KR102152356B1 - 생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 아토피질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑미강을 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

Description

생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 아토피질환 치료용 조성물{A composition for treating atopic disease comprising a fermented product of black rice bran by bioconversion}

본 발명은 생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 아토피질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피피부염은 피부의 소양증, 건조증, 홍반성 습진을 특징으로 하는 난치성 면역질환으로 유전적 요인 및 환경적 영향이 주된 발병요인으로 증가추세에 있다. 2010년 질병관리본부의 조사에 따르면 우리나라 소아에서 지난 12개월간 가려운 발진이 있었던 아토피피부염 유병률은 초등학생이 20.6%, 중학생이 12.9%로 나타나 연령이 어릴수록 아토피피부염의 발병률이 높은 경향을 나타냈으며 2000년 조사 결과인 13.4%, 6.7%에 비해 질환 발병률이 크게 증가하는 추세로 나타났다. 1990년부터 2010년 사이 아프리카는 9.9%에서 20.9%, 유럽은 18.9%에서 19.6%로, 아시아권의 일본은 10.1%에서 13.6%로 증가하였다. 도시화로 인한 서구사회와 이주자 그룹에서 높은 유병률을 나타내고 동유럽에 비해 서유럽, 개도국에 비해 선진국에서 발생 빈도가 높다.

스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 피부보습제, 피부연화제 등이 모두 아토피피부염 치료에 사용되고 있으나 약리적인 치료방법으로 사용되는 약 중 경증 환자에 사용되는 대표적인 것은 국소 스테로이드제, 국소 칼시뉴린저해제 및 항히스타민제이며, 이중 항히스타민제는 가려움증 완화에 사용되나 그 효능이 높지 않아 큰 도움이 되지 못하고 있는 실정이다. 이에 따라 치료에는 주로 스테로이드제나, 칼시뉴린저해제와 같은 T세포 억제 면역조절제가 사용된다. 현재 경증 환자에 사용되는 국소 스테로이드제 및 중등증 이상의 환자에 사용되고 있는 대부분의 약들이 심각한 부작용을 나타내기 때문에 약물치료와 광선요법을 병용하여 치료효과를 높이고 부작용을 줄이려 하고 있다.

상기와 같이, 아토피피부염의 치료에 있어서 부작용을 줄이기 위한 노력의 일환으로 천연물 유래의 원료 및 제품 개발의 필요성이 대두되고 있다. 아토피성 피부 개선에 효과가 있다고 알려져 있는 천연물 유래의 기능성소재의 경우 대부분 비만세포 탈과립 억제 효과에 의존한다. 항히스타민제와 같은 효과가 기대되는 비만세포에서의 탈과립 억제는 아토피피부염 증상의 완화에 일정 부분 효과가 기대되기는 하나, 아토피피부염에서 항히스타민제는 가려움증의 완화를 위해서 사용될 뿐이며, 이 또한 효능이 높지 않아 가려움증 완화에 큰 도움이 되지 못하고 있는 실정인 점을 감안하면 비만세포에서의 탈과립 억제에 의한 효과는 크지 않을 것으로 사료된다.

지금까지 천연물 추출물을 유효성분으로 하는 아토피피부염 치료용 약학 조성물(KR 2018-0138265 및 KR 1898262) 등의 기술이 개발되었으나, 미생물(담자균류 균사)로 발효하거나, 추가로 효소 처리를 통해 생물전환된 흑미강발효물을 유효성분으로 하는 염증 또는 아토피피부염 치료제나 예방제에 대한 기술 개발은 미비한 실정이다.

따라서 본 발명은 담자균류 균사로 발효하거나, 추가로 효소 처리를 통해 생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 염증 및 아토피피부염 치료용 조성물 및 이의 효과에 대한 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 담자균류 균사로 발효하거나, 추가로 효소 처리를 통해 생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 염증 및 아토피피부염 치료용 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 담자균류란, 진균류의 한 아문으로 유성생식 한 결과로 담자기라는 세포가 되어 홀씨를 만드는 균류이다. 스스로 양분을 만들지 못하여 다른 생물체에 붙어 기생하며, 버섯으로 알려진 것이 많은데 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯 따위가 대표적이다. 성숙한 버섯의 갓주름 면에는 담자기가 빽빽이 생긴다. 담자균류 버섯의 대부분은 고등식물의 유체에서 부생적으로 생활하며, 특히 셀룰로오스와 리그닌을 분해하여 물질의 생물학적 순환에 없어서는 안 될 중요한 역할을 하지만, 또 수목의 뿌리에 균근을 형성하여 공동생활을 하는 것도 많다. 그밖에 식용균으로 중요시되거나 독버섯으로 주의를 해야 할 종류도 있다.

본 발명에서 균사란, 사상균(곰팡이)의 영양세포이다. 영양적 기능이나 생리적 기능 같은 기능 분화도 볼 수 있다. 형태적으로는 격벽의 유무가 분류에 사용되고 있으며, 포자의 발아관에서 발육하여 선단생장에 의해서 신장한다. 분지한 균사의 집단을 균사체(mycelium)라고 한다. 생리적 기능에 따라 배지나 기주의 표면 또는 내부에 들어가면서 신장하는 기저균사와 공기 중에서 신장하는 기생균사로 구별된다. 기생균사는 영양을 기저균사로부터의 이송에 의존하고 있으며, 그 일부는 포자 형성기관 등으로 분화한다. 유기물이 있고 적당한 습도와 온도 등 환경조건이 양호하면 여러 가지 균사조직을 형성한다. 자낭균류의 균사의 격막은 단순하지만 담자균류에서는 꺾쇠연결을 형성하는 것을 많이 볼 수 있다. 곰팡이류에서는 여러 갈래로 분지하여 실처럼 엉겨 있고, 버섯류에서는 집합하여 자실체를 만든다. 엽록소가 없어 광합성을 하지 못하고 기주생물에 붙어서 영양분을 흡수한다. 버섯인 담자균류의 경우, 포자에서 발아한 균사는 핵을 1개 가지고, 이것이 다른 균사와 융합하면 1개의 세포에 핵을 2개 가지게 된다. 핵을 1개 가진 균사를 1차 균사, 핵을 2개 가진 균사를 2차 균사라고 한다. 본 명세서에 있어서 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양받아 사용할 수 있다.

본 발명에서 흑미(Oryza sativa L.)는 안토시아닌계(anthocyanins) 및 폴리페놀계(polyphenols) 화합물 등의 기능성 성분을 풍부하게 함유하고 있는 쌀로서, 흑미는 영양성분으로 전분, 단백질, 지방산 등을 함유하고 있으며 앞서 설명한 안토시아닌 및 폴리페놀계 화합물 외에도 섬유소, 인체에 필수적인 무기질, 비타민 B군, 비타민 C, 니아신(niacin), 카로틴(carotene) 등이 함유되어 있어 식량의 개념보다도 건강식품의 개념으로 백미에 소량씩 혼합하여 밥으로 많이 섭취하고 있다. 흑미의 약용효과로는 안토시아닌계 색소성분 등에 의한 항산화 효과, 항암 효과, 항알레르기 효과, 항염증 효과, 항고지혈증 효과가 알려져, 최근에는 가공하여 기능성 식품으로도 개발되고 있다.

본 명세서에 있어서 흑미강은 흑미의 도정이나 제분시 제거되는 외피와 약간의 호분층을 포함하는 부산물을 의미한다.

본 발명에서 생물전환이란, 생물학적 방법을 통해 첨가된 물질의 구조적 변화를 유도하여 화학적으로 변형된 형태로 전환시켜 새로운 성분의 생성을 유도하는 것을 말한다.

본 발명에서 발효란, 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 발효라고 하는 것은 효소작용에 의해 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유에너지를 내놓는 현상이지만, 일반적으로는 미생물이 유기물의 분해과정을 통해 대사물을 축적하는 현상을 말한다. 즉, 효모가 당을 무산소적으로 분해해서 에틸알코올과 이산화탄소로 하는 알코올 발효, 락트산균이 당을 무산소적으로 분해해서 락트산으로 하는 락트산 발효 등이 전형적인 발효이지만, 현재는 아세트산균이 공기 중의 산소를 이용해서 알코올을 아세트산으로 산화시키는 현상, 곰팡이가 공기 중의 산소를 이용해서 글루코오스를 글루콘산으로 산화시키는 현상 등도 각각 아세트산 발효, 글루콘산 발효 등으로 부르고 있다. 또 이러한 것들을 혐기적 발효, 호기적 발효(산화 발효)로 나누어 논하기도 하고, 위에 언급한 것 외의 혐기적 발효로는 글리세롤 발효, 아세톤부탄올 발효, 2, 3-부틸렌글리콜 발효, 부티르산 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이, 또 호기적 발효로는 시트르산 발효, 이타콘산 발효, 숙신산 발효, 2-케토글루타르산 발효, 옥살산 발효, 푸마르산 발효, 소르보오스 발효 등이 있다. 이외에 미생물에 의한 아미노산, 비타민, 항생물질의 생산도 예를 들면 글루탐산 발효, 리보플라빈 발효, 페니실린 발효 등으로 불리는데, 그다지 좋은 호칭은 아니다. 발효작용명은 생산물로 부르는 것이 원칙이나, 때로는 셀룰로오스 발효, 펙틴 발효 등으로 기질의 이름을 붙이기도 한다.

