 반복하였다. 상기 배지에서 일주일간 배양하며 고주파 처리된 상기 샘플은 회수한 후 3 ~ 5 일 동안 진공 건조하였다.
본 발명에 따른 에델바이스 식물세포, 부정근 배양물의 이차대사산물인 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀성 화합물의 함량을 측정하는 방법은 다음과 같다.
총 카로티노이드 함량은 AOAC법에 따라 측정하였다. 즉, 동결건조 에델바이스 식물세포 및 부정근 시료에 아세톤:핵산(3:7, v/v) 혼합액을 가하여 추출한 뒤 여과하여 얻은 추출액을 증류수로 세척하고, 활성화 마그네시아:규조토(1:9, v/v)의 혼합물로 크로마토칼럼을 만든 뒤 추출액을 주입하고 흡인하면서 아세톤:핵산(1:9, v/v) 혼합액으로 436 nm에서 흡광도를 측정하였다.
총 플라보노이드 함량은 Colorimetric 방법에 기초한 Sakanaka 등(2005)의 방법에 따라 측정하였다. 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물과 표준물질용액 0.25ml에 증류수 1.25ml을 첨가한 뒤, 5%(w/v) NaNO2 용액 0.075ml을 첨가하였다. 6분 뒤 혼합액에 10%(w/v) AlCl3용액 0.15ml을 첨가한 후, 5분간 방치한 다음 1N NaOH용액 0.5ml을 첨가하였다. 혼합액의 최종 부피가 2.5ml이 되도록 증류수를 첨가한 뒤 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 (+/-) catechin standard solution (Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며 총 플라보노이드함량은 mgg-1DW로 나타내었다.
총 페놀 함량은 Foline-Ciocalteu reagent가 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물의 총 페놀물질에 의해 환원되면서 몰리브덴 청색으로 발색하는 Foline-Ciocalteu 방법(Folin와 Ciocalteu, 1927)에 기초한 Ali 등 (2006a)의 방법을 이용하여 총 페놀 함량을 측정하였다. 추출액과 표준물질용액 0.05ml에 증류수 2.55ml을 첨가한 뒤, 2N Folin-Ciocalteu reagent 용액(10 time dilution; Sigma chemical CO., St. Louis, MO, USA) 0.1 ml을 첨가하였다. 6분뒤 혼합액에 20%(w/v) Na2CO3용액 0.5ml을 첨가한 후 30분간 암상태로 방치한 다음 760 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 garlic acid를 사용하였으며, 총 페놀 함량은 mgg-1DW로 나타내었다.
(단위: mgg-1)
카로티노이드
함량		 플라보노이드
함량		 페놀 화합물
함량
대조군
(고주파 처리전)		 34 32 45
실험군
(고주파 처리후)		 170 128 158
상기 표 1에 제시된 결과와 같이, 고주파 처리후 카로티노이드, 플라보노이드, 페놀 함량이 증가되는 것을 확인하였고, 이것은 항염 및 항노화와 signaling으로 연결되어 최종적으로 항노화효과가 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 에델바이스 외에, 산삼부정근에 관하여 상기와 같은 고주파 처리를 하는 경우에는 오히려 유효성분들의 피크가 감소되어, 고주파 처리가 모든 식물세포에서의 효능 증가에 도움을 주는것이 아님도 알 수 있었다.
실시예 1-5: 본 발명에 따른 에델바이스 식물세포 배양 추출물 제조
실시예 1-3에서 배양하여 얻은 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양물을 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양물 분말 50g을 용기에 담고, 1L의 정제수를 넣은 후 90 ~ 120℃ 에서 48시간 열수추출하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과하여 나온 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물을 본 발명에 사용하였다. 비교실험을 위하여, 에델바이스 추출물을 같은 방법 열수추출하여 비교하였다.
실시예 1-6: 본 발명에 따른 식물세포 배양추출물의 HPLC 성분분석
에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물을 HPLC로 성분분석을 수행하였다. 분석조건은 다음과 같았다.
