KR102642230B1 - 흑미강발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물 - Google Patents
흑미강발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 목적은 흑미강발효물 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공에 관한 것이다. 본 발명은 장기간 약물복용으로 인한 면역능 저하, 감염, 혈압 상승, 골다공증 또는 위궤양 같은 부작용을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 흑미강발효물을 정제 가공하여 흑미강발효물 정제분획을 수득하여 이용함으로써, 스테로이드계 약물의 부작용을 해소하고, 천식의 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 흑미강발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물에 관한 것이다.
천식은 기도에 발생하는 만성염증으로 인하여 기관지가 과민해지고 간헐적인 기도 수축이 발생하여 호흡곤란 증상을 유발하는 만성질병으로서, 아직까지는 완치방법이 없는 것으로 알려지고 있다. 천식환자가 알레르기 유발물질을 흡입하면 항체들이 인지하고 면역계를 활성화시켜 염증반응이 진행되어 기도의 염증과 부종, 기도의 수축을 야기하고 점액이 방출되면서 기관지가 좁아지면 이로 인해 다양한 천식의 증상들이 발현된다. 천식환자는 Th2 임파구가 활성화되어 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13의 증가가 이루어지게 된다. 이들 중 IL-4는 점액 생성과 B세포의 증식을 촉진하고, IgE 항체의 생성을 유도, 항진시키며, 호흡곤란을 야기한다. IL-4는 히스타민이나 류코트리엔과 같은 염증매개물질을 분비하는 비만세포(mast cell)를 활성화시키는 IgE를 생성하고 폐조직으로 eosinophil을 전달하는 VCAM-1을 발현시키게 된다. 호흡곤란, 기침, 가래, 천명(음) 등 전형적인 천식의 호흡기증상 외에도 비전형적인 증상이 나타나기도 한다. 또한 IL-5는 호산구(eosinophils)의 침윤을 항진시키고, IL-13은 천식에 있어서 항원 유발성 기도 과인성 발달에 중요한 사이토카인이라는 사실이 밝혀지면서 알레르기의 면역학적 병인기전과 관련해서 Th2 면역반응에 초점을 맞추게 되었다.
천식환자는 심박수 상승, 건성 수포음 등도 나타날 수 있고, 매우 심각한 천식 발작 동안에는 산소부족으로 청색증이 오고, 강한 흉통이 의식을 잃기 직전에 팔다리의 무감각을 느끼거나 손바닥에 땀이 나는 것을 느낄 수 있으며, 일반적인 치료에 반응하지 않는 심각한 천식 발작은 생명을 위협할 수 있으며, 호흡정지와 사망에 이를 수도 있다. 이러한 기관지 천식은 우리나라를 포함하여 세계적으로 대다수의 국가들에서 전체 인구 중 약 5 내지 10%의 인구가 앓고 있는 것으로 보고될 만큼 매우 흔한 질병으로서, 최근 들어 대기 등 환경오염의 속도가 빨라짐에 따라 그 유병률이 세계적으로 더욱 증가되고 있다. 미국 국립 심폐혈관연구소와 유럽호흡기학회에 의하면, 천식에 관한 연간 비용은 미국에서 161억 달러, EU에서 163억 달러로 예측되며, 천식질환의 특성상 장기간 약물복용이 불가피하지만, 종래의 스테로이드제나 평활근 이완제와 같은 천식치료제들은 면역능 저하, 감염, 심장에 대한 작용 등의 많은 부작용을 나타낸다. 천식의 치료에 사용되는 경구용 스테로이드제는 전신에 흡수되므로 혈압 상승, 골다공증, 위궤양 등과 같은 부작용이 생길 수 있다. 호흡기 흡입용 스테로이드제 역시 목이 쉬는 부작용이 있다.
따라서 부작용이 적고, 근원적 치료 효과를 갖는 새로운 천식증 치료 약물이나 식품 조성물의 개발이 시급히 요구되며, 특히 종래의 천식증에 사용되는 스테로이드계 약물이 갖는 부작용을 해소할 수 있는 천식치료제 개발이 요구되고 있다. 이에, 상기와 같은 문제를 해결하기 위해서 본 발명을 완성하였다.
(선행문헌)
대한민국 등록특허공보 제10-2152356호 (2020.09.04)
(선행문헌)
대한민국 등록특허공보 제10-2152356호 (2020.09.04)
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 흑미강발효분말 정제분획을 포함하는 천식 치료용 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 흑미강발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 흑미강발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 흑미(Oryza sativa L.)는 안토시아닌계(anthocyanins) 및 폴리페놀계(polyphenols) 화합물 등의 기능성 성분을 풍부하게 함유하고 있는 쌀로서, 흑미는 영양성분으로 전분, 단백질, 지방산 등을 함유하고 있으며 앞서 설명한 안토시아닌 및 폴리페놀계 화합물 외에도 섬유소, 인체에 필수적인 무기질, 비타민 B군, 비타민 C, 니아신(niacin), 카로틴(carotene) 등이 함유되어 있어 식량의 개념보다도 건강식품의 개념으로 백미에 소량씩 혼합하여 밥으로 많이 섭취하고 있다. 흑미의 약용효과로는 안토시아닌계 색소성분 등에 의한 항산화 효과, 항암 효과, 항염증 효과, 항고지혈증 효과가 알려져, 최근에는 가공하여 기능성 식품으로도 개발되고 있다.
본 명세서에 있어서 흑미강은 흑미의 도정이나 제분시 제거되는 외피와 약간의 호분층을 포함하는 부산물을 의미한다.
본 발명에서 담자균류란, 진균류의 한 아문으로 유성생식 한 결과로 담자기라는 세포가 되어 홀씨를 만드는 균류이다. 스스로 양분을 만들지 못하여 다른 생물체에 붙어 기생하며, 버섯으로 알려진 것이 많은데 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯 따위가 대표적이다. 성숙한 버섯의 갓주름 면에는 담자기가 빽빽이 생긴다. 담자균류 버섯의 대부분은 고등식물의 유체에서 부생적으로 생활하며, 특히 셀룰로오스와 리그닌을 분해하여 물질의 생물학적 순환에 없어서는 안 될 중요한 역할을 하지만, 또 수목의 뿌리에 균근을 형성하여 공동생활을 하는 것도 많다. 그밖에 식용균으로 중요시되거나 독버섯으로 주의를 해야 할 종류도 있다.
본 발명에서 균사란, 사상균(곰팡이)의 영양세포이다. 영양적 기능이나 생리적 기능 같은 기능 분화도 볼 수 있다. 형태적으로는 격벽의 유무가 분류에 사용되고 있으며, 포자의 발아관에서 발육하여 선단생장에 의해서 신장한다. 분지한 균사의 집단을 균사체(mycelium)라고 한다. 생리적 기능에 따라 배지나 기주의 표면 또는 내부에 들어가면서 신장하는 기저균사와 공기 중에서 신장하는 기생균사로 구별된다. 기생균사는 영양을 기저균사로부터의 이송에 의존하고 있으며, 그 일부는 포자 형성기관 등으로 분화한다. 유기물이 있고 적당한 습도와 온도 등 환경조건이 양호하면 여러 가지 균사조직을 형성한다. 자낭균류의 균사의 격막은 단순하지만 담자균류에서는 꺾쇠연결을 형성하는 것을 많이 볼 수 있다. 곰팡이류에서는 여러 갈래로 분지하여 실처럼 엉겨 있고, 버섯류에서는 집합하여 자실체를 만든다. 엽록소가 없어 광합성을 하지 못하고 기주생물에 붙어서 영양분을 흡수한다. 버섯인 담자균류의 경우, 포자에서 발아한 균사는 핵을 1개 가지고, 이것이 다른 균사와 융합하면 1개의 세포에 핵을 2개 가지게 된다. 핵을 1개 가진 균사를 1차 균사, 핵을 2개 가진 균사를 2차 균사라고 한다. 본 명세서에 있어서 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양받아 사용할 수 있다.
