KR102009633B1 - 아스페르길루스 크리스타투스 균주로 고체발효시킨 발효 인삼의 추출물을 포함하는 피부미용 개선용 조성물 - Google Patents

아스페르길루스 크리스타투스 균주로 고체발효시킨 발효 인삼의 추출물을 포함하는 피부미용 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

신규한 아스페르길루스 크리스타투스 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 포함하는 피부미용 개선용 조성물, 상기 추출물을 제조하는 방법, 및 신규한 아스페르길루스 크리스타투스 균주에 관한 것이다. 일 양상에 따른 피부미용 개선용 조성물에 의하면, 신규한 아스페르길루스 크리스타투스 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물은 피부 보습, 장벽 강화, 주름 개선, 항염증, 미백, 피부 재생, 활력 증가, 또는 모공 크기 감소 효능이 있으므로, 피부미용을 개선하는데 유용하다. 다른 양상에 따른 신규한 아스페르길루스 크리스타투스 균주에 의하면, 배당체를 가수분해하는 효소 활성에 의해 다양한 기능성을 가지는 비배당체를 생산할 수 있다.

Description

아스페르길루스 크리스타투스 균주로 고체발효시킨 발효 인삼의 추출물을 포함하는 피부미용 개선용 조성물 {Composition for improving skin beauty comprising extract of solid state fermented ginseng by Aspergillus cristatus strain}
아스페르길루스 크리스타투스 균주로 고체발효시킨 발효 인삼의 추출물을 포함하는 피부미용 개선용 조성물에 관한 것이다.
아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus)는 중국의 후발효차(post fermented tea)인 푸주안 복전차(Fuzhuan brick tea)에 우점하고 있는 미생물로 금꽃과 같은 포자를 형성하기에 중국인들은 금화균(Golden flower Fungus)으로 부르기도 한다. 금화균(A. cristatus)은 발암성 곰팡이 독소를 생성하지 않아 안전한 균주로서 벽돌 차 생산에 오랜기간 동안 사용해왔다. 또한 Yongyi Ge 등(2016)도 복전차에서 분리한 금화균(A. cristatus)에서 곰팡이 독소 유전자의 존재 및 발현이 관찰되지 않았다고 보고하여 인체에 안전한 균주로서 인정하였다.
인삼은 오가와 인삼속에 속하는 식물로 뿌리를 약용으로 이용한다. 만병을 치료한다는 의미의 Panax ginseng C.A. Mayer란 학명을 가지고 있으며 건강 기능성 식품으로 널리 이용되고 있다. 수 천년 동안 위장병 치료, 혈액순환 촉진, 활력증강 등에 전통적으로 사용되었으며, 현대의학에서는 항암, 항산화, 항당뇨, 면역증강 등에 효과가 있다.
이러한 인삼의 효능을 나타내는 주요성분인 진세노사이드는 크게 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)계인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 등과 프로토파낙사트리올계인 진세노사이드 Re, Rg1, Rf 등으로 나뉜다. 이와 같은 진세노사이드들은 사람이 섭취하게 되면 장내에 존재하는 특정 미생물에 의해 분해되어 체내로 흡수된다. 이에 사포닌의 체내 흡수율을 증가시키기 위해 유용한 미생물을 분리하여 수삼을 발효하거나, 미생물의 당분해 효소를 이용하여 비배당체 진세노사이드로 전환시키는 연구가 진행된 바 있다.
종래의 발효 홍삼에 관한 기술들은 인삼 또는 홍삼 추출액에 유산균 또는 장내 세균으로 발효시키거나(한국 등록특허 제0479803호), 상황버섯, 영지버섯, 노루궁뎅이 버섯 등을 이용하여 가공한 바 있다(한국 공개특허 제2004-0107203호). 하지만 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8을 이용하여 고체 발효한 발효 인삼에 대한 연구는 전무하다. 또한 종래의 인삼 가공 기술들은 고비용의 인삼 추출물에 유산균이나 장내 세균들을 배양해야 하기에 공정이 복잡하고 고비용인 단점을 가진다.
