CN112386665A

CN112386665A - 天然原料的发酵液以及其用于抑制过敏反应或提升免疫力的用途

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Publication number: CN112386665A
Application number: CN202010822836.5A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 吴佩宜
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: TWI772723B; TWI729618B; CN112386643A; TW202106323A; CN112386534A; TW202106329A; TWI819235B; CN115227774A; TW202106328A; CN112386665B; TWI809299B; CN112386655A; TW202106324A; TW202106330A; CN112386627A

Abstract

本发明提供一种天然原料的发酵液，借由一包含下列步骤的制备方法制得：将葡萄糖、红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁与水混合以得到培养液，以及将培养液及多个菌种进行发酵4‑15日。本发明另提供一种将天然原料的发酵液用于抑制过敏反应或提升免疫力的用途。

Description

天然原料的发酵液以及其用于抑制过敏反应或提升免疫力的用途

技术领域

本发明关于一种将天然原料的发酵液用于抑制过敏反应或提升免疫力的用途。

背景技术

当生物组织受到外在的某些刺激(诸如源自于病原体、受损细胞或刺激物的刺激)后，在某些时候将会引发过敏反应，释放出发炎物质，进而引起发炎反应。

发炎反应原本即为血管组织对有害刺激物的既有生物反应的一部分。发炎反应为生物体的免疫系统试图移除有害刺激物及引发愈合过程的保护性反应。在无发炎的情况下，刺激物不易排除、及/或创口感染不易痊愈。

然而，当过敏引发过于激烈的发炎反应时，反而会对生物体造成不适、不便或甚至损伤，例如引发气喘、使受损组织无法进行修复等问题。此外，发炎可分类为急性发炎或慢性发炎。急性发炎为身体对有害刺激物的初始反应且借由增强血浆及白血球自血液向受损组织中移动而达成，涉及局部血管系统、免疫系统及受损组织内的各种细胞，一般而言为短期的反应。然而当发炎期间较长、或是间歇性连续产生时，则称为慢性发炎。

当身体处于长期过敏状态而导致慢性发炎时，除了过敏症状产生的不适所导致的疲劳、失眠等症状外，亦会导致许多疾病，诸如枯草热、牙周炎、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎及甚至癌症的风险。

此外，当免疫系统长期处于不正常的过度活化状态下时，将导致当免疫系统受到真实细菌或病毒的侵害时无法有效发挥功效，使得个体的免疫力大幅下降，暴露于较高风险之中。

发明内容

有鉴于此，研究或开发一种抑制过敏反应的组合物来有效舒缓过敏症状、以及研究或开发一种提升免疫力的组合物来提升生物体的免疫力是有其需求的。

本发明的一目的在于提供一种天然原料发酵液，借由一包含下列步骤的制备方法制得：(a)将葡萄糖、红枣(Ziziphus jujuba Miller)、苹果、蛹虫草(CordycepsMilitaris)、以及砂仁(Fructus Amomi)与水混合以得到一培养液，其中水的重量为红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁总重的5-15倍；以及(b)将培养液及多个菌种进行发酵4-15日以得到天然原料发酵液，其中些菌种包括相对于该培养液为0.01-0.5wt％的酵母菌、相对于培养液为0.01-0.25wt％的乳酸菌及相对于培养液为3-10wt％的醋酸菌。

在一些实施例中，于(a)得到培养液的步骤中，红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁之间的重量比为1：1：1：1。

在一些实施例中，于(a)得到培养液的步骤中，葡萄糖的添加量为红枣、苹果、蛹虫草、砂仁与水总重的8-12wt％。

在一些实施例中，于(a)得到培养液的步骤中，包括(a1)将葡萄糖、红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁与水混合，形成混合液；以及(a2)将混合液于50-100℃下浸提0.5-1.5小时以得到培养液。

在一些实施例中，于(a)得到培养液的步骤中，包括(a1)将红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁与水混合，于50-100℃下浸提0.5-1.5小时，形成天然原料的浸提汁液；以及(a2)将葡萄糖加入至天然原料的浸提汁液以得到培养液。

在一些实施例中，于(b)将培养液及多个菌种进行发酵以得到天然原料发酵液的步骤中，醋酸菌为最后加入的菌种。

在一些实施例中，于(b)将培养液及多个菌种进行发酵以得到天然原料发酵液的步骤中，包括(b1)于培养液中加入酵母菌进行发酵1-2日后形成第一初发酵液；(b2)于第一初发酵液中加入乳酸菌进行发酵1-3日后形成第二初发酵液；以及(b3)于第二初发酵液中加入醋酸菌进行发酵2-10日后形成天然原料发酵液。

在一些实施例中，于(b3)在第二初发酵液中加入醋酸菌进行发酵2-10日后形成天然原料发酵液的步骤中，包括于第二初发酵液中加入醋酸菌进行发酵2-10日后，得到天然原料发酵原液，将天然原料发酵原液在50-60℃下减压浓缩及以200-400目筛网过滤后，得到天然原料发酵液。

在一些实施例中，于(b)将培养液及多个菌种进行发酵以得到天然原料发酵液的步骤中，包括将培养液及多个菌种进行发酵4-15日后，得到天然原料发酵原液，将天然原料发酵原液经浓缩及过滤后，得到天然原料发酵液。

在一些实施例中，于(b)将培养液及多个菌种进行发酵以得到天然原料发酵液的步骤中，包括将培养液及多个菌种进行发酵4-15日后，得到天然原料发酵原液；添加寡糖至天然原料发酵原液使天然原料发酵原液的糖度达到35-40°Bx以形成天然原料发酵液。

在一些实施例中，天然原料发酵液的pH值为3.9-4.2，且其糖度为3.0以下。

在一些实施例中，酵母菌为Saccharomyces cerevisiae，乳酸菌为Lactobacillushelveticus，醋酸菌为Acetobacter aceti。

根据一些实施例，本发明提供一种将天然原料发酵液用于制备抑制过敏反应的组合物的用途。

在一些实施例中，抑制过敏反应的组合物同时具有以下所述功能的至少其中两种：抑制组织胺分泌、抑制一氧化氮生成、以及提升白血球介素-10(Interleukin-10，IL-10)基因表现量。

在一些实施例中，若组合物用于抑制组织胺分泌，则组合物含有0.8-1.2vol％的天然原料发酵液。

在一些实施例中，若组合物用于抑制一氧化氮生成或提升白血球介素-10，则组合物中含有0.030-0.035vol％的天然原料发酵液。

根据一些实施例，本发明提供一种将天然原料发酵液用于制备提升免疫力的组合物的用途。

在一些实施例中，提升免疫力的组合物提升白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)基因表现量、提升白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)基因表现量、或提升自然杀手细胞毒杀能力。

