CN110859797A - 包含西潘莲提取物和火绒草细胞的化妆品组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于局部或口服使用的新型化妆品组合物或皮肤用组合物，其包含至少一种西番莲提取物、至少火绒草愈伤组织细胞和至少一种生理学上可接受的支持物；涉及使用这种化妆品组合物的非治疗性美容皮肤护理方法；并且还涉及这种化妆品组合物用于保护皮肤免受环境侵袭，预防、延缓和/或对抗皮肤老化迹象的非治疗性用途。

Description

包含西潘莲提取物和火绒草细胞的化妆品组合物及用途
本发明涉及用于局部或口服使用的化妆品或皮肤用产品(其可特别用于皮肤上)的一般技术领域。
更确切地说，本发明涉及用于局部施用的新型化妆品组合物，其包含至少一种西番莲提取物、火绒草愈伤组织培养细胞和/或火绒草愈伤组织培养细胞的提取物以及至少一种生理学上可接受的支持物；涉及使用这种化妆品组合物的非治疗性美容皮肤护理方法；并且还涉及这种化妆品组合物用于预防和/或延缓皮肤老化迹象的非治疗性用途。
皮肤是一个真实的器官，其包含从表层(即，表皮)到最深的层(即，真皮和皮下组织)的几个整合层，并且这些层中的每一层都具有特定的性质，使得整体能够对环境条件作出反应并适应环境条件。
表皮主要由以下构成：合成角蛋白的角质细胞(90％的表皮细胞)、负责皮肤色素沉着的黑素细胞(2％至3％的表皮细胞)、以及具有免疫学作用的朗格汉斯细胞。表皮(其厚度根据身体的不同部分而变化)构成皮肤的外层，因此，它起到确保保护和保持良好营养的基础性作用。这就是已经开发出用于保护它(特别是防止环境侵袭)的许多组合物的原因。
真皮是最厚的层，富含神经、血管和汗腺，且主要由胶原、弹性蛋白和蛋白多糖构成。这三种类型的分子由真皮成纤维细胞合成。占真皮干重70％的胶原纤维为皮肤提供机械强度和纹理，弹性蛋白负责提供弹性，蛋白多糖在结构和保湿皮肤中起主要作用。其他细胞(例如巨噬细胞和白细胞)也存在于真皮层中。
皮下组织是皮肤最深层，含有产生脂质的脂肪细胞，使皮下组织产生保护肌肉、骨骼和内脏免受冲击的脂肪层。
皮肤老化可以是内在的或外在的，即它可以由包括气候攻击因子的环境引起，所述环境可能尤其有助于加速真皮胶原的降解。特别地，暴露在阳光、温度变化和污染下会通过产生自由基而对皮肤起有害作用，所述自由基是活性氧衍生物(或ROS，“活性氧物质”)，如超氧阴离子(O2 ·-)。自由基介导的攻击引发链反应，所述链反应仅在两个自由基变得相互失活时停止。特别地，自由基引起氧化应激，所述氧化应激损害皮肤细胞的膜脂质和细胞本身，特别是线粒体DNA和线粒体中的膜脂质，导致皮肤过早老化和/或加速老化。具体而言，线粒体通过产生ATP在细胞内充当能量站。降低其活性(特别是与其以ROS形式响应氧化应激的能力相关的活性)与老化过程和年龄症状直接相关。
幸运的是，好氧体具有防御氧化应激的有效系统。具体而言，许多具有自由基清除特性的天然抗氧化剂(酶和维生素)由身体产生或者从饮食中摄取。因此，维生素C抑制细胞内的自由基，而维生素E和类胡萝卜素在细胞膜中起到相同作用。
细胞老化可定义为身体维持自由基和抗氧化剂之间平衡的能力的逐渐丧失。在皮肤中，自由基带来时间流逝的痕迹：皮肤萎缩、皮肤松弛、皱纹、色素沉着痕迹等，还有皮肤癌。
因此，重要的是保护皮肤细胞免受环境侵袭的有害作用，特别是由UV射线和污染产生的氧化应激，以预防和/或延缓皮肤老化迹象(例如皱纹和细纹)的出现。
将抗氧化剂引入许多用于局部施用的化妆品组合物(如霜、乳、浆液等)中是为了对抗这些自由基的有害作用。
因此，可以通过将具有自由基清除特性的化妆品组合物施用于皮肤来克服这种不平衡，以对抗老化迹象的出现。
此外，化妆品消费者越来越重视天然来源的产品或含有天然化合物的产品。这就是在化妆品市场上发现越来越多的含有天然物质或天然来源物质并具有自由基清除特性的产品的原因。
此类组合物通常含有至少一种抗氧化物质，特别是植物来源的复合分子，例如多酚、类黄酮、花青素、类胡萝卜素等。
然而，尽管可获得多种组合物，仍然需要获得可有效对抗皮肤老化作用的新型替代性局部组合物，特别是基于合适的植物提取物(优选源自有利特性已知的植物)的局部组合物。