한국 등록특허 제0479803호. 한국 공개특허 제2004-0107203호.
일 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 또는 흉터, 피부 염증 질환, 피부 색소 침착 질환, 피부 건조증, 습진, 및 건선으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시켜 발효 인삼을 제조하는 단계; 및 상기 발효 인삼을 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 발효 인삼의 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 신규한 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주 (수탁번호: KCCM12432P)를 제공한다.
일 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 피부미용 개선은 피부 보습, 장벽 강화, 주름 개선, 항염증, 미백, 피부 재생, 활력 증가, 또는 모공 크기 감소일 수 있다. 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물은 발효시키지 않은 인삼의 추출물이나 동속이종의 아스페르길루스 오리제(A. oryzae) 또는 동속동종의 상이한 아종인 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물에 비해 피부 보습 효과, 장벽 강화 효과, 주름 개선 효과, 항염증 효과, 피부 미백 효과, 피부 재생 효과, 활력 증가, 또는 모공 크기 감소 효과가 우수하므로, 상기 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 포함하는 조성물은 피부 보습, 장벽 강화, 주름 개선, 항염증, 미백, 피부 재생, 활력 증가, 모공 크기 감소용 조성물로 사용될 수 있다.
용어, "피부 보습"이란 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "피부 장벽 강화"란 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "피부 주름 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라게나제 활성을 억제하여 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "항염증"이란 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "피부 미백"이란 멜라닌의 합성을 저해하여 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "피부 재생"이란 피부의 일부분이 소실되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "피부 활력 증가"란 피부의 세포 내 미토콘드리아의 활성이 증가하여 피부의 생기 또는 활력을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어 “모공 크기 감소”란 모공 크기가 확대된 경우 모공의 크기를 일시적 또는 장기적으로 감소시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "개선"이란 상태의 완화 도는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 "아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus)"는 누룩곰팡이의 일종으로서, 금꽃과 같은 포자를 형성하여 금화균(golden flower fungus)이라고도 한다. 상기 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus)는 식품, 토양, 바다 등에서 분리한 것일 수 있고, 이에 제한하지 않으나, 예를 들어 중국의 후발효차(post fermented tea)인 푸주안 복전차(Fuzhuan brick tea)로부터 분리한 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 균주는 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주 (수탁번호: KCCM12432P)일 수 있다. 아스페르길루스 크리스타투스 GF8 균주는 중국에서 제조된 복전차로부터 분리된 신규한 균주로서, 구체적으로 복전차를 NaCl 용액으로 희석하는 단계; 희석된 복전차를 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 감자한천배지에서 배양하는 단계; 및 배지에서 금색의 콜로니를 형성하는 균주를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 분리된 균주일 수 있다. 상기 NaCl 용액은 0.50%(w/w) 내지 0.99%(w/w), 0.60%(w/w) 내지 0.95%(w/w), 0.70%(w/w) 내지 0.90%(w/w), 0.80%(w/w) 내지 0.90(w/w), 0.84%(w/w) 내지 0.86%(w/w), 예를 들어 0.85%(w/w) NaCl 용액일 수 있다. 상기 배양은 20 내지 40℃, 25 내지 40℃, 25 내지 35℃, 27 내지 35℃, 28 내지 32℃의 온도에서 수행할 수 있다. 상기 배양은 10 내지 100시간, 20 내지 90시간, 30내지 80시간, 40 내지 70시간, 48 내지 65시간, 48 내지 60시간 동안 수행할 수 있다.
