KR101605057B1

KR101605057B1 - 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101605057B1
Application number: KR1020140103268A
Authority: KR
Inventors: 표미경; 유지현; 홍세철; 오명환; 설수연; 박영식; 조일식; 박종대
Original assignee: 재단법인 금산국제인삼약초연구소
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2014-08-11
Publication date: 2016-03-21
Also published as: KR20160019190A

Abstract

본 발명은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출물을 효소 발효시킴으로써 진세노사이드 Rd가 강화된 아토피 개선용 발효 인삼 또는 홍삼 추출물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 아토피 개선용 발효 인삼 또는 홍삼 추출물은 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킨 장점이 있다.

Description

진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 조성물{Composition comprising fermented ginseng or red ginseng extract containing increased ginsenoside Rd for improving atopic dematitis}

본 발명은 진세노사이드 Rd 함량이 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액을 효소 발효함으로써 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 아토피 소인을 가지고 있는 개인에서 피부, 호흡기점막, 안정막, 장잠막 등에 나타나는 알레르기 증상을 말하는 것이다. 특히, 아토피 알레르기를 가진 사람에게서 나타나는 대표적인 피부질환인 아토피 피부염은 피부염증 및 가려움증을 유발시키는 것으로 가볍고, 건조하고, 민감한 피부를 유발하여 아토피 피부염에 걸린 사람에게 많은 불쾌감을 나타낸다. 아토피 피부염은 어린아이에게 많은 고통을 지속적으로 일으킬 수 있는 것으로 밤낮없이 피부가 가려워서 긁게 되고, 잠을 설치며, 피부가 흉측하게 변할 수 있으며, 이와 동시에 아토피 피부염을 통한 성장발육의 문제 및 사회생활의 부적응 등을 불러올 수 있는 문제가 있다.

최근에는 환경적 요인, 정신적인 스트레스와 같이 사회생활의 다양화에 따른 생활환경의 다변화로 인하여 많은 아토피 피부염 환자들이 발생하고 있는 실정이다. 특히, 이러한 아토피 피부염의 악화요인으로는 건조한 피부, 주변 온도와 습도의 변화, 심한 운동과 과도한 땀, 양모 및 섬유 등에 의한 피부자극, 음식물, 약물, 집먼지, 동물의 털, 자극성 화학물질, 감염이나 정신적인 스트레스 등과 같이 아토피 피부염을 일으키는 원인 및 요인도 다양화되고 있는 추세이다.

위와 같은 아토피 피부염을 예방하고 개선하기 위하여 최근에는 항 알러지 효과가 나타나는 제재를 사용하거나, 항균작용이 있는 제재를 사용하여 아토피 피부염이 발생된 피부에 바르는 방법을 통하여 아토피 피부염의 증상을 완화시키고, 가려움증을 야기시킬 수 있는 요인을 사전에 제거하여 아토피 피부염의 증상악화를 예방하고 있는 실정이다.

인삼은 소련의 과학자 C.A.Meyer가 1843년에 만병을 치료한다는 의미로 학명을 "Panax ginseng C.A. Meyer"로 명명된 식물학적으로는 오가과(Araliaceae) 인삼속(Panax)에 속하는 식물로 뿌리를 약용으로 이용하고 있다. 이러한 인삼은 자연 건강식품으로 널리 이용되고 있으며, 약리 효능의 과학적 입증과 임상을 근거로 인식과 신뢰가 높으며, 의약품 및 기능성 식품으로 그 수요가 증가하고 있다.

인삼은 2,000년 전부터 동양에서 뛰어난 약리효과로 인해 민간에서 이용되어 왔으며, 그 효과는 대부분 사포닌계 성분에 의한 것으로 알려져 있다(Ha, 2005). 인삼은 약용으로 쓰는 뿌리의 처리방법에 따라 홍삼과 백삼으로 나누어지며, 홍삼은 채굴한 수삼을 탈피하지 않고 쪄서 말린 갈홍색을 띤 인삼이며, 백삼은 수삼을 건조한 인삼으로서 미황백색이다. 인삼의 대표적인 약리성분인 사포닌(ginsenoside)은 백삼에 22가지, 홍삼에 30가지 정도가 밝혀져 있으며 (Ryu, 2003), 특히 panaxatriol은 백삼에는 없고 홍삼에만 존재하는 특이한 성분이다 (Kitagawa, 1983). 또한 인삼을 찌고 말리는 과정을 반복한 홍삼의 제조과정에서 발생되는 열에 의해 인삼에는 존재하지 않는 홍삼만의 특유 성분인 non-polar ginsenoside Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, Rg5, Rk1와 polar ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg, Rg1, Re 등의 사포닌 성분이 새로이 생성되며, 이러한 홍삼 특유의 사포닌은 혈압강하작용 (Jeon et al., 1999), 뇌신경세포 보호 및 학습능력 개선작용 (Kim et al.,, 2004; Petkov and Mosharrof, 1987), 항혈전 작용 (Jung et al., 1998), 항산화 작용 (Bae and Kim, 1998) 등이 있다고 보고되고 있어 이에 대한 홍삼만의 탁월한 약리 효능을 기대할 수 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 암세포의 증식을 억제하는 주요 활성성분으로는 홍삼의 특유 사포닌 성분인 G-Rh2와 비사포닌 물질로서 panaxydol, panaxynol, panaxytriol 등의 polyacetylene 성분이 있다. 이들 성분은 암세포 증식 억제 작용이 있다고 알려져 있다. 이 외에도 다당체 성분은 항당뇨 작용, 면역 증강 작용, 항위궤양 작용 등이 알려지고 있다.

홍삼의 제조과정은 수삼을 물로 깨끗하게 씻고, 일정한 용기에 넣어 가열된 수증기를 이용하여, 크기에 따라 일정시간 증삼(蒸蔘)을 한 후 1차 열풍건조 후부터는 태양열을 이용하거나 기타 방법으로 수분이 12.5∼13.5% 정도 될 때까지 건조하여 제조하게 되는 것으로, 상기 홍삼의 제조과정에서 잔뿌리를 떼어낸 것을 홍미삼(紅尾蔘)이라 한다.

상기 홍미삼은 홍삼의 잔뿌리이나 그 성분은 홍삼과 크게 다르지 않는 것으로, 배당체(glycosides), 인삼향성분(panacen), 폴리아세틸렌계 화합물, 함질소성분, 플라보노이드, 비타민(B군), 미량원소, 효소, 항산화물질과 유기산 및 아미노산 등이 함유되어 있으며, 중추신경에 대해서 진정작용과 흥분작용이 있고, 순환계에 작용하여 고혈압이나 동맥경화의 예방효과가 있으며, 조혈작용(造血作用)과 혈당치(血糖値)를 저하시켜 주고, 간을 보호하며, 내분비계에 작용하여 성행동(性行動)이나 생식효과에 간접적으로 유효하게 작용하며, 항염(抗炎) 및 항종양작용(抗腫瘍作用)이 있고, 방사선에 대한 방어효과, 피부를 보호하며 부드럽게 하는 작용이 있는 것으로 알려져 있다.

그러나 상기 사포닌은 장내 미생물에 의해 분해 및 전환이 이루어져 체내로 흡수된다는 사실이 밝혀졌으며, 이러한 결과 사람에 따라 사포닌의 흡수 정도가 다른 것으로 규명되어 있다. 예를 들어, 2004년도 한국 식품영양학회 국제학술대회Ham et al. 에 따르면 사포닌을 흡수할 수 있는 그룹을 제외하고 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol, 이하 'PPD'라 칭한다.)계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 20.3%, 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol, 이하 'PPT'라 칭한다.)계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 12.5%, 아예 사포닌 흡수를 못하는 그룹이 4.7%로 사람마다 흡수율의 차이가 두드러지고 있는 것이다.