西番莲科的西番莲是一种耐寒的药用植物，因其镇静(calmative/sedative)作用而用于输注中。它包括数百种种类，其中已知一些(如紫果西番莲(Passiflora edulis)和甜西番莲(Passiflora ligularis))可以提供可食用的果实(西番莲果(passionfruit)和大果西番莲(granadilla))。专利EP 1 002 524中描述了用于对抗皮肤老化的化妆品组合物，其含有富含必需脂肪酸的油以及西番莲提取物。专利申请JP 2002 332224描述了用于对抗皮肤老化的化妆品组合物，其含有作为用于消除超氧离子的化合物的西番莲提取物和选自保湿剂、抗氧化剂、细胞活化剂、漂白剂和防晒剂的添加剂。最后，专利EP 2 291 173描述了化妆品组合物或皮肤用组合物，其包含西番莲提取物和野牛舌草(Anchusa arvensis)提取物的组合，该组合物提供皮肤脱收缩(skin-decontracting)作用并且能够对抗肌肉收缩，特别用于预防或减少由不受控制的面部肌肉收缩导致的表情皱纹。
火绒草(特别是高山火绒草(Leontopodium alpinum))是菊科(Asteraceae)(原为菊科(Compositae))的一种植物。它是最著名的山地植物之一，这部分是由于其稀有性。火绒草在瑞士有栽培，并因其抗炎特性被化妆品行业使用。此外，专利FR3031454描述了通过体外细胞培养方法获得的未分化或去分化的高山火绒草细胞的用途，用于恢复老化的皮肤细胞的体内平衡和增加其代谢活性的美容处理。
现在，申请人进行的研究表明，在氧化应激的存在下，西番莲提取物和火绒草愈伤组织培养细胞和/或火绒草愈伤组织培养细胞提取物的组合出乎意料地具有协同抗氧化活性，使得该组合特别适合用作化妆品组合物中的用于保护皮肤和预防皮肤老化迹象的成分。
因此，本发明的第一主题是用于局部施用的化妆品组合物，其包含：
-至少一种西番莲提取物，和
-至少火绒草愈伤组织培养细胞和/或火绒草愈伤组织培养细胞的至少一种提取物，以及
-至少一种生理学上可接受的支持物。
优选地，火绒草愈伤组织培养细胞可以是全细胞。换句话说，全细胞有利地是未裂解的细胞。
因此，所述化妆品组合物可包含至少完整的火绒草愈伤组织培养细胞和/或完整的火绒草愈伤组织培养细胞的至少一种提取物。
术语“完整的火绒草愈伤组织培养细胞的提取物”是指如下提取物，在该提取物中全细胞在高压下被显著均质化以破坏细胞聚集体和/或被冻干。
这种化妆品组合物具有优异的自由基清除特性，这些性质可用于护肤化妆品，更特别地用于保护皮肤免受环境侵袭，特别是UV射线或污染的有害作用，以及用于预防皮肤老化迹象。
特别地，申请人进行的测试表明，西番莲提取物(特别是来自粉色西番莲(Passiflora incarnata))和火绒草愈伤组织培养细胞的提取物(特别是来自高山火绒草)的组合使得在人成纤维细胞的氧化应激条件下降低细胞内氧化水平成为可能，并且该活性在测试浓度范围内协同显示。
因此，本发明的第二个主题还是用于护理皮肤特别地用于保护皮肤免受环境侵袭，预防、延缓和/或对抗皮肤老化迹象的非治疗性美容方法，所述方法在于将至少一种如上文在本发明的第一主题中所定义的用于局部施用的化妆品组合物(即，局部化妆品组合物)施用于皮肤的相关区域，所述化妆品组合物包含：
-至少一种西番莲提取物，和
-至少火绒草愈伤组织培养细胞和/或火绒草愈伤组织培养细胞的至少一种提取物，以及
-至少一种生理学上可接受的支持物。
优选地，火绒草愈伤组织培养细胞可以是全细胞。换句话说，全细胞有利地是未裂解的细胞。
因此，所述化妆品组合物可包含至少完整的火绒草愈伤组织培养细胞和/或完整的火绒草愈伤组织培养细胞的至少一种提取物。
术语“完整的火绒草愈伤组织培养细胞的提取物”是指如下提取物，在该提取物中全细胞在高压下被显著均质化以破坏细胞聚集体和/或被冻干。
最后，本发明的第三个主题是如以上根据本发明的第一个主题所定义的用于局部施用的化妆品组合物的非治疗用途，即，所述化妆品组合物包含：
-至少一种西番莲提取物，和
-至少火绒草愈伤组织培养细胞和/或火绒草愈伤组织培养细胞的至少一种提取物，以及
-至少一种生理学上可接受的支持物，用于保护皮肤免受环境侵袭，预防、延缓和/或对抗皮肤老化迹象。
优选地，火绒草愈伤组织培养细胞可以是全细胞。换句话说，全细胞有利地是未裂解的细胞。