在一些实施例中，若组合物用于提升自然杀手细胞毒杀能力，则组合物含有0.8-1.2vol％的天然原料发酵液。

在一些实施例中，若组合物用于白细胞介素-6基因表现量、提升白细胞介素-8基因表现量，则组合物含有0.030-0.035vol％的天然原料发酵液。

综上，根据任一实施例的天然原料的发酵液、或是由天然原料发酵液所制成天然原料发酵物，可用以抑制过敏反应或是提升免疫力。在一实施例中，在发酵过程中分次依序加入多个菌种并且控制使用各菌种的发酵时间，以使得菌种能有最佳的生长，并且进一步提升天然原料的发酵液中有效成分浓度。在一些实施例中，借由使用特定的混合成分的浸提汁液来进行发酵，所得到的天然原料的发酵液可同时以至少两种以上的路径来抑制过敏反应。在一些实施例中，借由使用特定的混合成分的浸提汁液来进行发酵，所得到的天然原料发酵液可提升白细胞介素-6基因表现量、提升白细胞介素-8基因表现量、或提升自然杀手细胞毒杀能力。

附图说明

图1为总多酚含量测试结果的比较数据图。

图2为组织胺相对分泌量的测试结果数据图。

图3为一氧化氮相对生成量的测试结果数据图。

图4为IL-10基因的相对表现量结果数据图。

图5为IL-8基因、IL-6基因的相对表现量结果数据图。

图6为自然杀手细胞活性测试结果的比较数据图。

图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

具体实施方式

以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。

本案使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)进行分析。

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。

过敏反应是一复杂的反应机制，其主要是当生物体首次接触到过敏原时，过敏原将接触B细胞并与其上的受体结合，刺激B细胞分化成浆细胞并大量产生免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)。而IgE分子可紧密地附着到位于皮下、鼻腔、上呼吸道黏膜、以及消化道等器官的肥大细胞表面上。当生物体再次接触到过敏原时，已经附着在肥大细胞表面的IgE分子会与过敏原交互连结，而诱发了肥大细胞的活化并释放出细胞内含的多种致敏成分(如组织胺、一氧化氮、细胞激素等)。此些致敏成分可导致局部组织充血肿胀、血管通透性增加、呼吸道平滑肌痉挛、以及眼鼻部搔痒难耐等症状。

致敏成分中的组织胺在被分泌出来后，游离的组织胺会与血管平滑肌上的接受器(H1 receptor)结合，使血管扩张因而产生局部水肿，引起痒、打喷嚏、流鼻水等剧烈发炎现象。过量的一氧化氮所产生的自由基使得血管舒张，导致大量的其他促炎因子流入组织，引发过敏反应。另一方面，人体中亦有抑制发炎的因子(抑炎因子)，用以调节过敏反应，而当抑炎因子不足时，同样会导致过度的发炎、过敏现象产生。

故如前所述，由于过敏反应是由多种致敏成分经多重路径所产生的结果，因此若仅针对单一路径，例如单纯服用抗组织胺药物，将无法完全舒缓过敏作用。若希望达到所欲的抑制过敏作用效果，则必须加强所用剂量，而可能伴随产生嗜睡或药物依赖性等副作用，且其改善幅度有限。

而根据本案的一些实施例，以水浸提红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁的天然原料所得到的天然原料浸提汁液，在经过特定发酵程序后所形成的天然原料发酵液，可抑制过敏反应。故此天然原料发酵液可用于制备抑制过敏反应的组合物的用途。

根据一些实施例，本发明的天然原料发酵液可经由多种途径来抑止过敏反应。亦即，在一些实施例中，天然原料发酵液可同时具有以下所述功效中的至少其中两种：抑制组织胺分泌、抑制一氧化氮生成、以及提升抑炎因子(例如IL-10)基因的表现量。

在一些实施例中，将细胞与含有0.8-1.2vol％天然原料发酵液的溶液接触8小时后，可抑制细胞的组织胺分泌。在一些实施例中，将细胞与含有0.030-0.035vol％天然原料发酵液的溶液接触24小时后，可抑制细胞的一氧化氮生成量或提升细胞的白血球介素-10基因表现量。

在一些实施例中，天然原料的发酵液中所使用的天然原料为包含红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁的混合物。因此天然原料发酵液亦可称为混合物发酵液。其中，红枣是指鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyphus)乔木所生长且成熟的褐红色果实，在一些实施例中，可为红枣(Ziziphus jujube Miller)。

苹果可为蔷薇科苹果属(Malus)的乔木所产生的果实，又可称为文林果、文官果、陵果、柰等。在一些实施例中，苹果可包含苹果(Malus domestica)、新疆野苹果(Malussieversii)、欧洲苹果(Malus sylvestris)、栽培苹果(Malus pumila)、或其组合。在一些实施方式中，所指「苹果」可以包括其果肉/果实、含有果皮(外果皮、中间果皮和/或内果皮)的果肉/果实、或含有籽的果肉/果实。

蛹虫草(Cordyceps Militaris)为麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)的真菌，亦称为北虫草、北冬虫夏草或金虫草。自然环境中的蛹虫草寄生于虫蛹之上，以菌丝吸取宿主的身体养份维生，虫体僵死后真菌会从感染的蛹体上长出子实体(fruit body)，此即为古人所称的「虫草」。

砂仁(Fructus Amomi)为多种姜科植物果实的集合称，在一些实施例中可包含阳春砂(Amomum villosum)、海南砂(Amomum longiligulare)及缩砂(Amomum xanthioides)等植物的果实。

本案所述的天然原料发酵液，如同前述，在一些实施例中是指以水浸提含有红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁的混合物得到天然原料浸提汁液后，再将此天然原料浸提汁液经过特定发酵程序，形成天然原料发酵液。

在一些实施例中，天然原料发酵液可经由其他合适的处理步骤，得到天然原料发酵液中所含有的天然原料发酵物。举例而言，「天然原料发酵物」可为由天然原料发酵液经干燥而得的粉末。

在一些实施例中，天然原料发酵液借由一包含下列步骤的制备方法制得：(a)将葡萄糖、红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁与水混合以得到培养液，其中水的重量为红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁总重的5-15倍；以及(b)将培养液及多个菌种进行发酵4-15日以得到天然原料发酵液。

在一些实施例中，红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁之间的重量比可为(1-3)：(1-3)：(1-3)：(1-3)。在一些实施例中，红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁之间的重量比可为1：1：1：1。

在一些实施例中，葡萄糖的添加量为红枣、苹果、蛹虫草、砂仁与水总重的8-12wt％。借由添加葡萄糖，使培养液中具有足够的糖度以确保发酵时菌种可以有足够的养份，让后续发酵可顺利进行。

在一些实施例中，可先将葡萄糖外的成分(即红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁)与水混合，于50-100℃下浸泡0.5-1.5小时以进行浸提，得到一天然原料的浸提汁液；再将葡萄糖加入至天然原料的浸提汁液中得到培养液。