이에, 사포닌의 체내 흡수율을 증가시키기 위해 유용한 미생물을 이용하여 수삼을 발효하고, 미생물의 당분해효소 등을 이용하여 배당체 구조인 인삼사포닌(ginsenoside)의 성분전환을 유도하여 영양학적, 기능적 가치를 높이고자 하는 인삼 발효 미생물의 선별에 관한 연구가 진행되고(Kim et al., 2007) 있다. 그 일 예로 유산균을 이용한 발효인삼제조에 가장 적합한 유산 균주 및 최적공정을 확립하여 차후 건강기능성 식품소재로서의 유산균 발효 인삼제품화 가능성을 조사한 연구가 수행되고(Park et al., 2006) 있으며, 백삼, 홍삼과 대비하여 발효인삼의 일반성분에 대한 성분 특성에 대한 연구가 보고된 바 있다(Kong et al., 2008).

또한, 인삼을 비롯한 다양한 소재들을 활용하여 발효하거나 또는 첨가하여 식품의 기능성 강화, 관능적 품질을 향상시켜 발효식품으로서 개발하려는 연구가 시도되고 있으며(Kim and Han, 2005), 다양한 미생물이 존재하는 사람의 장내에서 우세균으로 분포하고 체내 유익균의 성장을 촉진하는 생균활성제(probiotics)로서 당류를 발효하여 젖산을 생성하는 세균인 락토바실리(Lactobacilli) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 유산균이 보고된 바 있다(Goldin,1998).

대한민국 등록특허 제10-1345226호 "신규한 패니바실러스 속 엠비티213 균주, 이를 이용한 발효인삼 및 이를 이용한 발효인삼 추출물을 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물"에서는 패니바실러스 속 MBT213 균주를 이용한 발효인삼의 추출물을 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물이 제공되어 있다. 그러나 이러한 미생물에 의한 추출액의 발효를 산업화하기 위해서 일정한 품질을 유지하기 위한 공정 표준화가 어렵다는 문제를 안고 있다. 미생물 발효의 원리는 미생물이 자라면서 분비하는 효소가 궁극적으로 식품 또는 한약재에 함유된 성분을 전환하는 것으로 미생물을 한약재에 직접 접종하여 발효했을 때보다 미리 만들어 놓은 효소를 넣어 발효하면 미생물 발효와 같은 효과를 내면서 공정을 단순화하고 품질관리도 용이한 장점이 있다.

KR 10-1345226 B1, 2013년 12월 19일 KR 10-1382115 B1, 2014년 04월 01일

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구를 지속하던 중, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근을 일정 비율로 혼합하여 제조한 추출물을 효소 발효시킴으로써 아토피 개선 효과를 극대화할 수 있는 다량의 진세노사이드 Rd를 함유하는 새로운 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법을 확립하고 상기 방법에 의한 조성물을 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 진세노사이드 Rd를 포함한 총사포닌 함량이 높은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합 비율로 추출물을 제조하고 이를 효소 발효시킴으로써 유용사포닌인 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계(1단계) 및 상기 혼합 추출액에 효소를 첨가하여 효소 발효시키는 단계(2단계)를 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 1단계에서 제조된 인삼 또는 홍삼 혼합 추출액을 농축하는 단계 및 상기 농축된 추출액을 물로 희석하고 2 kDa 내지 6 kDa의 분자량컷(molecular cut-off)으로 한외여과하여 여과물을 수득하는 단계를 더 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 인삼 사포닌은 진세노사이드를 말한다.

본 발명의 진세노사이드 Rd는 PPD계 진세노사이드의 일종으로, 하기 화학식 1과 같은 구조를 가지는 화합물이다.

[화학식 1]

상기 진세노사이드 Rd는 인삼 또는 홍삼에 1% 미만으로 미량 존재하며 산업적으로 잘 이용되지 않아 왔으나, 관절염 개선, 연골 재생, 콜라겐 형성 등의 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 유용사포닌인 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 개선용 조성물로 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계 및 상기 혼합 추출액에 효소를 첨가하여 효소 발효시키는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 추출물의 제조방법은 도 1의 공정도를 참조한다.

상기 제조방법은 발효 후 통상적인 방법에 따라 살균하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서 80 내지 100℃에서 5 내지 20분 동안 살균할 수 있다.

상기 제조방법은 발효 후 통상적인 방법에 따라 진공농축, 스프레이 드라이 또는 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서 50 내지 70℃에서 감압농축할 수 있다.

본 발명에서 상기 1단계에서 제조된 인삼 또는 홍삼 혼합 추출액을 농축하는 단계 및 상기 농축된 추출액을 물로 희석하고 2 kDa 내지 6 kDa의 분자량컷(molecular cut-off)으로 한외여과하여 여과물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 희석은 제한되지는 않지만 발효 인삼 또는 홍삼 추출물 총 중량에 대하여 3 내지 20배의 물을 첨가할 수 있다.

본 발명에서 상기 여과단계의 분자량컷은 제한되지는 않지만 3 kDa 또는 5 kDa로 정하여 사용할 수 있으며, 상기 여과단계의 한외여과는 제한되지는 않지만 내액:외액이 75 내지 85: 25 내지 15의 비율을 갖도록 배합하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼은 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 수삼, 백삼, 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium) 및 히말라야삼(Panax pseudoginseng)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인삼일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 수삼은 밭에서 캐낸 후 가공하지 아니한 상태의 생삼을 말하며, 백삼은 주로 4～6년근 수삼을 원료로 하여 표피를 제거하거나 제거하지 않고 건조, 가공한 것을 말한다.

본 발명에 있어서 홍삼은 4 내지 6년근 수삼을 엄격히 선별하여 표피를 제거하지 않은 상태에서 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색 인삼을 말한다.

본 발명에 있어서 인삼근 또는 홍삼근은 상기 인삼 또는 홍삼 중 몸통 부분인 인삼의 주근 또는 홍삼의 주근을 말한다.

본 발명에 있어서 홍미삼은 4 내지 6년근 수삼을 증기로 쪄서 말린 홍삼 중에서도 맨 끝부분의 가느다란 잔뿌리, 즉 홍삼의 세근를 말하며, 제조과정에서 주근에서 잔뿌리를 떼어 분리한 것을 '홍미삼(紅尾蔘)'이라 별도로 칭하여 사용하였다.

본 발명에 있어서, 인삼은 수삼, 백삼 또는 홍삼 등을 포함하는 통상적인 인삼 및 이의 가공삼을 포괄하는 명칭으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물은 주근 대비 세근의 비율이 주근 0% 내지 40% 대비 세근 60% 내지 100% 일 수 있으며, 바람직하게는 주근 대비 세근의 비율은 세근이 60% 이상인 것이 적절하다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 추출에 앞서 추출효율을 높이기 위하여 분쇄 또는 분말화할 수 있으며, 당업계에 공지된 통상적인 추출법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 물 추출법, 알코올 추출법, 유기용매 추출법 및 초임계 추출법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 추출법 또는 알코올 추출법을 이용하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 알코올 추출법에 있어 사용되는 추출용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올,이소프로판올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 등을 사용할 수 있으며. 상기 유기용매 추출법의 추출용매로는 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 염산, 초산, 포름산, 구연산, 시클로헥산 및 석유에테르 등의 유기용매 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

추출시 첨가되는 추출용매의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물(건조 중량)에 대하여 추출용매를 2배 내지 20배(중량기준)로 사용할 수 있다. 추출효율을 증가시키기 위해서는 바람직하게는, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물에 대하여 추출용매 5배 내지 15배(중량기준)를 사용하여 2회 이상 수회 반복할 수 있다.

