KR102361257B1 - 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부 미백용 및 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부 미백용 및 주름 개선용 화장료 조성물이 개시된다.
본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 조성물은 피부미백 및 피부주름 개선 기능성이 우수하여, 피부미백용 및/또는 피부주름 개선용 기능성 화장품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부 미백용 및 주름 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for skin whitening and anti-wrinkle containing extracts of fermented whole wild-cultivated ginseng}

본 발명은 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부 미백용 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하여, 증진된 피부미백 및 피부주름 방지 기능성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드 또는 빌리루빈 등 인체 내외의 색소함유 유무 등의 여러요인들에 의해 결정된다. 그 중 멜라노사이트에서 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소가 사람의 피부색에 가장 중요한 영향을 미친다. 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비 및 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인이 영향을 미친다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 가지고 있지만 멜라닌이 과잉생산됨으로써 기미, 주근깨 또는 색소침착 등과 같은 피부색소 이상침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생된 과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시키기 위한 미백을 목적으로 하는 기능성 화장품의 연구가 활발하게 진행되고 있다 (공개특허 10-2016-0112655호).

멜라닌은 기질인 타이로신(tyrosine)의 연속적인 산화반응으로 합성되는데, 티로신이 타이로신아제(tyrosinase)의 작용에 의해 도파(DOPA, 3,4-dihydroxyphenylalanine)를 거쳐 도파 퀴논(DOPA quinone)으로 전환된 후 비효소적 반응, 자발적 산화 과정을 거쳐 아미노산 혹은 단백질과의 중합 반응에 의해 합성된다. 멜라닌을 생성하는 첫 단계로 타이로신아제가 가장 중요한 역할을 하기 때문에 미백제 개발을 위해 다양한 타이로신아제 저해제에 대한 탐색이 지속적으로 진행되어 왔다.

타이로신아제의 활성을 억제하는 대표적인 물질로는, 알부틴, 코직산 등이 있다. 알부틴과 코직산은 강력한 미백효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 피부 자극 등의 일부 부작용으로 인하여 상대적으로 부작용이 적은 식물로부터 미백 활성을 가지는 소재가 요구되고 있다.

피부 주름은 여러 요인들에 의해 산화적 스트레스 (Oxidative Stress)는 체내의 자유라디칼(Free radical)을 되고, 콜라겐이 감소하거나 분해되어 진행된다. 콜라겐 분해는 각질형성세포와 섬유아세포 등에서 분비된 MMP(matrix metalloproteinases)의 활성에 의해 심화되는데, 콜라겐 수준 감소는 피부 주름 및 처짐 등의 피부의 임상 증상을 유발한다고 알려져 있다.

산양삼은 「산지관리법」제2조 제1호에서 정의하고 있는 산지에서 차광막 등 인공시설을 설치하지 아니하고 생산되는 삼으로 약리성분은 인삼보다 함량이 높은 것으로 알려져 있어, 산양삼을 이용한 기능성 식품 또는 약품 소재 개발이 이루어지고 있으나 (특허 10-1917128호), 새로운 기능성 개발이 요구되고 있는 실정이다.

또한 산양삼 단순 추출물로는 산양삼에 함유된 다량의 생리활성성분이 인체 흡수형으로 존재하지 않아서 그 효과가 제한적이었던바, 인체 흡수형 생리활성성분을 강화시키는 방법의 개발이 시도되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 종래 기술의 요구에 부응하기 위한 연구를 지속한 결과, 산양삼 전초를 증숙과 숙성을 수행한 후 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합유산균으로 발효한 후 추출농축하여 얻은 조성물이, 피부미백 및 피부주름 개선 효능이 탁월하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 하기 단계들을 포함하는 제조방법에 의하여 제조된다:

ⅰ) 산양삼 전초를 100℃에서 30~120분간 증숙하여 60∼80℃에서 2∼5일 숙성하는 단계;

ⅱ) 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합유산균으로 발효하는 단계; 및

ⅲ) 에탄올로 추출하여 가용성 고형분이 12∼18 brix가 되도록 농축하는 단계.

단계 ⅰ): 산양삼 증숙 및 숙성

산양삼 전초를 100℃에서 30~120분간 증숙하여 60∼80℃에서 2∼5일 숙성한다.

본 발명에서는 산양삼 전초를 사용한다. 전초는 뿌리, 줄기 및 잎을 모두 포함하는 것을 의미한다. 산양삼은 뿌리 이외에도 잎 등에 다량의 생리활성성분이 함유되어 있으며 무농약으로 재배되는 특성에 따라서 전초 사용시도 안전하다.

