TWI809299B

TWI809299B - 紫花地丁萃取物之製備方法

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Publication number: TWI809299B
Application number: TW109127833A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 姚采涵
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2023-07-21
Also published as: CN112386643A; CN112386665B; TWI772723B; CN112386534A; TW202106329A; TW202106324A; TW202106330A; TWI819235B; TW202106323A; CN115227774A; TW202106328A; CN112386627A; TWI729618B; CN112386655A; CN112386665A

Abstract

本發明提供一種紫花地丁萃取物的製備方法。

Description

紫花地丁萃取物之製備方法

本發明提供一種紫花地丁萃取物的製備方法，特別是關於可用於製備改善肌膚狀態的紫花地丁萃取物。

皮膚是保護人類個體的最大屏障，其具有對抗水分散失、病原菌以及各種外界環境損害的功能。當皮膚暴露於大量的紫外線(ultraviolet，UV)、游離輻射(ionizing radiation)、藥物或異生物質(xenobiotics)會促使皮膚內生成活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)。當所累積的活性氧物質的濃度超過細胞或組織本身的抗氧化能力時，便會形成氧化性壓力(oxidative stress)，活性氧物質將會與細胞內的組成物(包括DNA、蛋白質以及脂質等)進行反應。當皮膚細胞受到破壞，將對皮膚產生非所欲的影響，甚至加速老化。

皮膚由外向內依序為表皮層、主要由結締組織構成的真皮層、及皮下組織。表皮層是皮膚的最外層，而表皮層與真皮層間存在持續分裂的細胞，如纖維母細胞。此類細胞因不斷分裂，對於細胞傷害因素則更為敏感而較易受到影響。若纖維母細胞受到例如紫外線等其他外界環境傷害的影響，降低其增生速度或甚至是使細胞總量減少，則將會導致皮膚表層受損、變薄而無法有效保護內層肌膚，進而加速肌膚整體老化速度。

另一方面，粒線體(mitochondria)亦被稱為細胞的發電站，因為它是細胞內合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)(一種傳遞能量的分子)的主要場所，為細胞的各項活動提供了化學能量。粒線體若損壞，對細胞以及生物個體的影響甚鉅。粒線體在合成ATP的過程中會產生很多的自由基，自由基的活性極強，會與體內任何物質發生強烈的氧化反應而破壞其正常功能。自由基日積月累地傷害粒線體內的酵素與DNA，漸漸地使粒線體功能下降進而使各器官組織的功能衰退。因此，如何提升細胞的粒線體活性，進而達到抗老化之效用，亦為重要的議題。

有鑑於此，研究或開發一種可促進纖維母細胞生長、提升粒線體活性的組合物以減緩皮膚老化，是有其需求的。

據此，本發明的一目的在於提供一種紫花地丁萃取物之製備方法，包含以下步驟：將紫花地丁浸泡於萃取溶劑以進行萃取，得到含紫花地丁萃取物的紫花地丁萃取液；其中萃取溶劑為水，且萃取溶劑與紫花地丁之重量比為25-35：1。

在一些實施例中，將紫花地丁浸泡於萃取溶劑以進行萃取的步驟包括：將紫花地丁浸泡於45℃-50℃之萃取溶劑50-120分鐘以進行第一階段萃取；以及將萃取溶劑升溫至75℃-85℃後浸泡20-60分鐘以進行第二階段萃取，得到紫花地丁萃取液。

在一些實施例中，將紫花地丁浸泡於萃取溶劑以進行萃取的步驟包括：將紫花地丁浸泡於45℃-50℃之萃取溶劑50-120分鐘以進行第一階段萃取，其中萃取溶劑中添加有萃取溶劑之0.05wt%至0.15wt%的果膠酶；以及將萃取溶劑升溫至75℃-85℃後浸泡20-60分鐘以進行第二階段萃取，得到紫花地丁萃取液。

在一些實施例中，製備方法更包含：在將紫花地丁浸泡於萃取溶劑以進行萃取的步驟後，將浸泡有紫花地丁的萃取溶劑經過濾後得到上清液；以及將上清液濃縮得到紫花地丁萃取液。

在一些實施例中，紫花地丁萃取液具有下述條件中的至少其中一者：白利糖度值(Degrees Brix)為8-11°Bx、總黃酮含量為2500-3100ppm、及總多酚含量為2500-3100ppm。