본 발명에서 생물전환이란, 발효 및 효소처리 등의 생물학적 방법을 통해 첨가된 물질의 구조적 변화를 유도하여 화학적으로 변형된 형태로 전환시켜 새로운 성분의 생성을 유도하는 것을 말한다.
본 발명에서 발효란, 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 발효라고 하는 것은 효소작용에 의해 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유에너지를 내놓는 현상이지만, 일반적으로는 미생물이 유기물의 분해과정을 통해 대사물을 축적하는 현상을 말한다. 즉, 효모가 당을 무산소적으로 분해해서 에틸알코올과 이산화탄소로 하는 알코올 발효, 락트산균이 당을 무산소적으로 분해해서 락트산으로 하는 락트산 발효 등이 전형적인 발효이지만, 현재는 아세트산균이 공기 중의 산소를 이용해서 알코올을 아세트산으로 산화시키는 현상, 곰팡이가 공기 중의 산소를 이용해서 글루코오스를 글루콘산으로 산화시키는 현상 등도 각각 아세트산 발효, 글루콘산 발효 등으로 부르고 있다. 또 이러한 것들을 혐기적 발효, 호기적 발효(산화 발효)로 나누어 논하기도 하고, 위에 언급한 것 외의 혐기적 발효로는 글리세롤 발효, 아세톤부탄올 발효, 2, 3-부틸렌글리콜 발효, 부티르산 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이, 또 호기적 발효로는 시트르산 발효, 이타콘산 발효, 숙신산 발효, 2-케토글루타르산 발효, 옥살산 발효, 푸마르산 발효, 소르보오스 발효 등이 있다. 이외에 미생물에 의한 아미노산, 비타민, 항생물질의 생산도 예를 들면 글루탐산 발효, 리보플라빈 발효, 페니실린 발효 등으로 불리는데, 그다지 좋은 호칭은 아니다. 발효작용명은 생산물로 부르는 것이 원칙이나, 때로는 셀룰로오스 발효, 펙틴 발효 등으로 기질의 이름을 붙이기도 한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 정제분획은 고액분리분획(BRB-F-S), 수용성분획(BRB-F-W), 및 다당체분획(BRB-F-P)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid; BALF)에서 면역글로불린 E(IgE)의 발현량을 감소시키거나, 혈청 내에서 면역글로불린 G(IgG), 및 면역글로불린 G1(IgG1)의 발현량을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명에서 약학 조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학 조성물은 염증활성 물질의 억제를 위해 사용되는 것이며, 이를 위한 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 약학 조성물에 상응하는 유효성분을 0.1 내지 100 중량%로 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증 부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 면역세포 수를 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 면역세포는 림프구(Lymphocyte), 호산구(Eosinophil), 호중구(Neutrophil) 또는 대식세포(Macrophage)인 것인, 약학 조성물이다.
본 발명에 따르면, 림프구(Lymphocyte)는 무과립성 백혈구의 일종을 의미하며, 면역 기능에 관여한다. 림프구에는 자연살해세포, T세포, 및 B세포가 포함되며, 무과립성 백혈구 중 가장 많은 수를 차지하고, 전체 백혈구 중에서도 30%를 차지한다.
본 발명에 따르면, 호산구(Eosinophil)는 호산구 과립구라고도 하며, 세포질에 호산성 과립을 가지고 있는 과립구성 백혈구의 일종이다. 직경은 약 9 내지 10μm 정도로 적혈구보다 조금 크며, 핵은 연결된 두 개의 둥근 엽으로 구성되어 있고, 세포질은 H&E 염색에 붉은 색으로 염색되는 호산성 과립이 채워져 있다.
본 발명에 따르면, 호중구(Neutrophil)는 포유류에서 가장 많은 비율을 차지하는 백혈구이다. 선천성면역에 주요한 역할을 하며, 골수에 있는 줄기세포에서 형성되고, 수명은 짧으며 이동성이 높다. 호중구는 분절형 호중구와 띠형 호중구로 세분할 수 있으며, 호중구는 호산구, 호염기구와 함께 다형핵세포족에 속한다.
본 발명에 따르면, 대식세포(Macrophage)는 병원체를 삼키고 소화하는 면역계의 백혈구 유형으로, 암세포, 미생물, 세포 찌꺼기 및 외부 물질과 같이 표면에 건강한 신체 세포에 특이적인 단백질이 없는 물질이다. 이 과정은 감염과 부상으로부터 숙주를 방어하는 작용을 하는 식균작용(phagocytosis) 이라고 한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 및 인터루킨 13(IL-13)의 발현량을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명에 따르면, 인터루킨(interleukin)은 백혈구 및 일부 다른 신체 세포에서 발현 및 분비되는 사이토카인 그룹을 의미한다. 인간 게놈은 50개 이상의 인터루킨 및 관련 단백질을 암호화한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 혈청(serum)에서 저하된 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 12(IL-12), 및 인터루킨 10(IL-10)의 농도를 회복시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증 부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 염증매개물질을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 염증매개물질은 에오탁신(Eotaxin), 혈관세포접착분자-1(VCAM-1), 또는 류코트리엔 C4(Leukotriene C4; LTC4)인 것인, 약학 조성물이다.
본 발명에 따르면, 에오탁신(Eotaxin)은 호산구에 특이적인 케모카인으로서, 각종 염증반응에 있어 호산구의 동원을 일으키는 강력한 매개체이고, 혈중 에오탁신은 알레르기 염증반응의 표지자로서 기관지천식 환자에서 증상의 중증도를 반영할 수 있어, 기관지천식 환자의 상태를 감시하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 혈관세포접착분자-1(VCAM-1)은 분화 클러스터 106으로도 알려져 있으며, 인간에서 VCAM-1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이고 VCAM-1은 세포접착분자로 기능한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 인터루킨 6(IL-6), 및 케모카인 리간드 1(CXCL1)의 발현량을 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid; BALF)에서 투여농도에 의존적으로 면역글로불린 E(IgE)의 발현량을 감소시키거나, 혈청 내에서 면역글로불린 G(IgG), 및 면역글로불린 G1(IgG1), 면역글로불린 G2a(IgG2a)의 발현량을 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 면역세포의 수를 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 면역세포는 림프구(Lymphocyte), 호산구(Eosinophil), 호중구(Neutrophil) 또는 대식세포(Macrophage)인 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 및 인터루킨 13(IL-13)의 발현량을 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 혈청(serum)에서 저하된 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 12(IL-12), 및 인터루킨 10(IL-10)의 농도를 투여농도에 의존적으로 회복시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 염증 부위의 기관지폐포세척액(BALF)에서 염증매개물질을 투여농도에 의존적으로 감소시키는 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 염증매개물질은 에오탁신(Eotaxin), 혈관 세포 접착 분자 1(VCAM-1), 류코트리엔 C4(Leukotriene C4; LTC4), 또는 프로스타글란딘 D2(Prostaglandin D2; PGD2) 인 것인, 약학 조성물이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 흑미강발효물 정제분획을 유효성분으로 포함하는, 천식의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 식품 조성물이란, 천식의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물로 다양하게 이용되는 것으로서, 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연식품인 흑미강 및 이의 생물전환된 발효물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 100%의 비율로 첨가할 수 있다. 여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다. 그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 100 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 정제분획은 고액분리분획, 수용성분획, 및 다당체분획으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 식품 조성물이다.