산양삼 전초는 3년근 이상을 사용한다. 산양삼 전초를 흐르는 물에 3회 세척하고 물기를 제거한 후 증숙한다.

증숙는 통상의 찜기와 같은 증숙기를 사용하여 수행할 수 있으며, 100℃에서 30∼120분간 수행한다. 증숙 시간이 30분 미만인 경우 충분한 증숙이 진행되지 않아 숙성 또는 발효와 같은 후속 단계가 원활하지 않을 수 있고 잡균의 오염이 발생될 수 있다. 120분 초과하여 증숙될 경우는 오랜 열처리로 산양삼 전초의 영양성분이 파괴될 수 있다.

증숙된 산양삼 전초를 60∼80℃에서 2∼5일간 숙성시킨다. 숙성 온도가 60℃ 미만이거나 숙성 기간이 2일 미만인 경우, 숙성이 원활히 이루어지지 않으며, 숙성온도가 80℃ 초과하거나 숙성 기간이 5일 초과의 경우 생산된 생리활성물질이 분해되어 함량이 감소될 수 있다.

증숙과 숙성의 1~3회 반복될 수 있으며, 가장 바람직하게는 3회 반복 수행한다.

단계 ⅱ) 복합발효

단계 ⅰ)로부터의 증숙 및 숙성된 산양삼 전초를 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합유산균으로 발효한다.

본 발명에서 복합유산균을 구성하는 하나의 균주인 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주는 본 발명자가 김치로부터 분리/동정하여 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2016년 12월 12일에 기탁한 균주(수탁번호 KACC92157P)로, 가바(GABA)의 생산성 및 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K) 생산성이 탁월하다 (특허출원 10-2017-0152033).

본 발명에서 복합유산균을 구성하는 또 다른 하나의 균주인 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 본 발명자가 발효식품으로부터 분리/동정하여 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2013년 7월 19일에 기탁한 균주(수탁번호 KACC91848P)로서, 생균제제능이 우수하고 생리활성물질 생산성이 우수한 특성을 갖는다 (등록특허 10-154418호).

본 발명의 복합종균을 구성하는 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 발효 특성이 상호 보완되어 상승작용을 나타낸다. 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주는 이형유산발효 (hetero-lactic acid fermentation) 유산균으로 단독 발효 시 유산 생성이 충분하지 않고, 락토바실러스플란타륨 P1201 균주는 동형유산발효(homo-lactic acid fermentation) 유산균으로 단독 발효 시 유산이 과다하게 생성되는데, 놀랍게도 산양삼 전초를 이들 두 가지 유산균을 함께 사용하여 복합발효시 양 균주의 발효 특성이 상호 보완되고 피부미백 및 피부주름 개선 효능이 현저히 증진되었다 (시험예 1∼7).

본 발명에서 복합유산균은 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주 각각 별도의 배양액으로서 첨가될 수도 있으며, 혼합 배양된 혼합 배양액으로서 첨가될 수도 있다.

복합유산균에서 상기 2종의 균주의 혼합 비율은 3 : 1 ~ 1 : 3(v/v)으로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1 : 1(v/v)로 혼합한다.

발효는 복합유산균 배양액을 증숙 및 숙성된 산양삼 전초에 2∼10%(v/w) 농도로 접종하여 25∼40℃에서 2∼7일간 발효시키는 것으로 수행될 수 있다.

복합유산균 접종량이 2%(v/w) 미만일 경우는 발효 속도가 지연될 수 있고, 발효 온도가 25℃ 미만일 경우는 발효 기간이 길어져 잡균의 오염을 초래하고 40℃를 초과할 경우는 균주의 생육이 정지될 수 있고, 발효 기간이 2일 미만일 경우는 발효 기간이 충분하지 않아 생리활성물질 등의 생성이 저조하게 될 수 있으며 7일 초과의 경우는 과 발효되어 생성된 생리활성물질이 분해될 수 있다.

단계 ⅲ) 추출 및 농축

복합발효된 산양삼 전초를 에탄올로 추출하여 가용성 고형분이 12∼18 brix가 되도록 농축한다.

복합발효된 산양삼 전초는 바람직하게는 50∼55℃에서 2∼3일간 열풍건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 분말을 제조하여 추출한다.

본 발명에서 추출은 상기와 같이 제조된 분말에 40∼60% 에탄올을 10∼20배(w/v)를 첨가한 후 40∼70℃에서 4∼8시간 동안 교반하여 여과지로 여과하여 수행한다. 추출은 2회 반복할 수 있다.