구 분 분 석 조 건
HPLC 기기 종류 Waters 1525 Binary HPLC Pump
Column 종류 Gemini 5 C18 110 A (Phenomenex 사)
Column 규격 250 * 4.60 mm, 5 micron
용매 조건 - 용매 A : Water (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유)
- 용매 B : Acetonitrile (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유)
파장 234 nm (UV 램프)
유속 1 ml/min
에델바이스 식물체(열수 추출 및 70% 에탄올 추출) 및 에델바이스 식물세포 열수추출물의 분석결과, 에델바이스 식물체의 열수 추출 및 70% 에탄올 추출에 의하여 비슷한 성분의 패턴을 보였으나, 에델바이스 식물세포의 열수추출에 의하여 항산화효능, 항노화효능을 나타내는 Chlorogenic acid 성분이 유인제 처리를 통하여 증가됨을 확인하였다 (도 2)
실험예 1: 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양 추출물의 세포독성( Cytotoxicity )
실시예 1-3에서 제조한 조성물에 대한 피부 세포 생존율을 알아보기 위하여, 인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast, CCD-986Sk)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다. 각 세포를 1×104cells/ml의 농도로 하여 24 well 배양판에 접종하였다. 배지는 10 % FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, 실시예 1-3에서 제조된 조성물이 0.1 ~ 5 %가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200㎕의 Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕ 씩을 96 well 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 생존율 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였고, 결과는 표 3에 나타난 바와 같았다.
[수학식 1]
세포증식효과(%) = [(실험군 흡광도 - 대조군 흡광도)/대조군의 흡광도]×100
처리농도(%) 세포 독성율 %
(Cytotoxicity)
대조군 99
에델바이스
식물세포
배양추출물		 0.5% 101
2.0% 103
5.0% 106
에델바이스
부정근
배양추출물		 0.5% 101
2.0% 104
5.0% 109
상기 인간섬유아세포를 이용한 Cytotoxicity(세포독성)에 미치는 영향시험 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 0.5 %, 2.0 % 및 5.0 % 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물에 의하여 세포독성을 보이지 않았다. 즉, 세포생존율에 영향을 미치지 않았다. 반면, 에델바이스 추출물의 경우 처리농도에 따라 20~30% 세포독성율을 보였다.
실험예 2: 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양 추출물의 항산화 효과 ( ABTS Radical Scavenging Activity )
ABTS radical을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법을 변형하여 측정하였다.
1.0 mM의 AAPH(2,2'-azo-bis 2-amidinopropanedeihydrochloride)는 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68℃의 항온조에서 12분 동안 반응시켰다. 농도별로 희석한 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물 20㎕ 와 980㎕ ABTS 용액을 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox 0.1 % 을 사용하였다. ABTS radical 소거능은 다음의 수학식 2에 따라 계산하였으며, 결과는 표 4와 같았다.
[수학식 2]
Figure pat00001
처리농도(%) 항산화 효과
(ABTS Radical Scavenging Activity % )
정제수
(음성 대조군)		 0
0.1% Trolox
(양성 대조군)		 80
에델바이스
식물세포
배양추출물		 0.5% 6
2.0% 11
5% 46
에델바이스
부정근
배양추출물		 0.5% 8
2.0% 16
5% 47
상기 표에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 조성물인 0.1~5.0 % 농도의 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물의 함량이 증가함에 따라 항산화능이 증가함을 확인할 수 있었고, 고주파 처리를 통해서는 이러한 항산화능이 더 증가함을 알 수 있었다.
실험예 3: 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양 추출물의 Procollagen 합성 증진 시험
인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO2 배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1x105cell/ml로 48 well plate에 500㎕씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 대조군(DMEM 배지)과 0.1~5 % 농도의 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물을 함유한 배지를 넣고 48시간동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕을 취해 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit(PICP, Takara, Cat No. MK101)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. 하기 수학식에 따라 계산하여 그 결과는 표에 나타나 있다.