而在另一些实施例中，可先将葡萄糖与红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁与水一起混合，形成混合液；再将混合液于50-100℃下浸泡浸提0.5-1.5小时以得到培养液。借由将葡萄糖与红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁同时混合来进行浸提程序，由于不需再开启浸提设备添加葡萄糖、且加入的葡萄糖可再经过高温环境处理，有助于葡萄糖的溶解且可降低原料受污染风险。

在获得培养液后，可将培养液及多个菌种进行发酵4-15日以得到天然原料发酵液。其中，多个菌种包括相对于培养液为0.01-0.5wt％的酵母菌、相对于培养液为0.01-0.25wt％的乳酸菌及相对于培养液为3-10wt％的醋酸菌(Acetobacter aceti)。在一些实施例中，培养液不另滤除其内部的固形物(浸提后的红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁)而直接于其中加入菌种进行发酵(此时培养液的总重为固形物与液态的重量)，借以利用菌种进一步提取固形物中的活性成分。在另一些实施例中，可先滤除培养液内部的固形物，再添加菌种进行发酵(此时培养液的总重为液态的重量)，由此可避免当后续发酵反应过度时，产生其他较复杂且非所欲的成分而可较佳地控制發酵液的质量。

在一些实施例中，将培养液及多个菌种进行发酵以得到天然原料发酵液的步骤中，酵母菌、乳酸菌以及醋酸菌可以同时加入至培养液中。

在一些实施例中，将培养液及多个菌种进行发酵以得到天然原料发酵液的步骤中，是将酵母菌、乳酸菌、以及醋酸菌以此特定顺序进行分批发酵。举例而言，在一些实施例中，先于培养液中加入酵母菌进行发酵1-2日后形成第一初发酵液；再于第一初发酵液中加入乳酸菌进行发酵1-3日后形成第二初发酵液；以及于第二初发酵液中加入醋酸菌进行发酵2-10日后形成天然原料发酵液。

借由先于培养液中添加酵母菌，可先将培养液中的糖份(例如葡萄糖)经发酵转化为乙醇，而乙醇有助于提取天然原料内的有效成分。而后，于第一初发酵液中加入乳酸菌，可使第一初发酵液内尚未反应的糖份经发酵而转化为乳酸，以进一步消耗其中的糖份，进而降低第二初发酵液所含糖度。由于在第二初发酵液中产生了乳酸，其将会进一步改变整体反应环境(例如使第二初发酵液的pH值下降)，对于提取天然原料内的有效成分亦有影响与帮助(使溶于酸性溶液的有效成分更易提取出)。接着，再于第二初发酵液中加入醋酸菌，由此可使第二初发酵液内的乙醇转化为乙酸。而由于乙醇被进一步消耗，酵母菌可进一步地继续将糖份转化为乙醇，使酵母菌进行的反应更为完全，糖度进一步降低。在一些实施例中，天然原料发酵液的糖度为3.0以下，以确保发酵反应完全。在一些实施例中，天然原料发酵液的pH值约为3.9-4.2，糖度约为1.8-3.0°Bx。

在另一些实施例中，将培养液及多个菌种进行发酵以得到天然原料发酵液的步骤中，酵母菌与乳酸菌彼此间的添加顺序不限，但醋酸菌为最后加入的菌种。由此，可让发酵液中确保已经产生乙醇，使醋酸菌可更佳地生长、进行乙醇转化反应，进而最终降低天然原料发酵液中的乙醇含量。在一些实施例中，醋酸菌进行发酵的时间长于酵母菌的发酵时间以及长于乳酸菌的发酵时间，由此使醋酸菌可更完全地消耗发酵液中的乙醇。在一些实施例中，醋酸菌进行发酵的时间可为5-10日。

在一些实施例中，可先于培养液中同时添加酵母菌与乳酸菌进行发酵，再于其中加入醋酸菌发酵得到天然原料发酵液。因酵母菌与乳酸菌两者的发酵反应皆较为快速，其所需发酵时间较为接近，而借由将醋酸菌于酵母菌、乳酸菌后再加入，可让发酵液在酵母菌、乳酸菌阶段先以较短时间(例如共同发酵1日)同时完成其发酵反应，能减少整体发酵所需时间。

在一些实施例中，酵母菌、乳酸菌、以及醋酸菌可于25-40℃下进行发酵反应。若温度超过40℃，则将会使菌种失去活性；若温度低于25℃，则发酵反应的速率将过低、甚至无法进行发酵反应，不利于天然原料发酵液的取得。在一些实施例中，酵母菌、乳酸菌、以及醋酸菌可于28-32℃下进行发酵反应。

在一些实施例中，所使用的酵母菌可以是市售的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。举例而言，可为向财团法人食品工作发展研究所采购的寄存编号BCRC20271(国际寄存ATCC26602)菌株的啤酒酵母。

在一些实施例中，所使用的乳酸菌可以是为市售的瑞士乳酸菌(Lactobacillushelveticus)、胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles)或植物乳杆菌。举例而言，可采用瑞士乳酸菌TCI357(财团法人食品工作发展研究所寄存编号BCRC910846、国际寄存编号DSM33107)、寄存编号BCRC910805(国际寄存DSM33108)菌株的胚芽乳酸杆菌TCI028、寄存编号BCRT910760(国际寄存DSM32451)菌株的胚芽乳酸杆菌TCI378、或寄存编号BCRC910636(国际寄存DSM28121)菌株的嗜热链球菌TCI633。

在一些实施例中，所使用的醋酸菌是向美国菌种中心(American Type CultureCollection)所采购、寄存编号BCRC11688(国际寄存ATCC15973)菌株的醋酸菌。

在一些实施例中，当培养液完成所有菌种的发酵步骤后(例如经过醋酸菌发酵后)，将先得到天然原料发酵原液。而后，将此天然原料发酵原液经过滤、浓缩，再得到天然原料发酵液。举例而言，在一些实施例中，可将培养液及多个菌种进行发酵4-15日后所得到天然原料发酵原液，经适当孔洞大小的滤网(例如200-400目筛网)过滤，再将过滤后的液体于50℃-60℃下进行减压浓缩，以得到天然原料发酵液。在一些实施例中，亦可先进行减压浓缩，再进行过滤步骤。借由浓缩步骤，可再进一步调整天然原料发酵液中的成分浓度。

在一些实施例中，可于天然原料发酵原液中添加寡糖，以使最后得到的天然原料发酵液具有所欲的糖度。举例而言，在一些实施例中，可于天然原料发酵原液中添加寡糖，使天然原料发酵原液的糖度达到35°Bx-40°Bx。寡糖是指由3-10个单醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可为果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、或异麦芽寡糖等等。在一些实施例中，所添加的寡糖可使最后得到的天然原料发酵液中含40wt％-70wt％的异麦芽寡糖。在一些实施例中，添加寡糖可调整天然原料发酵液的风味，且有助于天然原料发酵液的保存。