상기 "인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)"은 두릅나무과에 속하는 다년생 초본 식물이다. 상기 인삼은 통상적으로 입수할 수 있는 방법에 의해 얻은 것일 수 있고, 예를 들어 시중에서 판매하는 것을 구입한 것일 수 있다. 상기 인삼은 고려인삼(Panax ginseng C.A.Meyer), 화기삼(Panax quinquefolius L.), 죽절삼(panax japonicus C.A.Meyer), 전칠삼(Panax notoginseng), 수삼, 홍삼, 백삼, 또는 태극삼일 수 있으며, 4 내지 6년근일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 인삼은 고려인삼 4 내지 5년근일 수 있으며, 예를 들어 고려인삼 5년근일 수 있다. 용어 “년근”은 인삼을 재배한 기간을 의미하는 것으로 수확시기에 따라 달라지는 것일 수 있다. 상기 인삼은 멸균된 인삼을 사용할 수 있으며, 멸균 방법은 당해 기술분야에서 통상적인 방법으로 수행할 수 있다. 상기 인삼의 주요성분으로는 진세노사이드(ginsenoside) 등이 있을 수 있다. 진세노사이드는 배당체(glycoside)의 일종인 사포닌(saponin)을 의미할 수 있다. 진세노사이드는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)계인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등과 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)계인 진세노사이드 Re, Rg1, Rf, Rg2 등을 포함할 수 있다. 용어, "배당체(glycoside)"란 널리 식물계에 분포하는 성분의 하나로서, 산, 알칼리 또는 적당한 가수분해 효소의 작용으로 당 부분과 아글리콘 또는 게닌이라고 칭하는 비당 부분으로 분해하는 물질의 총칭이다.
일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 발효는 고체 발효일 수 있다. 용어, "고체 발효"란 수분이 적은 고체 상태의 원료에 미생물을 접종하여 발효하는 것을 의미할 수 있다. 고체 발효법은 종래의 발효법인 액체 발효법 또는 반 고체 발효법에 비해 잡균의 오염을 받지 않고, 생산물의 회수가 쉽다는 장점이 있을 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 발효 인삼은 인삼에 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8, 구체적으로 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8 포자 현탁액을 접종하여 고체 발효시킨 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 발효를 통해 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8의 세포외 효소(extracellular enzyme)에 의해 배양 기질을 기능성 물질로 전환시킬 수 있다. 상기 세포외 효소의 종류는 예를 들어, 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase), 에스테라제(Esterase(C4)), 에스테라제 리파제(Esterase Lipase(C8)), 산성 포스파타제(Acid phosphatase), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-글루코시다제(beta-glucosidase), N-아세틸-베타-글루코사미니다제(N-acetyl-beta-glucosaminidase), 알파-만노시다제(alpha-mannosidase) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8의 라이프 사이클(life cycle)에서 효소의 생합성량이 가장 높은 시점인 균사에서 포자로 전환되는 단계(phase)를 오랫동안 유지시키는 것이 중요하다. 그러므로, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8의 세포외 효소의 발현이 많이 되는 단계(phase)를 최대한 유지하여 인삼의 비배당체 성분을 증가시키기 위하여, 발효 온도, 시간, 및 습도를 적절히 선택할 수 있다. 용어, "비배당체"란 배당체가 발효 또는 가수분해 과정을 통해 당이 제거된 물질을 의미할 수 있다. 따라서, 상기 인삼의 비배당체 성분은 비배당체 진세노사이드를 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 비배당체 진세노사이드는 Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 발효 인삼은 25 내지 40℃, 25 내지 35℃, 28 내지 35℃, 30 내지 35℃, 31 내지 34℃, 32 내지 34℃, 33℃에서 발효시킨 것일 수 있다. 발효 온도가 35℃를 초과하는 경우 균주가 포자로 형성되는 시간이 빨라져 상대적으로 효소의 활성과 발현량이 낮아질 수 있고, 반대로 온도가 30℃ 미만인 경우 효소반응속도가 느려져 비배당체 기능성 성분의 전환 속도가 낮아질 수 있다.
상기 발효 인삼은 10 내지 100시간, 20 내지 100시간, 20 내지 90시간, 30 내지 90시간, 30 내지 80시간, 40 내지 80시간, 40 내지 70시간, 48 내지 65시간, 50 내지 65시간, 55 내지 65시간, 60 내지 65시간 동안 발효시킨 것일 수 있다. 발효 시간은 발효 온도에 따라 균사의 생장을 고려하여 포자가 형성되기 직전까지 종료하는 것으로 적절히 선택할 수 있다.