추출온도는 50 내지 110℃가 적절하며, 바람직하게는 70 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 75℃ 내외이다. 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2시간 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 6시간 동안 추출한다. 또한, 추출시 교반기(shaker)로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액은 감압농축하여 고형분의 함량이 1 내지 20 브릭스(Brix)인 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 주근 대비 세근의 비율이 60%이상 함유된 인삼 또는 홍삼을 물, 주정 또는 주정함유 용매에 추출하여 농축한 후 약 6 브릭스(Brix)로 조정할 수 있다.

상기 고형분의 함량을 1 내지 20 브릭스(Brix)로 조절하지 않으면 농도가 너무 진해서 발효가 잘되지 않고 겔화되기 때문에, 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액의 고형분 함량을 1 내지 20 브릭스(Brix)로 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 발효 단계는 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물 추출액의 중량에 0.1 내지 15% 정도가 되도록, 바람직하게는 10% 정도가 되도록 효소를 첨가하고 20 내지 60℃의 반응기에서 2 내지 5일 동안 효소 발효시킬 수 있으며, 바람직하게는 50℃에서 5일 정도 배양하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 6 브릭스의 인삼 또는 홍삼 추출물에 10%(w/w)의 펙티나제 효소를 첨가하여 50℃ 조건에서 3일간 교반 배양한 후 95℃에서 30분간 가열하여 효소 반응을 정지시켜 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물(GS-E3D)을 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 발효액의 효소 발효 반응을 중지하기 위해서 80 내지 100℃에서 5 내지 30분 동안 살균하며, 바람직하게는 95℃에서 10분 내지 30분 동안 가열하는 것이 바람직하다. 이때 가열에 의하여 상기 첨가된 효소의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소발효액을 살균한 후 30 내지 40℃, 바람직하게는 37℃로 냉각시킨다.

이때 90 내지 95℃에서 5 내지 30분 동안 처리하여 효소를 불활성화시킬 수 있으며, 95℃에서 30분 동안 처리하는 것이 바람직하다.

이때 상기 첨가한 효소에 의하여 발효가 가속화되어 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킬 수 있다.

본 발명의 상기 효소 발효단계에서 효소로서 펙티나아제를 이용하며, 바람직하게 펙티나아제는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear), α-허브자임(α-herbzym), 노보자임 33095(Novozym 33095)이며, 더욱 바람직하게는 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear) 또는 노보자임 33095(Novozym 33095)인 것을 특징으로 한다.

더욱 상세하게는 본 발명의 효소 발효단계에 의해 진세노사이드 Rb1이나 Rc 등을 진세노사이드 Rd로 전환시킴으로써 다량의 진세노사이드 Rd를 포함시킬 수 있게 한다.

따라서 본 발명에 따라 제조된 아토피 개선용 발효 인삼 또는 홍삼 추출물은 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킬 수 있다. 또한, 진세노사이드 Rd를 포함한 총사포닌 함량이 높은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 이용하여 아토피 개선용 발효 효소 추출물을 제조함으로써 몸에 흡수가 뛰어나고 기능적 활성을 가진 진세노사이드 Rd로 더 많은 구조전환을 시킬 수 있어 기존의 인삼 또는 홍삼과 차별성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법은 효소 발효를 이용하여 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근에 미량 존재하는 진세노사이드 Rd를 간편하고, 경제적으로 구조전환시킬 수 있는 장점이 있다. 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법은 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킨 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 효소별 진세노사이드 Rd 강화 조사포닌의 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 효소별 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼농축액의 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 효소발효 후 인삼 또는 홍삼 농축액의 온도 및 농도별 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 인삼 또는 홍삼 농축액 12 Brix에서 효소 농도에 따른 시간별 진세노사이드 Rd의 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합 비율에 따른 추출 수율을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 한외여과막 여과율에 따른 진세노사이드 함량 및 Rb1/Rg1 변화를 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 8은 5 kDa 한외여과막 여과율에 따른 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 9는 3 kDa 한외여과막 여과율에 따른 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다
도 10은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합 비율에 따른 진세노사이드 함량 변화를 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 11은 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합 비율에 따른 Rb1/Rg1 및 PPD/PPT 계열 사포닌 비율을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 12는 추출물 농도에 따른 진세노사이드 Rd 함량 변화를 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 13은 반응시간에 따른 진세노사이드 Rd 함량 변화를 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 14는 인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근 혼합물의 추출액(GS-C46) 및 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 기능성분 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 NO 생성억제효과를 나타낸 것이다(Values are mean±SEM. Mean with same letters (a-c) are not significantly different at p < 0.05 by Tukey's multiple range test(이하, 본 발명의 도 16 내지 도 26에서 동일한 분석방법에 의한다)).
도 16은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 TNF-α 생성억제효과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 육안적 관찰 효과를 나타낸 사진이다.
도 18은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 긁는 횟수 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 비장 무게 증가 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 혈청 히스타민물질 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 IgE 수준 증가 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 혈청 (A)TNF-α, (B)IL-1β, (C)IL-6 상승억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 혈청 IFN-γ 상승 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 혈청 (A)IL-4, (B)IL-10 상승 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 피부조직에 H&E 염색을 실시한 결과를 나타낸 사진이다.
도 26은 본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)의 LPS 유도 아토피 피부염 동물 모델에서 피부조직변화 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

이하, 본 발명에 있어서, 인삼은 수삼, 백삼 또는 홍삼 등을 포함하는 통상적인 인삼 및 이의 가공삼을 포괄하는 명칭으로 사용될 수 있다.

1. 실험재료

GAP 인증 4년근 홍삼주근을 금산인삼농협에서 구입하였고, 홍미삼은 우신산업에서 구입하여 사용하였다. Pectinase 효소는 식품첨가물로 시판되는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3), 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5) 등을 Novozymes(Denmark)에서 구입하여 사용하였다. 또한, α-허브자임(α-herbzym)(E4)은 한국효소원 (한국)에서 구입하였다.

2. 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비 선발을 위한 추출물 제조방법

인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따라 진세노사이드 함량을 알아보고 진세노사이드 Rd 전환을 위한 최적의 배합비율을 찾기 위하여 인삼 또는 홍삼의 주근과 세근의 비율을 주근0:세근10(C-01), 주근2:세근8(C-28), 주근4:세근6(C-46), 주근6:세근4(C-64), 주근8:세근2(C-82), 주근10:세근0(C-10) 비율로 무게를 달아 총 중량 100g으로 맞추고 중량의 5배의 물을 넣고 75℃ 수욕 상에서 6시간씩 3회 반복 추출한 후 여과한 액을 60℃ 수욕 상에서 농축하여 3 Brix, 6 Brix, 12 Brix 로 농도를 조정하였다.

3. 진세노사이드 Rd 강화 효소처리 인삼 또는 홍삼추출물 제조

PPD계열의 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc로부터 진세노사이드 Rd를 제조하기 위하여 상기 인삼 또는 홍삼 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 10%(w/w)를 넣고 50℃ 교반배양기(Shaking incubator)에서 3일, 5일 동안 반응한 후 95℃에서 30분간 처리하여 효소 반응을 중지하였다.