본 발명에서 아토피피부염(atopic dermatitis)은 소양증, 건조증, 홍반성 습진을 특징으로 하는 만성염증 피부질환의 난치성 면역질환을 지칭한다. 아토피피부염은 유전적 요인, 환경적 요인 등이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있으며 피부장벽 이상, 면역학적 이상 등이 주요 발병요인으로 증가 추세에 있다. '아토피'와 '알레르기'라는 용어는 20세기 초부터 사용되기 시작했으며 그리스어에서 파생된 단어이다. 'atopy (아토피)'는 장소를 뜻하는 그리스어 'topos'에 반대의 뜻으로 사용되는 'a'를 앞에 붙여 장소 밖(out of place)의 의미를 가진 용어이다. 'allergy (알레르기)'라는 단어는 그리스어로 '다르다'는 뜻의 단어 'allos'와 '작동한다'는 뜻의 단어 'ergon'의 합성어이다. 정상적으로 받아들여야 하는 것들에 대하여 우리 신체가 비정상적으로 반응하는 경우, 즉 '변형된 반응'을 일컫는 단어로서 과민반응 (hypersensitivity)을 의미한다. 현재 이 두 가지 단어는 혼용되어 쓰이고 있다.

우리 몸은 외부에서 이물질이 침입하면 이로부터 자신을 보호하기 위해서 이물질을 제거하고 신체를 보호하기 위한 반응을 보이는데 이것을 면역반응이라고 한다. 이와는 달리 과민반응은 우리 몸에 해롭지 않은 것에 대해서도 면역반응을 보임으로써 오히려 조직을 파괴하여 유해한 방향으로 작동한다. 과민반응은 1형 과민반응, 2형 과민반응, 3형 과민반응, 4형 과민반응 등 크게 4가지로 나눌 수 있으며, 이중에서 1형 과민반응을 통상적으로 알레르기라고 한다. 1형 과민반응에 서는 외부에서 들어오는 이물질(혹은 '알레르겐'이라고 한다)에 대하여 면역글로불린-E(IgE)가 생성되고, 이 IgE가 알레르겐과 결합함으로써 두드러기, 기침, 콧물, 재채기, 호흡곤란 등의 증상이 나타나게 된다. 1형 과민반응은 즉시형 또는 IgE 매개형 과민반응이라고도 하는데, 그 이유는 알레르겐에 노출된 후 IgE의 매개에 의해 과민반응이 나타나고, 또한 과민반응이 나타나기까지의 기간이 매우 짧기 때문이다. 반면, 4형 과민반응은 알레르겐에 노출된 후 증상이 즉시 나타나지 않고 서서히 나타나게 되며 IgE의 생성이 없기 때문에 지연형 또는 세포 매개형 과민반응이라고도 부른다. 최근 알레르기의 기본 병리가 염증에 의해 발생한다는 것이 밝혀지면서 IgE와 상관없이 나타나는 경우도 알레르기에 포함하게 되었다. 결국 알레르기는 IgE와 관련이 있던 없던 간에 표적기관에 염증을 형성하는 과민반응으로 정의할 수 있다. 즉, 알레르기에는 IgE 의존성 알레르기과 함께 IgE 비의존성 알레르기가 포함된다.

본 발명에서 엄밀한 의미에서 '아토피'라는 용어는 외부로부터 신체 내로 들어오는 이물질에 대하여 비정상적으로 IgE를 생성하는 성향을 의미한다. 따라서 '아토피'라는 용어는 '알레르기'라는 용어와 의학적으로 동일하지는 않다. 그러나 실제적으로는 같은 의미로 혼용하고 있다. 즉 IgE 매개성 과민반응이 임상적으로 증상으로 발현되는 경우를 '아토피질환'이라 하며 혼용하여 '알레르기질환'으로 부르며, 전통적으로 아토피피부염, 천식, 알레르기비염, 알레르기결막염, 두드러기 등이 이러한 질환으로 분류되고 있다. 아토피질환은 IgE 의존성 (IgE 매개성) 알레르기 질환에 해당하며, IgE 비의존성 알레르기질환은 아토피질환에 해당하지 않는다. 또한 간혹 '아토피피부염'이라는 용어가 너무 길어서 짧게 '아토피'라는 말로 대신하는 경우가 있지만 상기한 바와 같이 '아토피피부염'과 '아토피'라는 용어의 정의는 의학적으로는 분명히 다르므로 정확한 용어를 사용하는 것이 필요하다.

본 발명에서 아토피피부염은 주로 영유아기에 발병되는 대표적인 난치성 질환으로 알려져 있으며 일반적으로 가려움(pruritus), 피부 건조, 염증을 동반한 아토피성 습진(eczema)을 말한다. 아토피피부염의 면역학적 기전으로는 Th2 면역반응의 항진과 함께 Th세포 중 Th1 과 Th2 면역반응의 불균형, cytokine 체계 이상(dysfunction), 랑겔한스세포의 활성 증가 등이 있다. 최근에는 Nograles 등에 의해 Th17 면역반응도 아토피피부염에 악영향을 미치는 것으로 보고되었다.

IgE 의존성 알레르기반응의 공통적인 기전은 ①알레르기를 유발하는 알레르기항원(외부항원)이 우리 몸에 들어와 항원특이 Th2세포의 활성화가 이루어지고, ②활성화된 Th2세포가 분비하는 사이토카인에 의해 B세포가 IgE 항체 생성 B세포로 전환되어 IgE 항체 생성이 유도되어 분비되면, ③분비된 IgE 항체가 비만세포(mast cell)와 결합하여 비만세포의 감작이 유도되고, ④이때 재차 외부에서 들어온 알레르기항원이 비만세포 표면에 결합된 IgE와 결합하면서 비만세포가 활성화되어 히스타민과 같은 여러가지 화학적 알레르기 매개물질을 분비하면서 알레르기 증상이 나타나게 된다.

이 중 아토피피부염에서 Th2 사이토카인이 분비되기까지의 과정을 더 자세히 설명하면 7단계로 나눌 수가 있다. 알러젠이나 바이러스 등에 의한 피부의 각질형성세포, 섬유아세포, 비만세포, 및 수지상세포에서 TSLP를 생성하고(1단계), TSLP는 미성숙 수지상세포를 활성화시키고(2단계), TSLP에 의해 활성화된 미성숙 수지상세포는 케모카인 IL-8과 에오탁신-2를 분비하고 이것이 호산구와 호중구를 끌어들일 뿐만 아니라, 또한 TARC(thymus and activation-regulated chemokine)와 MDC(macrophage-derived chemokine)를 분비하여 Th2세포들을 병변 부위로 끌어들인다(3단계). TSLP에 의해 활성화된 골수계수지상세포(mDC)는 성숙해지고 림프절로 이동하게 된다(4단계). TSLP에 의해 활성화된 성숙 수지상세포는 OX40L을 표면에 발현하고, 이것은 림프절에서 항원에 특이적인 naive CD4+ T세포가 염증성 Th2세포가 되도록 촉진시킨다. Th2세포들은 IL-4, IL-5, IL-13 과 TNF를 생산하지만 IL-10을 생산하지는 않는다(5단계). 병변의 염증부위에서는 TARC와 MDC가 생성되기 때문에 염증성 Th2세포는 다시 병변 부위인 염증이 일어나는 곳으로 이동하게 된다(6단계). 염증부위에서는 염증성 Th2세포에 의해서 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13과 TNF가 생성되며, 이 사이토카인은 IgE 생성과 호산구 증가와 점액물질의 생성을 촉진한다(7단계).