상기 발효 인삼은 10 내지 99.9% 습도, 20 내지 99.9% 습도, 30 내지 99.9% 습도, 40 내지 99.9% 습도, 50 내지 99.9% 습도, 50 내지 90% 습도, 60 내지 90% 습도, 70 내지 90% 습도, 75 내지 85% 습도, 80 내지 85% 습도 조건에서 발효시킨 것일 수 있다. 습도가 75% 미만인 경우 균주가 포자로 형성되는 시간이 빨라져 상대적으로 효소의 활성과 발현량이 낮아질 수 있고, 반대로 습도가 85% 초과인 경우 수분함량이 높아 원물 사이의 공기 순환율이 좋지 않아 절대 호기성 균주인 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8의 생장이 느려지고 다른 미생물에 의한 오염 발생률이 높아질 수 있다.
예를 들어, 상기 발효 인삼은 30 내지 35℃에서 48 내지 65시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 발효시킨 것일 수 있다.
상기 발효 인삼은 발효 인삼의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료일 수 있다. 상기 일부분은 인삼의 뿌리, 줄기, 열매, 꽃, 또는 잎일 수 있으며, 상기 뿌리는 뇌두, 주근, 지근 또는 세근일 수 있다. 구체적으로, 상기 인삼은 인삼 뿌리로부터 유래된 것일 수 있다. 추출에 사용된 상기 발효 인삼은 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료를 분쇄 또는 세절하거나 적당하게 건조한 것일 수 있다. 상기 발효 인삼은 건조에 의해 수분함량이 20% 미만, 15% 미만, 예를 들어 12% 미만인 것을 사용할 수 있다.
상기 추출물은 친수성 용매 (hydrophilic solvent), 예를 들면, 알콜, 물, 또는 그 조합에 의하여 추출된 것일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C10의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C6의 알코올, C3 내지 C6의 다가 알콜일 수 있다. 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올, n-펜탄올, n-헥산올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 용매는 예를 들면, 물과 알콜의 혼합물, 즉 알콜 수용액일 수 있다. 알콜 수용액의 알콜 농도는 1 내지 100%(w/w), 예를 들면, 1 내지 99.5%(w/w), 10 내지 100%(w/w), 20 내지 100%(w/w), 30 내지 100%(w/w), 40 내지 100%(w/w), 50 내지 100%(w/w), 60 내지 100%(w/w), 70 내지 100%(w/w), 75 내지 100%(w/w), 60 내지 90%(w/w), 60 내지 80%(w/w), 65 내지 75%(w/w), 또는 70%(w/w)일 수 있다. 상기 알콜 수용액은 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올 수용액일 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 추출물은 에탄올 추출물인 것일 수 있다.
상기 추출물은 가온 추출, 가압 추출, 초음파 추출, 열수 추출, 환류 냉각 추출, 아임계 추출, 또는 초임계 추출 등 당업 기술분야에서 통상적인 방법으로 추출된 것일 수 있다.
상기 추출 용매는 발효 인삼의 5 내지 15 (부피/중량)배, 예를 들면, 5 내지 13 (부피/중량)배, 5 내지 11 (부피/중량)배, 8 내지 15 (부피/중량)배, 8 내지 13 (부피/중량)배, 8 내지 11 (부피/중량)배, 또는 9 내지 11 (부피/중량)배일 수 있다. 예를 들면, 상기 발효 인삼 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료 100g에 대하여 상기 추출 용매를 0.5 내지 1.5L 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
상기 추출은 4℃ 내지 70℃, 예를 들면, 4℃ 내지 50℃, 4℃ 내지 40℃, 4℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 70℃, 15℃ 내지 70℃, 20℃ 내지 70℃, 4℃ 내지 50℃, 10℃ 내지 50℃, 4℃ 내지 40℃, 4℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 35℃, 또는 10℃ 내지 30℃, 또는 실온에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 추출 시간은 선택된 온도 및 추출 방법에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 추출 시간은 1시간 내지 3일, 1시간 내지 2일, 1시간 내지 1일, 5시간 내지 3일, 5시간 내지 2일, 5시간 내지 1일, 10시간 내지 3일, 15시간 내지 2일, 15시간 내지 36시간, 18시간 내지 30시간, 1일 내지 3일, 1일 내지 2일, 또는 24시간일 수 있다.