4. 진세노사이드 분석

진세노사이드 함량 분석을 위하여 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근 배합비별 추출물시료 및 진세노사이드 Rd 강화 효소처리 인삼 또는 홍삼추출물을 각각 동결건조기에서 건조하여 분말화하여 시료로 사용하였다. 분말화된 시료를 정확하게 10mg을 달아 메탄올 1ml에 녹여 1시간 동안 초음파 추출 후 원심분리하여 상층액을 회수하여 0.45um 멤프레인필터에 여과하여 여과액을 분석용 시료로 사용하였다. 분석기기 조건은 다음과 같다.

진세노사이드 함량분석은 Waters-PDA(Waters 1525, detector 2998, USA)를 활용하여 물(A액)과 ACN (B액)을 하기 표 1 및 표 2와 같은 용매 조건으로 flow rate 1.0 ml/min으로 하여 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석하였다.

[표 1] 진세노사이드 분석을 위한 용매조건

[표 2] 진세노사이드 분석을 위한 HPLC 분석조건

[ 실험예 1] 최적 효소 선발을 위한 실험

1. 진세노사이드 Rd 강화 최적 효소 선발 실험

조사포닌((주)위디아), 인삼추출물((주)성신BST), 홍삼((주)우신산업)을 구입하여 사용하였다. 홍삼은 80% 에탄올로 환류 추출하여 추출액을 얻었고, 인삼 또는 홍삼 추출물은 동결건조하여 사용하였다.

시료 5mg을 증류수 2 mL에 완전히 녹이고, 효소액은 1% (v/v)로 하여 0.5 mL씩 넣어 2.5 mL로 맞추었다. 50℃ Shaking Incubator에서 120 RPM으로 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켰다. 무처리군은 효소 대신 증류수를 가하여 반응시켰다.

진세노사이드 Rd 강화 최적 효소를 선발하기 위해서 식품 첨가물용으로 시판되고 있는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3), α-허브자임(α-herbzym)(E4)을 조사포닌, 인삼농축액 및 홍삼농축액에 1% (v/v)가 되도록 첨가한 후 50℃에서 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켜 진세노사이드 함량을 분석하였다.

진세노사이드 함량 분석을 위하여, 추출액에 수포화 n-부탄올 1:1을 넣고 충분히 혼합한 후 원심분리하여 수포화 n-부탄올 층을 회수하는 것을 2회 더 반복하였다. 회수된 수포화 n-부탄올 층에 증류수 3mL로 세척한 후 원심분리하여 부탄올 층만을 회수하여 70℃ 수욕조에서 농축하여 분석을 위한 사포닌 성분을 회수하였다.

상기 4가지 효소에 의한 효소발효 후 조사포닌 발효물의 진세노사이드 함량을 조사하여 하기 표 3, 표 4 및 도 2에 나타내었다.

[표 3] 조사포닌에 효소 E1 및 E2 처리 후의 진세노사이드 함량 변화

[표 4] 조사포닌에 효소 E3 및 E4 처리 후의 진세노사이드 함량 변화

상기 4가지 효소에 의한 효소발효 후 인삼 또는 홍삼추출물 발효물의 진세노사이드 함량을 조사하여 하기 표 5, 표 6 및 도 3에 나타내었다.

[표 5] 인삼 또는 홍삼추출물에 효소 E1 및 E2 처리 후의 진세노사이드 함량 변화

[표 6] 인삼 또는 홍삼추출물에 효소 E3 및 E4 처리 후의 진세노사이드 함량 변화

상기 표 3 내지 표 6에 나타낸 바와 같이, 상기 4가지 효소 모두 PPT계열 사포닌의 함량에는 크게 영향을 미치지 않았으나 PPD계열 사포닌의 함량변화에는 영향을 미쳐 PPD계열 사포닌에 작용하는 효소로 판단되었다.

상기 표 3 내지 표 6과 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rd 함량을 선택적으로 가장 높이는 효소는 4가지 효소 중 E3인 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)로 나타나, 진세노사이드 Rd 생산을 위한 최적 효소는 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear, E3)로 결정하였다. 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1)과 α-허브자임(α-herbzym)(E4)은 진세노사이드 Rd 함량을 높이나 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)보다 진세노사이드 Rd의 절대함량이 떨어졌고, 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2)는 반응이 매우 빠르게 진행되어 같은 시간에 진세노사이드 Rd를 거쳐 F2와 Compound K 생성량이 많아 F2와 Compound K를 최종산물로 할 경우 유용한 효소로 판단되었으나, 진세노사이드 Rd 생성을 위한 scale up 공정표준화가 어려울 것으로 판단되어 배제되었다. 진세노사이드 Rd 생성은 정도의 차이는 있었으나 조사포닌과 인삼 또는 홍삼추출물에서 모두 반응 1 내지 6시간에 가장 높은 진세노사이드 Rd 수치를 나타내는 것으로 확인되었다.

2. 경제성을 위한 최적 추출물 농도 및 온도 선발 실험

인삼 또는 홍삼농축액은 증류수로 3, 6, 12 Brix로 희석시켜 사용하였다. 추출액 2 mL에 효소액(E2, E3)은 10% (v/v)로 하여 0.5 mL씩 넣어 2.5 mL로 맞추었다. 온도는 각각 37℃, 50℃로 설정하여 교반 배양기(Shaking Incubator)에서 120 RPM으로 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켰다. 무처리군은 조효소 대신 증류수를 가하여 반응시켰다. 효소반응물은 95℃에서 10분간 처리하여 반응을 중지시켰다.

본 기술을 사업화하려면 보다 경제적인 생산 방식을 채택하여야 하는데, 경제적인 Rd 효소전환 최적 온도를 선발하기 위하여 선발된 효소 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)를 37℃와 50℃ 온도 조건에서, 추출물 농도 선발을 위하여 인삼 또는 홍삼추출물의 농도를 3 Brix, 6 Brix, 12 Brix로 조절하여 추출물 농도 및 온도 선발실험을 하였다. 실험결과, 진세노사이드 함량을 조사하여 50℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화(표 7), 37℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화(표 8) 및 인삼 또는 홍삼 농축액의 온도 및 농도별 효소 전환 후 사포닌 함량분석(도 4)을 나타내었다.

[표 7] 50℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화

[표 8] 37℃에서 추출물 농도별 효소 E3에 의한 진세노사이드 함량 변화

상기 표 7 및 표 8과 도 4에 나타낸 바와 같이, 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)에 의한 진세노사이드 Rd 함량을 높이는 온도 조건은 같은 추출물 조건에서 37℃ 보다 50℃가 훨씬 더 높은 진세노사이드 Rd 전환율을 보였고, 50℃ 온도조건에서는 추출물 농도가 낮을 때 진세노사이드 Rd의 전환이 빠르게 나타났고, 추출물 농도를 높일 경우 반응 시간 연장 및 효소 농도 조정이 필요한 것으로 나타났다. 그러나 추출물의 농도가 낮을 경우 농축 등의 시간적 경제적 비용이 높아지므로 경제적인 생산 방법은 추출물 농도를 높이고 반응시간을 다소 연장하는 것이 좋을 것으로 판단되었다. 따라서 본 실험을 통하여 진세노사이드 Rd 함량을 높이기 위한 최적 효소 온도는 50℃이고, 추출물 농도는 12 Brix로 결정하되 반응 시간 및 효소 농도를 조정하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.

3. 효소 농도 및 시간 결정을 위한 조건 실험

인삼 또는 홍삼농축액을 증류수로 희석시켜 12 Brix (550 mg에 2.5 mL 증류수)으로 조정한 후 효소액(노보자임 33095(Novozym 33095) (E5))을 10% 또는 15% (w/w)를 넣고 50℃ shaking incubator에서 RPM은 120으로 하여 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일 동안 반응시켰다. 효소반응물은 95℃에서 10분간 처리하여 반응을 중지시켰다.