多酚类化合物可透过抑止组织胺分泌来缓解过敏症状。而在一些实施例中，相较于以水浸提红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁的混合物所得到的天然原料浸提汁液，将此天然原料浸提汁液经过特定发酵程序后所形成的天然原料发酵液可具有较高的总多酚含量。举例而言，在一些实施例中，天然原料发酵液的总多酚含量为150.0-170.0μg/ml，而天然原料浸提汁液的总多酚含量为86.0-87.0μg/ml。据此可知，借由本案发酵方式所得的天然原料发酵液，其总多酚含量可被大幅提升，故本案的发酵方式确实可有效改变天然原料浸提汁液中的所含成分，有效提升活性成分。此外，在一些实施例中，此总多酚含量亦可作为天然原料发酵液的检验基准。

此外，根据本案的一些实施例，以水浸提红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁的混合物所得到的天然原料浸提汁液，在经过特定发酵程序后所形成的天然原料发酵液，可提升免疫力。故此天然原料发酵液可用于制备提升免疫力的组合物的用途。

在一些实施例中，提升免疫力包含提升白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)基因表现量、提升白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)基因表现量、或提升自然杀手细胞(Natural killer cell，NK cell)毒杀能力。其中，白细胞介素-8可促进白血球分化；白细胞介素-6可活化淋巴细胞增加抗体的产生；自然杀手细胞为进行非专一性防御，可以毒杀肿瘤细胞和被病毒感染细胞，具有影响免疫的能力。

在一些实施例中，将细胞与含有0.8-1.2vol％天然原料发酵液的溶液接触3小时后，可提升自然杀手细胞毒杀能力。在一些实施例中，将细胞与含有0.030-0.035vol％天然原料发酵液的溶液接触24小时后，可提升细胞的白细胞介素-6基因表现量、或可提升白细胞介素-8基因表现量。

在一些实施例中，前述的各组合物可为医药组合物、保养品组合物、食品组合物、保健食品组合物。

医药组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于经肠道地(enterally)、非经肠道地(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型。例如可为：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)或其他类似物。

医药组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列一种或多种载剂：乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些载剂的选用与数量是本领域技术人员可视情况进行选择的。

在一些实施例中，医药上可接受的载剂可包含下列一种溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(alcohol containing aqueous solution)以及其他任何合适的溶剂。

在一些实施例中，该医药组合物可由下列所述的任一种非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，医药组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于局部施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)。举例而言，其可为下列所述的任一种，但不限于此：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。

在一些实施例中，外部制剂是借由将医药组合物与一为本领域技术人员所详知的基底(base)相混合而制成。

在一些实施例中，该基底可包含下列一种或多种的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如

974P(

974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。

在一些实施例中，保养品中可包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含下列一种或多种佐剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。可根据实际需求对这些试剂的选用与数量进行合适的调整。

在一些实施例中，保养品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，其可为下列中的任一种，但不限于此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oilysolution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansing products)等。

在一些实施例中，保养品亦可与下列中的已知活性的外用剂(external useagents)的一种或多种一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物提取物(plant extracts)[诸如芦荟提取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。

在一些实施例中，医药组合物可被当作食品添加物(food additive)，借由现有技术方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

在一些实施例中，食品的种类可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

下列范例中的实验步骤若无特别叙明，即在室温(25±5℃)、常压(1atm)下进行。

[例1]天然原料发酵液的制备

将红枣(Ziziphus jujube Miller)、苹果(Malus pumila)、蛹虫草(CordycepsMilitaris)、阳春砂(Amomum villosum)、以及水以1：1：1：1：40的重量比混合后(水的重量为红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁总重的10倍)，在95℃下浸泡提取1小时，得到天然原料的浸提汁液。而后，在尚未回温至室温前，根据红枣、苹果、蛹虫草、砂仁、以及水的总重，添加10wt％的葡萄糖于天然原料的浸提汁液中，得到培养液。培养液此时的pH值为5.4，糖度值为10.7°Bx。

待培养液冷却至室温后，先添加培养液0.1wt％的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)于培养液中，进行发酵1天以形成第一初发酵液。再添加相对于培养液为0.05wt％的TCI357菌株之胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)于第一初发酵液内，进行发酵1天以形成第二初发酵液。最后添加相对于培养液为5wt％的BCRC11688菌株之醋酸菌(Acetobacter aceti)于第二初发酵液内，进行发酵5天以得到天然原料发酵液。前述各发酵阶段皆于30℃下进行。天然原料发酵液的pH值为4.05，糖度值为2.0°Bx，显示大部分的糖份皆已反应。

[例2]天然原料发酵液的制备

将红枣、苹果、蛹虫草、阳春砂、以及水以1：1：1：1：40的重量比混合后(水的重量为红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁总重的10倍)，在95℃下浸泡提取1小时，得到天然原料的浸提汁液。而后，在尚未回温至室温前，根据红枣、苹果、蛹虫草、砂仁、以及水的总重，添加10wt％的葡萄糖于天然原料的浸提汁液中，得到培养液。培养液此时的pH值为5.4，糖度值为10.7°Bx。

待培养液冷却至室温后，先添加培养液0.1wt％的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)于培养液中，进行发酵1天以形成第一初发酵液。再添加相对于培养液为0.05wt％的TCI357菌株之胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)于第一初发酵液内，进行发酵1天以形成第二初发酵液。最后添加相对于培养液为5wt％的BCRC11688菌株之醋酸菌(Acetobacter aceti)于第二初发酵液内，进行发酵5天以得到天然原料发酵原液。前述各发酵阶段皆于30℃下进行。天然原料发酵原液的pH值为4.05，糖度值为2.0°Bx，显示大部分的糖份皆已反应。

将天然原料发酵原液在60℃下减压浓缩及以200目筛网过滤天然原料发酵原液，并以异麦芽寡糖60wt％及天然原料发酵原液40wt％的比例进行混合，以得到糖度达到40°Bx的天然原料发酵液。

[例3]天然原料发酵液的制备

将红枣、苹果、蛹虫草、阳春砂、以及水以1：1：1：1：40的重量比混合后(水的重量为红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁总重的10倍)，再根据红枣、苹果、蛹虫草、砂仁、以及水的总重，添加10wt％的葡萄糖于其中，得到混合液。将混合液于95℃下浸泡提取1小时，得到培养液。培养液此时的pH值为5.4，糖度值为10.7°Bx。

待培养液冷却至室温后，先添加培养液0.1wt％的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)于培养液中，进行发酵1天以形成第一初发酵液。再添加相对于培养液为0.05wt％的TCI357菌株之胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)于第一初发酵液内，进行发酵1天以形成第二初发酵液。最后添加相对于培养液为5wt％的BCRC11688菌株之醋酸菌(Acetobacter aceti)于第二初发酵液内，进行发酵5天以得到天然原料发酵液。前述各发酵阶段皆于30℃下进行。