예를 들면, 발효 인삼의 분말을 추출 용매에 2내지 4시간 동안 침적하여 초음파 추출하거나, 용매를 가해 실온에서 24 내지 72시간 동안 침적하여 추출할 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있고, 각 추출은 동일한 방법으로 수행되거나, 다른 방법으로 수행될 수 있다.
상기 추출은 식물체 잔사 및 추출액을 여과 등의 알려진 방법에 의하여 분리할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.
상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은, 상기 발효 인삼의 추출물 대신 발효 인삼의 추출물의 분획물을 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물은, 상기 발효 인삼의 추출물의 분획물을 더 포함할 수 있다. 용어, "분획물(fraction)"은 상기 발효 인삼의 추출물이 그 일부의 성분으로 나누어진 물질 즉, 분획되어진 물질을 나타낸다. 상기 분획물은 용매 분획화 (fractionation)에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 용매 분획화는 발효 인삼 추출물을 용매와 혼합하고 상기 용매에 존재하는 물질을 분리하는 것일 수 있다. 상기 분획물은 상기 발효 인삼 추출물을 물에 현탁시킨 후 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차적으로 분획화하여 얻어진 메틸렌클로리드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 또는 물 분획물일 수 있다.
구체적으로, 상기 메틸렌클로리드 분획물은 상기 발효 인삼 추출물을 물과 혼합하고, 이 혼합물을 다시 메틸렌클로리드와 혼합한 후 일정 시간 동안 방치한 후 메틸렌클로리드 층을 분리하고, 분리된 메틸렌클로리드층으로부터 분획물을 분리하는 것에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 분획물을 분리하는 것은 메틸렌클로리드층으로부터 메틸렌클로리드를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 에틸아세테이트 분획물은 상기 메틸렌클로리드 분획물 분리 후 남은 물을 다시 에틸아세테이트와 혼합한 후 일정 시간 동안 방치한 후 에틸아세테이트층을 분리하고, 분리된 에틸아세테이트층으로부터 분획물을 분리하는 것에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 분획물을 분리하는 것은 에틸아세테이트층으로부터 에틸아세테이트를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 부탄올 분획물은 상기 에틸아세테이트 분획물 분리 후남은 물을 다시 부탄올과 혼합한 후 일정 시간 동안 방치한 후 부탄올층을 분리하고, 분리된 부탄올층으로부터 분획물을 분리하는 것에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 분획물을 분리하는 것은 부탄올층으로부터 부탄올을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 온도 조건, 압력 조건, 시간, 사용된 용매의 양 또는 농도, 교반 등과 같은 상기 분획화의 조건은 상기한 발효 인삼 추출물을 제조하는데 사용된 추출에 대하여 설명한 바와 같을 수 있다. 상기 분획화는 1회 이상, 예를 들면, 1 내지 5회 반복될 수 있다.