상기 에탄올로는 바람직하게는 발효주정을 사용한다.

추출액을 감압농축기를 이용하여 가용성 고형분이 12∼18 brix가 되도록 농축하여 복합발효 산양삼 전초 추출농축물을 얻는다.

필요에 따라서, 여과지로 여과한 후 살균하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 조성물은 멜라닌 생설물질인α-MSH를 처리한 대조군에 비하여 멜라닌 생성량을 29% 이상 감소시키고 타이로신아제 활성을 48% 이상 감소시키고, 원재료에 비하여 26% 이상 증진된 멜라닌 생성 억제 및 31% 이상 감소된 타이로신아제 활성을 가짐에 의해 피부미백 기능성이 현저히 증진되어 탁월하다 (도 4a~도 5).

또한, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 인체흡수형 진세노사이드 F2, Rg3와 컴파운드 K가 각각 2.4 mg/ml 이상, 1.0 mg/ml 이상, 및 2.0 mg/ml 이상으로 함유한다 (표 2, 도 2c). 원재료인 산양삼전초 추출농축액에 비하면, 인체 흡수형 진세노사이드 F2, Rg2와 컴파운드 K 함량이 각각 1.35배, 7.2배, 및 11배 증진되었다 (표 2).

또한 본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

복합발효 산양삼전초 추출농축물은 상기에서 정의된 바와 같다.

본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 조성물은 UVB 무처리한 대조군에 비하여도 MMP-1 생성량을 42% 이상 감소시키고 MMP-1 유전자 발현량을 58% 이상 감소시키고, 원재료에 비하여 9% 이상 증진된 MMP-1 생성량 저해활성 및 52% 이상 증진된 MMP-1 유전자 발현 저해활성을 가짐에 의해 피부주름 기능성이 현저히 증진되어 탁월하다 (도 6a 및 도 6b).

본 발명에서 화장료 조성물은 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 그대로 또는 분말화하여, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 형태의 제품으로 가공될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 복합발효 산양삼전초 추출농축물 이외에, 통상의 화장품 제형시 사용되는, 보습제, 에몰리언트제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 조성물은 피부미백 및 피부주름 개선 기능성이 우수하다.

따라서 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 조성물은 피부미백용 및/또는 피부주름 개선용 기능성 화장품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 제조하는 제조공정의 일례이다.
도 2는 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물의 진세노사이드 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 2a는 진세노사이드 표준물질 21종의 HPLC 크로마토그램이며, 도 2b는 비교예의 진세노사이드 화합물 HPLC 크로마토그램이며, 도 2c는 본 발명에 따른 실시예 1의 복합발효 산양삼전초 추출농축물의 진세노사이드 HPLC 크로마토그램이다.
도 3는 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물 처리시 대식세포주에서 NO 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물 처리시 흑색종 세포주에서 멜라닌 생성 억제 정도를 나타낸다. 4a는 멜라닌 생성 여부를 육안으로 확인할 수 있는 사진이며, 도 4b는 각 군의 멜라닌 생성량을 상대적 비율(%)로 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물 처리시 타이로신아제 활성 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 6a는 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물 처리시 세포외기질 금속함유 단백분해효소-1(MMP-1) 활성의 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물 처리시 세포외기질 금속함유 단백분해효소-1(MMP-1) 유전자 발현의 저해 정도를 나타낸 그래프이다.

다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.

제조예: 복합발효 산양삼전초 추출농축물 제조

5~8월 사이에 수확한 3년근 이상 산양삼 전초 5 kg을 흐르는 물에 3회 세척하고 완전히 물기를 제거한 후, 찜기통에 담은 후 100℃에서 1시간 증숙한 후 75℃에서 3일간 숙성하는 증숙-숙성 과정을 3회 반복(총 9일 숙성)하여 증숙 및 숙성된 산양삼 전초를 제조하였다. 제조된 증숙 및 숙성된 산양삼 전초에 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주 및 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주를 각각 맥아엑기스 액체배지에서 종균으로 배양하며 1:1 비율로 혼합한 복합유산균을 5% (v/w)로 접종하고 30~35℃에서 5일간 발효시켜 복합발효 산양삼 전초를 얻었다.