본 발명에서 상기 배양배지화는 흑미강을 분말화하여 액상에서 흑미강 분말을 가수분해효소로 처리한 후 살균하여 흑미강 배지로 만드는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서, 상기 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 또는 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 생물전환된 흑미강발효물 발효액에서 불용성 잔사를 제거하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 발효액에서 지방구를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 발효액에서 저분자 불순물을 제거하는 단계;를 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계는 고액분리분획(BRB-F-S)을 수득하는 것인, 제조방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 수용성분획(BRB-F-W)을 수득하는 것인, 제조방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 남은 발효액에서 유기용매로 지방구(지용성 불순물)를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계는 다당체분획(BRB-F-P)을 수득하는 것인, 제조방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계에서의 저분자 불순물은 300,000 da이하의 물질인 것인, 제조방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 정제하는 단계는 에탄올 침전법 및 한외여과(Ultrafiltration)를 이용하는 것인, 제조방법이다.
본 발명에 따르면, 한외여과(Ultrafiltration)는 압력 또는 농도 구배와 같은 힘이 반투막을 통해 분리되도록 하는 막 여과를 의미한다. 물과 저분자량의 용질이 투과막을 통과하는 동안 고분자량의 용질은 투과막을 통과하지 못하고 보유물에 유지된다. 이 분리공정은 거대분자 용액, 특히 단백질 용액의 정제 및 농축을 위한 산업 및 연구에 사용된다.
본 발명에 따르면, 생물전환공정에 의해 생산된 흑미강발효물(BRB-F)은 90℃ 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 면역활성 효능을 가지는 흑미강발효물의 분말을 20배의 물에 녹인 용해액 또는 흑미강발효물 발효액을 10,000rpm, 30분간 원심분리하여 불용성 잔사를 제거하여 고액분리분획(BRB-F-S)으로 수득하거나, 고액분리분획 상등액을 동결 건조하여 고액분리분획 분말로 수득할 수 있으며, 혹은 고액분리분획에서 지방구를 제거하여 수용성분획(BRB-F-W)으로 수득하거나, 수용성분획을 동결건조하여 수용성분획 분말로 수득할 수 있으며, 혹은 수용성분획에 5배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 이상 침전을 유도하고 침전물을 동결건조하여 면역활성을 갖는 고분자성 조다당체분획의 분말을 수득하였다. 상기 조다당체분획은 이후, 한외여과(ultra filteration)과정을 추가로 거쳐 다당체분획(BRB-F-P)으로 정제하게 된다. 그 결과로, 고액분리분획(BRB-F-S), 수용성분획(BRB-F-W) 및 다당체분획(BRB-F-P)을 수득하였다. 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S)은 생물전환된 흑미강발효물(BRB-F) 발효액에서 불용성 잔사를 제거하는 과정으로 수득되어지며, 흑미강발효물 수용성분획(BRB-F-W)은 지방구를 분산형태에서 유기용매로 제거하는 단계를 포함한다. 또한, 흑미강발효물 다당체분획(BRB-F-P)은 수용성분획(BRB-F-W)의 정제과정 이후 추가로 에탄올 침전법 및 한외여과(ultrafilteration)를 이용하여 고분자성 다당체를 제외한 저분자성 불순물을 제거하는 과정을 추가로 포함하여 수득되어진다.
본 발명에 따르면, 천식의 발병과 관련하여 ①알레르기를 유발하는 알레르기항원(외부항원)이 우리 몸에 들어와 항원특이 Th2세포의 활성화가 이루어지고, ②활성화된 Th2세포가 분비하는 사이토카인에 의해 B세포가 IgE 항체 생성 B세포로 전환되어 IgE 항체 생성이 유도되어 분비되면, ③분비된 IgE 항체가 비만세포(mast cell)와 결합하여 비만세포의 감작이 유도되고, ④이때 재차 외부에서 들어온 알레르기항원이 비만세포 표면에 결합된 IgE와 결합하면서 비만세포가 활성화되어 히스타민과 같은 여러가지 화학적 알레르기 매개물질을 분비하면서 알레르기 증상이 나타나게 된다.
천식의 알레르기 반응은 초기반응과 후기반응으로 나눌 수 있다. 초기반응은 수분 내에 발생하며 비만세포로부터 histamine, β-hexoaminidase, serotonin과 같이 이미 생성되어 있는 매개물질과 새로 합성된 지방성분의 매개물질을 분비하고, 후기반응은 수시간 내에 발생하며 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13 등)을 합성 분비하여 염증반응을 지속시킨다. 비만세포에 의해 새롭게 생성된 지방성분의 매개물질과 사이토카인은 알레르기 급성 및 만성 염증반응을 유발하는 주요인자이다. ⑤세포와 비만세포에서 분비된 IL-5 등에 의해 말초 및 조직에서 호산구의 침윤이 유도, 항진되면 호산구과다증이 유발되어 호산구성 염증이 발생하게 되는데 이를 호산구성 알레르기라고 부르며, 호산구과다증이 알레르기성 과민반응 유도에 직접적인 원인이 된다. 또한 IL-13은 항원 유발성 기도 과민성 발달에 중요한 역할을 한다.
이 중 천식의 알레르기반응에서 Th2 사이토카인이 분비되기까지의 과정을 더 자세히 설명하면 7단계로 나눌 수가 있다.
본 발명에 따르면, 천식에 있어서 알레르겐이나 바이러스 등에 의한 공격은 ①기관지의 상피세포, 섬유아세포, 비만세포에서 TSLP를 생성하고(1단계), ②TSLP는 미성숙 수지상세포를 활성화시키고(2단계), ③TSLP에 의해 활성화된 미성숙 수지상세포는 케모카인 IL-8과 에오탁신-2를 분비하고 이것이 호산구와 호중구를 끌어들일 뿐만 아니라, 또한 TARC(thymus and activation-regulated chemokine)와 MDC(macrophage-derived chemokine)를 분비하여 Th2세포들을 끌어들인다(3단계). ④TSLP에 의해 활성화된 골수계수지상세포(mDC)는 성숙해지고, TSLP에 의해 활성화된 성숙 수지상세포는 OX40L을 표면에 발현하고 림프절로 이동하게 된다(4단계). ⑤림프절에서 성숙 수지상세포는 항원에 특이적인 naive CD4T세포가 염증성 Th2세포가 되도록 촉진시킨다. Th2세포들은 IL-4, IL-5, IL-13 과 TNF를 생산하지만 IL-10을 생산하지는 않는다(5단계). ⑥염증부위에서는 TARC와 MDC가 생성되기 때문에 염증성 Th2세포는 림프절에서 염증이 일어나는 곳으로 이동하게 된다(6단계). ⑦병변부위(염증부위)로 이동한 염증성 Th2세포에 의해서 병변부위에서는 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13과 TNF가 생성되며, 이 사이토카인은 IgE 생성과 호산구 증가와 점액물질의 생성과 섬유아세포의 증식을 촉진한다(7단계).