상기 분획물을 분리하는 것은 여과 등의 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 분획화는 또한 얻어진 분획물으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 분획화는 또한 얻어진 분획물을 농축 및/또는 건조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 농축은 감압 농축일 수 있다. 상기 건조는 감압 건조, 비등 건조, 분무 건조, 상온 건조 또는 동결건조를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 HAS3 또는 AQP3의 발현을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 HAS3 또는 AQP3의 발현을 증가시켜 피부 보습 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 필라그린(Filaggrin)의 발현을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 필라그린의 발현을 증가시켜 피부 장벽 강화 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 MMP-1의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로 MMP-1의 발현을 억제하여 피부 주름을 개선하기 위한 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 IL-6 또는 TNF-α의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로 IL-6 또는 TNF-α의 발현을 억제하여 항염증 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 섬유아세포의 증식을 증진시키는 것일 수 있고, 구체적으로 섬유아세포의 증식을 증진시켜 피부 재생 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 세포 내 미토콘드리아 활성을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 섬유아세포 내 미토콘드리아 활성을 증가시켜 피부 활력 증가 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 피부 모공 크기를 감소시키는 것일 수 있고, 구체적으로 외관상 피부 모공 크기를 감소시키는 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 상기 추출물을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 추출물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 “화장료 조성물”은 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트, 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
다른 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물에 있어서, 인삼, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) 균주, 발효, 발효 인삼, 추출, 추출물, 피부미용 개선에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 “식품 조성물”은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
상기 식품 조성물 중의 상기 추출물의 함량은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 구체적으로 0.3 내지 1 g의 비율로 함유할 수 있다.
상기 음료는 상기 추출물 이외의 다른 성분을 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 음료에 사용되는 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 단당류(예: 포도당, 과당 등), 이당류(예: 말토즈, 수크로즈 등), 다당류(예: 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 함유될 수 있다. 또한, 향미제로서 천연 향미제(예: 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예: 사카린, 아스파탐 등)를 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 음료 100 mL 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 구체적으로 약 5 내지 12g으로 함유될 수 있다.
또 다른 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 또는 흉터, 피부 염증 질환, 피부 색소 침착 질환, 피부 건조증, 습진, 및 건선으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에 있어서, 인삼, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) 균주, 발효, 발효 인삼, 추출, 추출물에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 “피부 질환”은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증, 피부 색소 침착일 수 있다. 용어, “예방”은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, “치료”는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.
상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 필라그린의 발현을 증가시켜 피부 장벽 기능을 강화하여 피부 장벽 기능 손상을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 피부 노화는 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 상처 치유 능력의 저하, 피부 면역 기능의 저하 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 피부 장벽 강화, 피부 주름 개선, 피부 수분 유지, 피부 수분 손실 방지, 피부 재생, 피부 활력 증가 등의 효과에 의해 피부 노화를 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 피부 상처 또는 피부 흉터는 피부 세포가 재생, 분화, 증식되어 잃어버렸던 연속성을 다시 유지하거나, 반흔의 교원질 합성을 방해하고 교원질 분해를 촉진하여 개선 또는 치유될 수 있는 모든 질환을 의미할 수 있다. 예를 들어, 타박상, 찰과상, 열상 등의 상처, 비후성 반흔, 켈로이드 반흔 등의 흉터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 피부 수분 유지, 피부 수분 손실 방지, 피부 재생, 항염증 등의 효과에 의해 피부 상처 또는 피부 흉터를 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 피부 염증 질환은 면역 자극에 의해 유발되는 모든 질환을 의미할 수 있다. 예를 들어, 아토피성 피부염, 습진, 지루성 피부염, 건선, 여드름 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 피부 수분 유지, 피부 수분 손실 방지, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염증 등의 효과에 의해 피부 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 피부 색소 침착 질환은 멜라닌의 생성 증가로 인한 피부 색소 침착으로 유발되는 모든 질환을 의미할 수 있다. 예를 들어, 기미, 주근깨, 반점, 일광 색소반, 약물 사용 후의 색소 침착, 염증 후의 색소 침착, 임신성 색소 침착 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 티로시나아제 활성을 억제하여 피부 색소 침착 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 화장품, 식품, 또는 약학 조성물은 화장품학적으로, 식품적으로, 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 화장품, 식품, 또는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부미용을 개선시키는 방법을 제공한다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다.