복합발효 산양삼 전초를 50℃에서 3일간 건조한 후 100 메쉬 이하로 분쇄하여 분말화하였다. 얻어진 분말에 20배(w/v)의 50% 발효주정을 첨가하여 70℃에서 4시간 추출하고 냉각한 후 8mm 여과지로 여과한 여과액과, 여과물에 다시 20배(w/v)의 50% 발효주정을 첨가하여 40℃에서 4시간 추출하고 냉각한 후 치즈크로스로 여과한 여과액을 모아서 감압농축기를 이용하여 12.4 브릭스가 되게 농축하여 복합발효 산양삼 전초 추출농축물 (실시예 1)을 제조하였다 (도 1).

비교를 위하여, 원재료인 산양삼 전초를 상기와 동일한 방식으로 추출하고 농축하여 산양삼 전초 추출농축액을 제조하였다 (비교예).

시험예 1: 이화학적 특성

상기 제조예에서 제조된 실시예 1의 복합발효 산양삼 전초 추출농축물과 비교예 1의 산양삼 전초 추출농축액의 pH를 pH 미터기를 사용하여 측정하여 그 결과를 표 1에 나타냈다.

	비교예 (산양삼 전초 추출농축액)	실시예 1 (복합발효 산양삼 전초 추출농축액)
pH	5.11	4.26

본 발명에 따라 제조된 복합발효 산양삼 전초 추출농축물은 비교예의 산양삼 전초 추출농축액 보다 pH가 감소하여 보존성과 기호성이 향상된 것으로 판단된다.

시험예 2: 인체 흡수형 진세노사이드 F2, Rg2와 컴파운드 K 함량 분석

제조예에서 제조한 복합발효 산양삼 전초 추출농축물 (실시예 1) 및 산양삼 전초 추출농축액 (비교예)을 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 후 분석 시료로 사용하였다.

진세노사이드 함량 분석은 기능성식품 분석법에 기술된 방법을 변형하여 고압액체크로마토그래피(HPLC, high press liquid chromatograph)로 분석하였다. 분석 컬럼은 TSKgel ODS-100Z을 사용하여 시료 주입량 10㎕, 온도는 30℃ 측정파장은 203 nm, 유속은 1.0 ml/min으로 하였고 이동상으로는 A용액은 HPLC water, B용액은 아세토니트릴을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 용액은 0분때 A용액81% : B용액 19%로 흘려주고 15분때에는 A용액 80% : B용액 20%로 흘려주고 40분때 A용액 77% : B용액 23%, 42분때 A용액 70% : B용액 30%, 75분때에 A용액 65% : B용액 35%, 80분때에 A용액 30% : B용액 70%, 90분때에 A용액 10% : B용액 90%로 이동상을 흘려주었다. 각각의 결과 HPLC 크로마토그램을 도 2b 및 도 2c에 나타냈고, 각 진세노사이드 함량을 산출하여 표 2에 나타내었다.

진세노사이드* (mg/ml)	비교예 (산양삼 전초 추출농축액)	실시예 1 (복합발효 산양삼 전초 추출농축액)
진세노사이드 F2	1.78	2.41
진세노사이드 Rg3	0.14	1.01
진세노사이드 CK	0.19	2.09
*모든 실험은 삼 반복 수행하여 평균값으로 나타냄

도 2c와 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 인체 흡수형 진세노사이드 F2, Rg2와 컴파운드 K 함량이 각각 2.41 mg/ml, 1.01 mg/ml, 및 2.09 mg/ml로 높게 나타났다.

비교예와 비교하면, 실시예 1의 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 인체 흡수형 진세노사이드 F2, Rg2와 컴파운드 K 함량이 각각 1.35배, 7.2배, 및 11배 증진되었다.

시험예 3: 마우스 대식세포주의 NO 생성 억제능 분석

마우스 대식세포주(RAW 264.7 대식세포)를 이용하여 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물의 NO 생성 억제능을 측정하였다.

마우스 대식세포주(RAW 264.7 대식세포)에서 염증유발물질인 LPS에 의해 유도된 NO 생성 억제능을 측정하기 위해 24-well 플레이트에 3×10⁵ cells/well이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후, 상기 제조예에서 제조된 실시예 1 추출농축물 또는 비교예의 추출농축액 시료를 처리하고 1시간 배양 후 LPS(1 ㎍/ml)를 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 후 상층액 100 ㎕를 취하여 동량의 Griess 시약을 첨가하고 10분간 방치한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 니트리트(nitrite)의 농도는 소듐 니트리트를 DMEM 배지에 용해한 표준곡선을 이용하여 계산하였으며 LPS를 처리한 대조군 (대조예 2)과 LPS를 처리하지 않은 대조군 (대조예 1)에서 생성된 니트리트 양의 차이를 기준으로 각 시료의 NO 생성 억제능을 분석하여 그 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물 (실시예 1)을 처리한 경우, NO 생성량이 52.11%로 LPS를 처리한 대조군 (대조예 2; 100%)에 비하여 NO 생성량이 약 48% 감소하였며, 비교예에 비교하여도 약 33.5% 더 감소하였다.