아토피피부염 환자가 가려움증으로 인해 피부를 긁거나 혹은 알러젠에 노출되면 피부의 각질형성세포에서 TSLP가 분비되며 이렇게 분비된 TSLP는 랑게르한스세포에 영향을 주면서 결과적으로 활성화된 염증성 Th2 세포에서 Th2 사이토카인을 분비시키는 것으로 알려져 있다.

면역학적 관점에서 아토피피부염은 Th2 면역반응의 항진과 함께 Th1/Th2 라는 특정 면역반응의 균형이 깨지면서 발생하는 질환이다. 이때 중요한 역할을 하는 것이 TSLP(흉선기질림포포이에틴, Thymic stromal lymphopoietin)인데, 아토피피부염 발생단계에서 피부각질세포 등에서 TSLP가 분비되어 naive Th0세포를 Th2세포로 분화시킴으로써 Th2 면역반응을 일으키게 되는데, TSLP가 과도하게 분비되게 되면 이로 인해 Th2 면역반응의 항진과 함께 Th1/Th2 균형이 무너지면서 아토피피부염이 진행되거나 악화되는 것이다. 면역학적 관점에서 볼 때 아토피피부염의 치료는 TSLP의 생성을 억제하여 Th2 면역반응을 감소시켜 Th1/Th2 면역반응의 균형을 회복시킬 필요가 있다.

TSLP은 주로 피부의 각질형성세포와 기도 및 비점막의 상피세포에서 주로 만들어지며 미성숙 골수계수지상세포(mDC)를 자극하는데, 이는 상기의 미성숙 수지상세포가 성숙 수지상세포로 되기 위해 heterodimeric TSLP receptor(수용체)를 발현한다. TSLP-activated 수지상세포는 naive CD4+ T cells를 Th2 표현형으로 분화시키고, Th2 chemotactic cytokine인 TARC(CCL17) 및 MDC(CCL22)와 함께 costimulatory molecule인 OX40 ligand를 발현하여 Th2 기억세포의 증식을 촉진시킨다. 뿐만 아니라 TSLP는 수지상세포에 발현되는 IL-12 p40 수용체를 억제하고, Th1 면역반응을 억제하여 더욱 더 Th2 면역반응을 촉진한다. TSLP는 Th2 세포에서의 IL-4 유전자의 전사를 활성화시키고, 비만세포에서 IL-13의 생성을 촉진시키며, 호염구의 반응을 증대시켜 호산구를 침윤시킴으로써 알레르기 염증반응을 악화시킨다. 그러므로 TSLP는 아토피피부염 시작에 핵심적인 역할을 한다. TSLP는 아토피피부염 환자의 상피세포에서 발현된다. 또한, 마우스에서 피부 각질형성세포에서의 TSLP 과발현은 감작된 흡입항원에 대한 염증반응을 증폭시킨다.

아토피피부염은 심한 가려움증이 가장 특징적인 증상으로 이를 완화시켜 주는 것이 삶의 질 향상과 피부병변의 악화를 막을 수 있는 효과적인 방법이다. 아토피피부염의 가려움증이 증폭되는 기전을 간략히 정리하면, 외부자극이 손상된 피부장벽을 뚫고 피부에 도달하면, 알레르기 염증반응이 유발되고, 그 결과 발생한 가려움증이 '가려움증 → 긁기 → 염증 → (다시) → 가려움증 → 긁기 → 염증 → ……'의 악순환을 통해 걷잡을 수 없이 증폭되는 것이다.

아토피피부염에서 피부염증으로부터 가려움증에 이르는 기전은 아직까지 완전히 밝혀지지 않았지만 염증반응에 의해 생성되어 가려움증을 야기하는 여러 매개체 중 Interleukin-31(IL-31)이 가려움증과 밀접한 연관이 있는 주된 요인으로 보고 있다. IL-31은 주로 Th2세포에 의해 생성되며, 감각 신경(Sensory nerve) 및 피부 각질형성세포 등에 발현되어 있는 IL-31 수용체와의 결합을 통해 신호를 보내게 되는데, 이때 IL-31은 Sensory nerve의 IL-31 수용체와 결합하여 가려움증을 유도하고, 또한 각질형성세포의 IL-31 수용체와 결합하여 TARC(CCL17), MDC(CCL22), S100A7, β-defensin2의 발현을 증가시키고, filaggrin, corneodesmosin의 발현을 억제함으로써 아토피피부염에서 나타나는 피부병변을 악화시키게 된다.

중증의 아토피피부염 환자를 비롯하여 많은 아토피피부염 환자들(약 90%)의 피부에 S. aureus 균이 증식하고 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 Th2 사이토카인들이 S. aureus를 증식하기에 좋은 조건을 만든다고 알려져 있으며, 반대로 S. aureus는 Th2 사이토카인의 분비를 촉진시킨다고 알려져 있다.

Th2 사이토카인은 S. aureus 알파톡신에 의한 각질형성세포의 사멸을 촉진한다고 알려져 있으며, 델타톡신은 IgE의 생성을 촉진하고 Th2 사이토카인의 효과를 증가시킨다고 알려져 있다. 또한 Superantigen으로 알려진 Staphylococcal enterotoxin B는 비만세포에서의 탈과립 증가 및 IgE 항체의 분비를 촉진하고, Th2 사이토카인의 분비를 촉진시켜 병변을 악화시킨다고 알려져 있다. 뿐만 아니라 S. aureus의 Peptidoglycan는 마우스에서 Th2 면역반응을 유도할 수 있다고 알려져 있다. 이는 Peptidoglycan이 TLR2의 리간드라는 것과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한 각질형성세포에서의 TSLP 생성이 S. aureus의 membrane과 diacylated lipopeptide에 의한 TLR2 및 TLR6의 pathway를 통해 유도된다는 것도 보고되어 있다.

결론적으로 Th2 사이토카인은 S. aureus의 증식을 도와주고, 반면에 S. aureus는 TSLP 및 Th2 사이토카인을 유도할 수 있어, S. aureus가 아토피피부염을 악화시킬 수 있다는 점이다.

이를 극복하기 위해서 임상가이드라인에서는 2차 감염 치료에서 항생제 등의 사용을 권하고 있으며, 특히 본 특허에서 제시하는 소재가 TLR4 아고니스트(agonist), LPS 경쟁적 저해제(competitive inhibitor)의 Th1 어쥬번트(adjuvant)로서 Class II 항생제 어쥬번트로 사용될 수 있다는 점에서 아토피피부염에 추가적인 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

한국 아토피피부염 치료 가이드라인(2015)에 따른 치료의 가이드라인은 아래와 같다.

아토피피부염은 경증 환자와 중등증/중증 환자의 치료방법이 구분되어 있다. 경증 환자의 경우는 증상이 악화되도 중등증 이상으로 진행되지 않지만, 중등증 환자는 악화되면 중증으로 진행되기 때문이다.

아토피피부염 환자는 증상과 상관없이 기본치료로 보습제의 사용 및 악화인자의 회피, 환자교육을 받아야 한다. 경증 아토피피부염 환자의 피부 병변에는 국소 스테로이드제 및 국소 칼시뉴린억제제 등의 국소 항염치료가 병변을 소실시키기 위한 적극치료로 사용되어야 하며, 가려움증을 호소하는 경우 항히스타민제를 사용한다. 참고로 일반 염증과는 달리 일반 비스테로이드성 소염제는 기본 치료로 사용되지 않는다.

중등증 이상의 환자는 경증 환자의 치료제를 포함하여, 적극치료로 전신치료제가 반드시 사용되어야 한다. 또한, 중등증, 중증 아토피피부염의 경우 전신치료에 있어서 “사이클로스포린, 단기 전신스테로이드제, 기타 전신면역조절제(AXA, MMF, MTX, IFN-γ, Alitretinoin), 광선치료, 항원특이면역치료, 생물학적 제제"를 사용한다. 또한 중등증 이상 피부염이 악화될 때는 습포치료와 항생제를 사용할 수도 있다.

증상이 사라진 이후에는 유지를 위해서 주 2~3회 국소 칼시뉴린억제제 또는 국소 스테로이드제를 도포하고, 재발을 방지하기 위하여 유지(proactive)치료를 권장한다. 그 이외에 아직 효과가 뚜렷하게 증명되지는 않았지만 보조치료로 달맞이꽃종자유, 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스, 비타민 D를 사용할 수 있다.

아토피피부염 대부분의 증상이 피부에 나타나기 때문에 단순 피부질환으로 오해할 수 있지만, 아토피피부염은 피부장벽 이상뿐 아니라 과도하게 활성화된 면역계 기능 이상으로 기저 염증이 지속적으로 재발하는 게 원인으로 아토피피부염은 염증으로 분류될 수는 있지만, 일반적인 염증과는 다르기 때문에 염증질병에서 흔히 사용하는 비스테로이드성 소염제는 거의 치료제로 사용되지 않는다.