최소의 효소농도로 Rd강화 발효 인삼 또는 홍삼을 제조하기 위하여 효소 농도와 효소반응 시간 설정 실험을 하였다. 12 Brix로 조정한 인삼 또는 홍삼추출물에 효소 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 각각 10%와 15%가 되게 넣고 50℃에서 1일, 2일, 3일, 4일간 반응시킨 후 진세노사이드 함량을 분석하여 하기 표 9 및 도 5에 나타내었다.

[표 9] 효소 Novozym 33095 (E5) 농도에 따른 시간별 진세노사이드 함량 변화

상기 표 9 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 함량을 분석한 결과 시간이 증가할수록 진세노사이드 Rd의 함량이 증가하였으나 2일 이후부터는 큰 폭으로 증가하는 경향을 보이지 않았고, 효소 10%와 15%간에 현격한 차이가 나타나지 않음을 관찰하였다. 따라서 12 Brix의 인삼 또는 홍삼 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 10% 정도로 넣고 50℃에서 3일간 반응하였을 때 인삼·홍삼 지표성분인 Rg1과 Rb1의 합이 크게 줄지 않으면서도 진세노사이드 Rd 수준이 크게 증가한 효소반응물을 얻을 수 있음을 확인하였다.

[ 실험예 2] 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비 선발을 위한 실험

1. 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따른 추출수율 비교

진세노사이드 Rd는 미생물이나 효소에 의해 PPD 계열인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc등으로부터 당이 1개 떨어져 생성된다. 따라서 본 발명에서는 인삼 또는 홍삼에서 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc등의 PPD계열 진세노사이드 함량이 높을수록 진세노사이드 Rd 함량을 높이는데 유리하다. 따라서 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따라 진세노사이드 함량을 알아보고자 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 비율을 주근0:세근10(C-01), 주근2:세근8(C-28), 주근4:세근6(C-46), 주근6:세근4(C-64), 주근8:세근2(C-82), 주근10:세근0(C-10)의 6개의 비율로 추출 농축 후 동결건조하여 추출수율 및 진세노사이드 분석을 하였다. 추출수율은 인삼 또는 홍삼주근만 사용하였을 경우 29.9%로 가장 낮았고, 주근에 인삼 또는 홍삼세근의 비율을 높일수록 수율은 점차 증가하다가 인삼 또는 홍삼세근만 사용하였을 경우 54.0%로 주근만 사용했을 때보다 세근만 사용했을 경우 추출 수율이 약 2배가량 높은 것을 확인할 수 있었다 (표 10 및 도 6). 이것은 주근의 경우 피부가 두껍고, 물에 용출되지 않는 섬유질, 펙틴 및 전분이 세근보다 많기 때문인 것으로 사료되었다.

[표 10] 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근 배합 비율에 따른 추출 수율

2. 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따른 추출수율 비교

진세노사이드는 인삼 또는 홍삼의 주요성분 7가지를 대상으로 분석하였으며(표 11, 도 7 및 도 8), PPT 계열 진세노사이드로서 진세노사이드 Rg1, Re, Rf와 PPD 계열 진세노사이드로서 Rb1, Rc, Rb2, Rd를 분석하였을 때, 이들 7가지 진세노사이드를 총합으로 본 진세노사이드 총량은 인삼 또는 홍삼세근 추출물(C01)이 75.06 mg/g으로 인삼 또는 홍삼주근 추출물(C10) 30.17 mg/g보다 약 3.2배 월등히 높게 나타났으며, 인삼 또는 홍삼세근에 인삼 또는 홍삼주근을 비율별로 증가할수록 진세노사이드 총합 함량은 줄어들었다. 또한, 진세노사이드 Rd 전환 가능한 PPD 계열 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3, Rd의 합은 인삼 또는 홍삼세근 추출물(C01)이 57.64 mg/g으로 인삼 또는 홍삼주근 추출물(C10) 18.08 mg/g보다 약 3.2배 월등히 높게 나타났으며, PPD계열 진세노사이드 함량 역시 인삼 또는 홍삼세근에 인삼 또는 홍삼주근을 비율별로 증가할수록 감소하였다. 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 진세노사이드 Rd 강화를 위한 시료는 인삼 또는 홍삼주근보다는 인삼 또는 홍삼세근을 사용하는 것이 훨씬 유리할 것으로 사료 되었다.

[표 11] 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근 배합 비율에 따른 진세노사이드 분석

3. 한외여과 성분분획의 제조

주근:세근을 4:6의 비율로 혼합(R4S6)하여 500 g의 총 중량이 되도록 하고, 5 L의 물을 첨가하여 80 ℃에서 6시간 동안 3회 반복 추출 및 여과한 후 추출액 10 L를 3 kDa 및 5 kDa의 분자량컷(molecular cut-off)을 갖는 한외여과막을 활용하여 각각 0%(내액:외액 9:1), 20%, 40%, 60%, 80% 한외여과한 후, 한외여과 내액을 각각 동결건조하였다.

한외여과 농축액 (내액)의 수율은 3 kDa 및 5 kDa 한외여과막에서 여과율에 따른 수율차이를 나타내지 않았다 (표 12 및 도 7). 3 kDa 포어사이즈를 가진 한외여과막에 의한 수율로 볼 때 20% 한외여과했을 경우 수율은 89.2%으로 약 90%정도 됐고, 50% 한외여과했을 경우 70.9%의 수율을 나타냈으며, 80%까지 농축했을 경우의 수율은 54.9%로 나타났다 (표 12 및 도 7).

[표 12] 한외여과막 3 kDa와 5 kDa의 여과율에 따른 수율

내액:외액의 비율은 10%(내액:외액 9:1), 20%(내액:외액 8:2), 30%(내액:외액 7:3), 40%(내액:외액 6:4), 50%(내액:외액 5:5), 60%(내액:외액 4:6), 70%(내액:외액 3:7), 80%(내액:외액 2:8)을 나타낸다.

[ 실시예 1] 본 발명에 따른 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물 ( GS -E3D) 제조

인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 배합비에 따른 6개의 시료 C-01, C-28, C-46, C-64,C-82, C-10를 활용하여 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물을 제조하기 위한 조건 설정을 위한 실험을 하였다. 인삼 또는 홍삼 추출물에 펙티나제(10%, w/w)를 넣고 50℃ 교반배양기(Shaking incubator)에서 4일, 5일, 6일 동안 반응한 후 95℃에서 30분간 처리하여 효소 반응을 중지한 후 농축한 다음 PPT계열로서 진세노사이드 Rg1, Re, Rf와 PPD 계열로서 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3, Rd, F2, CK 함량을 각각 분석하였다. 당쇄가 3개 있는 진세노사이드 Rd는 당쇄가 4개 있는 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3로부터 효소에 의해 당이 1개 떨어지면서 만들어지며, 진세노사이드 Rd로부터 당쇄가 2개 있는 F2를 거쳐 당쇄가 1개 있는 CK로 전환된다. 따라서 진세노사이드 Rd 함량을 높이기 위해서는 기질인 추출물에 PPD 계열의 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rb3의 함량이 높을수록 유리하다.