본 발명에 따르면, 알레르기질환의 근본적인 원인은 면역 불균형으로 알려져 있으며, 이는 다양한 생물학적 신호전달의 결과물이다. 천식에 있어서 이러한 비정상적 신호전달의 시작은 바로 기관지의 상피세포에서 분비되는 IL-25, IL-33, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin, 흉선기질상림포포이에틴) 등의 사이토카인으로, 이들 사이토카인은 ILC2 세포를 활성화시킨다. 또한 알레르겐이 몸에 침투되면 IL-25 및 IL-33은 T세포에 직접 작용하여 Th2세포로 분화시키며, TSLP는 수지상세포를 자극하여 Th2세포로 분화를 유도하는데, 이 과정에서 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13의 분비가 이루어져 Th2 면역반응에 의한 IgE 의존성 알레르기질환이 시작되게 된다. 또한 천식에 있어서 상피세포는 LPS 등에 의한 TLR 활성화를 통해 IL-1β, TNF-α 등의 염증성 사이토카인을 분비하여 주변 smooth muscle cells, fibroblast, mast cells, eosinophils, basophils 세포들의 CC 케모카인과 Th2 사이토카인의 생성 및 분비를 향상시켜 영향을 미친다.
본 발명에 따르면, TSLP는 아토피피부염 발생에 중요한 역할을 담당하는 것으로 밝혀져 있으나, 천식의 발생에도 관여하는 것으로 밝혀진 사이토카인이다. TSLP는 IL-7 유사 사이토카인으로 흉선기질세포의 배양액에서 처음 발견되었다. TSLP는 신체와 환경의 경계면(피부, 호흡기, 소화기, 안구 등)에서 면역반응을 조절하는 중요 인자로써 피부 각질형성세포 및 기관지 상피세포에서 주로 분비된다. 최근 연구에 따르면, 피부 각질형성세포와 기관지 상피세포 외에도 비만세포(mast cells), 기도평활근(airway smooth muscle), 섬유아세포(fibroblasts) 등에서도 TSLP가 분비되어 면역반응을 조절하고, 과발현될 경우 면역 불균형을 일으킨다고 알려졌다.
최근 연구된 문헌에 의하면 TSLP 단백질 및 mRNA가 알레르기질환 환자의 병소에서 증가되어 있는 것이 발견되었으며, 천식환자 기관지 세척액에서 TSLP가 검출되었으며, 질병의 심각성과 기도 표피세포에서의 TSLP 발현 증가 사이에 상관관계가 있음이 보고되었고, 피부세포에서 분비된 TSLP 때문에 항원 노출 시 알레르기성 염증반응이 심화되고 천식 발병이 촉진되는 것이 밝혀졌다. 또한 피부에서 TSLP 발현을 증가시킨 동물모델(마우스)와 인간에서 심각한 알레르기성 질환을 나타내었다.
TSLP 분비를 촉진시키는 원인으로는 천식에 있어서 단백질분해효소 활성 항원(protease allergen)과 이외에도 바이러스(virus), 박테리아 및 박테리아 부산물(bacteria and bacterial products), 염증성 사이토카인, 화학물질 등이 있으며, 과발현 될 경우 면역 불균형을 일으키게 된다. 면역 불균형을 일으키는 기전은 하기 서술하는 바와 같다. TSLP 수용체(TSLPR)는 주로 조혈세포에 발현되어 있으며, 수지상세포(dendritic cells, DC)에 가장 많이 발현되어 있다. 수지상세포의 생존 시간은 TSLP 때문에 증가하게 되고, 이로 인해 제II급 주조직적합복합체분자(major histocompatibility complex II) 및 공자극분자인 CD86과 CD40의 발현이 증가하며, Th2 CD4+T 세포와 나이브(naive) CD4+T 세포 유입을 증가시키는 CCL17(TARC)과 CCL22(MDC) 분비 또한 증가하게 된다. 더욱이 Th2 분화를 증가시키는 OX40L 발현이 증가하고, Th1 분화에 관여하는 IL-12 발현이 감소하게 되어, TSLP는 결과적으로 수지상세포가 Th2 반응을 유도하는 과정을 촉진한다. 더불어 TSLP는 호산구, 비만세포, 자연살해 T 세포의 유입 및 IL-13과 같은 사이토카인 분비를 촉진시켜 면역 불균형을 심화시킨다.
본 발명에 따르면, TSLP은 천식에 있어서 주로 기도 및 비점막의 상피세포에서 만들어지며 미성숙 골수계수지상세포(mDC)를 자극하는데, 이때 상기의 미성숙 수지상세포가 성숙 수지상세포로 되기 위해 heterodimeric TSLP receptor(수용체)를 발현한다. TSLP-activated 수지상세포는 naive CD4+ T cells를 Th2 표현형으로 분화시키고, Th2 chemotactic cytokine인 CCL17(TARC) 및 CCL22(MDC)와 함께 costimulatory molecule인 OX40 ligand를 발현하여 Th2 기억세포의 증식을 촉진시킨다. 뿐만 아니라 TSLP는 수지상세포에 발현되는 IL-12 p40 수용체를 억제하고, Th1 면역반응을 억제하여 더욱 더 Th2 면역반응을 촉진한다. TSLP는 Th2 세포에서의 IL-4 유전자의 전사를 활성화시키고, 비만세포에서 IL-13의 생성을 촉진시키며, 호염구의 반응을 증대시켜 호산구를 침윤시킴으로써 알레르기 염증반응을 악화시킨다. 그러므로 TSLP는 알레르기질환인 아토피피부염, 천식, 비염의 시작에 핵심적인 역할을 한다. TSLP는 천식환자의 기도에 매우 높은 수준으로 발현되고, 발현 정도는 질병의 중증도 및 CCL17의 발현과 관련되어 있다. 또한, TSLP는 알레르기비염 환자 및 아토피피부염 환자의 상피세포에서 발현된다. 마우스에서 피부 각질형성세포에서의 TSLP 과발현은 감작된 흡입항원에 대한 염증반응을 증폭시키므로, 어린이에서 아토피피부염이 천식으로 이어진다는 점에서 알레르기 행진의 기전을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 목적은 흑미강발효물 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 장기간 약물복용으로 인한 면역능 저하, 감염, 혈압 상승, 골다공증 또는 위궤양 같은 부작용을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 흑미강발효물을 정제 가공하여 흑미강발효물 정제분획을 수득하여 이용함으로써, 스테로이드계 약물의 부작용을 해소하고, 천식의 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 흑미강발효물 다당체분획(BRB-F-P) 정제공정도의 흐름을 나타내는 그래프이다.
도 2는 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능을 비교하기 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포에서의 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 나타내는 그래프이다.
도 3은 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능을 확인하기 위하여 대식세포주인 MH-S 세포에서의 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 나타내는 그래프이다.
도 4는 사람 유래 B세포주인 U266.B1 세포를 이용하여 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 IgE 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 5는 Rat 유래 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 탈과립 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 천식 억제 활성을 평가하기 위하여 ovalbumin과 aluminium hydroxide에 의해 유발된 천식 마우스모델을 제작하는 스케줄을 나타내는 모식도이다.
도 7은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 기관지폐포세척액(BALF) 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 BALF 내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과를 평가한 그래프이다.
도 9는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인한 그래프이다.
도 10은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13)의 양을 측정한 그래프이다.
도 11은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 사이토카인(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 양을 측정한 그래프이다.
도 12는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 염증매개물질 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF와 혈액을 회수한 후 BALF 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과를 측정한 그래프이다.
도 15는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수하여 BALF 내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과를 확인한 그래프이다.
도 16은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인한 그래프이다.
도 17은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인 생성 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 18은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 cytokines(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 생성 회복 효과를 평가한 그래프이다.
도 19는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 TSLP의 양을 측정하여 생성 억제 효과를 평가한 그래프이다.