[例4]天然原料发酵液的制备

待培养液冷却至室温后，先添加培养液0.1wt％的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)以及相对于培养液为0.05wt％的TCI357菌株之胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)于培养液中，进行发酵1天。再添加相对于培养液为5wt％的BCRC11688菌株之醋酸菌(Acetobacter aceti)于其中，进行发酵5天以得到天然原料发酵液。前述各发酵阶段皆于30℃下进行。

[例5]总多酚含量测试

本案以没食子酸(Gallic acid)当量作为总多酚相对含量的表示。故以没食子酸(Gallic acid)作为标准品制作标准曲线(Standard curve)。

首先，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL的没食子酸(没食子酸购自Sigma，产品编号G7384)的标准溶液，并分别取100μL的各浓度的标准溶液至各试管中。针对各试管，于其中添加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenolreagent，购自Merck，货号1.09001.0100)，混合均匀并静置3分钟，接着添加400μL的7.5wt％碳酸钠(购自Sigma，产品编号31432)水溶液于试管中，使其混合均匀并反应30分钟。分别取其中的200μL溶液于750nm的波长下测量吸光值。将六种不同浓度的没食子酸标准溶液依相同方式所测得的吸光值，绘制成标准曲线。

将[例1]中所得到、尚未发酵的天然原料的浸提汁液，以水将其稀释至原体积浓度的1/5后，取100μL至试管中。并于试管中添加500μL的佛萧酚试剂，混合均匀并静置3分钟，接着添加400μL的7.5wt％碳酸钠水溶液于试管中，使其混合均匀并反应30分钟。分别取其中的200μL溶液于750nm的波长下测量吸光值。

另将[例1]中所得到的天然原料发酵液(糖度值为2.0°Bx)，以水将其稀释至原体积浓度的1/5后，取100μL至试管中。并于试管中添加500μL的佛萧酚试剂，混合均匀并静置3分钟，接着添加400μL的7.5wt％碳酸钠水溶液于试管中，使其混合均匀并反应30分钟。分别取其中的200μL溶液于750nm的波长下测量吸光值。

接着，利用标准曲线将稀释后的天然原料浸提汁液、天然原料发酵液的吸光值换算成总多酚含量。于此，如图1所示，可推算出稀释前的天然原料浸提汁液的总多酚含量为88.69μg/mL；稀释前天然原料发酵液的总多酚含量为169.64μg/mL，亦即天然原料发酵液的总多酚含量约为天然原料浸提汁液的总多酚含量的2倍。由此可知，经过特定发酵程序，确实可有效改变天然原料浸提汁液中的成分组成，提升其中所含总多酚含量。

[例6]天然原料发酵液对于抑制组织胺分泌的效用评估

肥大细胞(mast cell)是血液中白血球的一种类型，其会分泌组胺。此处将使用IgE致敏细胞并以DNP-HSA(dinitrophenyl-human serum albumin)抗原来诱发过敏反应，再借由酵素结合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析确定组胺的分泌量，以评估样品的抑制组织胺能力。

材料与仪器

1.细胞株：大鼠嗜碱性白血病细胞(rat basophilic leukemia cells,tumoranalogue of mast cells)RBL-2H3，购自美国典型培养物保存中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，编号CRT-2256。

2.含胎牛血清(fetal bovine Serum，FBS)的培养基：将Eagle’s最低限度基本培养基(minimum essential medium，MEM，购自Gibco，61100-061)、胎牛血清(fetal bovineSerum，FBS，购自Gibco，10437-028)、以及抗生素-抗真菌药(Antibiotic-Antimycotic，AA)，购自Gibco，商品编号15240-062，以体积比84：15：1的方式配制而成。

3.不含FBS的培养基：将Eagle’s最低限度基本培养基(minimum essentialmedium，MEM，购自Gibco，61100-061)以及抗生素-抗真菌药(Antibiotic-Antimycotic，AA，购自Gibco，商品编号15240-062)，以体积比99：1的方式配制而成。

4.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco，产品编号14200-075。

5.抗二硝基苯基化免疫球蛋白E(monoclonal anti-dinitrophenyl antibodyproduced in mouse IgE isotype，anti-DNP-IgE，购自Sigma，商品编号D8406-2MG)。

6.二硝基苯基化人血清白蛋白(dinitrophenyl-human serum albumin，DNP-HSA)。

7.组织胺(Histamine)ELISA试剂盒，购自USCN，产品编号CEA927Ge。

8.ELISA分光亮度计，Epoch，型号1212171。

9.天然原料浸提汁液样品溶液：将[例1]中所得到、尚未发酵的天然原料的浸提汁液与不含FBS的培养基，依其体积做100倍稀释进行配制(含有1vol％的天然原料浸提汁液)。

10.天然原料发酵液样品溶液：将[例1]中所得到的天然原料发酵液(糖度值为2.0°Bx)与不含FBS的培养基，依其体积做100倍稀释进行配制(约含有1vol％的天然原料发酵液)。

实验步骤

将RBL-2H3细胞以每孔1×10⁵个的方式，接种于每孔含500μL含FBS培养基的培养盘中，并于5％CO₂、37℃环境下，培养8小时。而后，将各孔的培养基移除，并将细胞分为4组，分别为空白控制组、正对照组、天然原料浸提汁液组以及天然原料发酵液组。针对空白控制组以及正对照组的细胞，仅分别加入500μL不含FBS的培养基；针对天然原料浸提汁液组的细胞，则是加入500μL天然原料浸提汁液样品溶液；针对天然原料发酵液组的细胞，则是加入500μL天然原料发酵液样品溶液。将各组细胞于5％CO₂、37℃环境下，培养6小时。

接着，于各组细胞中加入浓度为0.2μg/ml的anti-DNP-IgE溶液(以不含FBS的培养基进行配制)500μL，静置30分钟以致敏细胞。而后，移除各孔的培养基，针对空白控制组的细胞，仅加入500μL不含FBS的培养基于每孔中；针对其他各组的细胞，加入浓度为1μg/ml的DNP-HSA溶液(以不含FBS的培养基进行配制)500μL于每孔中。将4组细胞于5％CO₂、37℃环境下静置30分钟，以诱发过敏反应。

随后，收取各组细胞，并依照组织胺ELISA试剂盒内所附的操作手册，使细胞呈色，再以ELISA分光亮度计于450nm的波长下测量各孔吸光值。根据吸光值推算组织胺浓度，并以空白控制组的组织胺浓度为100％，将结果绘示于图2中。

由图2可知，当细胞以IgE致敏，并以DNP-HSA刺激细胞时，如正对照组所示，将产生大量的组织胺。天然原料浸提汁液与天然原料发酵液皆可抑止组织胺产生，但由图2可见，借由特定发酵程序的天然原料发酵液，其抑止组织胺的效果可进一步提升(相较于正对照组，天然原料发酵液可减少约90％的组织胺产生量)。天然原料发酵液组细胞的组织胺生成量，甚至可低于未受DNP-HSA处理的细胞。显示相较于天然原料浸提汁液，天然原料发酵液可更有效地抑止组织胺产生。