따라서, 아토피피부염 질환 치료에 있어서 무엇보다 염증이 아닌 Th2 면역과민반응을 치료하는 것이 장기적으로 우수한 효과를 보인다. 그러므로 아토피피부염을 치료하기 위한 방법은 엄밀히 말하면 염증 억제가 아닌 Th2 면역과민반응 억제 등 면역반응의 방향을 바꾸는 것이라 할 수 있다.

본 발명에서 아토피피부염(atopic dermatitis)은 가려움증을 주된 증상으로 하는 만성적인 염증성 피부질환 중 하나로, 주로 유아기 또는 소아기에 시작되어 가려움, 피부건조증, 피부 병변, 태선화, 아토피성 습진, 홍반 및 염증 등을 동반한다. 아토피피부염에서 파생되는 증상들은 만성 재발성으로 경과되는 특징이 있어 환자에게 지속적인 정신적, 신체적 고통을 수반한다. 아토피피부염의 치료제로는 현재 스테로이드제, 칼시뉴린억제제, 항히스타민제, 면역조절제, 인터페론-감마 등이 사용되고 있으며, 이중 상기 스테로이드제는 빠른 호전을 보이는 장점으로 인해 아토피피부염의 치료제로 가장 널리 사용되고 있으나 사용을 줄이거나 끊게 되면 증상이 급격히 악화되고, 또한 쿠싱증후군 등을 포함한 각종 심각한 부작용의 위험이 있는 단점이 있다. 이와 같은 스테로이드제의 단점으로 인해 스테로이드제를 대체하여 칼시뉴린억제제, 면역조절제, 인터페론-감마 등이 사용되는 추세이나, 상기 면역조절제는 피부가 화끈거리거나 고혈압, 신기능 장애 등의 부작용의 위험이 있으며, 또한 상기 항히스타민제는 졸음 및 입이 마르는 등의 증상을 동반하며, 상기 인터페론-감마를 주사하는 경우에는 그 치료효과가 수주일 후에 나타나 즉각적인 증상완화 효과를 기대할 수 없는 단점이 있다. 이러한 종래의 화학조성물에 의한 아토피피부염 증상 완화제의 단점을 보완하여 장기적으로 사용하더라도 부작용이 없고, 효과적으로 아토피피부염 증상을 예방, 완화 또는 치료할 수 있는 것으로 자연(특히, 식물)에서 추출한 천연물질을 이용한 아토피성 피부질환 치료제가 각광을 받고 있다.

또한 아토피피부염의 경우 치료에 스테로이드성 소염제, 면역억제제, 항히스타민제 외에 필요시 이차감염치료제 등이 사용되고 있으나, 면역 과민성 자체는 개선시키지 못하고 부작용이 심각하여, 장기간의 반복적인 사용에 어려움이 있다. 따라서 피부외용제가 주로 사용되는 경증 치료 및 유지치료에 있어서 몸 안에서 발생한 Th2 면역과민반응을 억제할 수 있는 적당한 경구용 전신치료제가 없는 현실에서, 약물치료와 광선요법을 병행하여 치료효과를 높이고 부작용을 줄이려 노력하고 있으며 또한 아토피피부염의 개선에 도움이 될 수 있다고 알려진 프로바이오틱스(유산균) 등의 건강기능식품 섭취도 이루어지고 있다.

이를 종합하면 현재까지는 면역반응을 억제하는 기전을 가지고 있는 거의 모든 제품의 차이점은 스테로이드제가 가장 광범위하게 면역을 억제하고, 반면에 최근의 제품들은 좁은 범위의 면역만 억제하는 것이 특징이다. 하지만 질병의 진행을 변화시킬 정도의 항진된 Th2 면역반응과 함께 Th1/Th2 불균형을 해결하는 제품은 아직까지 없다고 할 수 있다.

본 발명은 이러한 항진된 Th2 면역반응과 함께 Th1/Th2 불균형을 해결할 수 있는 Th1 어쥬번트를 함유한 것으로써, 담자균류 균사로 발효하거나, 추가로 효소 처리를 통해 생물전환된 흑미강발효물을 포함하는 아토피피부염 치료용 조성물 및 이의 효과에 대한 것이다.

본 발명에서 IgE란, 면역글로불린 E라고도 불리는 항체 단백질이다. 알레르기반응에서 중요한 역할을 하므로 종종 "알레르기 항체"라고도 한다. 특정물질(알레르겐)에 알레르기반응을 보이는 경우, 면역체계가 일반적으로 무해한 물질을 몸에 유해하다고 잘못 판단하는데, 이런 특정한 물질에 노출되면 면역체계는 우리 몸을 보호하기 위해 IgE를 생산하기 시작한다. IgE 항체는 몸 안에 남아있다가 다음에 알레르겐 물질과 다시 접촉하면 알레르기반응을 일으킨다. 결과적으로 알레르기가 있는 사람은 혈중 IgE 농도가 증가하며, IgE는 각 알레르겐에 특이도를 나타낸다.

본 발명에서 약학 조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학 조성물은 염증활성 물질의 억제를 위해 사용되는 것이며, 이를 위한 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 약학 조성물에 상응하는 유효성분을 0.1 내지 100 중량%로 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에서 식품 조성물이란, 아토피피부염 질환의 개선을 위한 식품 조성물로 다양하게 이용되는 것으로서, 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연식품인 흑미강 및 이의 생물전환된 발효물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 100%의 비율로 첨가할 수 있다. 여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다. 그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 100 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에서 화장료 조성물이란, 아토피성 피부상태 또는 아토피성 피부질환의 개선을 위한 조성물이다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜워시, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다. 상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다. 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸알콜, 옥틸도데칸올, 올레일알콜, 판텐올, 라놀린알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다. 그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명에서, 아밀라아제 계열의 가수분해효소는 다당류의 α-글리코시드 결합을 우선적으로 가수분해하여 저분자량의 탄수화물/당 절편을 생성하는 효소 계열로서, α-아밀라아제, β-아밀라아제 및 γ-아밀라아제를 들 수 있다. 본 발명에서, 셀룰라아제 계열의 가수분해효소는 나무껍질, 근피, 뿌리, 잎 등을 분해할 수 있는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 또는 글루카나아제를 포함할 수 있다. 시판품인 셀룰라아제 제제로서는, 예를 들면 셀룰라아제 T「아마노」, 셀룰라아제 A「아마노」[이상 아마노 엔자임 가부시키가이샤(Amano Enzyme inc.）제조], 트리세라아제 KSM, 멀티팩트 A40, 셀룰라아제 GC220[이상 제넨코아 쿄와 가부시키가이샤 제조], 셀룰라아제 GODO-TCL, 셀룰라아제 GODO TCD-H, 벳세렉스, 셀룰라아제 GODO-ACD[이상 고도슈세이 가부시키가이샤(GODO SHUSEI CO., LTD.）제조]), Cellulase[토요보세키 가부시키가이샤(Toyobo Co., Ltd.) 제조], 셀라이저, 셀룰라아제 XL-522[이상 나가세 켐텍스 가부시키가이샤(Nagase ChemteX Corporation) 제조], 셀소프트, 데니맥스[이상 노보자임즈사(Novozymes A/S) 제조], 셀룰로신 AC40, 셀룰로신 AL, 셀룰로신 T2[이상 에이치비아이 가부시키가이샤(HBI enzymes Inc.) 제조], 셀룰라아제 "오노즈카" 3S, 셀룰라아제 Y-NC[이상 야쿠르트 야쿠힌 코교 가부시키가이샤(Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) 제조], 스미팀 AC, 스미팀 C[이상 신니혼 가가쿠 코교 가부시키가이샤(SHINNIHON CHEMICALS Corporation) 제조], 엔티론 CM, 엔티론 MCH, 바이오히트[이상 라쿠토 가세이 코교 가부시키가이샤(Rakuto Kasei Industrial CO., LTD.) 제조] 등을 들 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명은 흑미강을 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 염증은 아토피피부염일 수 있다.

본 발명에서 상기 배양배지화는 흑미강을 분말화하여 액상에서 흑미강 분말을 가수분해효소로 처리한 후 살균하여 흑미강 배지로 만드는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나일 수 있으며 또한 필요에 따라 셀룰라아제 계열의 가수분해효소를 추가로 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 또는 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물일 수 있다.