도 20은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 염증매개물질(Eotaxin, VCAM-1, LTC4, PGD2)의 생성 억제 효과를 평가한 그래프이다.
도 2는 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능을 비교하기 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포에서의 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 나타내는 그래프이다.
도 3은 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능을 확인하기 위하여 대식세포주인 MH-S 세포에서의 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 나타내는 그래프이다.
도 4는 사람 유래 B세포주인 U266.B1 세포를 이용하여 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 IgE 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 5는 Rat 유래 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 탈과립 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 천식 억제 활성을 평가하기 위하여 ovalbumin과 aluminium hydroxide에 의해 유발된 천식 마우스모델을 제작하는 스케줄을 나타내는 모식도이다.
도 7은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 기관지폐포세척액(BALF) 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 BALF 내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과를 평가한 그래프이다.
도 9는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인한 그래프이다.
도 10은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13)의 양을 측정한 그래프이다.
도 11은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 사이토카인(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 양을 측정한 그래프이다.
도 12는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 염증매개물질 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF와 혈액을 회수한 후 BALF 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과를 측정한 그래프이다.
도 15는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수하여 BALF 내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과를 확인한 그래프이다.
도 16은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인한 그래프이다.
도 17은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인 생성 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 18은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 cytokines(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 생성 회복 효과를 평가한 그래프이다.
도 19는 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 TSLP의 양을 측정하여 생성 억제 효과를 평가한 그래프이다.
도 20은 OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 분말의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 염증매개물질(Eotaxin, VCAM-1, LTC4, PGD2)의 생성 억제 효과를 평가한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 발효 및 효소 처리의 생물전환공정
실시예 1-1. 흑미 전처리 및 흑미강 수득 작업
구입한 흑미의 원물로부터 도정하여 흑미강을 수득하기까지의 전처리 작업을 위하여 원재료 상태의 곰팡이 오염도를 측정한 후, 흑미 원재료의 이물 및 오염물 제거를 위한 수세작업을 하였다. 수세작업은 총 3단계를 거쳐 수행하였으며 ①이물 및 곰팡이 포자를 제거하기 위한 공기 세척 단계, ②잔류 농약 등의 제거를 위한 물 세척 단계, ③미생물 등의 오염을 제거하기 위한 알코올(Et-OH) 세척 단계를 통해 원재료의 수세작업을 수행하였다. 수세 및 절단작업을 마친 원재료는 대량건조가 가능한 열풍건조기에서 건조작업을 수행한 후 도정공정을 거쳐 흑미강 수득 작업을 수행하였다.
실시예 1-2. 흑미강발효물(BRB-F) 수득
이물 및 곰팡이 오염을 제거한 흑미강분말은 액상 배양배지화를 위해 물을 첨가한 후 효소 처리 및 열처리 살균공정을 수행하였다. 아밀라아제(amylase) 계열의 가수분해효소를 사용하였고, 상기 효소를 첨가 후 60℃에서 1시간 반응시키고, 고온에서 30분간 살균 처리하여 흑미강의 배양(발효)배지화를 수행하였다. 이 때, 상업적으로 판매되고 있는 효소 제품을 사용할 수 있으며 이 경우 제품설명서에서 제시하는 적정량 및 적정 조건(pH, 온도)에서 실시하였다.
이후, 상기 배양(발효)배지에 별도로 배양한 담자균류 균사 중 표고버섯균사를 첨가하였다. 생물전환공정의 발효공정은 담자균류 균사 종균배양액을 10%(v/v) 접종하고 28 내지 30 ℃및 pH 4.5 내지 7의 조건에서 3 내지 5일간 배양하여 발효물을 수득하였다. 상기의 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으나 표고버섯균사가 바람직하며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 또한, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양 받아 사용할 수 있다.
상기 발효물에 대한 생물전환공정의 효소처리는 섬유소분해효소 중 셀룰라아제를 사용하였다. 이때, 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 효소제가 함께 포함된 상업적으로 판매되고 있는 효소 제품을 사용할 수 있다. 이 경우, 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량)을 첨가하여 실시하였다. 효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소분해효소인 라미넥스(Laminex:Tricoderma reesei 유래 복합물), 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물) 등의 섬유소분해효소에서 어느 하나 또는 복수를 선택하여 사용할 수 있으나 라미넥스가 바람직하며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 라미넥스 효소제의 제품설명서에서 제시하는 추천 농도(0.05%)로 첨가하고, 50 내지 60 ℃조건에서 1 내지 3시간 동안 250 rpm으로 회전시키며 효소/기질반응을 수행하였다. 생물전환공정에 의해 생산된 BRB-F(흑미강발효물)는 90℃ 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거치고 동결건조하여 BRB-F(흑미강발효분말)을 최종 수득하였다.
실시예 1-3. 흑미강발효물의 순차적 정제에 따른 정제분획의 정제 방법
발효 및 효소처리의 생물전환공정에 의해 생산된 흑미강발효물은 90℃ 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 면역활성 효능을 가지는 흑미강발효물의 분말을 20배의 물에 녹인 용해액 또는 흑미강발효물 발효액을 원심분리를 이용하거나 여과망을 통과시켜 불용성 잔사를 제거하여 고액분리분획(BRB-F-S)으로 수득하거나 고액분리분획 상등액을 동결 건조하여 고액분리분획 분말로 수득할 수 있으며, 고액분리분획에서 지방구를 제거하여 수용성분획(BRB-F-W)으로 수득하거나 수용성분획 상등액을 동결건조하여 수용성분획 분말로 수득할 수 있으며. 또한 수용성분획에 5배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 이상 침전을 유도하고 침전물을 회수하여 고면역활성을 갖는 고분자성 조다당체분획을 수득할 수 있으며, 조다당체분획은 이후, 한외여과(ultra-filtration) 과정을 추가로 거친 후 동결건조하여 고순도 다당체분획의 분말을 수득할 수 있으며, 상기 다당체분획은 생물전환된 산물을 의미하며, 흑미강발효물 다당체분획(BRB-F-P)이다. 이하, 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S), 흑미강발효물 수용성분획(BRB-F-W), 및 흑미강발효물 다당체분획(BRB-F-P)의 수득 방법에 대해 구체적으로 설명한다.
실시예 1-3-1. 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 수득
상기 실시예 1-2에서 수득한 BRB-F에 포함된 불용성 잔사를 제거하기 위해 원심분리 또는 여과 공정을 수행하였다. 즉, 불용성 잔사의 제거에 10,000rpm, 30분간 원심분리하거나 200 mesh(약 75㎛) 및 1㎛의 공극 크기를 지닌 여과망을 통과시켜 불용성 잔사를 제거하였다. 소규모 생산에서는 원심분리공정이 편하나, 대규모 생산에서는 여과망을 사용하는 것이 바람직하다. 불용성 잔사가 제거된 여과액(또는 상등액)을 동결건조하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S)분말을 수득하였다. 보다 구체적으로는 흑미강발효물 1 L를 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 그 상등액 0.8 L를 수득하고 동결건조하여 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S)분말을 수득하였다.