綜合上述，本發明提供一種紫花地丁萃取物的製備方法。藉由使用二段式萃取方式，可提升萃取效率以及保有一定含量的活性成分。在一些實施例中，藉由於萃取溶劑中添加果膠酶，可加速紫花地丁中所含之成分進行分解，縮短萃取所需時間或提升萃取物中的活性成分含量。在一些實施例中，藉由濃縮可使紫花地丁萃取物達到特定濃度的糖度、多酚含量、或黃酮含量。

圖1係空白控制組、正對照組及含有紫花地丁萃取物的實驗組對皮膚纖維母細胞增生率的影響之結果比較圖。***p值<0.001，相較於空白控制組。

圖2係空白控制組以及含有紫花地丁萃取物的實驗組在提升皮膚纖維母細胞的粒線體活性上之結果比較圖。**p值<0.01，相較於空白控制組。

圖3係將安慰劑組及實驗組的面膜使用於受試者臉部肌膚後，其各組的肌膚光澤狀態之變化比較圖。**p值<0.01，相較於使用安慰劑面膜後的結果。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)進行分析。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。

紫花地丁(學名：Viola mandshurica)是一種堇菜科堇菜屬的多年生草本植物。

在一些實施例中，紫花地丁萃取物可促進纖維母細胞生長、提升細胞粒線體活性、及/或提升肌膚光澤。故紫花地丁萃取物可用於製備促進皮膚纖維母細胞增生的組合物的用途、製備提升細胞粒線體活性的組合物的用途、或是製備提升肌膚光澤的組合物的用途。

在一些實施例中，前述的各組合物可為醫藥組合物、保養品組合物、食品組合物、保健食品組合物。

醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道地(enterally)、非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型。例如可為：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)或其他類似物。

醫藥組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種或多種載劑：乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些載劑的選用與數量是熟習此項技術人員可視情況進行選擇的。

在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(alcohol containing aqueous solution)以及其他任何合適的溶劑。

在一些實施例中，該醫藥組合物可由下列所述的任一種非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

在一些實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)。舉例而言，其可為下列所述的任一種，但不限於此：乳劑 (emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

在一些實施例中，外部製劑是藉由將醫藥組合物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而製成。

在一些實施例中，該基底可包含下列一種或多種的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P(carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，保養品中可包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。

在一些實施例中，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，其可為下列中的任一種，但不限於此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

在一些實施例中，保養品亦可與下列中之已知活性的外用劑(external use agents)的一種或多種一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑 (ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，醫藥組合物可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

在一些實施例中，食品的種類可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

本案中所述的「紫花地丁」，在一些實施例中係指含有根、莖、以及葉之全株的植物體。在另一些實施例中，亦可以是除含有根、莖、以及葉外，亦包含其花、及/或果實之植物體。在一些實施例中，紫花地丁可以是將全株植物體經切碎及/或磨製而成的紫花地丁粉末，以方便進行運輸或萃取程序。

在一些實施例中，紫花地丁萃取物係以水為萃取溶劑，並以萃取溶劑與紫花地丁之重量比為25-35：1之方式來萃取紫花地丁而得。在一些實施例中，紫花地丁萃取物可藉由將紫花地丁全株浸泡於水中，在室溫(25±5℃)下萃取3-4小時而得。

在一些實施例中，紫花地丁萃取物係以經過不同溫度的二段式萃取方式而得。舉例而言，可將萃取溶劑(例如水)與紫花地丁粉末以重量比25-35：1的方式混合後，先於45℃-50℃下浸泡約50-120分鐘(例如50-80分鐘)進行第一階段萃取，然後將溶液溫度升溫至75℃-85℃再浸泡約20-60分鐘(例如20-40分鐘)以進行第二階段萃取，得到含有紫花地丁萃取物的紫花地丁萃取液。藉由此二段式萃取方式，可提升活性物質的萃取效率以及加速整體萃取過程，亦不致破壞過多的活性成分。

在一些實施例中，可於萃取溶劑中添加果膠酶，可加速紫花地丁進行分解，縮短萃取所需時間或提升萃取物中的活性成分含量。在一些實施例中，可於萃取溶劑中添加萃取溶劑的0.05wt%至0.15wt%的果膠酶。在一些實施例中，若採二段式萃取方式進行萃取，則果膠酶可於較低溫的第一階段中加入，使果膠酶可具有較高的活性，以促進第一階段的萃取效率；而後在較高溫的第二階段萃取可使果膠酶失去活性，避免果膠酶持續進行非所欲的分解反應。

