KR102001740B1 - 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량 숙취 예방 및 해소용 액상조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 활성산양삼 복합-발효액을 유효성분으로 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량 간 보호용 액상조성물 및 그 제조방법이 개시된다. 본 발명에 따른 액상조성물은 간 보호 기능이 탁월하여 종래 홍삼 음료에 비하여 저용량(1/2 이하)으로도 비알코올성 및 알코올성 간 기능 장애의 예방 및 개선용 기능성식품으로 유용하다. 또 알코올 및 알코올 대사산물에 기인한 숙취의 예방 또는 해소용 음료로 유용하다.
Description
본 발명은 활성산양삼 복합-발효액을 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량 간 보호용 액상조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 산양삼을 고온 숙성하여 열수로 추출한 추출물을 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주로 복합발효하여 제조된 활성산양삼 복합-발효액을 포함하여, 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이가 현저히 증진된 간 보호용 및 숙취 예방/해소용 액상조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
간 기능장애(손상, 질환)는 과도한 스트레스, 음주, 흡연 및 약물에 의해 빈번히 일어나고 있으며, 인체에 치명적인 위험을 가하므로 사회적으로 지대한 관심의 대상이 되고 있다. 간 기능장애는 원인별로 분류하면 크게는 알코올성과 비알코올성 간 기능장애로 분류할 수 있고, 비알코올성은 바이러스성 기능장애, 약물 독성으로 인한 기능장애, 간 조직에 지방이 축적되는 지방간 등으로 세분할 수 있다. 종래 간질환 치료제로서 간 기능 보조제, 항바이러스제, 간세포 촉진제, 면역억제제, 섬유화억제제, 인터페론 등이 사용되고 있지만, 위와 같은 제제들은 간 지능장애에 효과적이지 못하고 부작용 및 재발의 위험이 높기 때문에 최근에는 천연물로부터 간 기능장애에 유효하거나 간 보호 활성을 가진 물질 탐색이 이루어지고 있다 (등록특허 10-1437641).
숙취란 술에 몹시 취한 뒤의 수면에서 깬 후에 특이한 불쾌감이나 두통, 속쓰림, 두근거림, 갈증, 멀미, 위장질환, 설사, 또는 심신의 작업능력 감퇴 등이 1~2일간 지속되는 것을 뜻한다. 간으로 들어온 알코올은 간세포 세포질 내의 알코올 탈수소효소에 의해 알코올이 아세트알데히드로 산화되고, 아세트알데히드는 알데히드 탈수소효소에 의해 아세테이트로 전환되며, 이는 순환계를 통해 간세포 밖으로 배설되어 진다. 특히 아세트알데히드는 반응성이 매우 높고 독성이 강하여 알코올성 간 손상의 주 원인물질로 알려져 있으며, 세포 내 에너지 생성기관인 미토콘드리아의 호흡을 방해하고 산화적 인산화 반응을 억제하기도 한다.
알데히드 탈수소효소는 아세트알데히드가 저농도라도 산화를 개시하는 Ⅱ형과, 아세트알데히드가 고농도로 되지 않으면 작용하지 않는 Ⅰ형이 있으나, 동양인은 일반적으로 Ⅱ형 알데히드 탈수소효소가 결핍 또는 부족하기 때문에 아세트알데히드의 산화가 느리거나 산화되지 않아 간세포와 체내에 축적된 아세트알데히드 및 알코올의 유독 작용에 의해 정상적인 신진대사가 방해받아 숙취 현상을 느끼게 되는 것이다. 따라서 혈중 알코올 농도를 감소시키고 알코올 및 아세트알데히드 분해 촉진을 통한 숙취 해소 방법들이 개발되어 왔으며, 그 중에서도 한약재 혹은 천연물을 이용하는 방법들이 주목을 받고 있다 (등록특허 10-1723022호, 공개특허 10-2017-0075250호).
고려인삼의 속명인 Panax는 그리스어의 Pan(모든)과 Akok(치료하다)의 복합어로서 '모든 병을 치료한다'라는 의미로 예로부터 식약용으로 가장 널리 이용되고 있는 약용작물이다. 인삼은 약 60％의 탄수화물, 8~15％의 조단백질, 1~3％의 조지방, 4~6％의 회분, 3~7％의 조사포닌, 그 외 미량성분들로 구성되어 있다. 삼은 중추신계를 비롯하여 내분비계, 면역계, 대사계 등에 영향을 미쳐 신체기능 조절에 다양한 약리효과를 나타낸다고 보고되어 있으며, 이와 같은 약리효과는 특히 활성형 진세노사이드의 작용에 기인하는 것으로 알려져 있다.