실시예 1-3-2. 흑미강발효물 수용성분획(BRB-F-W) 수득
상기 흑미강발효물 고액분리분획 상등액에 포함된 지방구(지용성 불순물)를 제거하기 위해 유기용매를 이용한 층분리 공정을 수행하였다. 상기의 유기용매는 헥세인(Hexane), 아세트산에틸(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메테인(Dichloromethane) 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으나, 디클로로메테인이 바람직하다. BRB-F 또는 BRB-F-S의 동일 부피의 디클로로메테인 유기용매를 첨가하고, 30분간 50 내지 150 rpm의 속도로 교반하여 지방구를 상분리 한다. 이후 지방구 상분리액을 8,000 내지 12,000 g의 원심력으로 원심분리하여 지방구가 제거된 수용층을 수득한다. 이후 얻어진 원심분리 수용액층을 동결건조하여 흑미강발효물 수용성분획(BRB-F-W)분말을 수득하였다. 보다 구체적으로는 흑미강발효물 고액분리분획(BRB-F-S) 0.8 L에 디클로로메테인 0.8 L를 첨가하고, 격렬히 흔들어 혼합한 뒤 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 수용성분획 0.75 L를 수득하고 동결건조하여 흑미강발효물 수용성분획(BRB-F-W) 분말을 수득하였다.
실시예 1-3-3. 흑미강발효물 다당체분획(BRB-F-P) 수득
추가로 흑미강발효물 수용성분획 상등액에 포함된 저분자 불순물을 제거하기 위해 에탄올침전법 및 한외여과를 수행하였다. 에탄올침전법은 흑미강발효물 수용성분획 부피의 4배에 해당하는 에탄올을 첨가하여 고분자성 다당체는 침전으로 분리하고, 침전이 이루어지지 않은 저분자성 불순물은 상등액으로 제거한다. 이때 생성된 침전물을 정제수에 녹인 뒤 만일에 남아있을 잔사를 10,000rpm, 30분간 원심분리를 통해 제거한다. 한외여과는 cut off 크기가 300,000 Da인 한외여과막을 이용하여 저분자성 불순물은 한외여과 통과액으로 제거하고, 고분자성 다당체는 농축한다. 이후 정제수를 가하여 일정한 부피를 유지시키면서 한외여과를 수행하였다. 얻어진 에탄올침전물 용해액 또는 한외여과 농축액을 동결건조하여 다당체분획(BRB-F-P) 분말을 수득하였다. 이때 에탄올침전법 또는 한외여과를 하나만 수행할 수 있으나, 바람직하게는 두 가지 방법을 순차적으로 수행하여 순도를 더욱 높이는 것이 바람직하다. 소규모 생산에서는 에탄올침전법 후 한외여과를 수행하는 것이 편하나, 대규모 생산에서는 한외여과 후 에탄올침전법을 수행하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는 흑미강발효물 수용성분획(BRB-F-W) 0.75 L에 주정(95%) 3 L를 첨가하고, 냉장(4 ℃에서 4시간 정치한 뒤 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 그 침전물을 회수한다. 얻어진 침전물을 3차 증류수 0.75 L에 녹이고 10,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 회수한다. 얻어진 상등액을 cut off 크기가 300,000 Da인 한외여과막에 흘리며 일정량의 통과액 부피만큼 3차증류수를 첨가하며, 한외여과를 진행한다. 이후 통과액에서 색소 등 불순물이 충분히 제거되면 한외여과를 종료하고 그 농축액(retentate)를 얻어 동결건조하여 흑미강발효물 다당체분획(BRB-F-P)분말을 수득하였다. 고순도로 정제된 BRB-F 다당체분획(BRB-F-P) 분말의 순도는 구성당 함량 및 조지방, 조섬유, 질소 함유량 분석을 통해 다당체로써 순도 98% 이상으로 분석되었다.
실시예 2. 흑미강 정제분획의 체외(in vitro) 효능 평가
세포배양
실험에 사용한 RAW264.7, MH-S 세포주는 ATCC (Manassas, VA)에서 구입하였다. DMEM, RPMI1640, IMDM 배지는 웰진(Gyeongsan, Korea)에서 구입하여 사용하였고, fetal bovine serum (FBS) 및 배지에 첨가하는 항생물질은 모두 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)에서 구입하여 사용하였으며, 5% CO2를 함유하는 37℃포화습도 공기조건에서 배양하였다.
대식세포주에서의 사이토카인 측정
대식세포주인 RAW264.7세포 및 MH-S 세포를 24 웰 플레이트에 2x105개 세포/웰로 접종한 뒤 하룻밤 배양하고, 각 시료를 농도에 맞게 희석하여 처리하였다. 16시간 뒤, 상층액을 회수하고 각각의 사이토카인 분석을 위해 상업적으로 판매되고 있는 ELISA(Enzyme linked immune solvent assay) assay 키트를 사용하여 분석을 수행하였다.
결과 1. 대식세포주에서 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제분획분말의 사이토카인 생성량 측정을 통한 면역활성 유효성분(다당체) 확인
흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 선천성 면역활성 효능 및 면역활성 유효성분 확인을 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포 및 폐포 대식세포주인 MH-S 세포에서 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 조사하였다. 사이토카인 분비패턴을 조사한 결과, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말 처리시 LPS와 동일하게 TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 분비되고, LPS에 의해 분비되지 않는 사이토카인에 대해서는 동일하게 분비되지 않는 것을 확인하였다. LPS는 TLR4에 의해 인식되는 대표적인 리간드(ligand)로 잘 알려져 있는 바, 이를 통해 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제분획분말(고액분리분말, 수용성분획, 다당체분획)은 TLR4에 인식되어 신호를 매개하는 TLR4 agonist의 성분을 함유하고 있다고 유추할 수 있었다.
또한 흑미강 원물에서는 사이토카인 분비 효능이 매우 약하거나 거의 나타나지 않으나, 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말에서 원물에 비해 대폭 향상된 사이토카인 분비 효능을 확인하였으며, 특히 유효성분의 농도가 같을 수 있도록 BRB-F 대비 회수율을 고려하여 BRB-F에 회수율을 곱한 농도로 처리하여 사이토카인 분비능을 확인하였다. BRB-F 대비 고획분리분획, 수용성분획, 다당체분획의 회수율은 각각 40.3% 29.7%, 9.4%이다. 그 결과, BRB-F의 정제분획분말에서 BRB-F와 동일하거나 오히려 높게 나타나 사이토카인 분비 효능은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 기인한 것으로 판단된다. 상기 결과는 도1 및 도 2에 나타내었다.
또한 4가지의 사이토카인 중 IFN-β는 type I interferon으로 항균, 항바이러스 효과가 있으며 Th1 세포의 분화에 기여하여 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로 Th1 면역반응을 유도하는 반면, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 사이토카인이다. 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리 시 IFN-β의 분비를 유도함에 따라 Th1 면역반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 TLR4 agonist의 Th1 inducer로 판단된다.
결과 2. B세포주에서 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제분획분말의 IgE 생성 억제 효능 평가
사람 유래 B세포주인 U266.B1 세포를 이용하여 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 IgE 생성능을 측정하였다. U266.B1 세포를 10 μg/mL의 LPS와 5 μg/mL의 IL-4로 72시간 자극하여 IgE 생성을 유도하였으며, 상기 시료를 함께 처리한 뒤 ELISA 방법을 이용하여 분비된 총 IgE의 양을 측정하였다. 그 결과, 흑미강 원물에서는 IgE의 생성 억제 효과가 거의 나타나지 않으나, 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였으며, 또한 BRB-F의 정제분획분말에서는 순차적 정제가 진행될수록 IgE 생성 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제분획분말은 처리농도에 의존하여 IgE 생성 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였고, 100 μg/mL의 BRB-F-P 처리 시 75%의 IgE 생성 억제능을 확인하였다. Th1 반응을 활성화시키는 물질의 경우 IgG로의 immunoglobulin isotype switching을 촉진시킨다고 알려져 있어, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제분획분말이 갖는 Th1 면역반응 활성화 효과에 의해 IgE 생성 억제 및 IgG 개별형 전환이 효과적으로 유도되어 천식 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 것이라 판단된다(도 4).