[수학식 3]
Figure pat00002
처리농도(%) Procollagen 생합성량
( % of control)
대조군 100
에델바이스
식물세포
배양추출물		 0.5% 112
2.0% 129
5% 131
에델바이스
부정근
배양추출물		 0.5% 107
2.0% 117
5% 137
상기 표에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 조성물 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물 함량이 증가함에 따라 콜라겐의 생합성량이 증가함을 알 수 있고, 고주파 처리를 통해서도 이러한 콜라겐 생합성량이 더 증가함을 알 수 있었다. 이에 본 발명의 조성물이 탁월한 콜라겐 합성 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 4: 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양 추출물의 AQP3 발현증가에 의한 보습효과
인간 각질형성세포주(HaCaT)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 인간각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×104 cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 DMEM free 배지(without FBS)로 교환 후 시험물질을 처리하였다. 물질처리 후 24시간동안 추가 배양하여 각 물질이 Aquaporin3의 발현에 어떠한 영향이 있는지 보았다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하며, 그 시험 순서는 아래와 같았다.
RNA isolation은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN Cat.# 216213)이용하였다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50ul cell processing mixture (Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시켰다. 보습과 관련한 유전자인 Aquaporin3를 분석하기 위하여 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행하였다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTectprimerassays(Aquaporin3,Cat.#QT00212996) 및 GAPDH(Cat.# QT01192646)로 Normalization 하였다.
Real-time PCR 조건은 다음과 같았다.
Figure pat00003
[수학식 4]
발현율(fold) = (시료처리군의발현율)/(대조군의발현율)
도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 조성물 에델바이스 식물세포배양추출물 함량이 증가함에 따라 보습효과와 관련한 AQP-3 (Aquaporin-3) 유전자의 생합성량이 증가함을 알 수 있었고, 고주파 처리를 통해서는 이러한 유전자 생합성능이 더 증가함을 알 수 있었다.
실험예 5: 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양 추출물의 MMP -2 발현 억제에 의한 주름개선 효과
피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기안하는데 보통 피부에서 type I 콜라겐의 합성과 그 분해 효소인 MMP-1이 균형을 이루고 있다. 그러나 광노화된 피부에서는 type I, III 콜라겐의 합성이 저하되고, MMP-1의 활성이 증가된다. 이러한 MMPs(matrix metalloproteinases)는 단백분해효소로 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 기능을 나타내며 정상적인 상태에서는 상처치유나 조직재생과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 조성물이 MMP-2 생성 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, 아래와 같은 실험을 하였다.
인간섬유아세포(CCD986sk, fibroblast)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
인간섬유아세포가 100%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×104 cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 제거한 다음 10-15 mJ/cm2의 UVB를 조사하여 주름을 유도한 후 DMEM free 배지(FBS를 포함하지 않는 배지)로 교환 후 시험물질을 처리하였다. 그 후 24시간 세포배양 조건에서 추가 배양하여 각 물질이 UVB 조사로 유도된 주름 관련 유전자인 MMPs의 발현에 어떠한 영향이 있는지 보았다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하며, 그 시험 순서는 아래와 같았다.
RNA isolation은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN, Cat.#216213)이용한다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50ul cell processing mixture(Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시켰다. 주름형성에 관여하는 유전자를 분석하기 위하여 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행하였다. Qiagen사의 QuantiTectprimerassays(MMP-2,Cat.#QT00088396)를 사용하였고, 상대적인 발현율은 Housekeeping genes인 GAPDH(Cat.#QT01192646)로 Normalization하였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같았다.
Figure pat00004

[수학식 5]
발현율(fold) = (시료처리군의발현율)/(대조군의발현율)
도 4와 같이, MMP-2 생합성 억제 효과는 0.5 ~ 5.0 % 농도의 에델바이스 식물세포배양추출물 처리에 의하여 우수한 MMP-2 생합성 유전자 발현 억제 효과를 보였고, 고주파 처리를 통해서는 역시 이러한 우수한 MMP-2 생합성 유전자 발현 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 6: iNOS 활성 저해에 의한 항염효과 실험
Raw 264.7 세포주로부터 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -형태로서 Griess시약을 이용하여 측정하였다. 1g LPS로 활성화된 Raw 264.7 cell에서 NO 생성 억제를 측정하기 위해, 상기 실시예 1에서 얻어진 0.1 ~ 5.0% 농도의 에델바이스 식물세포 및 부정근 세포배양추출물을 함유한 배지를 처리한 실험군과 대조군을 24시간 세포배양 한 후 Griess reagent를 세포배양 상층액 100㎕ 와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid, 1% -naphthylamide in H2O)100㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2 -의 농도는 sodium nitrate를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 얻었다.