활성형 진세노사이드는 인체 장내에서 흡수가 용이한 진세노사이드로서 진세노사이드 Rg1, Rg3, Rd, Rf, Rh, F2, 컴파운드 케이(compound K) 등이 있다. 특히 진세노사이드 Rg3, F2 및 컴파운드 케이는 간 보호 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 그러나 이들 활성형 진세노사이드는 삼 자체에는 거의 함유되어 있지 않고, 이를 해결하고자 효소나 장내 미생물을 이용하여 삼에 포함된 진세노사이드를 활성형으로 전환하는 기술들이 몇몇 개발되어 있으나 전환률이 낮아서 실제 제품화로 이어지지 못하는 실정이다.
이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속한 결과, 산양삼을 고온 숙성하여 열수로 추출한 추출물을 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합발효하여 제조한 활성산양삼 복합-발효액이 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이가 현저히 증진되고 간 보호, 숙취 예방 및 해소 활성이 우수하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 활성산양삼 복합-발효액을 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량 간 보호, 숙취 예방 및 해소용 액상조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조되고, 활성산양삼 복합-발효액을 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량 간 보호용 액상조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조되고, 활성산양삼 복합-발효액을 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량 숙취 예방 및 해소용 액상조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 액상조성물을 포함하는 간 보호, 숙취 예방 및 해소 기능성을 갖는 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기와 같은 단계들을 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량의 간 보호용, 숙취 예방 및 해소용 액상조성물의 제조방법을 제공한다:
ⅰ) 산양삼을 증숙하는 단계;
ⅱ) 증숙된 산양삼을 숙성하는 단계;
ⅲ) 숙성 산양삼의 열수로 추출하는 단계;
ⅳ) 숙성 산양삼의 열수추출물을 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합 종균으로 발효하여 활성산양삼 복합-발효액(액상조성물)을 얻는 단계.
본 발명의 제조방법은, 필요에 따라서 추가로, 단계 ⅳ)으로부터의 활성산양삼 복합-발효액에 타우린, 구연산, 올리고당, 벌꿀, 과일농축액 등의 첨가제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 '산양삼'은 산지에서 차광막 등 인공시설을 설치하지 아니하고 무농약으로 재배되는 삼을 의미한다.
본 발명에서 ‘간 보호’는 알코올성과 비알코올성 간 기능장애(손상, 질환) 예방 또는 개선을 의미한다.
본 발명에서 ‘숙취’는 음주 후 나타나는 신체적, 정신적 불쾌감을 총칭하는 것으로 객관적인 증상으로는 두통, 메스꺼움, 구토, 졸음, 운동능력저하, 혈액학적 변화, 호르몬의 변화 등의 현상을 말한다. 숙취의 원인은 알코올 대사과정에서 발생되는 대사산물인 아세트알데히드가 체내 잔존하는 농도가 높을 경우 나타나는 것으로 알려져 있다.
단계 ⅰ)
산양삼
증숙
산양삼을 증숙(steaming process)한다.
산양삼은 3년근 이상을 사용하는 것이 바람직하다.
증숙은 100℃에서 30~120분간 수행하며, 통상의 찜기와 같은 증숙기를 사용하여 수행할 수 있다.
증숙시간이 30분 미만인 경우 충분한 증숙이 진행되지 않아 숙성과 같은 후속 단계가 원활하지 않을 수 있고 잡균의 오염이 발생될 수 있으며, 120분 초과하여 증숙될 경우는 오랜 열처리로 산양삼의 생리활성성분이 파괴될 수 있다.
단계 ⅱ) 숙성
증숙된 산양삼을 숙성시킨다.
숙성은 60~80℃의 고온에서 8∼12일간 유지하여 수행한다. 이때 개방용기를 사용하여 수분이 증발되게 하거나, 밀폐용기를 사용하여 수분이 증발되지 않게 하여 수행할 수 있다.
숙성온도가 60℃ 미만이거나 숙성기간이 8일 미만인 경우 숙성이 원활히 이루어지지 않으며, 숙성온도가 80℃ 초과하거나 숙성기간이 12일 초과의 경우 생산된 생리활성물질이 분해되어 함량이 감소될 수 있다.
필요에 따라 숙성된 산양삼은 건조시켜 100 메쉬 이하의 분말로 제조하여 사용할 수 있다. 건조 온도는 55~55℃가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 ⅲ)
열수
추출물 제조
단계 ⅱ)로부터의 숙성 산양삼을 열수(熱水)로 추출한다.
열수는 95 ~ 100℃가 바람직하고 숙성 산양삼 중량 대비 15 ~ 25배 (v/w) 첨가하는 것이 바람직하다.
추출은 4시간 이상 수행하여 1 ~ 2 브릭스(brix)의 추출물을 얻는다.