상기와 같은 NO 생성 억제능은 지속적인 피부 염증 발생을 억제함으로서 미백 개선 또는 주름개선의 효과를 가진다.

시험예 4: 흑색종 세포주를 이용한 멜라닌 생성 억제능 분석

미백 효과 분석을 위해 흑색종 세포주를 이용한 멜라닌(Melanin) 생성 억제 활성을 측정하였다.

구체적으로는 흑색종 세포주(B16F1 세포)를 1×10⁵ cells/well의 비율로 희석해 6 well 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO₂배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 기존 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 다음 새로운 배지를 이용하여 비교예의 추출농축액 및 실시예 1의 추출농축물을 각각 전처리하였다. 1시간 후 α-MSH(melanocyte stimulating hormone) 100 nM을 각각 처리하여 멜라닌 생성을 촉진시키고 48시간 동안 배양하였고, 그 결과를 도 4a에 나타냈다.

멜라닌 양은 48시간 배양된 세포의 배양액을 취하여 Microplate reader를 이용하여 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 측정한 흡광도값을 바탕으로 세포내의 멜라닌은 α-MSH만을 처리한 대조군(대조예 2)의 흡광도값에 대한 백분율로 계산하였고, 그 결과를 도 4b에 나타냈다.

도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 처리한 실시예 1의 경우는 α-MSH를 처리한 대조군 (대조예 2)에 비하여 멜라닌 생성량이 29.18% 감소되었으며, 비교예에 비교하여도 26.35% 더 감소되었으며, α-MSH 무처리한 대조군 (대조예 1)에 가깝게 멜라닌 생성량을 감소시켰음을 확인할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 멜라닌 생성억제 효능이 현저히 증진된 것을 알 수 있다.

시험예 5: 흑색종 세포주를 이용한 타이로신아제 저해활성 분석

미백 효과 분석을 위해 흑색종 세포주를 이용한 타이로신아제(tyrosinase) 저해활성을 측정하였다.

흑색종 세포주(B16F1 세포)를 1×10⁵ cells/well의 비율로 희석해 6 well 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 기존 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 다음 새로운 배지를 이용하여 비교예의 추출농축액 및 실시예 1의 추출농축물을 각각 전처리하였다. 48시간 동안 배양한 후 기존 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척 한 다음 1% Triton X-100을 함유한 PBS 100 ㎕에 현탁시켜 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 활성측정 효소액으로 사용하였다. 96 well 플레이트에 효소액 40 ㎕와 기질 L-DOPA (2 ㎎/㎖) 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 Microplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 타이로신아제 활성은 대조군 (대조예 2)의 흡광도에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 처리한 실시예 1의 경우는 대조군 (대조예 2)에 비하여 타이로신아제 활성이 48.83% 감소되었으며, 비교예에 비교하여도 32.31% 더 감소되었음을 확인할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 타이로신아제 저해 활성이 현저히 증진되어 결과적으로 멜라닌 생성억제 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.

시험예 6: 인간 섬유아세포주를 이용한 MMP-1 생성 억제 활성

주름 개선 효과 검정을 위해 인간 섬유아세포주를 이용한 세포외기질 금속함유 단백분해효소-1(Matrix metalloportease-1(MMP-1), collagenase)의 저해 활성을 분석하였다.