因此，所述化妆品组合物可包含至少完整的火绒草愈伤组织培养细胞和/或完整的火绒草愈伤组织培养细胞的至少一种提取物。
术语“完整的火绒草愈伤组织培养细胞的提取物”是指如下提取物，在该提取物中全细胞在高压下被显著均质化以破坏细胞聚集体和/或被冻干。
出于本发明的目的，术语“生理学上可接受的支持物”是指适合于局部或口服使用并且当与哺乳动物(并且更特别地是人类)的黏膜、指甲、头皮、头发、体毛和皮肤接触时不存在任何毒性、不相容性等的风险的支持物。该生理学上可接受的介质形成通常称为组合物的赋形剂的物质。根据本发明，生理学上可接受的支持物优选是美容上可接受的支持物。
术语“美容上可接受的支持物”是指与皮肤和/或其外皮相容的支持物，其具有令人愉快的颜色、气味和感觉，并且在其使用期间(特别是在其施用于皮肤期间)不会引起任何不可接受的不适(刺痛、紧绷或发红)。
在可以在本发明中使用的西番莲属的多个物种中，可以特别提及粉色西番莲(Passiflora incarnata)、刺毛西番莲(Passiflora acuminata)、翅茎西番莲(Passifloraalata)、Passiflora antioquensis、Passiflora antiquiensis、橙色西番莲(Passifloraaurantia)、Passiflora baraquiniana、双花西番莲(Passiflora biflora)、西番莲(Passiflora caerulea)、蝙蝠西番莲(Passiflora capsularis)、Passifloracincinatta、红花西番莲(Passiflora coccinea)、Passiflora cumbalensis、Passifloradictamo、紫果西番莲(Passiflora edulis)、Passiflora garckei、腺叶西番莲(Passiflora glandulosa)、戟叶西番莲(Passiflora hastata)、羊膻味西番莲(Passiflora hircina)、樟叶西番莲(Passiflora laurifolia)、甜西番莲(Passifloraligularis)、墨西哥西番莲(Passiflora mexicana)、混合西番莲(Passiflora mixta)、香蕉西番莲(Passiflora mollissima)、桑叶西番莲(Passiflora morifolia)、多花西番莲(Passiflora multiflora)、光泽西番莲(Passiflora nitida)、Passiflora ornithoura、大果西番莲(Passiflora quadrangularis)、皂叶西番莲(Passiflora saponaria)、三角叶西番莲(Passiflora suberosa)、沟槽西番莲(Passiflora sulcata)、细裂西番莲(Passiflora tenuiloba)、Passiflora tinifolia、葡萄叶西番莲(Passifloravitifolia)、龙珠果(Passiflora foetida)、Passiflora nigelliflora、暗色西番莲(Passiflora obscura)、棉叶西番莲(Passiflora gossypifolia)、大花西番莲(Passiflora grandiflora)、Passiflora hastada、Passiflora hibisciflora、Passiflora hirsina、疏毛西番莲(Passiflora hirsuta)、粗毛西番莲(Passiflorahispida)、及其混合物。
根据本发明，优选使用粉色西番莲物种。
优选使用西番莲的地上部分，特别是西番莲的花梢(花梢包括顶部的花和幼叶)优先于植物的其他部分，用于制备可用于根据本发明的化妆品组合物中的提取物。
西番莲提取物可以从干燥和研磨的植物制备，由此获得的固体占植物总重量的约5％。例如，根据本领域技术人员熟知的技术，通过将按质量计0.5％至3％(优选按质量计1％至1.5％)的西番莲固体引入选自水、醇及其混合物的溶剂中，可以制备水提取物、醇提取物或水-醇提取物，例如水-乙二醇或水-乙醇提取物。因此，根据本发明，所使用的提取物中存在的西番莲的量以引入所选提取溶剂中的干燥和研磨的西番莲固体的质量表示。