단계 ⅳ) 복합발효
숙성 산양삼의 열수 추출물을 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합 종균으로 발효하여 활성산양삼 복합-발효액(액상조성물)을 얻는다.
본 발명에서 복합 종균을 구성하는 하나의 균주인 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주는 본 발명자들이 김치로부터 분리/동정하여 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2016년 12월 12일에 기탁한 균주(수탁번호 KACC 92157P)로, 가바(GABA)의 생산성 및 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K)와 같은 활성 진세노사이드의 생산성이 탁월하다 (특허출원 10-2017-0152033).
본 발명에서 복합종균을 구성하는 또 다른 하나의 균주인 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 본 발명자들이 발효식품으로부터 분리/동정하여 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2013년 7월 19일에 기탁한 균주(수탁번호 KACC91848P)로서, 생균제제능이 우수하고 생리활성물질 생산성이 우수한 특성을 갖는다 (등록특허 10-154418호).
본 발명의 복합종균을 구성하는 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 발효 특성이 상호 보완되어 상승작용을 나타낸다. 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주는 이형유산발효(hetero-lactic acid fermentation) 유산균으로 단독 발효시 유산 생성이 충분하지 않아 오염이 되기 쉽고, 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 동형유산발효(homo-lactic acid fermentation) 유산균으로 단독 발효시 유산이 과다하게 생성되는데, 놀랍게도 산양삼을 이들 두 가지 종균을 함께 사용하여 복합발효시 양 균주의 발효 특성이 상호 보완되고 활성형 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이의 생성이 현저히 증진되었다 (표 3).
본 발명에서 복합 종균은 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주를 각각 별도 배양하여 첨가시 혼합할 수도 있으며, 혼합 배양된 혼합 배양액으로서 첨가될 수도 있다.
복합종균에서 상기 2종의 균주의 혼합 비율은 3 : 1 ~ 1 : 3(v/v)으로 혼합될 수 있다.
발효는 상기 복합종균의 배양액을 숙성 산양삼의 열수 추출물에 2 ∼ 10%(v/w) 농도로 접종하여 25 ~ 40℃에서 2 ~ 7일간 발효시키는 것으로 수행될 수 있다.
복합종균 접종량이 2%(v/w) 미만일 경우에는 발효 속도가 지연될 수 있고 10%(v/w) 초과시에는 균체 증식 속도가 빨라 활성 진세노사이드의 전환율이 낮으며 신맛이 등이 과다할 수 있으며, 발효 온도가 25℃ 미만일 경우 발효기간이 길어져 잡균의 오염을 초래하고 40℃를 초과할 경우에는 균주의 생육이 정지될 수 있고, 발효 기간이 2일 미만일 경우 발효가 충분하지 않아 생리활성물질 등의 생성이 저조하게 될 수 있으며, 7일을 초과의 경우 과발효에 의해 생리활성물질이 분해될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조되고, 활성산양삼 복합-발효액을 유효성분으로 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량 간 보호용 액상조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 액상조성물은 활성형 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이를 각각 0.1 mg/ml 이상 함유하고, 용량 100 ml 기준으로 할 때 활성형 진세노사이드 함유량이 45 mg으로 고농도가 된다 (표 3 및 도 2).
본 발명에 따른 액상조성물은 비알코올성 간 손상에서 기인하는 혈중 ALT 함량도 유의적으로 억제하고 간 조직의 형태변화, 괴사 및 출혈 등과 간 세포사멸이 억제되어 비알코올성 간 손상으로부터 간 보호 효과가 우수하다 (도 3 ~ 도 5).
또한 본 발명에 따른 액상조성물은 알코올 섭취로 인한 혈중 ALT 함량도 유의적으로 억제하고 간 지질축적이 억제되어 알코올성 간 손상으로부터 간 보호 효과가 확인되었다 (도 6 및 도 7).
본 발명에 따른 액상조성물은 in vivo 상에서(ICR 마우스를 사용한 동물 실험) 정향반사 소실 억제효과(AUC 값: 14.6 및 19% 감소)를 나타내고 알코올과 아세트알데히드의 혈중 농도를 유의적으로 억제하여 숙취 예방 및 해소에 효과도 가진다 (표 4 및 도 8).
본 발명의 액상조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 간 보호 및 숙취 예방 및 해소 목적으로 장기간 섭취할 수 있는 건강보조제(건강기능성식품)로서 유용하다. 본 발명의 액상조성물 섭취 적정량은 성인기준 1일 10 ~ 20 ml이다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은 상기 액상조성물을 포함하는 간 보호, 숙취 예방 및 해소 기능성을 갖는 식품을 제공하는 것이다.