LPS
처리유무		 시 료
 농도
(%)		 Cell Viability
(%)		 NO Production
(M)
- 대조군(정제수) 100 1.32

+ 		대조군(정제수) 60 3.63
에델바이스
식물세포
배양 추출물		 0.5 102 3.41
2.0 101 3.31
5.0 102 3.22
에델바이스
부정근
배양 추출물		 0.5 101 3.33
2.0 103 3.25
5.0 106 3.14
Indomethacin 100M 95.8 3.12
상기 표 6에서와 같이, iNOS의 활성은 0.5 ~ 5.0 % 농도의 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물 처리에 의하여 대조군과 비교하여 NO 생산을 저해하며 매우 우수한 염증 억제 효과를 보였다. 고주파 처리된 경우에도 우수한 iNOS활성에 의한 염증 억제효과가 나타남을 알 수 있었다.
실험예 7: 모공 축소효과 시험 ( In vitro Test )
본 발명의 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물 조성물의 모공 축소 효과를 측정하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 조성물을 대상으로 피부를 대신할 단백질로 헤모글로빈을 사용하여 모공 축소효과를 시험하였다.
0.9% Phosphate Buffer Saline (0.1mM, pH 7.4)으로 헤모글로빈 용액(0.05g/50ml)을 제조하여 헤모글로빈 용액 2 ml에 상기 실시예 1에서 얻어진 에델바이스 식물세포 및 부정근 세포배양추출물 2 ml을 가한 후, 30초 동안 진탕 혼합한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상등액 1 ml에 정제수 2 ml을 가하여 407 nm에서 UV-Visible spectrum으로 측정하였다.
대조군으로는 PBS(Phosphate Buffer Saline) 2 ml을 가하였다.
농 도 (%) 헤모글로빈의 침전 (%)
PBS(음성 대조군) 0 0.1
탄닌산(양성 대조군) 1 36
에델바이스 식물세포
배양추출물		 0.5 11
2.0 18
5.0 31
에델바이스 부정근
배양추출물		 0.5 6
2.0 21
5.0 34
0.5 ~ 5.0 % 농도의 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물 조성물을 함유한 조성물의 헤모글로빈의 침전량을 측정하여 수축효과를 평가하였고, 헤모글로빈의 침전(%)가 높을수록 모공수축 효과가 우수한 것으로 판별하였다. 즉, 에델바이스 추출물과 비교하여 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물이 모공축소효과가 뛰어남을 확인하였고, 고주파 처리한 경우에도 우수한 모공축소 효과를 가짐을 알 수 있었다.
실험예 8: 피지 억제효과 실험
에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물의 피지억제효과를 확인하기 위하여, 피시험자 10명의 4주 후에 피부 유분 측정기(Sebum meter SM810)를 이용하여 피부의 피지분비량을 측정하였다. 실험은 22±2℃, 40±5% humidity에서 이루어졌다. 지성 피부인 경우 측정값이 220㎍/cm2이상이고, 정상 피부인 경우 100~220㎍/cm2이다. 대조군으로 정제수를 사용하였고, 실험결과는 표 8과 같았다.
시 료 피지 억제효과
0 일 (사용 전) 28 일 (사용 후)
대조군 230 223
2 2% 에델바이스 식물세포
배양 추출물		 230 173
3 2% 에델바이스 부정근
배양 추출물		 232 161
상기 표 8의 결과에서 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여, 2% 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물이 뛰어난 피지분비 억제효과를 보였고, 고주파 처리의 경우에도 우수한 피지분비 억제 효과를 가짐을 알 수 있었다.