在一些實施例中，萃取步驟可進一步包含其他調整濃度的步驟，以得到含有所欲濃度的指標物的紫花地丁萃取液。例如，萃取步驟可進一步包含有過濾濃縮的步驟。舉例而言，可將萃取完後的紫花地丁萃取液經適當孔徑大小的濾網(例如200-400目數的濾網)過濾，以去除大部分之固體雜質後，再將所得到的上清液於45℃-70℃下進行減壓濃縮，使最終得到的紫花地丁萃取液符合下述條件中的至少其中一者：白利糖度值(Degrees Brix)為8-11°Bx、總黃酮含量為2500-3100ppm、及總多酚含量為2500-3100ppm。在一些實施例中，濃縮後的紫花地丁萃取液之白利糖度值(Degrees Brix)為8-11°Bx、總黃酮含量為2500-3100ppm、且總多酚含量為2500-3100ppm。

在一些實施例中，「紫花地丁萃取物」係指紫花地丁萃取液中所含有的成分，其可為液態或是由紫花地丁萃取液經其他合適的處理步驟所獲得的其他型態之萃取物。舉例而言，由紫花地丁萃取液經乾燥而得之粉末中亦含有「紫花地丁萃取物」。

在一些實施例中，紫花地丁萃取物可促進纖維母細胞生長、提升細胞粒線體活性、及/或提升肌膚光澤。在一些實施例中，以濃度0.060-0.065vol%、含有紫花地丁萃取物的紫花地丁溶液處理細胞24小時，可使細胞增生率提高約1.25至1.35倍。在一些實施例中，以濃度0.060-0.065vol%、含有紫花地丁萃取物的紫花地丁溶液處理細胞24小時，可提升細胞粒線體活性25至35%。在一些實施例中，紫花地丁萃取物可提升肌膚5-7%的光澤度。

下列範例中的實驗步驟若無特別敘明，即在室溫(25±5℃)、常壓(1atm)下進行。

[例1]紫花地丁萃取液的製備

於水(萃取溶劑)中添加其總重0.1wt%的果膠酶(購自 Novozymes，型號Novozymes Viscozyme^® L)，再於該含有果膠酶的水中加入由紫花地丁全株(產地：中國)所研磨成之粉末(其中水：紫花地丁粉末的重量比為30：1)，使其混合後再將此液升溫至並維持在55±5℃，並持續浸泡約60分鐘，以進行第一階段萃取。而後，再將此液之溫度升溫至並維持在85±5℃約30分鐘，進行第二階段萃取。

停止加熱後，將萃取溶劑以400目數之篩網進行過濾以去除固態物，得到上清液。再將此上清液以濃縮機(購自BUCHI，型號Rotavapor R-100)在60±5℃下進行減壓濃縮，至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)為10±0.5°Bx時停止濃縮，得到含紫花地丁萃取物的紫花地丁萃取液。

[例2]總黃酮含量測試

將例1中所得到之紫花地丁萃取液以水，依其體積做10倍稀釋後，取200μL到試管中。於此試管內加入200μL 5wt%亞硝酸鈉(購自Sigma，商品編號31443)水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。接著加入200μL 10wt%硝酸鋁(購自Alfa Aesar，商品編號12360)水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2mL 4wt%氫氧化鈉水溶液(氫氧化鈉購自Macron，產品編號7708-10)，使其混合均勻。最後再加入1.4mL的水於試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以分光光度計(Jasco，型號V-730)於500nm的波長下偵測吸光值。

接著配製標準品以製作檢量線。本案以芸香素(rutin，購自ChromaDex，商品編號ASB-00018440)當量作為總黃酮相對含量的表示。先配製200μg/mL之芸香素甲醇溶液，作為芸香素標準液。取該芸香素標準液0μL、200μL、400μL、600μL、800μL及1000μL分別加入至不同試管中，再於該些試管中加入水，使其各試管內之總體積為1200μL。接著，針對每一試管，從試管中分別取200μL之芸香素標準溶液至另一新試管，再於此試管內加入200μL 5wt%亞硝酸鈉水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。接著加入200μL 10wt%硝酸鋁水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2mL 4wt%氫氧化鈉水溶液，使其混合均勻。最後再加入1.4mL的水於此試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以分光光度計於500nm的波長下偵測吸光值。將六種不同濃度的芸香素溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成檢量線。