본 발명에서 식품은 액상조성물을 그대로 음료로 이용하거나, 타우린, 구연산, 올리고당, 벌꿀, 과일농축액 등의 첨가제를 추가로 첨가한 음료로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 액상조성물은 활성산양삼 복합-발효액을 유효성분으로 포함하여 현저히 증진된 함량으로 활성형 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이를 함유한다.
또한 본 발명에 따른 액상조성물은 종래 홍삼 음료에 비하여 저용량(1/2 이하)으로 알코올 섭취에 기인한 혈중 ALT 함량과 간 지질축적을 유의적으로 억제하여 간 보호용 음료로 유용하며, 특히 알코올성 간 기능장애의 예방 및 개선용 기능성식품으로 유용하다.
또한 본 발명에 따른 액상조성물은 염증성 간 손상에 기인하는 혈중 ALT 함량과 간 조직세포 손상, 간 세포사멸도 유의적으로 억제하여 간 보호용 음료로 유용하며, 특히 비알코올성 간 기능 장애의 예방 및 개선용 기능성식품으로 유용하다.
또한 본 발명에 따른 액상조성물은 정향반사소실 억제효과를 나타내는 효과가 탁월하여 알코올 및 알코올 대사산물에 기인한 숙취의 예방 또는 해소용 음료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 간 보호용 및 숙취 예방/해소용 액상조성물의 제조공정의 일례를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 액상조성물의 진세노사이드 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 조성물의 LPS/GalN 처리에 기인한 혈중 ALT의 감소 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 조성물의 LPS/GalN 처리에 기인한 간 손상에 대한 보호 효능을 보여주는 간 조직 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물의 LPS/GalN 처리에 기인한 간 세포사멸 억제효능을 보여주는 간 조직 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물의 알코올에 기인한 혈중 ALT의 감소 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물의 알코올에 기인하는 간 조직의 지방 축적을 억제하는 효능을 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 조성물의 알코올 투여 후 정향반사소실에 대한 억제효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 액상조성물의 진세노사이드 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 조성물의 LPS/GalN 처리에 기인한 혈중 ALT의 감소 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 조성물의 LPS/GalN 처리에 기인한 간 손상에 대한 보호 효능을 보여주는 간 조직 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물의 LPS/GalN 처리에 기인한 간 세포사멸 억제효능을 보여주는 간 조직 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물의 알코올에 기인한 혈중 ALT의 감소 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물의 알코올에 기인하는 간 조직의 지방 축적을 억제하는 효능을 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 조성물의 알코올 투여 후 정향반사소실에 대한 억제효과를 보여주는 그래프이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
제조예
: 본 발명의 액상조성물(
활성산양삼
복합-발효액) 제조
<숙성 산양삼 제조>
산양삼은 함양군 서상면 일대에서 재배된 3년근 이상을 구입하여 사용하였다. 산양삼(뿌리) 5 kg을 흐르는 물에 3회 세척하고 완전히 물기를 제거한 후 찜기에 담은 후 100℃에서 60분간 증숙하였다.
증숙된 산양삼을 건조 채반에 나란히 담은 후 75℃의 고온에서 수분이 증발되게 하여 10일간 숙성시켜 숙성 산양삼을 제조하였다.
숙성 산양삼은 50 ~ 55℃에서 2 ~ 3일 건조시킨 후 분쇄기로 100메쉬 이하로 분쇄하여 분말을 제조하였다 (도 1).
<복합발효>
상기에서 준비된 숙성 산양삼 100 g에 정제수를 중량 대비 20배 (v/w) 첨가하고 95∼100℃에서 4시간 동안 추출하여 발효를 위한 1.5 브릭스(brix)의 숙성 산양삼 열수 추출물을 제조하였다. 준비된 추출물에 설탕을 중량 대비 2%(w/v)로 첨가한 후 121℃에서 15분 동안 살균시키고, 살균된 열수 추출물에 1×109 CFU/ml의 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주 및 1×109 CFU/ml의 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주를 추출물 중량 대비 각각 2.5%(v/v)로 접종한 후 30℃에서 5일 동안 발효시켜 활성산양삼 복합-발효액(액상조성물)을 얻었다.
본 발명에 따른 액상조성물(실시예 1)과 비교를 위하여 시판되고 있는 산양삼-홍삼 추출음료 제품 (비교예 1; ㈜함양산양삼, 산양산삼속으로; 시판제품)의 이화학적 특성과 생리활성물질 함량 분석을 수행하였다.