[例7]天然原料发酵液对于抑制一氧化氮分泌的效用评估

此处以脂多醣诱发巨噬细胞发炎，模拟发炎反应时iNOS(inducible nitricoxide synthase)产生大量NO自由基，NO的测定试验以Griess法进行。虽然Griess试剂系用以测定NO₂ ^-，但由于NO的半衰期很短，将会迅速地被氧化成NO₂ ^-。因此在短时间内，可借由使用Griess试剂测定NO₂ ^-的量，来间接地表示NO的释放量。

材料与仪器

1.细胞株：小鼠巨噬细胞RAW 264.7，购自美国典型培养物保存中心(AmericanType Culture Collection，ATCC)，产品编号TIB-71。

2.含FBS的培养基：于改良式Eagle’s最低限度基本培养基(Dulbecco's ModifiedEagle Medium，DMEM，购自Gibco，商品编号12100-046)中额外添加其10vol％的FBS(fetalbovine Serum，购自Gibco，10437-028)以及1vol％的抗生素-抗真菌药(Antibiotic-Antimycotic，AA，购自Gibco，商品编号15240-062)配制而成。

3.不含FBS的培养基：于改良式Eagle’s最低限度基本培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium，DMEM，购自Gibco，商品编号12100-046)中额外添加其10vol％的FBS(fetal bovine Serum，购自Gibco，10437-028)以及1vol％的抗生素-抗真菌药(Antibiotic-Antimycotic，AA，购自Gibco，商品编号15240-062)配制而成。

4.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco，产品编号14200-075。

5.脂多醣(Lipopolysaccharides，LPS)，购自Sigma，产品编号SI-L2880。

6.Griess试剂组，购自Life Technologies，产品编号1445263。

7.ELISA分光亮度计，Epoch，型号1212171。

8.天然原料浸提汁液样品溶液：将[例1]中所得到、尚未发酵的天然原料的浸提汁液与不含FBS的培养基，以体积比1：3200的方式进行配制(天然原料浸提汁液的浓度约为0.03125vol％)。再于其中添加LPS，使其中的LPS浓度为200ng/ml。

9.天然原料发酵液样品溶液：将[例1]中所得到的天然原料发酵液(糖度值为2.0°Bx)与不含FBS的培养基，以体积比1：3200的方式进行配制(天然原料发酵液的浓度约为0.03125vol％)。再于其中添加LPS，使其中的LPS浓度为200ng/ml。

实验步骤

将小鼠巨噬细胞RAW 264.7以每孔1×10⁴个的方式，接种于每孔含200μl的含FBS的培养基中，并于5％CO₂、37℃环境下，培养24小时。而后，将各孔的培养基移除，再将细胞分为4组，分别为空白控制组、对照组、天然原料浸提汁液组以及天然原料发酵液组。针对空白控制组的细胞，仅加入200μL不含FBS的培养基；针对对照组的细胞，仅加入200μL以不含FBS的培养基所配制的LPS溶液(LPS浓度为200ng/ml)；针对天然原料浸提汁液组的细胞，则是加入200μL的天然原料浸提汁液样品溶液；针对天然原料发酵液组的细胞，则是加入200μL天然原料发酵液样品溶液。将各组细胞于5％CO₂、37℃环境下，培养24小时。

接着，取一新的培养盘，每孔中加入130μL的二次水。再从前方所述各组的每孔中取出150μL，加入至前述已含有130μL的二次水的孔中。接着根据Griess试剂组中的说明，配制Griess试剂，并于每孔中加入20μL配制好的Griess试剂，使细胞避光静置30分钟。再以ELISA分光亮度计测量各孔细胞溶液在548nm波长下的光密度值(optical density，OD)，作为吸亮度。OD值读值越大，可间接表示NO的含量浓度越高。以空白控制组的NO浓度为100％，将各组结果绘示于图3中(空白控制组为绘示于图3)。

由图3可知，经LPS刺激的细胞确实会大量产生NO，而相较于对照组，天然原料浸提汁液可减少约12％的NO产生量，天然原料发酵液可减少约17％的NO产生量。据此可知，天然原料浸提汁液与天然原料发酵液皆可抑止NO的产生，且天然原料发酵液的抑制功效相较于天然原料浸提汁液更为显著。

[例8]天然原料发酵液对于提升IL-6、IL-8、IL-10的效用评估

材料与仪器

1.细胞株：人类单核球细胞(human monocytic cell)THP-1，购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)，产品编号TIB202。

2.培养基：RPMI-1640培养液(购自Gibco，产品编号31800-022)经额外添加，使其含有10vol％FBS(fetal bovine Serum，购自Gibco，10437-028)、0.05mM二硫基乙醇(2-mercaptoethanol，购自Sigma，产品编号21985023)、1vol％的抗生素-抗真菌药(Antibiotic-Antimycotic，AA，购自Gibco，商品编号15240-062)。

3.RNA提取试剂套组，购自中国台湾Geneaid公司，产品编号RBD300-DG。

4.

III反转录酶(Reverse Transcriptase)，购自Invitrogen，产品编号18080-051。

5.引子组(IL-6、IL-8、IL-10)。

6.KAPA CYBR FAST qPCR套组(2x)(购自KAPA Biosystems，商品编号KK4603)。

7.ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCRsystem)，购自Thermo Fisher Scientific。

8.天然原料浸提汁液样品溶液：将[例1]中所得到、尚未发酵的天然原料的浸提汁液与培养基，以体积比1：3200的方式进行配制(天然原料浸提汁液的浓度约为0.03125vol％)。

9.天然原料发酵液样品溶液：将[例1]中所得到的天然原料发酵液(糖度值为2.0°Bx)与培养基，以体积比1：3200的方式进行配制(天然原料发酵液的浓度约为0.03125vol％)。

实验步骤

接种1.5×10⁵个THP-1细胞至每孔含有2mL培养基的培养盘中，并置于5％CO₂、37℃下培养24小时。而后，将细胞分为3组，分别为空白控制组、天然原料浸提汁液组以及天然原料发酵液组。针对空白控制组的细胞，不作任何处理；针对天然原料浸提汁液组的细胞，加入2000μL的天然原料浸提汁液样品溶液；针对天然原料发酵液组的细胞，则是加入2000μL天然原料发酵液样品溶液。将各组细胞于5％CO₂、37℃环境下，培养24小时。