因此，相对于所述水提取物、醇提取物或水-醇提取物的总质量，可根据本发明使用的西番莲提取物优选包含按重量计0.5％至3％，甚至更优选按重量计1％至1.5％的西番莲固体。
存在于根据本发明的化妆品组合物中的西番莲提取物的量以引入提取溶剂中的西番莲固体质量表示，相对于化妆品组合物的总质量优选为约0.001％至0.5％，更优选为约0.005％至0.25％，甚至更优选约0.01％至0.05％。
在可用于本发明的多个火绒草物种中，可以特别提及高山火绒草(Leontopodiumalpinum)、雪腐火绒草(Leontopodium nivale)、朝鲜火绒草(Leontopodium coreanum)、异色火绒草(Leontopodium discolor)、香芸火绒草(Leontopodium haplophylloides)、珠峰火绒草(Leontopodium himalayanum)、雅谷火绒草(Leontopodium jacotianum)、小叶火绒草(Leontopodium microphyllum)、火绒鼠麹草(Gnaphalium leontopodium)和雪腐鼠麹草(Gnaphalium nivale)、及其混合物。
根据本发明的一个优选实施例，使用高山火绒草的愈伤组织培养细胞。
火绒草愈伤组织细胞(下文称为植物细胞培养物)来源于未分化或去分化细胞的体外培养。
体外细胞培养方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法通常包括以下步骤：
-从植物部分插条(叶、根、茎、芽等)获得的愈伤组织(大量未分化或去分化细胞)建立细胞系，
-根据预先确定的标准(恒定表型、所选代谢物的最佳和恒定产量、增殖能力)选择能够大规模生产细胞生物质的细胞系，
-从如此选择的品系产生所述生物质，任选地具有引发步骤，优选地在增殖期结束时，
-处理由此获得的生物质以回收全细胞。
根据所需的使用形式，所述细胞然后能以完整形式使用，任选地在破坏细胞聚集体的高压均质化以后，能以冻干形式使用，或者可以进行裂解步骤，以从中提取细胞内容物。
根据本发明的化妆品组合物中的火绒草愈伤组织培养细胞的量通常为约7×10-4％至0.3％，优选为0.0035％至0.15％，甚至更优选为约0.007％至0.03％，所述量以相对于化妆品组合物总质量的固体质量表示。
根据本发明，西番莲提取物的量与火绒草愈伤组织培养细胞的量之间的质量比优选为约0.3至6，甚至更优选为0.75至3。
根据一个特别优选的实施例，化妆品组合物包含相对于所述组合物总质量的按质量计约0.02125％的量(所述量以引入提取溶剂中的西番莲固体的质量表示)的西番莲提取物，以及按重量计相对于所述组合物总质量的0.014％的火绒草愈伤组织培养细胞。
除西番莲提取物和火绒草愈伤组织培养细胞以外，根据本发明的化妆品组合物还可含有一种或多种第二活性剂，所述第二活性剂有利地增强其活性或使其活性完整，并且相容，即不易相互反应或者掩盖或限制其作用。
更特别地，第二活性剂可以例如选自保湿剂、湿润剂、抗氧化剂、皮肤保护剂、抗老化活性剂、防射线剂特别是防UV射线剂、及其混合物。
保湿剂可以例如选自透明质酸、焦谷氨酸盐和共聚物、氢化卵磷脂、尿素及其衍生物、胆固醇、以及它们的混合物。
湿润剂可以例如选自乙二醇、甜菜碱、糖和糖衍生物、假交替单胞菌发酵物的提取物、乳酸、游离氨基酸、矿物盐、植物(例如甜菜根、木槿、藻类蠕虫叉红藻(Furcellarialumbricalis))提取物、及其混合物。
抗氧化剂可以例如选自生育酚(维生素E)及其衍生物、以及含有它们的提取物；抗坏血酸(维生素C)及其衍生物、以及含有它们的提取物；苯酚、多酚、酚酸、类黄酮、木脂素、其衍生物，以及含有它们的提取物；硫辛酸及其衍生物、以及含有它们的提取物；铁和铜螯合剂；乳铁蛋白；辅酶Q10；及其混合物。
皮肤保护剂可以例如选自促进屏障功能的试剂，如磷脂、神经酰胺、脂肪酸、蜂蜜、植物(如雨树(Samanea saman)、水葫芦、瓷玫瑰、苋属、tara)提取物；自由基清除剂；防污剂；抗炎剂和镇静剂，如泛醇、间苯二酚和衍生物、甜没药醇、尿囊素、羟基积雪草苷、薄荷醇、罂粟提取物、睡莲提取物、甘菊提取物、金盏花提取物、芦荟提取物、及其混合物。