하기 표 13 및 표 14에서 보여지는 바와 같이, 진세노사이드 Rd는 모든 조건에서 세근 100% 추출물인 C01에서 높게 나타나다가 주근의 함량이 늘어날수록 점차적으로 줄어들었고, 추출물의 농도를 브릭스(brix)로 기준하여 3브릭스, 6브릭스, 12브릭스로 하였을 경우 농도가 낮을수록 반응이 빨리 일어나 진세노사이드 Rd 함량이 늘어났다가 줄어들었으며, 농도가 높을 경우 반응이 천천히 지속적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 12 및 도 13). 그러나 본 제조물의 산업적 적용을 위해서는 반응시간의 단축도 중요하나 반응의 안정성 및 경제성도 중요하므로 반응시간의 단축을 위하여 추출물의 농도를 너무 낮게 할 수 없으므로 적정한 농도 및 반응시간을 결정하는 것이 중요하다. 따라서 발명자는 진세노사이드 Rd 함량을 높이면서 가장 경제성이 있는 조건을 선발하여 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물을 제조하였고 "GS-E3D"로 명명하였다. 요약하면, 주근 대비 세근의 비율이 60%이상 함유된 인삼 또는 홍삼을 물, 주정 또는 주정함유 용매에 추출하여 농축한 후 약 6 브릭스 (1~12 브릭스)로 조정한다. 6 브릭스의 인삼 또는 홍삼 추출물에 10%(w/w)의 펙티나제 효소를 첨가하여 50℃ 조건에서 3일간 교반 배양한 후 95℃에서 30분간 가열하여 효소 반응을 정지시켜 진세노사이드 Rd강화 인삼 또는 홍삼추출물(GS-E3D)을 제조하였다. 제조 공정도는 도 1과 같다.

[표 13] 조건에 따른 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물의 진세노사이드 함량(mg/g)

[표 14] 조건에 따른 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물의 진세노사이드 함량(mg/g)

[ 실시예 2] 진세노사이드 Rd 강화 인삼 또는 홍삼추출물 ( GS - E3D )의 규격기준

본 실시예에서 원료는 인삼 Panax ginseng C.A. Meyer(두릅나무과 Araliaceae)의 뿌리를 건조하여 만든 백삼 또는 수삼을 증기로 쪄서 익혀 말린 홍삼을 주정과 정제수 단독 또는 혼합액으로 추출한 다음, 식품첨가물용 효소 펙티나제를 넣고 효소 처리한 발효 인삼 또는 홍삼추출물이다.

본 실시예에서 제조방법은 인삼 또는 홍삼 (주근대비 세근 60%이상 함유) 1 kg에 물 또는 70% 주정 10L를 넣어 75℃에서 18시간 동안 1차 추출 후, 잔사에 30% 에탄올을 9L 넣고 75℃에서 18시간 2차 추출하여 1차 추출액과 2차 추출액을 합하여 농축하여 인삼 또는 홍삼 농축액 (60 Brix, 고형분 함량 60% 이상)을 제조한 후, 인삼 또는 홍삼농축액 100g을 정제수로 1000L가 되게 희석(6 Brix)한 다음 효소 10g을 넣어 50℃에서 3일간 반응시켜 얻었다. 본 시료의 성상은 적갈색으로 특이한 냄새가 있다.

상기 시료 0.2g을 정확하게 달아 메틸알코올 10mL에 녹여 0.45μm 멤브레인 필터로 여과한 시험용액을 사용하여 하기 표 15 및 표 16의 분석조건에 따라 분석기에 주입하여 HPLC 분석하여 피크 (진세노사이드 Rd)의 머무름 시간(RT)을 확인하였다.

[표 15]

[표 16]

본 시료의 기능성분은 진세노사이드 Rd이며 확인시험법에 따라 시험할 때 진세노사이드 Rd 함량은 15 mg/g이상이어야 한다. 본 시료를 가지고 약전 일반시험법 비중측정법 제1법에 따라 시험할 때 비중은 1.000∼1.040이어야 한다. 본 시료 3.0g에 새로 끓여 식힌 물을 넣어 30mL로 하여 약전 일반시험법 pH 측정법에 따라 시험할 때 pH는 5.0∼7.0이어야 한다. 본 시료를 가지고 약전 일반시험법 굴절률측정법에 따라 시험할 때 굴절률은 1.340∼1.380이어야 한다.

본 시료에 대한 순도시험 방법은 다음과 같다(표 17). 중금속은 본 시료 1.0g을 달아 약전 일반시험법 중금속시험법 제2법에 따라 조작하여 시험한다. 비교액에는 납 표준액 2.0mL를 넣는다(20ppm 이하). 비소는 본 시료 1.0g을 달아 약전 일반시험법 비소시험법 제3법에 따라 시험한다(2ppm 이하). 증발잔류물은 본 시료 1.0g을 달아 장원기 일반시험법 증발잔류물시험법에 따라 시험할 때 1.0∼5.0% 이어야 한다. 잔류농약시험은 본 시료를 가지고 식품의약품안전청고시 생약 등의 잔류오염물질 기준 및 시험방법에 따라 시험할 때 적합하여야 한다. 미생물한도시험은 본 시료를 약전 일반시험법 미생물한도시험법에 따라 시험할 때 호기성생균수는 1g당 100개 이하이어야 한다. 본 규격 및 시험방법에 대하여는 별도의 규정이 없는 한 약전 통칙 및 일반시험법을 준용하는 것으로 한다.

[표 17] 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물 (GS-E3D)의 순도시험 분석

[ 실시예 3] 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물 ( GS - E3D ) 성분 분석

본 발명에 따른 효소 발효 인삼 또는 홍삼 추출물(GS-E3D)을 제조하기 위하여 4년근 인삼 또는 홍삼을 사용하였고, 진세노사이드 Rd 함량을 높이기 위하여 주근 대비 세근의 비율을 60% 이상으로 설정하여 75℃에서 6시간 동안 물로 3회 추출하여 6 Brix까지 농축하여 주근 및 세근 혼합물의 추출액((GS-C46))을 제조하였다. 상기 혼합 추출물((GS-C46))에 펙티나제(Novozyme^®33095, Denmark)를 10%되게 첨가한 후 50℃의 교반 배양기에서 3일간 반응시켜 진세노사이드 Rb1 및 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환하였다. 더 이상의 반응을 중지하기 위하여 95℃에서 30분간 처리하여 효소를 불활성화시킴으로써 발효 인삼 또는 홍삼 추출물 제조를 완성하였고, 이것을 농축하여 엑기스 또는 분말의 형태로 만들어 분석에 사용하였다. 기능성분 설정은 진세노사이드 Rd(범위 15mg/g 이상)로 하여, 분석결과 기능성분 함량을 하기 표 18 및 도 14에 나타내었다.

진세노사이드 Rg1, Re, Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rb3,Rd, 20(S)-Rg3,20(R)-Rg3, Rk1, Rg5의 함량은 각각 5.9, 12.6, 4.7, 30.2, 14.0, 17.6, 2.5, 27.7, 1.3, 1.4, 0.8, 1.5 mg/g이었다.