随后，以RNA提取试剂套组分别提取3组细胞溶液内的RNA。接着，从每组中取2000纳克(ng)的RNA作为模板，透过

III反转录酶，将提取出的RNA反转录为相应的cDNA。再借由ABI StepOnePlusTM实时PCR系统、KAPA SYBR FAST及表1的引子，对3组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reversetranscription polymerase chain reaction，qPCR)以观察各组细胞内的IL-6、IL-8、IL-10基因的表现量。PCR反应的熔化曲线(melting curve)是在定量实时PCR反应期间进行确认，并采用SCORE方法来确认基因表达的相对定量。SCORE法是利用ACTB基因(作为内部对照组)及基准基因(reference gene)的循环阈值(cycle threshold value(C_t))来计算。目标基因的mRNA相对量推导自方程式2^-△△Ct，其中△C_t＝C_{t目标基因/基准基因}-C_{t ACTB}，接着计算上述每个基因的表现量在各组与空白控制组的差值(△△C_t＝△C_{t目标基因}-△C_{t基准基因})，并以此差值的加总作为基因表现的分数。

表1

试验结果绘示于图4(IL-10基因)以及图5(IL-8基因、IL-6基因)。图式中显示的各基因的相对基因表现量是以相对倍率呈现，并使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。

请先参阅图4。将空白控制组的IL-10基因的表现量视为1(即100％)时，天然原料浸提汁液组相对于空白控制组的表现量为0.88(即88％)，天然原料发酵液组对于空白控制组的表现量为2.94(即294％)。显示相较于空白控制组，天然原料浸提汁液并无法有效提升抑炎因子IL-10的基因表现量，而天然原料发酵液却可显著提升抑炎因子IL-10的基因表现量约3倍。由此可知，当细胞以天然原料发酵液处理后，人类单核球细胞的IL-10基因的表现量提高，代表IL-10的产生量亦可提升而可抑止发炎、过敏反应。

接着请参阅图5。将空白控制组的IL-8基因、IL-6基因的表现量视为1(即100％)时，天然原料浸提汁液组相对于空白控制组的IL-8基因表现量为1.29(即129％)、天然原料浸提汁液组相对于空白控制组的IL-6基因表现量为2.58(即258％)；天然原料发酵液组对于空白控制组的IL-8表现量为2.47(即247％)、天然原料发酵液组相对于空白控制组的IL-6基因表现量为8.47(即847％)。显示相较于天然原料浸提汁液，天然原料发酵液可显著提升IL-8、IL-6的基因表现量分别约2倍及3倍，而因IL-8、IL-6皆有助于免疫力的提升，故天然原料发酵液确实可用以提升免疫力。

[例9]天然原料发酵液对于提升自然细胞毒杀能力的效用评估

荧光染料3,8-二氨基-5-[3(二乙基甲氨基)丙基]-6-苯基啡瞇二碘(3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide，Propidium Iodide，PI，碘化丙啶)是种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它可在嵌入双链DNA后释放红色荧光。而由于PI不能通过活细胞膜但却能穿过破损的细胞膜而对其细胞核进行染色，故PI可作为死细胞核酸试剂，常用于细胞凋亡检测。PI也经常被用来与钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein acetoxymethyl ester，calcein-AM)或者二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)等荧光探针一起使用，以同时对活细胞和死细胞染色进行测试。

此处借由将外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(其中约含有10％的自然杀手细胞)与K562人类血癌细胞共培养，再以死细胞染剂PI搭配流式细胞仪检测，分析死细胞数目，间接推知各组自然杀手细胞的细胞毒杀能力。

材料与仪器

1.RPMI 1640细胞培养液(后方略称为RPMI)，购自Gibco，产品编号31800022。

2.1X杜氏磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS)，购自Gibco，产品编号14190144。

3.碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，购自BD Biosciences，商品编号556463。

4.钙黄绿素AM(Calcein AM)，购自Invitrogen，商品编号A13201。

5.天然原料发酵液样品溶液：将[例1]中所得到的天然原料发酵液(糖度值为2.0°Bx)，以培养基稀释为原体积浓度的1％。

6.流式细胞仪(Flow cytometry)，购自BD，型号Accuri^TMC6 Plus。

7.K562人类血癌细胞，购自美国典型培养物保存中心(American Type CultureCollection，ATCC)，产品编号CCL-243。

8.天然原料发酵液样品溶液：将[例1]中所得到的天然原料发酵液(糖度值为2.0°Bx)以RPMI 1640细胞培养液，依其体积做100倍稀释(约含有1vol％的天然原料发酵液)。

先由健康捐赠者提供周边血，并从中分离出PBMC。使用含EDTA抗凝剂的紫头采血管(购自greiner bio-one，商品编号455036)收集数字受试者的静脉血各6毫升，接着将抽取后的静脉血以转速300xg离心15分钟。自离心后的静脉血取2mL的血沉棕黄层(buffycoat)的白细胞层，并将白细胞层以2毫升DPBS稀释为4毫升，接着在稀释后的白细胞层中缓慢加入至含有3毫升的细胞分离液(Ficoll-Paque Plus细胞分离液，购自GE Healthcare，商品编号17144002)的离心管，其中于加入期间，稀释后的白细胞层与细胞分离液须为分层状态，不能混合。接着，将装有分层的稀释后的白细胞层与细胞分离液的离心管以400xg离心40分钟，并于离心后去除上清液，取上述离心后离心管内的中间层内的外周血单个核细胞(PBMC)2至3毫升。将PBMC以3倍体积的1X DPBS润洗后与前述1X DPBS缓冲液混合均匀以形成PBMC混合液。接着将PBMC混合液以转速300xg离心10分钟以形成上清液及PBMC细胞沉淀物。

去除上清液，以5mL RPMI重新悬浮PBMC细胞，并加入1μL的Calcein AM染剂于其中，静置5分钟以进行染色。染色完毕，以400xg转速条件将细胞离心5分钟。去除上清液，再加入5mL的PBS进行离心，而后重复此步骤三次，确保将未染上细胞的多余Calcein AM去除。

于此处，将会规划6个组别进行实验，其分组方式如下：

空白控制组(含有PBMC以及K562)：(1)0小时组以及(2)3小时组；

天然原料发酵液组(含有PBMC以及K562)：(3)0小时组以及(4)3小时组；

(5)单独培养的PBMC细胞；以及(6)单独培养的K562细胞。

将前述清洗过、染好Calcein AM的PBMC去除上清液后，以RPMI将其稀释为1x10⁶个PBMC/100μL，并根据上述分组方式，在需要有PBMC的组别中，于每孔加入100μL此PBMC稀释溶液。

另外，以RPMI配制5x10⁴个K562细胞/100μL的K562稀释溶液，并根据上述分组方式，在需要有K562细胞的组别中，于每孔加入100μL此K562稀释溶液。

此时，(1)-(4)组因同时加入了100μL的PBMC稀释溶液以及100μL的K562稀释溶液，故体积为200μL。再于单独培养的(5)、(6)组中，分别加入100μL的RPMI，使其体积皆为200μL。