在抗老化活性剂中，可以特别提及机械或化学脱皮剂/去角质剂；促进皮肤微循环的药剂；脱色剂，如可可提取物、番红花提取物和刺蒺藜提取物；抗糖化剂；紧致剂，如barbitamao提取物或皂荚提取物；修复剂，如山茶提取物、蓼属植物提取物或苹果树提取物；脱收缩剂，如蓝莲花提取物、罂粟提取物、锦葵提取物或牛舌草提取物；用于刺激真皮或表皮大分子合成和/或用于预防其降解的试剂，特别是用于刺激成纤维细胞和/或角化细胞增殖的试剂，例如肽、脂肽和肽衍生物，植物提取物(如南洋杉提取物、含羞草提取物、万寿菊提取物、藻类提取物、浮游生物提取物)；类视黄醇；基于蛋白质或植物多糖的绷紧剂；及其混合物。
防射线剂(特别是防UV射线剂)可以例如选自有机遮蔽剂、无机遮蔽剂、及其混合物。
根据本发明的化妆品组合物可以是通常用于局部施用的表现形式，例如呈凝胶、乳液(例如呈霜或乳形式)、微乳液、精华、油、面膜、药膏、软膏、化妆水、浓缩液、悬浮液、泡沫、固体棒(特别是用于嘴唇的保护棒)或气溶胶的形式，所述表现形式还含有美容中常见且生理学上可接受的赋形剂和支持物。
这些局部施用形式通过常规技术制备，例如，在霜的情况下，通过将脂肪相分散在水相中以获得水包油乳液，或相反地制备油包水乳液。
在根据本发明的化妆品组合物中，西番莲提取物和/或火绒草愈伤组织培养细胞和/或一种或多种第二活性剂还可以呈大颗粒、微粒或纳米颗粒的包封形式或呈大胶囊、微胶囊或纳米胶囊的形式。西番莲提取物和/或火绒草愈伤组织细胞和/或一种或多种第二活性剂可以掺入如脂质体、葡糖微球等载体中，掺入乳糜微粒、大颗粒、微粒或纳米颗粒中，以及掺入大胶囊、微囊或纳米胶囊中，并且还可以吸附在选自粉末状有机聚合物、滑石、膨润土的支持物上和其他矿物支持物上。
根据本发明的局部组合物可包含适于外用局部施用的赋形剂，特别是生理学上可接受的赋形剂，并特别是美容中可接受的赋形剂。适用于所述制剂的这些赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且包括例如润肤剂、有机溶剂、螯合剂、渗透剂、增稠剂、填充剂、乳化剂或表面活性剂、防腐剂、着色剂、芳香剂、和其混合物。
因此，这些局部组合物可有利地用于美容中以预防皮肤老化迹象。
根据本发明的化妆品组合物的美容用途包括皮肤、黏膜、外皮和头皮的所有护理，例如保护性防晒黑产品，抗老化产品、保湿产品、抗脂溢性产品和滋补品，用于改善皮肤外观的产品(特别是漂白产品)，与抗痤疮治疗并行使用的产品，旨在改善皮肤舒适性的产品(例如镇定产品和/或用于对抗皮肤发红和/或干燥的产品)。
以下实例更详细地说明了本发明而不限制其范围。在以下所有组合物实例中，除非另有说明，否则这些部分以质量为基础表示。
实例
在说明本发明的实例中使用的西番莲提取物是从粉色西番莲物种获得的水-甘油提取物，特别是来自该物种的花梢。
在干燥和粉碎植物后，通过渗滤以100g植物/500g水的比例进行提取。将通过渗滤获得的水提取物稀释在500g甘油中以构成可用于化妆品制剂中的水-甘油提取物。
由此获得的提取物具有以下特性：
粉色西番莲(干质量) 1.25％
水 49.375％
甘油 49.375％
如本文所述的以水-甘油提取物表示的浓度与以固体质量表示的浓度之间存在直接等效性，其中按重量计0.0425％的西番莲固体等于按重量计3.4％的该提取物。
用于说明本发明的实例中的火绒草愈伤组织培养细胞提取物是从高山火绒草物种获得的水-乙醇提取物。在植物细胞培养之后，将冻干形式的火绒草细胞溶解在70％乙醇和30％水的混合物中，然后将得到的溶液均质化并过滤。
由此获得的提取物具有以下特性：
火绒草细胞(干质量) 21％
乙醇 55.3％
水 23.7％
此外，高山火绒草培养细胞提取物还由司达玛公司(Sederma)以商品名
Figure BDA0002163572170000101
销售。更特别地，该提取物是完整火绒草愈伤组织培养细胞的提取物。除了高山火绒草愈伤组织培养细胞以外，该产品还包含甘油和黄原胶。在以固体质量表示的浓度与商业成分
Figure BDA0002163572170000102
的表示浓度之间存在直接等效性，其中按重量计0.028％的火绒草愈伤组织细胞等于按重量计2％的
Figure BDA0002163572170000103