실험예 9 : 여드름 개선 효과
여드름이 발생한 남녀 10명으로 대상으로 화장수를 아침, 저녁으로 4주간 얼굴 전체에 실시예 1에서 제조한 2% 농도의 에델바이스 식물세포 배양 추출물을 고루 바르도록 하였다. 여드름 개선 효과의 판정은 실험에 참가한 본인이 느끼는 정도에 따라 하기 판정기준을 참고로 1-3점으로 시험전 상태를 평가한 뒤 여드름 치유 효과를 평가하도록 하여 그 결과를 표에 나타내었다.
<시험전 상태의 평가>
1 = 여드름 조금 있음 2 = 여드름 약간 있음 3 = 여드름 심함
<여드름 효과 판정>
- : 효과 거의 없음, + : 약간의 효과 있음, ++ : 많이 완화,
+++: 완전히 치유됨
피험자 시험전 상태 2주 경과후 효과 4주 경과 후 효과
피험자1 2 + +
피험자2 1 + ++
피험자3 1 - +
피험자4 2 - -
피험자5 2 + ++
피험자6 2 + +
피험자7 3 ++ +++
피험자8 2 - ++
피험자9 3 + +
피험자10 2 + ++
상기의 표 9에서 알 수 있듯이, 2% 에델바이스 식물세포 배양 추출물이 함유된 유연 화장수를 4주간 사용한 후 대다수 피험자들에서 여드름의 개선 효과를 확인할 수 있었고, 고주파 처리의 경우에도 이러한 여드름 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 10: 자외선 조사에 의한 세포보호 효과
UV 조사에 사용할 광원으로는 302 nm 파장의 자외선을 방출하는 ultraviolet crosslinker CL-1000 (Ultra-Violet Products, CA)을 사용하였다. 피부각질형성세포인 HaCaT 세포를 1x105 cells/ml 농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 인산완충액으로 세척하였다. 인산완충액을 500 μL 첨가한 다음 자외선을 10 mJ/cm로 조사 후 FBS를 포함하지 않은 신선한 세포배양배지로 교체하고 실시예 1에서 얻어진 에델바이스 식물세포 배양 추출물, 부정근 배양 추출물 시료를 1% 농도로 처리한 다음 24시간 추가배양하였다. 여기에, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ml를 첨가한 후 배양기에서 3시간 배양한 후 형성된 fomazan을 DMSO로 녹이고, 96well plate로 옮긴 후 595 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 자외선 조사 후 시료를 처리하지 않은 대조군과 세포생존율을 비교하였다.
구분 처리농도(%) 자외선 조사에 의한 세포 보호 효과
( % of Control )
대조군 - 100
대조군 자외선
조사		 - 52
에델바이스
식물세포
배양 추출물		 0.5 68
2.0 75
5.0 89
10.0 94
에델바이스
부정근
배양 추출물		 0.5 53
2.0 58
5.0 67
10.0 72
에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물의 각질형성세포 보호 효과를 평가하기 위하여, 인간각질형성세포(Keratinocytes, HaCaT)를 자외선 조사 20 mJ/cm에 노출시킨 뒤 24시간 추가 배양한 뒤 세포생존율을 확인할 수 있는 MTT assay를 수행한 결과, 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물 농도가 증가함에 따라 대조군과 비교하여 세포 생존율(Cell Vialbility)가 증가하였다. 따라서, 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양추출물의 자외선조사에 의한 세포보호효과를 확인할 수 있었고, 고주파 처리의 경우에도 우수한 세포 보호효능을 가짐을 알 수 있었다.