接著，利用檢量線將稀釋後的紫花地丁萃取液的吸光值換算成總黃酮含量。於此，可推算出稀釋前的紫花地丁萃取液(即例1中所得到之紫花地丁萃取液)的總黃酮含量為3000ppm。

已知黃酮並非為本案所述促進纖維母細胞生長、提升細胞的粒線體活性、或提升肌膚光澤用途的活性成分，但由於已知黃酮可具有其他例如預防心血管疾病等之用途，而從前方實驗可知，相較於其他萃取方式，由本案萃取方式所得之紫花地丁萃取液可具有較高的總黃酮含量，故本案之紫花地丁萃取液可具有多種複合用途。此外，在一些實施例中，此總黃酮含量亦可作為濃縮終點的判斷基準。

[例3]總多酚含量測試

將例1中所得到之紫花地丁萃取液以水，依其體積做10倍稀釋後，取100μL到試管中。而後，於此試管內添加500μL的佛蕭酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent，購自Merck，貨號1.09001.0100)，混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5wt%碳酸鈉(購自Sigma，商品編號31432)水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。再經由振盪(vortex)確保溶液中無氣泡後，取其中之200μL溶液於750nm的波長下測量吸光值。

接著，配製標準品以製作檢量線。本案以沒食子酸(Gallic acid)當量作為總多酚相對含量的表示。於此，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL之沒食子酸(沒食子酸購自Sigma，產品編號G7384)的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至不同試管中。針對各試管，於其中添加500μL的佛蕭酚試劑，混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5wt%碳酸鈉水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。再經由振盪(vortex)確保溶液中無氣泡後，取其中之200μL溶液於750nm的波長下測量吸光值。將六種不同濃度的沒食子酸標準溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成檢量線。

接著，利用檢量線將稀釋後的紫花地丁萃取液的吸光值換算成總多酚含量。於此，可推算出稀釋前的紫花地丁萃取液(即例1中所得到之紫花地丁萃取液)的總多酚含量為3000ppm。

已知多酚並非為本案所述促進纖維母細胞生長、提升細胞的粒線體活性、或提升肌膚光澤用途的活性成分，但由於已知多酚可具有其他例如預防心血管疾病等之用途，而從前方實驗可知，相較於其他萃取方式，由本案萃取方式所得之紫花地丁萃取液可具有較高的總多酚含量，故本案之紫花地丁萃取液可具有多種複合用途。此外，在一些實施例中，此總多酚含量亦可作為濃縮終點的判斷基準。

[例4]細胞實驗-紫花地丁萃取液促進皮膚纖維母細胞增生的效用評估

藉由Click-iT^TM EdU試驗(利用EdU試劑處理細胞、固定並透化細胞、使用與EdU結合的螢光染劑)來檢測細胞數目，藉此檢驗紫花地丁萃取液對於纖維母細胞是否具有促進增生作用。

材料與儀器

1.細胞株：人類纖維母細胞(Human skin fibroblast)CCD-966SK，購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

2.培養基：於Eagle’s最低限度基本培養基(minimum essential medium，MEM，購自Gibco，商品編號61100-061)中添加額外成分使其含有10vol%胎牛血清(fetal bovine Serum，FBS，購自Gibco，商品編號10437-028)、90vol% 1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate，購自Gibco，商品編號11360-070)、1.5g/L碳酸氫鈉(購自Sigma，商品編號S5761)、0.1mM非必需胺基酸(non-essential amino acid solution，購自Gibco，購自11140-050)。

3.20vol% FBS溶液：於Eagle’s最低限度基本培養基中添加額外成分使其含有20vol% FBS、90vol% 1mM丙酮酸鈉、1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需胺基酸。

4.細胞增殖檢測試劑盒(Cell proliferation assay kits，Click-iT^TM Plus EdU Alexa Fluor^TM 488 Flow Cytometry Assay Kit)，購自Invitrogen，型號C10632，50 tests)

試劑盒中所含之藥品：

(a)5-乙炔-2’-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)10mg(成分A)

(b)Alexa Fluor^TM 488 picolyl azide的DMSO溶液130μL(成分B)