[표 18] 진세노사이드 Rd 강화 발효 인삼 또는 홍삼추출물 (GS-E3D)의 기능성분 함량 분석

[실시예 4] 세포를 이용한 아토피 피부개선 활성 탐색

1. 대식세포를 이용한 1차 소재 탐색

(1) 세포 생존율 측정

Raw 264.7 세포를 96 well plate에 2×10⁵ cell/well로 분주한 다음 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양한 후 농도별로 처리하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양 후 EZ-CYTOX(Daile, Korea)을 이용하여 10 μL를 넣고 30분 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

(2) NO 생성량 측정 및 PGE2 생성량 측정 및 저해효과

Raw 264.7 세포를 96 well plate에 2×10⁵ cell/well로 분주한 다음 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양한 후 농도별로 처리하고 1시간 후에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양 후 NO kit(intron, Korea) 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

PGE2를 측정하기 위하여 세포를 24 well plate에 2×10⁵ cell/well로 분주한 다음 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 농도별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하였다. LPS 처리 후 12시간에 배지를 수거하여 R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였다. Coating된 96 well plate에 배지를 150 μL씩 첨가하고 primary antibody solution과 PGE2 conjugate 를 50 μL씩 각각의 well에 넣은 후 상온에서 2시간동안 배양하였다. Washing buffer로 4회 세척하고 200 μL의 substrate solution 30분간 반응시키고 stop solution을 100 μL 처리한 후 ELISA microplate reader로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

RAW 264.7세포에서 GS-E3D의 LPS 유도 NO 생성량 및 PGE2 생성량을 측정한 결과 농도 의존적으로 NO 및 PGE2 생성량을 감소하여 염증억제 효과가 있음을 확인하였다(도 15)

(3) TNF-α 생성량 측정 및 저해효과

TNF-α를 측정하기 위하여 세포를 24 well plate에 2×10⁵ cell/well로 분주한 다음 37℃, 5% CO₂ 24시간 동안 배양한 후, 농도별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하였다. LPS 처리 후 12시간에 배지를 수거하여 ELISA kit(BD, USA)를 사용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

RAW 264.7세포에서 GS-E3D, F1강화분획을 농도별로 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 농도 의존적으로 감소하여 LPS 유도 염증 반응을 억제?을 확인할 수 있었다(도 16).

(4) iNOS, COX-2 단백질 양 분석

Raw 264.7 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well로 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 농도별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하였다. 시간별로 배양한 후, Immunoblot analysis를 실시하였다. 발색 후 각 단백질의 발현량을 평가하기 위하여 Chemi-Doc (Bio-rad, USA)을 이용하여 분석하였다.

[실시예 5] 아토피 피부염 동물 모델에서의 효능 검증

1. 화학물질(DNCB; dinitrochlorobenzene)을 이용한 아토피 피부염 유발

마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치한 후 아세톤과 올리브오일을 3:1로 혼합하여 제조한 면역교란물질로써 2% DNCB 용액(2,4-dinitrochloro benzene) 200 μL를 등 부위에 도포하여 면역화 반응을 유도하였다. 3일 후부터 2일에 1회씩 0.5 % DNCB 용액 150 μL를 등 부위에 도포하여 DNCB 용액을 등 부위에 2회 도포 이후부터 가피가 형성되면서 긁는 행동이 심 및 등 부위의 가피가 벗겨지기 시작하여 아토피 피부염이 유발되었음을 확인 후 이때부터 시료처리를 염증발생 부위에 200 μL 도포하였다. 자연치유에 의한 오차를 막기 위해 3일에 1회씩(10:00) 0.5% DNCB 용액 150 μL를 마우스의 등에 도포하여 아토피 피부염을 모델을 설정하였다.

2. 실험군의 구성

약물 도포방법은 붓을 이용하였으며, 도포양은 2%, 0.5% 농도였고, 약물 투여 기간은 21일이었다. 정상군 (normal group, NOR): DNCB를 유발하지 않음), 대조군 (control group, CON): DNCB를 유발), Promethazine hydrochloride(Positive control group 2, PC 1 도포군 : DNCB를 유발하고, 2% 도포한 군), GS-E3D 도포군 : DNCB를 유발하고, 2%, 0.5% 도포를 동시에 시행한 군)으로 실험군을 설정하였다.

3. 육안적 관찰 및 피부 병변의 정도에 미치는 영향

아토피 피부염은 태선화, 인설 및 건조와 같은 증상을 유발한다. 또한 급·만성기 전반에 걸쳐 소양감이 발생하게 되는데, 이는 긁는 행위로 인해 창상, 2차 감염 등 2차적인 피부증상 악화를 초래하기 때문에 아토피 피부염 치료에 있어서 중요시되고 있다. 피부염을 인위적으로 일으키는 hapten 형성 물질인 DNCB (2,4-dinitrochlorobenzene)를 BALB/c 마우스의 등 부위에 도포하여 아토피 피부염 유사 마우스 모델을 만든 후 GS-E3D를 도포하여 아토피 피부염 증상에 미치는 영향을 알아보았다. DNCB의 도포가 반복될수록 정상군에 비해 DNCB 도포군의 홍반과 부종은 증가하였고, 양성대조군 도포군은 발생된 홍반과 부종을 감소시켰으나 GS-E3D의 도포군은 농도 의존적으로 홍반과 부종을 감소시켜 정상군과 유사할 정도로 홍반과 부종을 감소시켰다(도 17). 알레르기성 아토피 피부염이 발생하였을 때 나타나는 표피상의 증상으로서 극심한 가려움증과 더불어 홍반이나 건조한 피부, 짓무르는 현상 그리고 혈종이나 부종의 형성을 들 수 있다. 따라서 이러한 알레르기성 아토피 피부염의 심각성 정도를 홍반(Erythma), 가려움과 건조피부(Pruritus & Dry skin), 부종과 혈종(Edema & Excoriation), 짓무름(Erosion), 태선화(Lichenification)와 같은 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총합으로 나타내었을 때, 정상군에서는 피부의 형태학적 변화가 나타나지 않았으나, DNCB를 처리한 AD군에서는 홍반, 가려움과 피부건조, 짓무름, 부종과 혈종 등의 아토피성 피부 변화가 확인되었다. GS-E3D 도포군은 양성대조도포군 보다 피부 병변의 정도가 감소되어 있는 것이 관찰되었다(도 17).

4. Scratching behavior 측정

군 분리 직후와 아토피 피부염 유발 후, DNCB에 의해서 sensitization된 마우스 및 시료를 처리한 마우스들의 긁는 행동을 15분 동안 등쪽 부위를 물어뜯거나 뒷발로 긁는 등의 행동양식을 횟수 측정하였다.

DNCB로 유발된 가려움증으로 인한 긁는 횟수가 대조군은 현저히 증가하는 반면에 2% GS-E3D 도포군은 양성대조군 도포군보다 현저히 가려움으로 긁는 횟수가 감소하였다(도 18).

5. 비장 무게의 측정

비장의 무게는 실험 마지막 날 생쥐를 희생시킨 후, 비장을 적출한 다음 미량 저울 (OHAUS, USA)을 이용하여 측정하였다.

아토피 피부염의 발생에는 비장 내 helper T(Th) 세포의 분화가 관여한다. Th1 cell과 Th2 cell의 불균형이 알레르기성 질환의 발생과 연관되어 있는데, 아토피 피부염의 경우 유전적 요인에 의해 Th2 cell로의 분화가 많이 이루어지며 이에 따라 T-림프구가 증가하여 비장이 커지고 아토피 피부염 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 이와 반대로 비장 내 Th1 세포와 Th2 세포의 균형이 이루어지면 증가된 T-림프구가 감소되고 히스타민의 생성을 억제시켜 아토피 피부염의 증상 완화를 나타낼 수 있다.

아토피 피부염 유발 및 시료 도포에 의한 마우스의 면역반응을 확인하기 위해 비장 수치를 비교·분석하였다(도 19). 정상군에 비해 대조군은 약 4배 증가된 수치를 보였다. 그에 반면에 GS-E3D는 양성대조군 도포군보다 비장무게가 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내어 아토피 피부염 유발로 인해 증가된 비장 내의 T-림프구를 GS-E3D가 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.