실험예 11: Wound healing assay 를 이용한 창상치유 , 항노화효과
인간 각질형성세포주 HaCaT(human keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO) 과 함께 100 mm/60.1 cm2 culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. HaCaT이 90%정도 confluence 될 때 100 mm/60.1 cm2 dish에 1.5×105 cells/12well plate 분주한 후 24시간 배양하고, FBS를 포함하지 않는 배지로 교체한 후 각 well에 200P tip을 이용해 #모양으로 스크레치를 내고 시험물질인 에델바이스 추출물, 에델바이스 식물세포 배양추출물 및 부정근 추출물을 처리하였다. 물질처리 후 0시간대에 cell image를 현미경 사진으로 찍고 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 물질처리 후 18-20 시간동안 추가배양 후 배지를 제거하고 fixing solution(4% paraformaldehyde)으로 넣고 15분간 상온에서 incubation하고 PBS로 3번 washing하였다. Fixed cells은 4℃에서 한달 동안 보관이 가능하였다. Wound healing이 된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 Image J라는 프로그램을 이용하여 계산하였다. 양성 대조군은 300ng/ml EGF를 사용하였다.
Wound healing assay를 이용하여 시험물질에 의한 세포 proliferation 및 migration을 촉진하는지의 유무를 관찰하여 항노화 효능을 평가하고자 하였다. 양성대조군으로 300ng/ml EGF를 사용하였다.
에델바이스 식물체로부터 유도된 유도된 식물세포 및 부정근 배양추출물을 1% 농도로 각각 처리하여 실험한 결과 다음과 같이, 도 5에서와 같이, 대조군과 비교하여 에델바이스 식물세포 배양추출물 및 부정근 배양추출물 모두에서 피부세포가 바닥에 붙어 자라면서 healing area가 증가함을 확인하였고, 고주파 처리한 경우도 우수한 효능을 가짐을 알 수 있었다 (도 5).
실험예 12: 피부 장벽 보호 기전 확인 시험
에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물에 의한 피부 장벽 보호 기전을 확인함으로써, 피부 장벽 강화, 개선 기능이 있는지 여부를 확인해보았다.
인간표피각질형성세포(Human epidermal Keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.#15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO의 조건으로 배양한다. 인간표피각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 12-well에 3×105 cells/well 분주한 후 48시간 배양한 뒤, 자외선 조사기를 이용하여 UVB 40 mJ/cm을 조사한 뒤, 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물이 농도별로 포함된 함유된 배지에서 3일간 배양하였다. 배양을 마친 후, cell lysis buffer (0.1% SDS, 1% NP40, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 50 mM Tris-Cl (pH 7.5))로 용출한 후에 BCA(bicinchoninic acid) 정량 방법으로 단백질량을 측정하였다. 20㎍의 동량의 단백질을 넣고 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리한 뒤, nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. Membrane을 5% Skim milk를 함유한 TBST (10mM Tris HCl, pH8.0, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20) buffer로 1시간 동안 반응시킨 뒤 occludin (invitrogen, USA), claudin-1 (abcam, USA) 및 -actin(Santa Cruz, USA) 1차 항체를 반응시켰다. 2차 항체로는 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz, USA)와 donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz, USA)를 사용하여 1시간 반응시켰다. TBST buffer로 세척 후에 ECL solution kit(amersham, UK)으로 발색하여 분석하였다.
에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물에 의한 밀착연접 구성 단백질의 양적 변화를 알아보기 위하여 각질형성세포를 이용하여 단백질 변화를 확인하였다. 다음과 같이, 자외선을 조사한 각질형성세포는 밀착연접 구성 단백질인 occludin과 claudin-1 단백질량이 감소됨을 확인하였으나, 자외선 조사 후에 농도별로 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물을 처리하면 감소된 occludin과 claudin-1 단백질 생성량이 증가된 것을 볼 수 있었고, 고주파 처리의 경우에도 상기 감소된 단백질 생성량이 증가됨을 알 수 있었다 (도 6).
실험예 13: 피부 장벽 기능 확인 시험
인간표피각질형성세포(Human epidermal Keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.#15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO의 조건으로 배양한다.