본 발명에서, 상기 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어질 수 있다.

본 발명의 조성물은 염증 부위에서의 IL-4, IL-5, IL-13, TSLP(흉선기질림포포이에틴, Thymic stromal lymphopoietin), 또는 IL-31의 발현량을 감소시키거나 염증 부위에서의 IFN-γ의 발현량을 증가시키거나, 비장 내에서 IL-2, IL-12, 또는 IFN-γ의 발현량을 증가시키거나, 혈청 내에서 IL-1β, IL-4, IL-6, 또는 IgE의 양을 감소시키거나, 갈렉틴-9(galectin-9)의 양을 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 제공하는 조성물은 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, (a) 흑미강을 액상으로 배양배지화 하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상흑미강 배지에 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하는 생물전환 발효공정을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 섬유소 분해효소를 처리하는 생물전환 효소처리공정을 수행하는 단계를 포함하는, 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 (a) 단계의 흑미강의 배양배지화는 흑미강을 분말화하여 액상에서 흑미강 분말을 가수분해효소로 처리한 후 흑미강 배지로 만드는 것일 수 있다. 여기서, 가수분해효소를 처리한 후 필요에 따라 살균 또는 멸균을 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 (a) 단계의 상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나일 수 있으며, 또한 필요에 따라 셀룰라아제 계열의 가수분해효소를 추가로 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 (b) 단계의 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 상기 단자균류 균사는 2%(v/v) 내지 18%(v/v), 바람직하게는 5%(v/v) 내지 15%(v/v), 보다 바람직하게는 7%(v/v) 내지 13%(v/v)의 양으로 접종할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 (b) 단계의 배양 발효 시 온도는 28~30℃ 및 pH 4.5~7의 조건에서 수행하여, 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상흑미강배지를 첨가하는 유가식 공정으로 7~10일간 배양하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 (c) 단계의 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제 및 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물일 수 있고, 구체적인 예로는 섬유소 분해효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소 분해효소인 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 섬유소분해효소는 0.01%(v/v) 내지 1%(v/v), 바람직하게는 0.01%(v/v) 내지 0.1%(v/v)의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 필요에 따라 아밀라아제 계열의 가수분해효소를 추가로 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 (c) 단계의 생물전환 효소처리공정은 50~60℃의 온도 조건 하에서 1~3시간 동안 교반시키며 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 (d) 단계의 흑미강 생물전환산물은 아토피피부염 병변 부위에서의 IL-4, IL-5, IL-13, TSLP(흉선기질림포포이에틴, Thymic stromal lymphopoietin), 또는 IL-31의 발현량을 감소시키거나, IFN-γ의 발현량을 증가시키거나, 비장 내에서 IL-2, IL-12 또는 IFN-γ의 발현량을 증가시키거나, 혈청 내에서 IL-1β, IL-4, IL-6, 또는 IgE의 양을 감소시키거나 갈렉틴-9(galectin-9)의 양을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 흑미강을 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 염증은 아토피피부염일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 흑미강을 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 염증의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 염증은 아토피피부염일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 생물전환된 흑미강발효물은, 미생물(담자균류 균사)로 발효하거나, 추가로 효소 처리를 통해 발효되지 않은 흑미강 추출물(흑미강 원물)에 비하여 아토피피부염 개선, 예방, 또는 치료 물질을 많이 함유하고 있으므로, 이를 이용하여 식품 등으로 개발 시 아토피피부염 발생을 저감시킬 수 있는 효과가 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강의 배양배지화, 생물전환공정 및 발효분말 수득 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 생물전환된 흑미강발효물의 대식세포에서의 사이토카인 분비능 평가를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR4의 선택적 억제제인 TAK242를 함께 처리한 결과 생물전환된 흑미강발효물의 활성이 완벽하게 억제되는 것과, 흑미강 발효물 내의 면역활성 유효성분이 다당체 분획물인 것을 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, LPS와 동시 처리 시 LPS에 의한 호중구 침윤을 억제하는 것을 확인한 그래프이다. 도 4의 (a)는 LPS 복강투여에 따른 복강내 호중구 침윤 유도능을 평가하였다. 도 4의 (b)는 생물전환된 흑미강발효물 다당체분획물의 호중구 침윤 유도능 및 항LPS 효능을 평가하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, in vitro 모델에서의 항아토피피부염 효능을 평가한 그래프이다. 도 5의 (a)는 LPS와 IL-4로 활성화된 B세포(U266.B1 세포주)에서 IgE 항체 생성 억제에 대한 활성을 나타내는 그래프이다. 도 5의 (b)는 비만세포(RBL-2H3 세포주)에서의 β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 생성 억제에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 예방 효과를 확인하기 위해 DNCB/진드기류 추출물에 의해 유도된 아토피피부염 동물모델에서 혈액에서 IgE 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 예방 효과를 확인하기 위해 DNCB/진드기류 추출물에 의해 유도된 아토피피부염 동물모델에서 효능을 평가한 그래프이다. 도 7의 (a)는 귀 두께를 측정한 그래프이다. 도 7의 (b)는 귀 조직 H&E 염색을 통한 염증 억제 효과를 확인하는 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 예방 효과를 확인하기 위해 Th1/Th2 사이토카인 조절 효과를 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 예방 효과를 확인하기 위해 귀 조직 내 사이토카인 발현량을 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 예방 효과를 확인하기 위해 혈청 내 사이토카인 발현량을 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 확인하기 위해 아토피피부염 동물모델에서 병변조직 내 IL-4, IL-5, 또는 IL-13의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 확인하기 위해 아토피피부염 동물모델에서 비장 내 IL-2, IL-12, 또는 IFN-γ의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 확인하기 위해 아토피피부염 동물모델에서 혈액에서 IgE 농도와 함께 병변부위인 귀 두께, 귀 조직 내 TSLP 및 IL-31의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 확인하기 위해 아토피피부염 동물모델에서 혈청 내 갈렉틴-9의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 발효 및 효소 처리의 생물전환공정

실시예 1-1. 흑미 전처리 및 흑미강 수득 작업

구입한 흑미의 원물로부터 도정하여 흑미강을 수득하기까지의 전처리 작업을 위하여 원재료 상태의 곰팡이 오염도를 측정한 후, 흑미 원재료의 이물 및 오염물 제거를 위한 수세작업을 하였다. 수세작업은 총 3단계를 거쳐 수행하였으며 ①이물 및 곰팡이 포자를 제거하기 위한 공기 세척 단계, ②잔류 농약 등의 제거를 위한 물 세척 단계, ③미생물 등의 오염을 제거하기 위한 알코올(Et-OH) 세척 단계를 통해 원재료의 수세작업을 수행하였다. 세척작업을 마친 원재료는 건조작업을 수행한 후 도정공정을 거쳐 흑미강 수득 작업을 수행하였다.

실시예 1-2. 흑미강의 발효분말 수득

이물 및 곰팡이 오염을 제거한 흑미강분말은 액상 배양배지화를 위해 물을 첨가한 후 효소 처리 및 열처리 살균공정을 수행하였다. 아밀라아제(amylase) 계열의 가수분해효소를 사용하였고, 상기 효소를 첨가 후 60℃에서 1시간 반응시키고, 고온에서 30분간 살균 처리하여 흑미강의 배양(발효)배지화를 수행하였다. 이 때, 상업적으로 판매되고 있는 효소 제품을 사용할 수 있으며 이 경우 제품설명서에서 제시하는 적정량 및 적정 조건(pH, 온도)에서 실시하였다.

이후, 상기 배양(발효)배지에 별도로 배양한 담자균류 균사 중 표고버섯균사를 첨가하였다. 담자균류 균사 종균배양액을 10%(v/v) 접종하고 28~30℃ 및 pH 4.5~7의 조건에서 배양하였다. 또한 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상 흑미강 배지를 첨가하는 유가식 배양공정으로 7~10일간 배양할 수 있다. 상기의 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으나 표고버섯균사가 바람직하며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 또한, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양 받아 사용할 수 있다.

상기 발효물에 대한 생물전환공정의 효소처리는 섬유소분해효소 중 셀룰라아제를 사용하였다. 이때, 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 효소제가 함께 포함된 상업적으로 판매되고 있는 효소 제품을 사용할 수 있다. 이 경우, 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량)을 첨가하여 실시하였다. 효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소분해효소인 라미넥스(Laminex:Tricoderma reesei 유래 복합물), 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물) 등의 섬유소분해효소에서 어느 하나 또는 복수를 선택하여 사용할 수 있으나 라미넥스가 바람직하며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 라미넥스 효소제의 제품설명서에서 제시하는 추천 농도(0.05%)로 첨가하고, 50~60℃조건에서 1~3시간 동안 250 rpm으로 회전시키며 효소/기질반응을 수행하였다.