<이화학적 특성>
pH는 pH 미터기를 사용하여 측정하였고 산도는 중화적정법을 통해 수행하여 젖산으로 환산하여 표기하였고, 환원당은 DNS법(Mille, 1953)을 통해 수행하여 포도당으로 환산하여 표기하여 그 결과를 표 1에 나타냈다.
| 함량1 ) | 비교예 1 | 실시예 1 |
| pH | 3.61 | 3.58 |
| 산도 (%, lactic acid) | 0.70 | 0.81 |
| 가용성 고형분 (。Brix) | 4.2 | 3.7 |
| 환원당 (mg/mL) | 22.24 | 20.43 |
| 1)모든 실험은 삼 반복 수행하였음. | ||
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 액상조성물은 비교예 1의 시판제품과 pH, 산도는 거의 유사하였고, 가용성 고형분 및 환원당은 약간 적었다.
<생리활성물질 함량 분석>
본 발명의 액상조성물(실시예 1)과 비교예 1의 음료(시판제품)를 0.45 μm 여과필터로 여과하여 그 여과액에 대해서 총 페놀릭스, 총 플라보노이드스 함량을 분석하였다.
총 페놀릭스 함량은 Folin Denis법(1912)으로 측정하였다. 구체적으로는 준비된 각각의 여과액 시료를 시험관에 0.5 ml 분주하고 여기에 25% Na2CO3 용액 0.5 ml를 첨가하여 3분간 정치시켰다. 다시 2N-Folin-Ciocalteu 페놀 시약 0.25 ml를 첨가하여 혼합한 다음 30 ℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀릭스 함량은 갈산을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하여 갈산(Gallic acid)에 상당하는 양으로 계산하여 표 2에 나타내었다.
총 플라보노이드 함량은 Davis 변법으로 측정하였다. 상기에서 준비된 시료 0.1 ml에 1 N NaOH 0.01 ml를 첨가한 후 디에틸렌글리콜 1.0 ml를 첨가하여 37℃에서 1시간 방치 후 420 nm 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 루틴(rutin)의 최종 농도를 0, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml로 제조하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하여 표 2에 나타내었다.
| 분석항목1 ) | 비교예 1 | 실시예 1 |
| 총 페놀릭스 (mg/ml d.w.) | 0.33 | 0.34 |
| 총 플라보노이드스 (mg/ml d.w.) | 0.80 | 0.85 |
| 1)모든 실험은 삼 반복 수행하였음. | ||
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 액상조성물(실시예 1)은 비교예 1의 음료 (시판제품)과 총 페놀릭스(phenolics)과 총 플라보노이드스(flavonoids) 함량은 거의 대등하였다.
시험예
1. 활성형 진세노사이드 함량 분석
상기에서 제조된 본 발명의 액상조성물(실시예 1)과 비교예 1의 음료(시판제품)를 0.45 μm 여과필터로 여과하여 그 여과액에 대해서 진세노사이드 함량을 분석하였다.
진세노사이드 분석은 기능성식품분석법의 홍삼 사포닌 분석법에 기술된 방법을 약간 변형하여 고압액체크로마토그래피(HPLC, high press liquid chromatograph)로 분석하였다. 분석 컬럼은 TSKgel ODS-100Z을 사용하여 시료주입량 10㎕, 온도는 30℃ 측정파장은 203 nm, 유속은 1.0 mL/min으로 하였고 이동상으로는 A용액은 HPLC water, B용액은 아세토니트릴을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 용액은 0분때 A용액 81% : B용액 19%로 흘려주고 15분때에는 A용액 80% : B용액 20%로 흘려주고 40분때 A용액 77% : B용액 23%, 42분때 A용액 70% : B용액 30%, 75분때에 A용액 65% : B용액 35%, 80분때에 A용액 30% : B용액 70%, 90분때에 A용액 10% : B용액 90%로 이동상을 흘려주었다. 각 HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타내고, 활성형 진세노사이드 함량을 표 3에 나타내었다.
| 함량1 ) (mg/ml d.w.) | 비교예 1 | 실시예 1 |
| Ginsenoside Rg2 | nd | 0.01 |
| Ginsenoside Rd | nd | 0.01 |
| Ginsenoside Rd2 | nd | 0.03 |
| Ginsenoside F2 | nd | 0.10 |
| Ginsenoside Rg3 | nd | 0.12 |
| Ginsenoside Compound K | nd | 0.18 |
| 총 활성형 진세노사이드 | - | 0.45 |
| 1)모든 실험은 삼 반복 수행하였음. 2)nd: 검출되지 않음. |
||
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 액상조성물(실시예 1)과 비교예 1의 음료 (시판제품)의 활성형 진세노사이드 함량을 분석한 결과, 비교예 1에서는 활성셩 진세노사이드가 검출되지 않았고, 본 발명의 액상조성물에서는 활성형 진세노사이드 Rg2, Rd, Rd2, F2, Rg3 및 컴파운드 케이(compound K)가 각각 0.01 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.12 mg/ml 및 0.18 mg/ml로 검출되었다. 특히 본 발명의 액상조성물은 간 보호 활성을 갖는 활성형 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이를 현저히 증진된 양(0.1 mg/ml, 0.12 mg/ml 및 0.18 mg/ml)으로 함유하고 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 액상조성물은 용량 100 ml 기준으로 할 때, 진세노사이드 섭취량(함유량)이 45 mg으로 매우 고농도가 된다.