实例1：证明西番莲提取物和火绒草愈伤组织细胞组合的抗氧化作用
在该实例中，研究了不同浓度的西番莲提取物和火绒草愈伤组织细胞的组合的抗氧化特性。
1.1.测试原理
该测试原理基于使用以下特定探针来测量细胞内氧化程度：2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，它是对活性氧物质(ROS)敏感的指示剂。DCFH-DA渗透到细胞内培养基中，其中在通过细胞内酯酶裂解两个乙酸酯基团后，产生的DCFH在细胞溶质中积累。
用不同活性氧物质(ROS)对DCFH进行的细胞内氧化导致荧光产物2’,7’-二氯荧光素(DCF)的形成。测试样品越是抗氧化，它就越能阻止DCFH氧化成DCF，且荧光信号越小。相反，如果测试样品不抗氧化，则荧光将响应于诱导型氧化应激而发展。未经处理的阴性对照使得可以确定细胞的基础氧化水平。通过添加5μM促氧化化合物(即，叔丁基过氧化氢，tBHP)而处理的阳性对照使得可以在缺乏抗氧化剂的情况下模拟诱导型氧化应激。
然后，每个测试批次的荧光强度测量使得可以通过在所述提取物存在下添加5μM的tBHP来评估经受氧化应激的皮肤细胞的细胞内氧化程度，从而评估所述测试提取物的抗氧化活性。
1.2.方案
该研究是对从46岁女性获得的正常人成纤维细胞(ATCC，CRL2106TM)进行的。将成纤维细胞在置于37℃和空气/CO2(95％/5％)气氛下的培养箱中的葡萄糖培养基(含有5mM葡萄糖、含有10mM HEPES缓冲液和10％胎牛血清的DMEM培养基)中培养。
在试验开始前24小时，将成纤维细胞以20 000个细胞/孔的比例转移到96孔板中，并与研究中的处理相接触，然后在相同培养条件下恢复。
研究中的处理分为下面描述的13个批次，其中浓度以西番莲固体(PF)和火绒草(EW)固体的质量表示。从上述提取物开始，通过在相同细胞培养基中稀释来调节浓度。
批次1：对照(-)：未处理和无应激的成纤维细胞；
批次2：对照(+)：未处理和被应激的成纤维细胞；
批次3：单独的提取物：用0.010625％的西番莲(PF)固体处理并被应激的成纤维细胞；
批次4：单独的提取物：用0.02125％的西番莲(PF)固体处理并被应激的成纤维细胞；
批次5：单独的提取物：用0.0425％的西番莲(PF)固体处理并被应激的成纤维细胞；
批次6：单独的提取物：用0.007％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞；
批次7：单独的提取物：用0.014％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞；
批次8：单独的提取物：用0.028％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞；
批次9：合并的提取物：用0.010625％的西番莲(PF)固体和0.014％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞；
批次10：合并的提取物：用0.02125％的西番莲(PF)固体和0.014％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞；
批次11：合并的提取物：用0.0425％的西番莲(PF)固体和0.014％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞；
批次12：合并的提取物：用0.02125％的西番莲(PF)固体和0.007％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞；
批次13：合并的提取物：用0.02125％的西番莲(PF)固体和0.028％的火绒草(EW)愈伤组织培养细胞处理并被应激的成纤维细胞。
如上所述，批次1的成纤维细胞未接受处理且无应激(阴性对照：未处理，无应激)，而批次2的成纤维细胞通过添加5μM的tBHP而经历氧化应激(阳性对照：单独应激)。
对于批次3至13中的每一个，将成纤维细胞同时暴露于指定量的每种提取物，并且还通过添加5μM用于诱导氧化应激的tBHP而暴露于处理中。