(c)Dimethylsulfoxide(DMSO)4.5mL(成分C)

(d)Click-iT^TM固定劑(fixative)(4% paraformaldehyde in PBS)5mL(成分D)

(e)Click-iT^TM滲透及清洗試劑(fixative saponin-based permeabilization and wash reagent)，10X 50mL(成分E)

(f)濃度為100mM的銅保護劑(Copper protectant)水溶液0.5mL(成分F)

(g)Click-iT^TM EdU緩衝添加劑(EdU buffer additive)400mg(成分G)

5.含有1vol% BSA(Bovine serum albumin，牛血清白蛋白，購自Sigma；商品編號A9647)的PBS溶液，後方將略稱為1%BSA/PBS溶液。

6.10mM的EdU溶液：將試劑盒中的成分C取4mL，加入至成分A中，並保存於-20℃。

7.1X Click-iT^TM滲透及清洗試劑：將試劑盒中的成分E以1% BSA/PBS溶液稀釋10倍，並保存於4℃。

8.10X Click-iT^TM EdU緩衝添加劑溶液：將2mL的二次蒸餾水加入至試劑盒中的成分G，並保存於-20℃。

9.Dulbecco's磷酸緩衝鹽溶液(Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS溶液)：購自Gibco，產品編號14200-075。

10.流式細胞儀(Flow cytometry)，Beckman，Catalog No.660519。

11.紫花地丁樣品溶液：將[例1]中得到之紫花地丁萃取液，使用培養基作為溶劑，以體積比1：1600的方式稀釋而得(紫花地丁樣品溶液濃度：0.0625vol%)。

實驗步驟

將CCD-966SK細胞以每孔1×10⁵個的方式，接種於每孔含2ml培養基之培養盤中，並於5% CO₂、37℃環境下，培養24小時。而後將細胞分為3組，分別為空白控制組、正控制組、以及實驗組。針對實驗組的細胞，於每孔添加紫花地丁樣品溶液2000μL；針對正控制組的細胞，於每孔添加20vol% FBS溶液2000μL；針對空白控制組，則僅添加培養基2000μL於每孔中。將各組細胞於5% CO₂、37℃環境下，培養24小時。

接著，將前述10mM的EdU溶液以培養基稀釋為10μM後，於每孔中加入2mL 10μM的EdU溶液並培養2小時，然後收取細胞。以1% BSA/PBS溶液清洗收取的細胞一次，並移除上清液。再將試劑盒中的Click-iT^TM固定劑(成分D)100μL添加至每孔中與細胞混合，在暗處中於室溫培養15分鐘。而後，以1% BSA/PBS溶液清洗細胞一次，並移除上清液。再將試劑盒中的1X Click-iT^TM滲透及清洗試劑(成分E)100μL添加至每孔中，並於暗處、室溫下靜置15分鐘。接著，收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的15ml離心試管內，將各離心試管以400xg離心5分鐘使細胞沉澱，並移除上清液。然後於各試管進行Click-iT^TM反應。

Click-iT^TM反應流程如下：首先，製備1X Click-iT^TM EdU緩衝添加劑溶液(將10X Click-iT^TM EdU緩衝添加劑溶液，以二次蒸餾水稀釋為1X Click-iT^TM EdU緩衝添加劑溶液)。接著製備Click-iT^TM Plus reaction混合試劑(每一試管使用500μL的Click-iT^TM Plus reaction混合試劑，該500μL的混合試劑以10μL的銅保護劑(成分F)、2.5μL picolyl azide的DMSO溶液(成分B)、50μL 1X Click-iT^TM EdU緩衝添加劑溶液、以及438μL的PBS溶液配製而成)，其需於配製後15分鐘內進行使用。

接著，於每一試管中添加500μL配製的Click-iT^TM Plus reaction混合試劑，並使其於暗處室溫下，靜置30分鐘。而後，以1X Click-iT^TM滲透及清洗試劑清洗細胞一次，並移除上清液。再以500μL 1X Click-iT^TM滲透及清洗試劑，重新懸浮細胞，並將各試管的細胞以流式細胞儀對細胞進行分析。

由於染料(成分B)將會與細胞中的核酸異性結合並產生綠色螢光，而螢光的強度將與細胞的數量成正比，故可透過測量螢光來量化細胞數目(激發波長：488nm；發射波長：530/30(515-545nm))。