시험예
2. 비알코올성 간 손상 보호 효능 검정
본 발명에 따른 액상조성물 (실시예 1), 비교예 1의 음료 (시판제품)와 대조예 (물)에 관하여 비알코올성(염증성 간 손상) 간 손상 보호(예방) 효능을 혈중 ALT 농도와 간 조직의 형태학적 분석을 통하여 검정하였다.
<혈중 ALT 농도>
알라닌 아미노전이효소(Alanine aminotransferase, ALT)는 간세포 안에서 아미노산 생성에 관여하는 효소로, 간세포가 손상될 경우 혈관 내로 방출되어 혈중 수치가 증가하게 된다. 따라서 혈중 ALT 농도 감소 여부를 분석하여 간 보호 효과를 검정할 수 있다.
염증성 간 손상 동물모델은 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 실험에 앞서 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스 50마리는 사료 섭취로 인해 나타날 수 있는 위장관을 통한 알코올의 흡수 방해 현상을 배재하기 위해 18시간 동안 절식시켰다. 마우스 50마리를 10마리씩 5개군으로 나누고 1개 군에는 물 (대조예) 10 ml/kg 경구투여하고, 다른 2개 군에는 시판제품(비교예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 나머지 2개 군에는 본 발명의 액상조성물(실시예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 1시간 후에 LPS(lipopolysaccharide) 10 ㎍/㎏과 GalN(galactosamine) 700 ㎎/㎏을 복강투여한 후 5시간 후에 대정맥에서 채혈하였고, 채혈된 혈액을 혈장을 분리한 다음 혈중 ALT의 함량을 자동 생화학 분석기(syncron cx 7 superior clinical system, Beckman Coulter, USA)를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다. 정상군으로서 무처리 마우스로부터도 동일한 방식으로 채혈하고 혈중 ALT의 함량을 측정하여 그 결과도 함께 나타냈다.
도 3에 도시된 바와 같이, 정상군(무처리구)에 비해 대조예(물 처리)의 ALT 농도는 약 800배 증가하였다.
대조예 대비, 시판제품인 비교예 1이 10 ml/kg로 투여군은 LPS/GalN에 의해 증가한 ALT의 감소 효과를 나타내지 않았으며 20 ml/kg 투여군에서는 약 19.4%의 ALT가 감소효과를 나타냈다.
이에 비하여, 본 발명의 액상조성물 (실시예 1)이 10 ml/kg로 투여군에서도 LPS/GalN에 의해 증가한 ALT가 약 15.6% 감소효과를 나타냈고, 20 ml/kg 투여군에서는 약 22.4% 감소효과를 나타냈다.
<간 조직의 형태학적 분석>
염증성 간 손상 동물모델에서 각 시료의 액이 손상되는 간 조직에 대한 보호 효과를 분석하였다.
상기와 같은 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스 50마리를 10마리씩 5개군으로 나누고 1개 군에는 물 (대조예) 10 ml/kg 경구투여하고, 다른 2개 군에는 시판제품(비교예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 나머지 2개 군에는 본 발명의 액상조성물(실시예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 1시간 후에 LPS(lipopolysaccharide) 10 ㎍/㎏과 GalN(galactosamine) 700 ㎎/㎏을 복강투여한 5시간 후에 각 군에서 5마리씩의 간 조직을 적출하여 적출된 간 조직은 10% 중성 포르말린 용액(10% neutral formalin solution)으로 고정시키고 파라핀 포매(paraffin-embedded) 과정을 거친 후 5 ㎛ 두께의 절편으로 잘랐다. 상기 잘라진 간 조직을 유리 슬라이드에 고정시키고 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin and eosin staining)을 실시한 다음 100배율에서 관찰하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 간의 조직학적 관찰에 의하면, LPS/GalN에 의한 손상의 지표로 사용되는 간 조직의 형태변화, 괴사 및 출혈 등이 본 발명의 액상조성물(실시예 1)을 투여한 마우스의 간에서는 현저한 감소하였음을 확인할 수 있다.