인간표피각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 12-well에 3×105 cells/well 분주한 후 24시간 배양한 뒤 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물이 농도별로 포함된 함유된 배지에서 24시간 배양하였다. 인간표피각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×104 cells/well 분주한 후 농도별로 함유된 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물을 처리한다. 그 후 24시간 추가 배양하여 Filaggrin 유전자 발현을 Real-time PCR 법으로 확인하였다.
RNA isolation과 cDNA 합성은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN, Cat.#216213)이용한다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50 cell processing mixture(Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube 에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시킨다. Filaggrin 유전자 발현을 분석하기 위하여 상기에서 합성된 cDNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행한다. 실험에 사용한 Filaggrin primer는 Qiagen사의 Cat.#QT01192646)를 사용하였고, 발현율은 Housekeeping genes(GAPDH, Cat.#QT01192646)로 Normalization였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같았다.
Figure pat00005
구분 처리농도(%) Filaggrin 유전자 발현율
(Relative Expression of Filaggrin)
대조군 - 1.00
에델바이스
식물세포
배양 추출물		 0.5 1.34
2.0 2.19
5.0 2.55
10.0 2.76
에델바이스
부정근
배양 추출물		 0.5 1.09
2.0 1.27
5.0 1.77
10.0 2.05
Filaggrin 발현증가는 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물에 의하여 각질형성세포의 정상적인 분화를 촉진하고, 피부에서의 자연보습인자로 변환되는 filaggrin의 피부내 발현을 촉진함으로써 피부장벽기능을 개선할 수 있음을 나타낸다. 즉, 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물의 Filaggrin 유전자의 발현을 측정한 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물의 유전자 발현율이 유전자 발현양이 월등히 증가함을 확인하였고, 고주파 처리한 경우에도 마찬가지로 이러한 유전자 발현양이 증가함을 알 수 있었다.
실험예 14: Tyrosinase 활성 저해에 의한 미백효과 확인 시험 ( in vitro )
에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물에 의한 미백효과를 확인하기 위해 멜라닌 형성에 중요한 역할을 하는 tyrosinase의 활성에 미치는 영향을 시험하였다.
96well plate에 phosphate buffer를 각 50㎕씩 분주하여 넣고 농도별 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물 시료를 10㎕씩 넣어주었다. 그 다음 정제수에 mushroom tyrosinase를 50㎍/ml이 되게 만들어 20㎕씩 각각 분주하여 준다. 그 후 2.5mM L-DOPA를 각 well에 20l씩 첨가하여 혼합한 뒤, 37℃에서 반응을 시키며 10분 간격으로 1시간정도 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 250μM kojic acid를 가하였다.
구분 처리농도(%) Tyrosinase activity (%)
대조군 - 100
양성 대조군 (kojic acid) 250M 65
에델바이스
식물세포
배양 추출물		 0.5 92
2.0 83
5.0 76
10.0 74
에델바이스
부정근
배양 추출물		 0.5 91
2.0 80
5.0 73
10.0 68
Tyrosinase 활성은 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물에 의하여 감소하였고, 이는 tyrosinase 활성 저해로 인한 멜라닌 형성 억제를 유도하여 미백효과를 가짐을 알 수 있다. 즉, 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물의 tyrosinase 활성을 측정한 결과, 표 12에 나타난 바와 같이, 에델바이스 식물세포 및 부정근배양추출물의 tyrosinase 활성 저해가 효과적임을 확인하였고, 고주파 처리한 경우에도 마찬가지로 이러한 미백 효능을 가짐을 알 수 있었다.
피부 외용제 조성물의 제조
본 발명의 에델바이스 식물, 부정근 배양 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.
제조예 2-1: 화장수
다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.
원 료 명 중량 %(w/w)
글리세린 5.0
디프로필렌글리콜 3.0
히아루론산 0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유 0.1
폴리에틸렌 올레일에틸 0.1
에탄올 5.0
방부제 0.15
항료 적량
착색료 적량
에델바이스 식물, 부정근 배양 추출물 2.0
정제수 to 100
제조예 2-2: 에센스
다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.