在24小时处理结束时，将探针DCFH-DA加入每个孔中，并将板再次在37℃下孵育30分钟。此外，将10μl过氧化氢(H2O2)添加至某些孔中以检查探针的响应和探针饱和度的缺失。然后将细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲溶液洗涤两次，然后使用荧光分光光度计(CLARIOstar，BMG莱伯泰科公司(BMG LABTEK))测量荧光。在第二阶段，通过用结晶紫溶液染色细胞而进行光密度的归一化。
1.3.数据分析
对于所有批次(批次1至13)，根据以下公式(1)计算批次的测量活性相对于由阴性对照(批次1)表示的细胞基础水平的百分比：
％ACTm批次N＝100*ROS值批次N/ROS值NegCtrl(1)
其中：
-％ACTm批次N是每批次的测量活性的百分比
-ROS值批次N是针对每批次测量的ROS值
-ROS值NegCtrl是针对阴性对照(批次1)测量的ROS值。
对于每种组合(批次9至13)，评估在应激存在下与两种化合物的累积效应相当的理论活性。为此，计算在应激存在下三种测试浓度的这两种单独的化合物(批次3至8)的每一种相对于单独应激(阳性对照-批次2)所观察到的水平的贡献，首先根据针对西番莲(PF)提取物的以下公式(2)计算：
Contrib PF[conc x]＝ROS值PF[conc x]/ROS值PosCtrl (2)
其中：
-Contrib PF[conc x]是西番莲提取物在浓度x下的贡献，
-ROS值PF[conc x]是针对用浓度为x的西番莲提取物处理的批次测量的ROS值，
-ROS值PosCtrl是针对阳性对照(批次2)测量的ROS值；
再根据针对火绒草(EW)愈伤组织培养细胞的以下公式(3)计算：
Contrib EW[conc y]＝ROS值EW[conc y]/ROS值PosCtrl (3)
其中：
-Contrib EW[conc y]是火绒草愈伤组织培养细胞在浓度y下的贡献，
-ROS值EW[conc y]是针对用浓度为y的火绒草愈伤组织培养细胞处理的批次测量的ROS值，
-ROS值PosCtrl是针对阳性对照(批次2)测量的ROS值。
对于每种测试组合，理论活性应相当于组合中使用的所述浓度的每种单独化合物的贡献累积，相对于单独应激(阳性对照-批次2)的活性。因此，根据以下公式(4)计算所述组合的理论活性百分比：
％ACTth Combi PF[conc x]EW[conc y]＝％ACTm PosCtrl*Contrib PF[concx]*Contrib EW[conc y] (4)
其中：
-％ACTth Combi PF[conc x]EW[conc y]是在浓度x下测试的西番莲提取物和浓度为y的火绒草愈伤组织培养细胞的组合的理论活性的百分比，
-％ACTm PosCtrl是阳性对照的测量活性的百分比，
-Contrib PF[conc x]和Contrib EW[conc y]是如以上对公式(2)和公式(3)所定义的。
将计算的理论活性与在应激存在下测试的每种组合的测量活性进行比较，即，将单独提取物的值与阴性对照条件和阳性对照条件的值进行比较。
4.4.结果
结果报告于以下表I和表II中：
表I
Figure BDA0002163572170000141
表II
Figure BDA0002163572170000142
用批次9至13的组合获得的结果也显示在附图1至5中。
阳性对照条件(批次2)显示相对于阴性对照(批次1)所产生的ROS量增加125％，这证明了tBHP的促氧化作用。除了含有3.4％西番莲提取物的组合物之外，单独的化合物没有显著地调整ROS的这种增加。
可以注意到，针对所有测试组合测量的抗氧化效果高于从提取物的添加计算的理论效果，这证明了这两种提取物组合使用时具有协同作用(图1至5)。对于所研究的所有组合都观察到这种协同作用，这两种提取物的可变浓度比是如上表II中所总结的。
对于0.02125％的PF和0.014％的EW的组合(批次10)观察到最高协同作用，其显示与单独的应激条件(阳性对照)相比，测量的ROS水平降低了3倍，并且ROS水平低于细胞基础水平(阴性对照)，这证明这种组合具有非常强的抗氧化作用。
实例2：抗老化化妆水
通过常规技术，制备根据本发明的抗老化化妆水，其包含以下成分(质量％)：