6. 혈장 내 사이토카인, 히스타민 및 면역글로블린 정량 측정

혈장 내 존재하는 면역글로블린 IgE 및 사이토카인 IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-4 등을 kit를 이용하여 sandwich ELISA법에 의해 흡광도를 측정하였다.

(1) 혈중 히스타민 유리억제에 미치는 영향

비만세포는 과립내의 화학 매개체와 사이토카인을 분비하면서 염증반응에 관여하는데 히스타민은 비만세포의 과립으로부터 가장 빠르게 유리되며 가장 많이 유리되는 화학 매개체로 말초혈관에 대한 투과성 항진과 확장작용, 기관지 평활근에 대한 수축작용, 점막 표면에 대한 선상세포의 분비 항진 작용 등을 나타내어 과민반응 및 만성 염증반응을 일으켜 알레르기 반응에 중요한 작용을 한다. 혈중 히스타민 유리에 미치는 영향을 관찰한 결과, DNCB 도포군은 비만세포주의 활성화에 의하여 정상군에 비하여 2배 이상 증가하였고, GS-E3D는 농도 의존적으로 유의하게 histamine 유리를 감소시켰다 (도 20).

(2) Total IgE에 미치는 영향

아토피 피부염을 가진 환자의 80~85%가 혈청 중 총 IgE의 함량이 상승되어 있으며 아토피 피부염뿐만 아니라 천식, 비염 등의 알레르기성 질환의 발현에 IgE가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 알레르기 반응을 통해 혈청에서 증가된 IgE는 비만 세포의 탈과립화(degranulation)를 유도하여 염증성 매개물을 방출하며 이로 인해 아토피 피부염의 증상이 심화된다. DNCB 만도포한 대조군은 정상군에 비하여 total IgE 수치가 3배 이상 증가되었다. GS-E3D는 농도 의존적으로 유의하게 IgE 수치를 감소시켜 정상에 가까운 수치를 보였다 (도 21).

(3) Pro-inflammatory cytokine에 미치는 영향

아토피 피부염의 염증반응은 손상에 대한 국소반응으로, 여기에는 여러 종류의 염증세포와 염증성 cytokine 및 mediator 들이 관여한다. 특히 IL-1β, TNF-α, IL-6는 염증을 일으키는 주요한 cytokine으로 보고되고 있으며, 염증반응의 정도를 나타내는 지표로 이용되고 있다. 만성 염증성 반응과 관련된 TNF-α는 활성화된 대식세포 등에서 분비되며, 대식세포는 염증반응시에 TNF-α와 함께 ROS(reactive oxygen species), IL-1β, IL-6와 같은 사이토카인을 생산한다. 대조군은 정상군에 비해 혈청 TNF-α 수준이 2배이상 증가 하였으나, GS-E3D는 농도 의존적으로 TNF-α 수준의 증가를 유의하게 억제하였다 (도 22A).

IL-1는 모든 cytokine 중 가장 전형적이고 중요한 cytokine으로 그 중 IL-1β 랑게르한스세포나 대식세포에서의 주된 cytokine이다. IL-1β는표피로부터 랑게르한스세포가 이주하는데 관여하고 있다. GS-E3D는 L-1β의 농도를 정상수준까지 감소시켰다(도 22B). IL-6 역시 2% GS-E3D 도포군은 정상수준까지 감소시킴을 확인할 수 있었다 (도 22C).

(4) Th1 세포에 미치는 영향

Th1 세포에서 분비되는 IFN-γ는 알레르기 반응을 일으키는 Th2 세포를 감소시키고 IgE 생산을 증가시키는 B세포 분화를 감소시키는 것으로 알려진 사이토카인이다. 혈청에서 Th1 cytokine인 IFN-γ를 분석한 결과 INF-γ의 농도는 정상군은 대조군에 비해 1.5 배 증가하였고, 2% GS-E3D은 양성대조군과 비슷하게 IFN-γ 증가하는 수치를 나타내었다(도 23).

(5) Th2 세포에 미치는 영향

아토피 피부염은 초기에 Th2 세포가 IL-4, IL-5 및 IL-13 등의 Th2 사이토카인을 과량 생성한다. IgE의 생성을 증폭시키는 IL-6 등과 같은 면역인자와 깊은 관련이 있다. 이들 중 IL-4는 B세포를 자극하여 IgE을 대량생성하게 하여, 비만세포 활성을 유도하고 아토피 피부염의 핵심 분자들을 발현시켜 염증반응을 가속화 시킨다. 이와 같이 아토피가 급성적으로 진행되면 Th 사이토카인 뿐만 아니라 CCL17, CCL22와 CCL27과 같은 일련의 Th2 케모카인이 발현됨으로써 염증관련 면역세포가 상처부위로 과다하게 침윤되고 더욱 더 심한 염증반응을 유발하여 피부조직에 부종과 함께 가려움증이 생기며 심각한 피부손상을 일으킨다.

IL-4는 B세포의 증식을 자극하고 Th2 세포에 대한 성장 및 분화인자로서 작용하며, VCAM-1등의 부착분자의 발현을 자극하여 림프구, 단핵구, 호산구의 결합을 증진시키고 비만세포의 성장인자인 IL-3와 상승작용을 일으킨다.

혈중 IL-4수치는 대조군은 정상군에 비해 약 3.7 배 이상 증가를 나타내었고, GS-E3D는 농도 의존적으로 유의하게 감소되었으며 정산군에 가깝게 IL-4 농도를 억제하였다 (도 24A). IL-10의 경우에는 양성대조군 도포군보다 유의하게 감소시켰다(도 24B).

7. 조직 변화에 미치는 영향

피부 조직에 H&E 염색을 실시한 결과, 정상군(A)은 epidermis가 얇게 분포하였고, 비만세포가 거의 관찰되지 않았다. 이에 비해 대조군(B)은 epidermis의 두께가 과형성, 확장되어, 그 주변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증, 비만세포의 침윤이 정상군에 비하여 현저하게 증가하였고, 양성대조군 도포군은 대조군에 비하여 표피두께가 줄어들었다. 2% GS-E3D 도포군은 정상군에 가깝게 epidermis의 두께가 줄어들었고 그 주변에 세포변형과 각화증상, 비만세포의 침윤 등이 감소됨을 확인하였다(도 25 및 도 26).

8. Skin severity score 측정

아토피 피부염의 심각성 정도를 홍반(Erythma), 가려움과 건조피부(Pruritus & Dry skin), 부종과 혈종(Edema & Excoriation), 짓무름(Erosion), 태선화(Lichenification)와 같은 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타낸다. 각각의 항목에 대하여 증상 없음(0점), 증상 약함(1점), 보통(2점), 심함(3점)으로 채점한 후, 5항목의 점수를 합산함으로써 최소 0점에서 최고 15점 사이의 평가점수 부여하였다.

9. 피부조직의 병리검사

희생 부검한 동물의 등 피부를 적출하여 10% 중성완충포르말린용액에 고정하여 haematoxylin-eosin 염색법을 서울메디컬센터에서 의뢰하여 분석하였다.

10. 통계처리

실험결과는 SPSS 프로그램을 이용하여 one-way ANOVA 검정 수행하여 각 처리군 간의 유의성 검증은 Tukey's multiple range test에 의하여 p<0.05 수준으로 실시하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직하게 구현한 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물을 이용하여 펙티나제로 효소 발효시킨 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 개선용 조성물.
제 1 항에 있어서,
인삼의 주근 및 세근 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계(1단계); 및
상기 혼합 추출액에 펙티나제 효소를 첨가하여 효소 발효시키는 단계(2단계)를 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 개선용 조성물.
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