생물전환공정에 의해 생산된 흑미강발효물은 90℃, 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 면역활성 효능을 가지는 흑미강발효물의 분말을 20배의 물에 녹인 용해액 또는 흑미강발효물 발효액을 10,000rpm, 30분간 원심분리하여 불용성 잔사를 제거하고, 상등액을 동결 건조하여 수용성분말로 수득하거나 혹은 상등액에 5배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 이상 침전을 유도하고 침전물을 동결건조하여 면역활성을 갖는 고분자성 다당체분획의 분말을 수득하였다. 상기의 흑미강의 배양(발효)배지화, 생물전환공정 및 발효분말 수득 과정을 도 1에 기재하였다.

실시예 2. 생물전환된 흑미강발효물의 체외(in vitro) 효능 평가

세포배양.

실험에 사용한 RAW264.7 세포주와, RBL-2H3 세포주, U266.B1 세포주는 ATCC (Manassas, VA)에서 구입하였고, HMC-1.2 세포주는 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. DMEM, RPMI1640, IMDM 배지는 웰진 (Gyeongsan, Korea)에서 구입하여 사용하였고, fetal bovine serum (FBS) 및 배지에 첨가하는 항생물질은 모두 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)에서 구입하여 사용하였으며, 5% CO₂를 함유하는 37℃ 포화습도 공기조건에서 배양하였다.

RAW264.7 세포주에서의 사이토카인 측정.

RAW264.7 세포주를 96 웰 플레이트에 2x10⁵개 세포/웰로 접종한 뒤 하룻밤 배양하고, 각 시료를 농도에 맞게 희석하여 처리하였다. 24시간 뒤, 상층액 100 ㎕를 회수하고 동량의 Griess solution을 첨가하여 15분간 방치한 후 570 nm의 흡광도를 측정하였다.

RBL-2H3 세포주에서의 β-헥소사미니다아제 분석 및 세포독성 측정.

RBL-2H3 세포주를 96 웰 플레이트에 1x10⁵개 세포/웰로 접종한 뒤 하룻밤 배양하고, 각 시료를 농도에 맞게 타이로드 완충액(tyroid buffer)(10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5.6 mM 글루코스, 0.1% BSA, pH 7.2)에 희석하여 15분간 처리하였다. 타이로드 완충액를 이용하여 3회 세척한 뒤, 10 μM의 A23187을 20분간 처리하여 탈과립을 유도하였다. 이후 상층액 50 ㎕를 취하여 동량의 1 mM p-니트로페닐-N-아세틸-β-글루코사미니드 용액 (pH 5.2)과 섞어 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후에 1M 탄산 나트륨 완충액 (pH 10.2) 200 ㎕를 넣어 반응을 종결시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 β-헥소사미니다아제의 활성을 확인하였다. 세포독성의 측정을 위하여, 상층액을 취하고 남은 세포에 0.5 mg/mL의 MTT 용액을 처리한 뒤 37℃에서 3시간 반응하였다. 이후, 상층액을 제거하고 200 ㎕의 DMSO를 넣어 포르마잔 결정(formazan crystal)을 완전히 용해시킨 뒤, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.

U266.B1 세포주에서의 IgE 측정.

U266.B1 세포주를 96 웰 플레이트에 1x10⁶개 세포/웰의 농도로 접종하고, 10 ㎍/㎖의 LPS와 5 ng/㎖의 IL-4, 농도별 시료를 처리하여 72시간 배양하였다. 이후, 상층액 50 ㎕를 취하고 사람 IgE ELISA 키트 (Bethyl, Montgomery, TX)를 이용하여 IgE의 생성량을 측정하였다.

결과 1. 생물전환된 흑미강발효물의 TLR4 작용제 입증

흑미강원물과 본 발명에 따른 생물전환된 흑미강발효물의 대식세포 활성화 효과를 확인하기 위하여, RAW264.7 세포주에 개발소재를 농도별로 처리하여 TNF-a, IL-6, IFN-β의 발현량을 ELISA 방법으로 확인하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 생물전화된 흑미강발효물 처리 시 양성대조군으로 사용한 LPS와 유사한 패턴의 사이토카인 발현 증가를 보였으며, 흑미강원물과 비교하여 최소 10배 이상의 활성 증가가 나타나는 것을 확인하였다(도 2 참조).

결과 2. 생물전환된 흑미강발효물 내의 유효성분 입증

흑미강발효분말의 선천성 면역활성 효능을 확인하기 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포에서의 사이토카인 분비능 및 분비패턴을 조사하였으며, 분비패턴을 통해 작용부위(특이수용체, specific receptor)를 유추하고, 이를 확인하기 위하여 유추된 특이수용체에 대한 억제제를 처리하여 신호전달이 차단되는지를 확인함으로써 작용부위를 확인하였다.

사이토카인 분비패턴을 조사한 결과, LPS와 동일하게 TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 분비되고, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-12p70 및 IFN-α는 분비되지 않음을 확인할 수 있었다. LPS는 TLR4에 의해 인식되는 대표적인 리간드로 잘 알려져 있는 바, 이를 통해 흑미강발효분말은 TLR4에 인식되어 신호를 매개할 것이라 유추할 수 있었다.

흑미강발효분말의 처리가 대식세포주에서 4가지 사이토카인의 생산을 효과적으로 유도함에 따라, 흑미강발효분말 내 유효성분을 확인하고자 하였다(도 3 참조). 흑미강발효분말 내 다당체분획물을 분리·정제하고 대식세포주에 처리하여 4가지 사이토카인의 발현량을 측정하였으며, 다당체분획물의 회수율을 고려하여 흑미강발효분말의 1/20 농도로 처리하였다. 그 결과, 다당체분획물만 처리하였을 경우에도 흑미강발효분말을 처리한 것과 유사한 수준의 사이토카인이 생성되어 흑미강발효분말의 유효성분은 다당체인 것으로 확인되었다.

또한, TLR4의 특이성 억제제인 TAK242를 함께 처리하여 사이토카인의 양을 측정한 결과, TAK242 처리 시 흑미강발효분말 및 다당체분획물의 처리에 의해 유도된 4가지 사이토카인 모두 생성이 완벽히 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 흑미강발효분말 및 흑미강발효분말의 다당체분획물은 TLR4에 결합하여 대식세포의 활성화를 유도하는 TLR4 작용제(agonist)을 확인하였다.

흑미강발효분말의 대식세포에서의 면역활성 관련 사이토카인 분비패턴을 조사한 결과, TNF-α, IL-6 및 IFN-β의 발현을 매우 높게 유도하는 것을 확인할 수 있었으며, 이 중 IFN-β는 I형 인터페론으로 항균, 항바이러스 효과가 있으며 Th1 세포의 분화에 기여하여 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로 Th1 면역반응을 유도하는 반면, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 사이토카인이다.

따라서 흑미강발효분말은 Th1 면역반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 TLR4 작용제의 Th1 어주번트(adjuvant)이며, 대식세포에서 PGE₂ 및 NO 생성 등을 억제하는 일반적인 염증억제제와는 다른 기전을 갖는 물질인 것으로 평가할 수 있었다.

결과 3. 생물전환된 흑미강발효물의 LPS 경쟁적 억제제 입증

LPS 복강투여에 따른 복강 내 호중구 침윤 유도 효과를 확인한 결과, 200ng의 LPS를 주사했을 경우, 호중구의 침윤이 최대로 일어나고 이후 일정하게 유지되는 것을 확인하였다. 하지만, 생물전환된 흑미강발효물 다당체분획은 동일량을 주사했을 경우 LPS와 달리 복강 내 호중구 침윤을 유도하지 않았으며, LPS와 동시 처리 시 LPS에 의한 호중구 침윤을 억제하는 것을 확인하였다(도 4 참조). 이에, 생물전환된 흑미강발효물의 다당체분획물은 LPS와 달리 복강 내 호중구 침윤을 유도하지 않으며, 오히려 LPS에 의해 유도된 복강 내 호중구 침윤이 생물전환된 흑미강발효물의 다당체분획물에 의해 억제되어 LPS에 대한 경쟁적 억제제임을 입증할 수 있었다. 따라서, 생물전환된 흑미강발효물은 LPS와 같은 TLR4 agonist이나 LPS와 달리 체내에서 염증반응을 유도하지 않는 안전한 물질이며, 오히려 LPS와 경쟁적으로 작용할 수 있는 물질인 것으로 평가할 수 있다.