LPS(lipopolysaccharide) 10 ㎍/㎏과 GalN(galactosamine) 700 ㎎/㎏을 복강투여한 6시간 후에 각 군에서 나머지 5마리씩의 간 조직을 적출하였고, TUNEL 분석법(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay)을 실시하였다. 구체적으로, 적출된 간 조직을 10% 중성 포르말린 용액으로 고정시키고 파라핀 포매 과정을 거친 후 5 ㎛ 두께의 절편으로 잘랐으며, 잘라진 간 조직은 인시츄 셀 데스 검출키트(in situ cell death detection kit, Roche, 스위스)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 실험을 수행하였고 그 결과를 도 5에 나타냈다. 사멸된 세포는 초록색 형광(green fluorescence)을 나타난다.
도 5에 도시된 바와 같이, 정상군(무처리구) 대비, 대조예에서는 세포사멸이 일어난 세포가 현저하게 많음이 확인되는데, 이에 비하여 본 발명의 액상조성물의 투여군 (실시예 1)은 저농도 (10 ml/kg)로 투여시에도 세포사멸이 현저하게 감소됨이 확인된다.
위와 같은 결과들로부터, 본 발명의 액상조성물은 저농도로 투여시도, 혈중 ALT 농도의 감소 활성, 간세포 손상 억제 및 간세포 사멸 억제의 활성이, 고농도 투여시의 현 시판제품의 효능에 필적할 정도로, 비알코올성 (염증성) 간 손상에 대한 간 보호 효능이 우수하다는 것을 알 수 있다.
시험예
3. 알코올성 간 손상 보호 효능 검정
본 발명에 따른 액상조성물 (실시예 1), 비교예 1의 음료 (시판제품)와 대조예 (물)에 관하여 알코올성 간 손상 보호(예방) 효능을 혈중 ALT 농도와 간 조직의 형태학적 분석(간 지방 축적)을 통하여 검정하였다.
<혈중 ALT 농도>
상기 시험예 2에서와 같이, 절식시킨 C57BL/6 마우스 50마리를 10마리씩 5개군으로 나누고 1개 군에는 물 (대조예) 10 ml/kg 경구투여하고, 다른 2개 군에는 시판제품(비교예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 나머지 2개 군에는 본 발명의 액상조성물(실시예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 1시간 후에 10 ml/kg의 18% 에탄올을 복강투여한 후, 6시간 후에 대정맥에서 채혈하였고, 채혈된 혈액을 혈장을 분리한 다음 혈중 ALT의 함량을 자동 생화학 분석기(상동)를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타냈다. 정상군으로서 무처리 마우스로부터도 동일한 방식으로 채혈하고 혈중 ALT의 함량을 측정하여 그 결과도 함께 나타냈다.
도 6에 도시된 바와 같이, 정상군(무처리구)에 비해 대조예(물 처리)의 ALT 농도는 약 230배 증가하였다.
대조예 대비, 시판제품인 비교예 1의 투여군 (각각 10 ml/kg, 20 ml/kg)은 알코올에 의해 증가한 ALT 수치의 유의적인 변화를 보이지 않아서 감소 효과를 거의 나타내지 않은 것으로 확인되었다.
이에 비하여, 본 발명의 액상조성물 (실시예 1)은 10 ml/kg로 투여군에서도 알코올에 의해 증가한 ALT가 약 32.3% 감소효과를 나타냈고, 20 ml/kg 투여군에서는 약 38.9% 감소효과를 나타냈다. 따라서 본 발명의 액상조성물은 알코올에 의한 간 손상을 억제하는 간 보호 효능이 우수하다는 것을 알 수 있다.
<간 지방 축적 분석>
알코올에는 영양소가 없지만 칼로리가 높기 때문에 간 조직의 지방 축적에 원인이 될 수 있다.
알코올로 유발된 간 손상(지방간) 동물모델에서 각 시료의 액이 손상된 간 조직에 대한 보호 효과를 분석하기 위해, 상기와 같이 처리한 5개군의 C57BL/6 마우스를 대정맥에서 채혈 후, 간 조직을 적출하였다. 적출된 간 조직은 10% 중성 포르말린 용액(10% neutral formalin solution)으로 고정시키고 파라핀 포매(paraffin-embedded) 과정을 거친 후 5 ㎛ 두께의 절편으로 잘랐다. 상기 잘라진 간 조직을 유리 슬라이드에 고정시키고 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin and eosin staining)을 실시한 다음 100배율에서 관찰하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 도시된 바와 같이, 대조예 (물 + 알코올 투여군)의 마우스 간 조직에서는 현저한 지질축적이 관찰되었으나, 본 발명에 따른 액상성물 투여군 (실시예 1)의 마우스 간 조직에서는 지질축적이 현저히 억제되었음이 확인된다. 따라서 본 발명의 액상조성물은 지방간 예방 효능을 가짐을 알 수 있다.