將空白控制組的細胞增生率作為基準值(即設為1.0)，並將空白控制組的細胞增生率、正控制組的相對細胞增生率、以及實驗組的相對細胞增生率，繪示於圖1。由圖1中可知，經過紫花地丁萃取物處理過的纖維母細胞，其細胞增生量可顯著提升，且紫花地丁萃取物具有如同FBS之促進細胞增生的功效。

[例5]細胞實驗-紫花地丁萃取液提升細胞的粒線體活性的效用評估

此處以人類皮膚纖維母細胞進行皮膚細胞粒線體活性分析，再利用流式細胞儀粒線體膜電位偵測試劑盒(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potential detection kit，購自BD bioscience，型號551302)進行實驗。

材料與儀器

1.細胞株：人類纖維母細胞(Human skin fibroblast)CCD-966SK，購自台灣生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC，產品編號：60153)。

2.培養基：於Eagle’s最低限度基本培養基(minimum essential medium，MEM，購自Gibco，商品編號61100-061)中添加額外成分使其含有10vol% FBS、90vol% 1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate，購自Gibco，商品編號11360-070)、1.5g/L碳酸氫鈉(購自Sigma)、0.1mM非必需胺基酸(non-essential amino acid solution，購自Gibco，11140-050)。

3.Dulbecco's磷酸緩衝鹽溶液(DPBS溶液)：購自Gibco，產品編號14200-075。

4.流式細胞儀粒線體膜電位偵測試劑盒(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potential detection kit，購自BD bioscience，型號551302)

5.流式細胞儀(Flow cytometry)，購自BD，型號Accuri^TM C6 Plus， 660517。

6.紫花地丁樣品溶液：將[例1]中得到之紫花地丁萃取液，使用培養基作為溶劑，以體積比1：1600的方式稀釋而得(紫花地丁樣品溶液濃度：0.0625vol%)。

實驗步驟

將CCD-966SK細胞以每孔1×10⁵個的方式，接種於每孔含2ml培養基之培養盤中，並於5% CO₂、37℃環境下，培養24小時，再將每孔之培養基更換為新鮮培養基。而後，將細胞分為空白控制組以及實驗組2組。針對實驗組的細胞，於每孔添加紫花地丁樣品溶液2000μL；針對空白控制組，則僅添加培養基2000μL於每孔中。將各組細胞於37℃環境下，培養24小時。

於37℃下預熱10X分析緩衝液(由試劑盒提供)，以無菌的DPBS溶液將其稀釋，以製備1X分析緩衝液，並將之保存於37℃下。另將130μL的二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，商品編號D2650-100ML)添加至凍乾的JC-1粒線體染劑(由試劑盒提供)以製備JC-1儲備溶液(若保存於-20℃可維持6個月)。接著，將JC-1儲備溶液與1X分析緩衝液以1：200的體積比例配製工作溶液。

將前述培養後的空白控制組以及實驗組細胞移除其培養基，再以DPBS溶液潤洗兩次。之後，加入200μl胰蛋白酶(Trypsin-EDTA，購自Gibco；產品編號15400-054)處理3分鐘後，吸取懸浮的細胞至1.5mL的微離心管，以400xg轉速離心5分鐘。移除上清液，再以1ml DPBS溶液於1.5mL的微離心管中再次懸浮細胞。再以400xg 離心5分鐘。移除上清液，並於微離心管中加入100μL先前所配製的工作溶液。將其振盪(vortex)混合後，於暗室靜置30分鐘。之後，以400xg轉速離心5分鐘，去除上清液，再以1mL的1X清洗緩衝液(1X DPBS，購自Gibco，商品編號14200-075)潤洗並以400xg轉速離心5分鐘。而後，去除上清液，再以1mL的1X清洗緩衝液潤洗並以400xg轉速離心5分鐘。去除上清液後，以含有2vol% FBS的500μL DPBS溶液再次懸浮細胞，然後利用流式細胞儀，於激發波長450-490nm、發射波長510-550nm的條件下，進行粒線體染色訊號值的分析，以觀察細胞凋亡時粒線體膜電位的改變。