결과 4. in vitro 모델에서의 항아토피피부염 효능 평가

생물전환된 흑미강발효물의 B 세포주에서의 IgE 생성 억제 효과를 확인한 결과, 생물전환된 흑미강발효물은 흑미강 원물에 비해 최소 100배 이상의 IgE 생성 억제 활성이 있는 것을 확인하였다. 특히 주목할 만한 점은 원물 100 ㎍/㎖의 농도에서 보다 생물전환된 발효물 1 ㎍/㎖의 농도에서 IgE 항체 생성 억제 활성이 더 높게 나타난 것이다. 그 결과를 도 5의 (a)에 나타내었다.

또한, 비만세포주에서 β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 생성 억제 활성을 확인한 결과, 생물전환산물과 원물의 활성 차이가 나타나지 않았다. 이러한 결과는, 원물에 존재하는 비만세포 탈과립 억제 활성 성분이 생물전환 공정을 거친 후에도 파괴되지 않고 남아 있음을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 5의 (b)에 나타내었다.

실시예 3. 아토피피부염 모델에서 생물전환된 흑미강발효물의 체내(in vivo) 효능 평가

실험동물.

실험에 사용한 마우스는 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오 (Seongnam, Korea)에서 구입하였고, 실험에 사용하기 전까지 실내온도를 22±2℃로 유지하면서, 충분한 물과 사료를 공급하여 사육하였다.

복강 내 호중구 침윤 유도능 및 항LPS 효능 평가 동물실험.

LPS 유도 호중구 유도능 측정을 위하여, 마우스는 그룹 당 10마리로 무작위적으로 분리하였으며, 1주일 적응식이 후 복강에 LPS (SIGMA, St. Louis, MO) 및 개발소재를 농도별로 주사하였다. 6시간 뒤, 마우스를 희생하고, 복강을 PBS로 세척하여 복강 내로 침윤된 세포를 회수하였으며, 김자 염색을 통해 호중구의 수를 계수하였다.

예방 효과 확인을 위한 항아토피피부염 효능 평가 동물실험.

아토피피부염의 유발을 위하여, 마우스는 그룹 당 10마리로 무작위적으로 분리하였으며, 1주일 적응식이 후 흑미강발효물을 일일섭취량(10 mg/kg)에 맞추어 식이투여를 시작하여 마우스를 희생할 때까지 총 6주간 식이를 하였으며, 흑미강발효물 식이투여 2주일 후 1% DNCB(디니트로클로로벤젠)를 한쪽 귀에 도포하여 감작하였으며, 4일 후 10 mg/ml의 진드기류 추출물(mite extract)을 동일한 귀에 도포하여 자극하였으며, 이후 일주일에 1번씩 DNCB 감작과 진드기류 추출물 자극을 반복하여 총 4주간의 아토피피부염 유발 후 마우스를 희생하였으며, 귀 두께 측정 후 심장에서 채혈하고 귀 조직 및 비장을 적출하였다.

치료 효과 확인을 위한 항아토피피부염 효능 평가 동물실험.

아토피피부염의 유발을 위하여, 마우스는 그룹 당 10마리로 무작위적으로 분리하였으며, 1주일 적응식이 후 1% DNCB(디니트로클로로벤젠)를 한쪽 귀에 도포하여 감작하였다. 3일 후, 10 mg/ml의 진드기류 추출물(mite extract)을 동일한 귀에 도포하여 자극하였으며, 감작 1주일 후부터 흑미강발효물을 일일섭취량(40 mg/kg)에 맞춰 식이투여를 시작하였다. 이후 4주간 흑미강발효물의 식이를 지속하면서 일주일에 1번씩 DNCB 감작과 진드기류 추출물 자극을 반복하여 총 5주간의 아토피피부염 유발 후 마우스를 희생하였으며, 귀 두께 측정 후 심장에서 채혈하고 귀 조직 및 비장을 적출하였다.

ELISA.

심장에서 채혈한 혈액을 4℃에서 30분 처리하여 혈액응고를 유도한 뒤, 2,000g에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청 내 IgE의 양은 마우스 IgE ELISA 키트 (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, England)을 이용하여 측정하였으며, IL-1β, IL-4, IL-6, 및 IFN-γ의 양은 각각의 ELISA 키트 (R&D systems, minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다. 귀 조직은 TNT 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0)에 넣고 균질화기를 이용하여 파쇄한 뒤, 13,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액 내 TSLP(Thymic Stromal Lymphopoietin)의 양은 마우스 TSLP quantikine ELISA 키트 (R&D systems, minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였으며, IL-31의 양은 IL-31 마우스 ELISA 키트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 측정하였다. IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ의 양은 각각의 ELISA 키트 (R&D systems, minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다.

실시간 PCR.

적출한 비장 내 총 RNA를 tissue RNA preparation 키트 (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출한 RNA는 역전사효소 (TAKARA, Kusatsu, Shiha, Japan)을 이용하여 cDNA로 합성하였으며, 각각의 프라이머를 이용하여 실시간 PCR (Bio-Rad, Hercules, CA)로 증폭하여 mRNA의 발현량을 확인하였다.

조직 염색.

적출한 귀 조직은 3.7% 포름알데히드로 고정한 뒤, 탈수과정을 거쳐 파라핀에 포매하였다. 조직이 포함된 파라핀 블록은 4μm 두께로 박편하여 슬라이드글라스에 부착하였다. 그 후, 수화과정을 거쳐 헤마톡실린 및 에오신 Y로 염색하였고, 현미경으로 관찰하였다.

결과 1. 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 예방 효과

DNCB와 진드기류 추출물의 처리로 인해 유발된 아토피피부염 마우스 모델에서, 10 mg/kg의 생물전환된 흑미강발효물의 식이를 통한 아토피피부염 억제 효과를 확인하였다. 아토피피부염이 유발됨에 따라 혈청 내 IgE의 생성량은 5.05배 증가하였으나 생물전환된 흑미강발효물 투여 시 IgE의 생성량이 58.8% 억제되는 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 아토피피부염이 유발됨에 따라, 귀 두께는 1.53배로 증가하였으나 생물전환된 흑미강발효물 투여 시 귀 두께의 증가가 54% 억제되는 것을 확인하였다(도 7 참조). 또한, 비장세포를 분리하여 IL-2와 IL-5의 mRNA 발현을 확인한 결과, 아토피피부염이 유발됨에 따라 감소되었던 IL-2의 발현은 생물전환된 흑미강발효물 투여 시 회복되었고, 아토피피부염이 유발됨에 따라 증가되었던 IL-5의 발현은 생물전환된 흑미강발효물 투여 시 억제되는 것을 확인하였다(도 8 참조).

또한 생물전환된 흑미강발효물의 투여로 인한 병변부위인 귀 조직 내 사이토카인 발현 변화와 혈청 내 사이토카인 발현 변화를 확인하였다. 아토피피부염의 유발로 인해 증가한 귀 조직 내 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13, IL-33의 발현은 생물전환된 흑미강발효물의 투여로 인해 억제되는 것을 확인하였다. 아토피피부염의 유발로 인해 감소한 귀 조직 내 IFN-γ의 양은 생물전환된 흑미강발효물 투여 시 회복되는 것을 확인하였다(도 9 참조). 또한, 아토피피부염의 유발로 인해 증가한 혈청 내 Th2 사이토카인인 IL-4와 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6의 양은 생물전환된 흑미강발효물의 투여에 의해 억제되는 것을 확인하였으며, 혈청 내 IFN-γ의 양은 아토피피부염 유발 시 큰 차이가 없는 것을 확인하였다(도 10 참조). 그 결과, 생물전환된 흑미강발효물은 Th2 사이토카인 및 염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 항진된 Th2 면역반응과 함께 염증반응을 제어할 수 있는 것을 확인하였다.

결과 2. 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과 1: 아토피피부염이 유발됨에 따라 항진된 Th2 사이토카인의 억제 확인

생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 평가하기 위하여 DNCB와 진드기류 추출물로 유도된 아토피피부염 동물모델을 이용하였다. 실험군당 10마리의 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 1주일간 순치 후 1% DNCB 20㎕를 오른쪽 귀에 도포하여 감작하였으며, 3일 후 10 mg/ml 진드기류 추출물 20㎕를 동일한 귀에 도포하여 자극하였다. 1주일에 1회씩 총 5주간 DNCB와 진드기류 추출물을 도포하여 아토피피부염을 유발하였으며, 아토피피부염 유발 1주일 후부터 생물전환된 흑미강발효물을 총 4주간 식이시켰다. 이후 마우스를 희생하여 생물전환된 흑미강발효물이 갖는 아토피피부염 억제 효과를 평가하였다.