위와 같은 결과들로부터, 본 발명의 액상조성물은 알코올로 유발되는 혈중 ALT의 농도 감소와 간 지질축적 억제 활성이 우수하여 알코올성 간 손상에 대한 간 보호에 유용함을 알 수 있다.
시험예
4. 숙취 예방 및 해소 효능 검증
본 발명에 따른 액상조성물의 숙취 예방과 해소 효능에 대해서 정향반사소실 억제 효과 분석을 통하여 검증하였다.
구체적으로는 본 발명에 따른 액상조성물 (실시예 1), 비교예 1의 음료 (시판제품)와 대조예(물)의 알코올 섭취에 따른 정향반사 소실에 대하여 미치는 효과를 분석하였다.
상기에서 같이 절식된 8주령의 수컷 ICR 마우스 50마리를 10마리씩 5개군으로 나누고 1개 군에는 물 (대조예) 10 ml/kg 경구투여하고, 다른 2개 군에는 시판제품(비교예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 나머지 2개 군에는 본 발명의 액상조성물(실시예 1)을 각각 10 ml/kg 및 20 ml/kg으로 경구 투여하고, 1시간 후에 10 ml/kg의 18% 에탄올을 복강투여한 후 행동학적 변화를 하기 기준에 따라 점수화하여 평균을 내었으며, 각 시간별 행동학적 변화에 해당하는 점수 및 시간 그래프를 도 8에 나타내고, 그래프의 곡선하면적(Area under curve, AUC)을 분석하여 그 결과를 표 4에 나타냈다.
정상행동 : 0점
뒷다리를 끌며 기어간다 : 1점
뒤집어 놓으면 정상 자세를 취하나 앞으로 전진하지 못한다 : 2점
뒤집어 놓아도 그대로 있으며 정상자세로 돌아오지 못한다 : 3점
| 대조예 (물) |
비교예 1 (시판제품) | 실시예 1 (액상조성물) | |||
| 10 ml/kg | 20 ml/kg | 10 ml/kg | 20 ml/kg | ||
| AUC (%) | 100 | 112.1 | 84.7 | 85.4 | 81.0 |
표 4 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 물을 투여한 대조예에 대비, 시판제품인 비교예 1의 10 ml/kg로 투여군은 정향반사소실 억제 효과를 나타내지 않다가, 고농도 (20 ml/kg) 투여군이 정향반사소실을 약 15.3% 감소하는 효과를 나타냈다.
이에 비하여 본 발명의 액상조성물 (실시예 1)은 저농도인 10 ml/kg로 투여된 군에서도 약 14.6%의 정향반사소실을 억제 효과를 나타냈고, 20 ml/kg 투여군에서는 약 19%의 더 증진된 정향반사소실을 억제 효과를 나타냈다.
따라서 본 발명의 액상조성물은 저농도에서도 우수한 숙취 예방 및 해소 효능이 나타냄을 알 수 있다.
Claims (8)
- 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량의 숙취 예방 및 해소용 액상조성물의 제조방법으로, 상기 방법은
ⅰ) 산양삼을 100℃에서 30~120분간 증숙하는 단계;
ⅱ) 증숙된 산양삼을 60~80℃에서 8∼12일간 숙성하는 단계;
ⅲ) 숙성 산양삼의 중량 대비 15 ~ 25배 (v/w)의 95∼100℃ 열수를 첨가하여 4시간 이상 추출하여 1∼2 브릭스의 추출물을 얻는 단계; 및
ⅳ) 추출물을 수탁번호 KACC 92157P로 기탁된 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 수탁번호 KACC91848P로 기탁된 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합 종균으로 발효하는 단계를 포함하고,
상기 진세노사이드 F2는 0.1 mg/ml 이상, 진세노사이드 Rg3는 0.12 mg/ml 이상, 및 진세노사이드 컴파운드 케이는 0.18 mg/ml 이상 함유하는 것인 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 ⅳ) 후에, 타우린, 구연산, 올리고당, 벌꿀 및 과일농축액으로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량의 숙취 예방 및 해소용 액상조성물의 제조방법.
- 삭제
- 제 1항에 따른 제조방법에 의해 제조된, 진세노사이드 F2, Rg3 및 컴파운드 케이 고함량의 숙취 예방 및 해소용 액상조성물.
- 삭제
- 제 1항에 따른 제조방법에 의해 제조되는 액상조성물을 포함하는 숙취 예방 및 해소 기능성을 갖는 식품.
- 제 6항에 있어서, 상기 식품은 음료인 것을 특징으로 하는 숙취 예방 및 해소 기능성을 갖는 식품.
- 삭제
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