粒線體在呼吸氧化過程中，將所產生的能量以電化學位能儲存於粒線體內膜，稱之為粒線體膜電位，並以此位能來進行電子傳遞鏈，最終產生ATP以供細胞使用。而此一電位差形成於粒線體內膜，為外正內負的形式。而JC-1為帶正電的染劑分子，當其進入細胞中，會被粒線體膜上的負電位吸引並形成二聚體。此二聚體在螢光顯微鏡下可發出橘色螢光。而若粒線體上的膜電位消失(例如當細胞凋亡時)，則JC-1染劑將會散佈於細胞中呈現單體狀態，此時將呈現綠色螢光。

JC-1聚合體的相對比例如圖2所示，由圖2可見，與空白控制組相較之下，實驗組的皮膚纖維母細胞的粒線體活性(即相對的JC-1聚合體比例)有顯著提升。顯示紫花地丁萃取物確實可提升細胞粒線體活性，有利維持細胞活力及其正常代謝。

[例6]人體實驗-紫花地丁萃取液提升肌膚光澤效用之評估

使用樣品：含紫花地丁萃取液的面膜(以面膜布浸泡於含有紫花地丁萃取液的精華液中，使其充分吸收後製得)以及安慰劑面膜(以相同型號的面膜布浸泡於前述精華液中，但其中的紫花地丁萃取液替換成等重的水)，再使其充分吸收後製得。於此實施例中，各面膜係含20mL的對應精華液。

含有紫花地丁萃取液的精華液成分：三仙膠0.2wt%、馨鮮酮0.6wt%、卡波姆0.1wt%、1,3-丁二醇5wt%、三乙醇胺0.1wt%、己二醇0.6wt%、紫花地丁萃取液1.0wt%，其餘為水。其中，此處之紫花地丁萃取液係指[例1]中得到之紫花地丁萃取液。

在另一些實施例中，精華液中的紫花地丁萃取液所佔比例可達5.0wt%。

受試者人數：8位30-55歲之受試者。

實驗方式：受試者將全臉清潔後，使用德國Courage+Khazaka electronic公司之多功能皮膚測試儀(C+K Multi Probe Adapter System)並裝配有肌膚光澤度檢測探頭Glossymeter GL200，紀錄左右半臉於使用面膜前之數值(藉由標準白光照射，測量肌膚的反射光和散射光，從而精確地測試皮膚的光澤度)。而後，分別將紫花地丁萃取液面膜以及安慰劑面膜貼敷於受試者的右半臉及左半臉上，經15分鐘後取下，再以指腹稍加按摩左半臉與右半臉。待面膜移除約5分鐘後，再以相同之儀器及測量方式進行測量，再與自身原左半臉或右半臉之數值進行對照(使用前與使用後欲進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響)，其結果記錄於圖3。

由圖3可知，相較於安慰劑面膜，紫花地丁萃取液面膜顯著提升肌膚光澤度(在一些實施例中，相較於使用前，肌膚光澤度提升5-7%。於此實施例中，相較於使用前，肌膚光澤度提升約6%。)。顯示以外用方式使用紫花地丁萃取液，確實可改善肌膚的暗沈，提升肌膚的光澤度。

綜合前述，本案提供一種紫花地丁萃取物以及得到該紫花地丁萃取物的製備方法。並證實紫花地丁萃取物可用於促進纖維母細胞生長、提升細胞的粒線體活性、以及提升肌膚光澤的用途。據此可知使用紫花地丁萃取物，可有效改善肌膚整體狀態。

Claims

一種紫花地丁萃取物之製備方法，包括：將紫花地丁浸泡於一萃取溶劑以進行萃取，得到一含該紫花地丁萃取物的紫花地丁萃取液；其中該萃取溶劑為水，且該萃取溶劑與該紫花地丁之重量比為25-35：1；其中，該將紫花地丁浸泡於該萃取溶劑以進行萃取的步驟包括：將該紫花地丁浸泡於45℃-50℃之該萃取溶劑50-120分鐘以進行第一階段萃取，其中該萃取溶劑中添加有該萃取溶劑之0.05wt%至0.15wt%的果膠酶；以及將該萃取溶劑升溫至75℃-85℃後浸泡20-60分鐘以進行第二階段萃取，得到該紫花地丁萃取液。
如請求項1所述之製備方法，其中該紫花地丁萃取液具有下述條件中的至少其中一者：白利糖度值(Degrees Brix)為8-11°Bx、總黃酮含量為2500-3100ppm、及總多酚含量為2500-3100ppm。