아토피피부염이 유발된 마우스의 병변조직 내 Th2 사이토카인의 양을 측정하여 생물전환된 흑미강발효물이 갖는 항진된 Th2 면역반응의 저하 효과와 함께 Th1/Th2 면역반응 조절 효과를 확인하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, 병변조직 내(여기서는 귀 조직 내) IL-4, IL-5, 또는 IL-13의 양을 RT-PCR 방법에 의해 확인한 결과, 아토피피부염의 유발에 의해 정상 마우스 대비 5배 이상 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 생물전환된 흑미강발효물을 투여한 마우스의 경우, IL-4, IL-5, 및 IL-13 발현량이 모두 감소하는 것으로 보아, 뛰어난 억제 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

결과 3. 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과 2: 아토피피부염이 유발됨에 따라 저하된 Th1 사이토카인의 회복 확인

결과 2에서와 마찬가지로 하여, 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 평가하기 위하여 아토피피부염이 유발된 마우스의 비장 내 Th1 사이토카인의 양을 측정하여 생물전환된 흑미강발효물이 갖는 Th1/Th2 면역반응 조절 효과를 확인하였다. 도 12 및 하기 표 1에 나타난 바와 같이, Th1 사이토카인 중 IL-2, IL-12, 또는 IFN-γ의 발현량을 RT-PCR 방법을 이용하여 확인한 결과, 아토피피부염이 유발됨에 따라 IL-2, IL-12, 또는 IFN-γ의 발현량이 감소되는 것을 확인하였다. 반면, 생물전환된 흑미강발효물을 투여한 마우스에서 IL-2, IL-12, 또는 IFN-γ의 발현량이 회복되는 것으로 확인되었다. 즉, 생물전환된 흑미강발효물을 투여한 마우스에서 IL-2, IL-12, 및 IFN-γ의 발현량이 각각 53 %, 21 %, 40 % 정도 회복되어 뛰어난 활성을 갖는 것으로 나타났다.

구분	비장 조직에서 사이토카인 mRNA 발현율(fold-increase)
	IL-2	IL-12	IFN-γ
정상	1.00 ± 0.07	1.00 ± 0.09	1.00 ± 0.06
아토피피부염 유발	0.62 ± 0.04	0.71 ± 0.05	0.75 ± 0.05
흑미강 원물40 mg/kg 투여	0.65 ± 0.05	0.71 ± 0.06	0.77 ± 0.07
흑미강발효물40 mg/kg 투여	0.82 ± 0.06	0.77 ± 0.03	0.85 ± 0.04

결과 4. 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과 3: 아토피피부염이 유발된 마우스의 혈청 내 IgE, 및 병변부위인 귀 두께, 귀 조직 내 TSLP, IL-31 발현 수준의 저하 확인

결과 2에서와 마찬가지로 하여, 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 평가하기 위하여 혈청 내 IgE, 귀 두께, 귀 조직 내 TSLP, 및 아토피피부염에서 가려움증을 유발하는 IL-31의 측정을 통해, 아토피피부염에 대한 생물전환된 흑미강발효물의 치료 효과를 확인하였다. 아토피피부염의 유발에 의해 정상마우스 대비 혈청 내 IgE는 약 7배, 귀 두께는 약 2배, 귀 조직 내 TSLP 단백질의 발현량은 약 6배, 귀 조직 내 IL-31 단백질의 발현량은 약 6배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 반면에 40 mg/kg 흑미강 원물을 투여한 경우, 양성 대조군 대비 혈청 내 IgE의 양이 31.0%, 병변부위인 귀 두께가 39.8% 억제되었으며, 각질형성세포에서 생성된 귀 조직 내 TSLP 단백질의 발현량이 31.9%, 귀 조직 내 IL-31 단백질의 양이 27.2% 억제되는 것을 확인하였다. 반면, 생물전환된 흑미강발효물을 40 mg/kg으로 투여한 경우, 양성 대조군과 비교하여 혈청 내 IgE의 양이 69.2%, 귀 두께가 75.7% 억제되었으며, 귀 조직 내 TSLP의 발현량이 69.3%, 귀 조직 내 IL-31의 양이 65.5% 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 생물전환공정에 의해 원물보다 뛰어난 활성을 갖는 물질로 전환된 것으로 판단할 수 있었다(도 13 참조). 또한, 본 발명에 따른 생물전환된 흑미강발효물의 투여는 TSLP의 생성 억제를 통해 만성적인 피부병변의 염증반응을 제어할 수 있고, IL-31의 생성 억제를 통해 아토피피부염에 의해 발생하는 가려움증을 효과적으로 완화하여 아토피피부염을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.

결과 5. 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과 4: 아토피피부염이 유발된 마우스의 혈청 내 갈렉틴-9(galectin-9)의 발현 수준의 증가 확인

결과 2에서와 마찬가지로 하여, 생물전환된 흑미강발효물의 아토피피부염 치료 효과를 평가하기 위하여 아토피피부염이 유발된 마우스의 혈청 내 갈렉틴-9의 양을 측정하여 생물전환된 흑미강발효물의 갈렉틴-9 발현 조절 효과를 확인하였다. 마우스 희생 후 혈청 내 존재하는 갈렉틴-9의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과, 아토피피부염의 유발로 갈렉틴-9의 발현이 정상마우스 대비 3.3배 증가하며, 또한 흑미강 원물을 투여한 마우스에서는 갈렉틴-9의 발현이 추가로 거의 증가되지 않는 것을 확인하였다. 반면에, 생물전환된 흑미강발효물을 투여한 마우스에서는 갈렉틴-9의 발현이 정상마우스 대비 5.56배, 양성 대조군 대비 약 2배 정도 대폭 증가되는 것을 확인하였다(도 14 참조). 갈렉틴-9은 TGF-β1의 발현을 증가시킴으로써 Treg 세포의 활성화를 유도할 수 있으며, Treg세포를 통한 항진된 Th2 면역반응 억제에 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있어, 갈렉틴-9은 생물전환된 흑미강발효물을 투여하는 경우에 Treg세포의 활성화를 통해 아토피피부염을 효과적으로 억제할 수 있는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

1. 흑미강을 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 아토피피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 배양배지화는 흑미강을 분말화하여 액상에서 흑미강 분말을 가수분해효소로 처리한 후 흑미강 배지로 만드는 것인, 약학 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서,
   상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나인, 약학 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제 및 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물인, 약학 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어지는, 약학 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 아토피피부염 병변부위에서의 IL-4, IL-5, IL-13, TSLP(흉선기질림포포이에틴, Thymic stromal lymphopoietin), 또는 IL-31의 발현량을 감소시키거나, 혈청 내에서 IL-1β, IL-4, IL-6, 또는 IgE의 양을 감소시키거나, 갈렉틴-9(galectin-9)의 양을 증가시키는, 약학 조성물.
   
8. (a) 흑미강을 액상으로 배양배지화 하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상흑미강 배지에 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하는 생물전환 발효공정을 수행하는 단계; 및
   (c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 섬유소 분해효소를 처리하는 생물전환 효소처리공정을 수행하는 단계를 포함하는, 아토피피부염의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
   
9. 제 8항에 있어서,
   상기 (a)단계의 흑미강의 배양배지화는 흑미강을 분말화하여 액상에서 흑미강 분말을 가수분해효소로 처리한 후 흑미강 배지로 만드는 것인, 방법.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나인, 방법.
    
11. 제 8항에 있어서,
    상기 (C)단계의 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 및 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물인, 방법.
    
12. 제 8항에 있어서,
    상기 (b)단계의 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어지는, 방법.
    
13. 제 8항에 있어서,
    상기 (d)단계의 흑미강 생물전환산물은 아토피피부염 병변부위에서의 IL-4, IL-5, IL-13, TSLP(흉선기질림포포이에틴, Thymic stromal lymphopoietin), 또는 IL-31의 발현량을 감소시키거나, 혈청 내에서 IL-1β, IL-4, IL-6, 또는 IgE의 양을 감소시키거나, 갈렉틴-9(galectin-9)의 양을 증가시키는, 방법.
    
14. 삭제
15. 흑미강을 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 아토피피부염의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    
16. 삭제
17. 흑미강을 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 아토피피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
18. 삭제

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