接着，针对空白控制组的(1)、(2)组细胞，不进行额外处理；而针对天然原料发酵液组的(3)、(4)组细胞则是分别于每孔中加入200μL的天然原料发酵液样品溶液。而后，立即于空白控制组的(1)组、天然原料发酵液组的(3)组、(5)组、以及(6)组的细胞中，加入1μLPI染剂。加入后，再立即将(1)、(3)、(5)、以及(6)组的细胞移至流式细胞仪。先对(5)组以及(6)组侦测其散布图分布范围，框选PBMC、K562于散布图中的族群，供后续试验进行红荧光(PE-A)的信号定量，接着检测(1)、(3)组的PE-A荧光信号。

于添加天然原料发酵液样品溶液后3小时，于(2)、(4)组的每孔中加入1μL PI染剂，而后立即利用流式细胞仪进行PE-A荧光信号测定。于PE-A荧光直方图(histagram)框选或然率间格区域(Interval gate)，由此比较各孔的红荧光信号强度。借由红荧光信号强度推算死细胞数目，并以死亡细胞数/原细胞数目代表自然杀手细胞的毒杀能力。其(2)、(4)组的毒杀能力结果绘示于图6。

由图6可知，相较于空白控制组，使细胞经天然原料发酵液处理3小时后，确实可有效提升自然杀手细胞的毒杀能力(在此实施例中，约可提升12％)，进而可提升个体免疫力。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

序列表

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 天然原料的发酵液以及其用于抑制过敏反应或提升免疫力的用途

<150> US62886404

<151> 2019-08-14

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6-F primer of THP-1 cell

<400> 1

actcacctct tcagaacgaa ttg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6-R primer of THP-1 cell

<400> 2

ccatctttgg aaggttcagg ttg 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-8-F primer of THP-1 cell

<400> 3

ttttgccaag gagtgctaaa ga 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6-R primer of THP-1 cell

<400> 4

aaccctctgc acccagtttt c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-10-F primer of THP-1 cell

<400> 5

tcaaggcgca tgtgaactcc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-10-R primer of THP-1 cell

<400> 6

gatgtcaaac tcactcatgg ct 22

Claims

1.一种天然原料发酵液，其特征在于，由一包含下列步骤的制备方法制得：

(a)将葡萄糖、红枣(Ziziphus jujuba Miller)、苹果、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)、以及砂仁(Fructus Amomi)与水混合以得到一培养液，其中水的重量为红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁总重的5-15倍；以及

(b)将该培养液及多个菌种进行发酵4-15日以得到该天然原料发酵液，其中该多个菌种包括相对于该培养液为0.01-0.5wt％的酵母菌、相对于该培养液为0.01-0.25wt％的乳酸菌及相对于该培养液为3-10wt％的醋酸菌。

2.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中该(a)步骤得到该培养液的步骤中，红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁之间的重量比为1：1：1：1。

3.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中该(a)步骤得到该培养液的步骤中，葡萄糖的添加量为红枣、苹果、蛹虫草、砂仁与水总重的8-12wt％。

4.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中该(a)步骤得到该培养液的步骤中包括：

(a1)将葡萄糖、红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁与水混合，形成一混合液；以及

(a2)将该混合液于50-100℃下浸提0.5-1.5小时以得到该培养液。

5.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中该(a)步骤得到该培养液的步骤中包括：

(a1)将红枣、苹果、蛹虫草、以及砂仁与水混合，于50-100℃下浸提0.5-1.5小时，形成一天然原料的浸提汁液；以及

(a2)将葡萄糖加入至该天然原料的浸提汁液以得到该培养液。

6.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中于该(b)将该培养液及该多个菌种进行发酵以得到该天然原料发酵液的步骤中，醋酸菌为最后加入的菌种。

7.如权利要求6所述的天然原料发酵液，其中该(b)将该培养液及该多个菌种进行发酵以得到该天然原料发酵液的步骤包括：

(b1)于该培养液中加入酵母菌进行发酵1-2日后形成一第一初发酵液；

(b2)于该第一初发酵液中加入乳酸菌进行发酵1-3日后形成一第二初发酵液；以及

(b3)于该第二初发酵液中加入醋酸菌进行发酵2-10日后形成该天然原料发酵液。

8.如权利要求7所述的天然原料发酵液，其中该(b3)于该第二初发酵液中加入醋酸菌进行发酵2-10日后形成该天然原料发酵液的步骤中包括：于该第二初发酵液中加入醋酸菌进行发酵2-10日后，得到一天然原料发酵原液，将该天然原料发酵原液在50-60℃下减压浓缩及以200-400目筛网过滤后，得到该天然原料发酵液。

9.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中该(b)将该培养液及该多个菌种进行发酵以得到该天然原料发酵液的步骤包括：将该培养液及该多个菌种进行发酵4-15日后，得到一天然原料发酵原液，将该天然原料发酵原液经浓缩及过滤后，得到该天然原料发酵液。

10.如权利要求9所述的天然原料发酵液，其中该(b)将该培养液及多个菌种进行发酵以得到该天然原料发酵液的步骤包括：将该培养液及该多个菌种进行发酵4-15日后，得到一天然原料发酵原液；添加一寡糖至该天然原料发酵原液以使该天然原料发酵原液的糖度达到35-40°Bx以形成该天然原料发酵液。

11.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中该天然原料发酵液的pH值为3.9-4.2，且其糖度为3.0以下。

12.如权利要求1所述的天然原料发酵液，其中酵母菌为Saccharomyces cerevisiae，乳酸菌为Lactobacillus helveticus，醋酸菌为Acetobacter aceti。

13.一种天然原料发酵物，其特征在于，由权利要求1-12中任一项所述的天然原料发酵液所获得。

14.一种将权利要求1-12中任一项所述的天然原料发酵液用于制备一抑制过敏反应的组合物的用途。

15.如权利要求14所述的用途，其中该抑制过敏反应的组合物同时具有以下所述功能的至少其中两种：抑制组织胺分泌、抑制一氧化氮生成、以及提升白血球介素-10(Interleukin-10，IL-10)基因表现量。

16.如权利要求15所述的用途，其中若该组合物用于抑制组织胺分泌，则该组合物含有0.8-1.2vol％的该天然原料发酵液。

17.如权利要求15所述的用途，其中若该组合物用于抑制一氧化氮生成或提升白血球介素-10的基因表现量，则该组合物含有0.030-0.035vol％的该天然原料发酵液。

18.一种将权利要求1-12中任一项所述的天然原料发酵液用于制备一提升免疫力的组合物的用途。

19.如权利要求18所述的用途，其中该提升免疫力的组合物提升白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)基因表现量、提升白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)基因表现量、或提升自然杀手细胞毒杀能力。

20.如权利要求19所述的用途，其中若该组合物用于提升自然杀手细胞毒杀能力，则该组合物含有0.8-1.2vol％的该天然原料发酵液。

21.如权利要求19所述的用途，其中若该组合物用于提升白细胞介素-6基因表现量或提升白细胞介素-8基因表现量，则该组合物含有0.030-0.035vol％的该天然原料发酵液。