Figure BDA0002163572170000151
实例3：抗老化霜
通过常规技术，制备根据本发明的抗老化霜，其包含以下成分(质量％)：
Figure BDA0002163572170000152
Figure BDA0002163572170000161

Claims (15)

1.一种用于局部施用的化妆品组合物，其包含：
-至少一种西番莲提取物，和
-至少火绒草愈伤组织培养细胞和/或火绒草愈伤组织培养细胞的至少一种提取物，以及
-至少一种生理学上可接受的支持物。
2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于所述西番莲提取物是从西番莲的地上部分制备的，并且优选地从西番莲的花梢制备。
3.根据权利要求1或2所述的化妆品组合物，其特征在于所述西番莲提取物是水提取物、醇提取物或水-醇提取物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于所述西番莲提取物是通过将按质量计0.5％至3％的干燥且经研磨的西番莲固体引入提取溶剂中而获得的，所述提取溶剂选自水、醇及其混合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于以引入所述提取溶剂中的西番莲固体的质量表示，所述西番莲提取物的量为相对于所述组合物总质量的按质量计0.001％至0.5％。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其特征在于以引入所述提取溶剂中的西番莲固体的质量表示，所述西番莲提取物的量为相对于所述组合物总质量的按质量计0.005％至0.25％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物包含7×10-4％至0.3％的量的火绒草愈伤组织培养细胞，所述量以相对于所述组合物总质量的固体质量表示。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物包含0.0035％至0.15％的量的火绒草愈伤组织培养细胞，所述量以相对于所述组合物总质量的固体质量表示。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其特征在于所述西番莲提取物的量与所述火绒草愈伤组织培养细胞的量之间的质量比为0.3至6。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物包含相对于所述组合物总质量的按质量计0.02125％的量的西番莲提取物，所述量以引入所述提取溶剂中的西番莲固体的质量表示；并且所述组合物包含0.014％的量的火绒草愈伤组织培养细胞，所述量以相对于所述组合物总质量的固体质量表示。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物还含有一种或多种第二活性剂，所述第二活性剂选自保湿剂、湿润剂、抗氧化剂、皮肤保护剂、抗老化活性剂、防射线剂特别是防UV射线剂、及其混合物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其特征在于所述西番莲提取物和/或火绒草愈伤组织培养细胞和/或一种或多种第二活性剂呈大颗粒、微粒或纳米颗粒的包封形式或呈大胶囊、微胶囊或纳米胶囊形式，或吸附在选自粉末状有机聚合物、滑石、膨润土的支持物上和其他矿物质支持物上。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物呈凝胶、乳液、微乳液、精华、油、面膜、药膏、软膏、化妆水、浓缩液、悬浮液、泡沫、固体棒或气溶胶的形式。
14.一种非治疗性美容方法，用于护理皮肤特别是用于保护皮肤免受环境侵袭，预防、延缓和/或对抗皮肤老化迹象，所述方法包括将至少一种如权利要求1至13中任一项所定义的用于局部施用的化妆品组合物施用于皮肤相关区域。
15.如权利要求1至13中任一项所定义的用于局部施用的化妆品组合物的非治疗性用途，用于保护皮肤免受环境侵袭，预防、延缓和/或对抗皮肤老化迹象。
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