결과 3. 비만세포주에서 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제분획분말의 탈과립 억제 효능 평가
Rat 유래 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 처리에 의한 탈과립 억제 효과를 측정하였다. RBL-2H3 세포를 10 μM의 A23187로 20분간 자극한 후 방출 과립 내 존재하는 β-hexosaminidase의 활성을 측정하여 탈과립의 정도를 평가하였으며, 대조군 대비 억제율로 환산하여 표기하였다. 그 결과, 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F)에서는 처리농도에 의존하여 탈과립 억제 효과를 확인하였으나 BRB-F의 정제분획분말에서는 순차적 정제가 진행될수록 탈과립 억제 효과가 소멸되어 탈과립 억제 효과는 다당체에 기인한 것이 아님을 확인하였다. 그리고 100 μg/mL의 BRB-F-S 처리 시 34%의 억제 효과를 확인하였다. BRB-F-S의 처리에 의해 β-hexosaminidase 활성이 감소함을 확인하여 비만세포에서의 탈과립 억제 효과를 확인하였으므로, 천식 질환을 예방 및 치료할 수 있을 것이라 판단된다(도 5).
실시예 3. 천식 모델에서 흑미강발효물 정제분획의 체내(in vivo) 효능 평가
실험동물
실험에 사용한 마우스는 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오 (Seongnam, Korea)에서 구입하였고, 실험에 사용하기 전까지 실내온도를 22±2℃로 유지하면서, 충분한 물과 사료를 공급하여 사육하였다.
천식 효능 평가 동물실험
흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)의 천식 억제 활성을 평가하기 위하여 ovalbumin과 aluminium hydroxide에 의해 유발된 천식 마우스모델을 제작하였다. 실험군당 10마리의 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 1주일간 순치 후 사용하였으며, 0.2 mL의 PBS에 20 ㎍의 ovalbumin (Sigma, A7641, OVA)과 1 mg의 aluminium hydroxide (Sigma, 239186)를 현탁하여 1주일 간격으로 총 3회 복강주사를 수행하여 OVA에 대한 감작을 유도하였다. 이후 개발소재를 2주간 식이 투여하였으며, 2주간의 투여기간이 끝나기 5일 전 매일 30분씩 1%의 OVA를 흡입하게 하여 천식을 유도하였다. 이후 마우스를 희생하여 염증 반응의 지표를 확인하여 호흡기질환 억제 효과를 평가하였다.
ELISA
심장에서 채혈한 혈액을 4℃에서 30분 처리하여 혈액응고를 유도한 뒤, 2,000g에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청 내 IL-2, IL-12, IL-10의 양은 ELISA 키트 (R&D systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다. 기관지를 통해 채취한 BALF(기관지폐포세척액)는 12,000rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. BALF 내 OVA-specific IgE, OVA-specific IgG, OVA-specific IgG1, OVA-specific IgG2a, IL-4, IL-5, IL-13, Eotaxin, VACM-1, LTC4, PGD2, IL-6, CXCL1, 및 TSLP의 양은 ELISA 키트 (R&D systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다.
결과 1. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 기관지폐포세척액(BALF) 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효과 평가
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 기관지폐포세척액(BALF)과 혈액을 회수한 후 BALF 내 존재하는 OVA-specific IgE의 양과 혈청 내 존재하는 OVA-specific IgG, 및 OVA-specific IgG1의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, 흑미강 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. BRB-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 BRB-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 BRB-F를 투여한 경우 각각 60%, 58%, 61%의 억제 효과를 나타내었으며, 또한 BRB-F와 정제분획분말별 소재간의 immunoglobulin 생성 억제 활성 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 7에 나타내었다.
결과 2. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF(기관지폐포세척액)내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수하여 BALF 내 총 면역세포수 및 세포(Lymphocyte, Eosinophil, Neutrophil, Macrophage) population에 미치는 효과를 확인하였다. 총 면역세포수의 경우 흑미강 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. BRB-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 BRB-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 BRB-F를 투여한 경우 총 면역세포수에서 39%의 억제 효과를 나타내었다. BALF 내 존재하는 세포의 종류를 확인한 결과, BRB-F 및 BRB-F 정제분획분말별 소재의 투여에 의해 lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage의 유입을 억제시키는 것을 확인하였고, 40 mg/kg의 흑미강발효분말(BRB-F)를 투여한 경우 각각 33%, 33%, 16%, 및 17%의 억제 효과를 확인하였다. 또한, BRB-F와 정제분획분말별 소재간의 BALF 내 면역세포의 침윤 억제 효과에 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다(도 8).
결과 3. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 폐 조직학적 평가
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 및 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인하였다. 희생한 마우스에서 폐 조직을 적출하여 고정 및 탈수 후 파라핀에 embedding하여 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록은 4 μm 두께로 박편하여 슬라이드 글라스 위에 부착하고, hematoxylin과 eosin Y로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. OVA에 의해 천식이 유발됨에 따라 정상 마우스와 비교하여 폐 조직상에서 면역세포의 침윤이 증가한 것을 확인하였고, 흑미강 원물의 투여에 의해 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하여 천식에 의한 염증 발생이 완화되어 폐 조직 보호 효과가 있음을 확인하였다. 또한, BRB-F와 정제분획분말별 소재간의 폐 조직 내 염증 억제 효과 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 9에 나타내었다.
결과 4. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 Th2 사이토카인 조절 효과 조사: 항진된 Th2 면역반응 억제
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, 및 IL-13)의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, 흑미강 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 발효공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. BRB-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 BRB-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였으며, 40 mg/kg의 BRB-F를 투여한 경우 각각 50%, 46%, 53%의 억제 효과를 나타내었으며, 또한 BRB-F와 정제분획분말별 소재간의 Th2 cytokine 생성 억제 활성 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 10에 나타내었다.
결과 5. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 혈청 내 Th1 사이토카인 조절 효과 조사: 저하된 Th1 면역반응 회복
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 사이토카인(IL-2, IL-12) 및 IL-10의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, 흑미강 원물에서 약간의 회복 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 회복 효과를 확인하였다. BRB-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 BRB-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 BRB-F를 투여한 경우 각각 60%, 51%, 55%의 회복 효과를 나타내었으며, 또한 BRB-F와 정제분획분말별 소재간의 Th1 cytokines 및 IL-10 생성 회복 효과 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 앞선 결과와 함께 BRB-F 투여에 의해 Th2 cytokines의 발현은 억제시키고 Th1 cytokines의 발현은 회복시키는 효과가 있음을 확인하여 해당 소재가 Th1/Th2 면역반응 조절효과가 있음을 확인하였다. 상기 결과는 도 11에 나타내었다.
결과 6. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 염증매개물질 생성 억제 효능 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 기관지폐포세척액(BALF)을 회수한 후 BALF 내 존재하는 Eotaxin, VCAM-1, LTC4의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, 흑미강 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. BRB-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 BRB-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 BRB-F를 투여한 경우 각각 71%, 52%, 79%의 억제 효과를 나타내었으며, 또한 BRB-F와 정제분획분말별 소재간의 BALF 내 염증매개물질의 생성 억제 효과 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 12에 나타내었다.