인간 섬유아세포주(CCD-986sk 세포)의 세포 현탁액을 준비하고, 혈구계수기를 이용하여 세포를 계수하였다. 세포는 5×10⁴cells/well의 비율로 희석해 96 well 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO₂배양기에 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 기존 배지를 제거하고 500 ㎕ PBS로 세척한 다음 새로운 배지를 이용하여 비교예의 추출농축액 및 실시예 1의 추출농축물을 각각 전처리하였다. 24시간 후 Ultraviolet B(UVB)을 80 mJ/㎠ 조사하고 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 세포 배양액을 검액으로 Human MMP1 ELISA kit(Abcam, Lot No. GR3256774-1)를 이용하여 MMP-1의 양을 측정하였다. 생성된 MMP-1의 양을 정량화하기 위해 Human MMP1 ELISA kit 내 표준물질을 이용하여 표준 곡선을 산출한 다음 검액 내 MMP-1의 양을 정량화하였다. Kit 내 표준물질에 100 ㎕의 멸균증류수를 첨가하여 50,000 pg/㎖ MMP-1 용액을 만든 다음 MMP-1 ELISA kit 내 있는 Sample Diluent Solution을 이용하여 0, 93.75, 187.5, 375, 750, 1,500, 3,000, 6,000 pg/㎖로 희석하여 표준용액을 준비하였다. 검액과 표준용액 50 ㎕를 각 well에 넣고 Antibody Cocktail 50 ㎕를 첨가한 뒤 400 rpm으로 상온에서 1시간 반응시켰다. 1시간 반응 후 내용물을 제거한 뒤 Wash Buffer 350 ㎕로 3번 세척하였다. 기질 용액 100 ㎕를 각 well에 첨가하고 상온에서 10분간 반응시킨 후 Stop Solution 100 ㎕를 첨가하여 발색을 중지시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준농도 곡선을 작성하여 MMP-1의 양을 산출하였고, 그 결과를 도 6a에 도시하였다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 처리한 실시예 1의 경우는 UVB를 처리한 대조군 (대조예 2)에 비하여 MMP-1 생성량이 86.89% 감소되었으며, UVB 무처리한 대조군 (대조예 1)에 비하여도 MMP-1 생성량을 42.45% 감소시켰음을 확인할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 MMP-1 생성 억제 활성이 현저히 증진되어 결과적으로 주름 개선 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.

시험예 7: 인간 섬유아세포주를 이용한 MMP-1 유전자 발현 분석

주름 개선 효과 검정을 위해 인간 섬유아세포주(CCD-986sk 세포)를 이용한 세포외기질 금속함유 단백분해효소-1(MMP-1)의 유전자 발현 분석을 하였다.

MMP-1 유전자 발효 분석은 상기 시험예 6에서의 각 군의 인간 섬유아세포주 세포에 Trizol(Invitrogen, Lot No.15596018)을 처리하여 총 RNA를 추출하였다. 추출 후 동등한 양의 총 RNA(1 ㎍)를 1st strand cDNA Synthesis kit(Takara, Lot No.AI81161A)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA 2 ㎕에 Taqman Gene Expression Assay 1 ㎕, Taqman Fast Advenced Master Mix(Appliedbiosystems, Lot No. 00739221) 10 ㎕, 3차 증류수 7 ㎕를 첨가하여 Real-time PCR을 수행하였다. UVB 무처리군 (대조예 1)의 MMP-1 유전자 발현량을 1로 할 때 각 군의 상대적인 MMP-1 유전자 발현량을 산출하여 도 6b에 나타냈다.

도 6b에 도시된 바와 같이, UVB 무처리한 대조군 (대조예 1)에 비하여 UVB를 처리한 대조군 (대조예 2)은 2,54배 높은 MMP-1 유전자 발현량을 보였으나, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 처리한 실시예 1의 경우는 MMP-1 유전자 발현량이 0.41로서 UVB 무처리한 대조군 (대조예 1)에 비하여도 59% 감소시켰으며, 비교예 (0.94)에 비하여도 53% 더 증진된 MMP-1 유전자 발현 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

상기와 같은 결과들 (도 6a 및 도 6b)을 종합해 보면, 본 발명에 따른 복합발효 산양삼전초 추출농축물은 현저히 증진된 MMP-1 저해 활성을 가져서 피부 주름 개선 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

농업생명공학연구원 KACC92157P 20161212 농업생명공학연구원 KACC91848P 20130719

Claims (6)

1. 복합발효 산양삼전초 추출농축물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물로,
   상기 복합발효 산양삼전초 추출농축물은
   ⅰ) 산양삼 전초를 100℃에서 30~120분간 증숙하여 60∼80℃에서 2∼5일 숙성하는 단계;
   ⅱ) 수탁번호 KACC 92157P로 기탁된 락토바실러스 브레비스 BMK484 균주와 수탁번호 KACC91848P로 기탁된 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합유산균으로 발효하는 단계; 및
   ⅲ) 에탄올로 추출하여 가용성 고형분이 12∼18 brix가 되도록 농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고,
   상기 조성물은 멜라닌 생성량을 29% 이상 감소시키고 타이로신아제 활성을 48% 이상 감소시키는 것인 조성물.
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