원 료 명 중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올 1.0
자기유화형모노스테아린산 1.0
밀납 0.5
스쿠알란 5.0
이소세틸옥타노에이트 3.0
디메틸실록산 0.3
모노스테아린산소르비탄 0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 8.0
글리세린 4.0
프로필렌글리콜 0.2
카르복시폴리머 0.22
트리에탄올아민 0.25
방부제 적량
향료 적량
착색료 적량
에델바이스 식물, 부정근 배양 추출물 7.0
정제수 to 100
제조예 2-3: 로션
다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.
원료명 중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올 0.8
자기유화형모노스테아린산 1.0
밀납 0.5
스테아린산 0.5
유동파라핀 7.0
스쿠알란 5.0
마카데미아오일 3.0
이소세틸옥타노에이트 2.0
디메틸실록산 0.3
모노스테아린산소르비탄 0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 1.2
글리세린 4.0
프로필렌글리콜 4.0
베타인 4.0
카르복시폴리머 0.12
트리에탄올아민 0.15
방부제 0.25
향료 적량
착색료 적량
에델바이스 식물, 부정근 배양 추출물 5.0
정제수 to 100
제조예 2-4: 크림
다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.
원 료 명 중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올 3.0
자기유화형모노스테아린산 1.5
친유형모노스테아린산 1.5
밀납 0.5
유동파라핀 8.0
스쿠알란 7.0
이소세틸옥타노에이트 4.0
정제호호바유 4.0
디메틸실록산 0.3
모노스테아린산소르비탄 1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 1.2
글리세린 6.0
프로필렌글리콜 4.0
베타인 4.0
산탄검 0.06
트리에탄올아민 0.10
방부제 0.25
향료 적량
착색료 적량
에델바이스 식물, 부정근 배양 추출물 7.0
정제수 to 100
제조예 2-5: 젤
다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.
원료명 중량 %(w/w)
글리세린 4.0
프로필렌글리콜 4.0
에탄올 10
폴리옥시에틸렌경화피마자유 0.1
카르복시폴리머 0.30
트리에탄올아민 0.30
방부제 적량
향료 적량
착색료 적량
에델바이스 식물, 부정근 배양 추출물 1.0
정제수 to 100
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
100: 고주파 세포 배양기 200: 바이오 리액터
210: 케이스 211: 주입구
212: 고주파 장착부 220: 상부 덮개
230: 고주파 단자 231: 단자부
232: 밀봉부재 233: 연결선
240: 수평 지지판 241: 고정공
250: 고정봉 260: 완충부재
300: 고주파 공급기 310: 조작부
320: 표시부 330: 레벨메타
400: 공기 공급기 420: 배출구
440: 공기 호스 500: 진동기록기
510: 진동 조작부 520: 진동 표시부
530: 연결선

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 에델바이스(Leontopodium alpinum) 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법:
    (a) 에델바이스 식물의 잎, 또는 줄기조직을 분리하여 식물 세포 또는 부정근으로 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 에델바이스 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계는,
    (i) 상기 에델바이스 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 6-벤질아미노푸린(6-Benzylaminopurine, 6-BAP), 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)을 함유한 배지에서 배양함으로써 식물 세포 배양물을 얻는 단계이거나,
    (ii) 상기 에델바이스 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 인돌부티르산(IBA)을 함유한 배지에서 배양함으로써 부정근 배양물을 얻는 단계,
    인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 배양된 식물세포 또는 부정근을 50 내지 500 kHz로 10~30분 간격으로 3~5회 고주파 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 에델바이스 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 유기용매, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 에델바이스(Leontopodium alpinum)의 식물 세포 또는 부정근 배양물, 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 주름 억제 또는 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부의 염증 완화 또는 개선인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 모공 축소용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 피지 억제용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 여드름 억제 또는 개선인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  11. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 자외선에 의한 피부 손상 억제용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 창상 치유용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  13. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 장벽 보호 또는 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  14. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 미백용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  15. 제5항에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  16. 제5항에 있어서, 상기 추출물은 에델바이스(Leontopodium alpinum)의 식물 세포 또는 부정근 배양물의 유기용매, 초음파 또는 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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