결과 7. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효능 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 흑미강 원물, 흑미강발효분말(BRB-F) 및 BRB-F의 순차적 정제에 따른 정제분획분말(고액분리분획, 수용성분획, 다당체분획)을 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 IL-6, CXCL1의 양을 측정하였다. 2가지의 지표들을 확인한 결과, 흑미강 원물에서 약간의 억제 효과만 나타났으나, 생물전환공정을 통해 생산된 흑미강발효분말(BRB-F)에서 원물에 비해 대폭 향상된 억제 활성을 확인하였다. BRB-F의 정제분획분말은 회수율을 고려하여 BRB-F로써 40 mg/kg에 해당하는 투여량으로 투여하였다. 40 mg/kg의 BRB-F를 투여한 경우 각각 73%, 53%의 억제 효과를 나타내었으며, 또한 BRB-F와 정제분획분말별 소재간의 염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성 억제 활성 차이가 나타나지 않았기에 천식 마우스모델에서의 활성은 모두 BRB-F 유래의 다당체에 의한 효과인 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 13에 나타내었다.
결과 8. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 및 혈청 내 immunoglobulin 생성 억제 효능 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 BRB-F-S의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF와 혈액을 회수한 후 BALF 내 존재하는 OVA-specific IgE의 양과 혈청 내 존재하는 OVA-specific IgG, IgG1, IgG2a의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, BRB-F-S의 투여량이 증가함에 따라 immunoglobulin 생성 억제 활성이 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 64 mg/kg의 BRB-F-S(BRB-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 각각 68%, 71%, 81%, 55%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 14에 나타내었다.
결과 9. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 총 면역세포수 및 세포 population에 미치는 효과 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 BRB-F-S의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수하여 BALF 내 총 면역세포수 및 세포(lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage) population에 미치는 효과를 확인하였다. 총 면역세포수의 경우 OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, BRB-F-S의 투여농도가 증가함에 따라 BALF 내 총 면역세포수가 감소하여 침윤 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 64 mg/kg의 BRB-F-S(BRB-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 72%의 억제 효과를 나타내었다. BALF 내 존재하는 세포의 종류를 확인한 결과, BRB-F-S의 투여에 의해 농도(투여량) 의존적으로 lymphocyte, eosinophil, neutrophil, macrophage의 침윤을 억제시키는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 64 mg/kg의 BRB-F-S(BRB-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여하였을 때 각각 51%, 55%, 48%, 31%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 15에 나타내었다.
결과 10. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 폐 조직학적 평가
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 BRB-F-S의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 폐 조직 내 염증 완화 효과를 확인하였다. 희생한 마우스에서 폐 조직을 적출하여 고정 및 탈수 후 파라핀에 embedding하여 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록은 4 μm 두께로 박편하여 슬라이드 글라스 위에 부착하고, hematoxylin과 eosin Y로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. OVA에 의해 천식이 유발됨에 따라 정상 마우스와 비교하여 폐 조직상에서 면역세포의 침윤이 증가한 것을 확인하였고, BRB-F-S의 투여량이 증가함에 따라 농도(투여량) 의존적으로 폐 조직 내 면역세포의 침윤 억제 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 도 16에 나타내었다.
결과 11. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 Th2 사이토카인 생성 억제 효과 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 BRB-F-S의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Th2 cytokines (IL-4, IL-5, 및 IL-13)의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, BRB-F-S의 투여량이 증가함에 따라 Th2 cytokines 생성 억제 활성이 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 64 mg/kg의 BRB-F-S(BRB-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 각각 66%, 56%, 및 62%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 17에 나타내었다.
결과 12. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 Serum 내 Th1 사이토카인 및 IL-10 생성 회복 효과 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 BRB-F-S의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 혈액을 회수한 후 serum 내 존재하는 Th1 cytokines (IL-2, IL-12) 및 IL-10의 양을 측정하였다. 3가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 감소하는 경향을 확인하였으며, BRB-F-S의 투여량이 증가함에 따라 Th1 cytokines 및 IL-10 생성 회복 효과가 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 64 mg/kg의 BRB-F-S(BRB-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 각각 74%, 56%, 및 90%의 회복 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 18에 나타내었다.
결과 13. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 TSLP 생성 억제 효과 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 BRB-F-S의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 TSLP의 양을 측정하였다. 그 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, BRB-F-S의 투여량이 증가함에 따라 TSLP 생성 억제 활성이 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 64 mg/kg의 BRB-F-S(BRB-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 91%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 19에 나타내었다.
결과 14. OVA로 유발된 천식 마우스모델에서 BALF 내 염증매개물질 생성 억제 효과 조사
OVA에 의해 유발된 천식 마우스모델에서 농도(투여량) 의존성을 확인하기 위하여 BRB-F-S의 투여량을 달리하여 식이한 후 희생하여 BALF를 회수한 후 BALF 내 존재하는 Eotaxin, VCAM-1, LTC4, PGD2의 양을 측정하였다. 4가지의 지표들을 확인한 결과, OVA 유도에 의해 정상마우스 대비 증가하는 경향을 확인하였으며, BRB-F-S의 투여량이 증가함에 따라 BALF 내 염증매개물질의 생성 억제 효과가 농도(투여량) 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 최대 투여용량인 64 mg/kg의 BRB-F-S(BRB-F로써 160 mg/kg에 해당)를 투여한 경우 각각 79%, 83%, 78%, 및 93%의 억제 효과를 나타내었다. 상기 결과는 도 20에 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (14)
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- (a) 흑미강을 액상으로 배양배지화 하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상흑미강 배지에 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하는 생물전환 발효 공정을 수행하는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 섬유소 분해효소를 처리하는 생물전환 효소 처리공정을 수행하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 생물전환 효소 처리공정에 의해 생산된 효소물로부터 불용성 잔사를 제거하는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 불용성 잔사가 제거된 여과액 또는 상등액에서 지방구를 제거하는 단계; 및,
(f) 상기 (e)단계의 지방구 제거액에서 300,000 da이하의 저분자성 불순물을 제거하는 단계;를 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
- 삭제
- 제 9항에 있어서,
상기 (d) 단계에서의 불용성 잔사 제거는 10,000rpm으로 원심분리하거나, 또는 1㎛ 공극의 여과망을 통화시키는 방법으로 수행하는 것인, 제조방법.
- 제 9항에 있어서,
상기 (e) 단계에서의 지방구 제거는 유기용매를 이용하는 것인, 제조방법.
- 제 12항에 있어서,
상기 유기용매는 헥세인(Hexane), 아세트산에틸(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 및 디클로로메테인(Dichloromethane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
- 제 13항에 있어서,
상기 (e) 단계에서의 지방구 제거는 상기 (d)단계의 불용성 잔사가 제거된 여과액 또는 상등액에 상기 유기용매를 첨가 후 교반하여 지방구를 상분리하고, 이를 원심분리하여 지방구가 제거된 수용층을 수득하는 것인, 제조방법.
Priority Applications (2)
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| KR1020220159088A KR102642230B1 (ko) | 2022-11-24 | 2022-11-24 | 흑미강발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물 |
| PCT/KR2023/018952 WO2024112112A1 (ko) | 2022-11-24 | 2023-11-23 | 흑미강발효분말 정제분획을 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물 |
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| KR102152356B1 (ko) * | 2019-09-25 | 2020-09-04 | (주)에스티알바이오텍 | 생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 아토피질환 치료용 조성물 |
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Patent Citations (1)
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| KR102152356B1 (ko) * | 2019-09-25 | 2020-09-04 | (주)에스티알바이오텍 | 생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 아토피질환 치료용 조성물 |
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| Publication number | Publication date |
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| WO2024112112A1 (ko) | 2024-05-30 |
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