상기 방법은 구체적으로, 개체의 피부 수분을 유지 또는 수분 손실을 효율적으로 방지하는 방법, 개체의 피부 장벽 기능을 강화시키는 방법, 개체의 피부 주름을 개선시키는 방법, 개체의 염증을 개선 또는 치료하는 방법, 개체의 피부톤을 개선하거나 색소침착을 억제하거나 색소 증가에 의한 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 개체의 피부 재생을 개선 또는 증진시키는 방법, 개체의 피부 활력을 증가시키는 방법, 또는 개체의 피부 모공 크기를 감소시키는 방법일 수 있다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 추출물 또는 추출물 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 장벽 강화, 주름 개선, 피부 재생, 또는 활력 증가 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 발효 인삼 추출물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
또 다른 양상은 인삼을 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) 균주로 발효시켜 발효 인삼을 제조하는 단계; 및 상기 발효 인삼을 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 발효 인삼의 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조하는 방법에 있어서, 인삼, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) 균주, 발효, 발효 인삼, 추출, 추출물에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 구체예에 따른 방법에서, 상기 균주는 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주 (수탁번호: KCCM12432P)일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법에서, 상기 발효는 고체 발효일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법에서, 상기 발효는 30 내지 35℃에서 48 내지 65시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 수행될 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 발효 인삼의 추출물은 HAS3, 또는 AQP3의 발현을 증가시켜 피부 보습 효과를 나타낼 수 있고, 필라그린의 발현을 증가시켜 피부 장벽을 강화할 수 있고, MMP-1의 발현을 억제하여 피부 주름을 개선할 수 있고, IL-6 또는 TNF-α의 발현을 억제하여 항염증 효과를 나타낼 수 있고, 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제하여 피부 미백 효과를 나타낼 수 있고, 섬유아세포의 증식을 촉진하여 피부 재생 효과를 나타낼 수 있고, 섬유아세포 내 미토콘드리아 활성을 증가시켜 피부 활력을 증가시킬 수 있으며, 피부 모공 크기 감소효과를 나타낼 수 있다. 이러한 발효 인삼의 추출물의 피부 보습, 장벽 강화, 주름 개선, 항염증, 미백, 피부 재생, 활력 증가, 또는 모공 크기 감소 효과는 발효시키지 않은 인삼의 추출물, 동속이종의 아스페르길루스 오리제(A. oryzae)로 고체발효시킨 발효 인삼의 추출물, 동속동종이나 상이한 아종인 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF로 고체발효시킨 발효 인삼의 추출물에 비해 매우 우수하다. 따라서, 상기 방법에 의해 제조된 발효 인삼의 추출물은 화장품, 식품, 약학 조성물 등 다양한 용도로 이용될 수 있다.
또 다른 양상은 신규한 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주 (수탁번호: KCCM12432P)를 제공한다.
상기 균주는 중국의 후발효차인 푸주안 복전차(Fuzhuan brick tea)로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 균주의 분리 방법은 상술한 바와 같다.
상기 균주는 배당체를 가수분해하는 효소 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 균주는 배당체를 발효시켜 비배당체를 생성하는 비배당체 생성능을 가지는 것일 수 있다. 상기 배당체를 가수분해하는 효소는 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase), 에스테라제(Esterase(C4)), 에스테라제 리파제(Esterase Lipase(C8)), 산성 포스파타제(Acid phosphatase), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-글루코시다제(beta-glucosidase), N-아세틸-베타-글루코사미니다제(N-acetyl-beta-glucosaminidase), 알파-만노시다제(alpha-mannosidase), 및 이의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 있어서, 상기 배당체를 가수분해하는 효소는 인삼의 배당체를 가수분해하여 Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비배당체 진세노사이드를 생성하는 것일 수 있다.
따라서, 상기 신규한 균주는 생리활성물질인 비배당체의 생성을 증가시켜 다양한 기능성을 가지는 물질을 생산할 수 있다.
일 양상에 따른 피부미용 개선용 조성물에 의하면, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 피부 보습, 장벽 강화, 주름 개선, 항염증, 미백, 피부 재생, 활력 증가, 또는 모공 크기 감소 용도로 사용할 수 있다.
다른 양상에 따른 발효 인삼의 추출물을 제조하는 방법에 의하면, 피부미용 개선 효과가 있는 발효 인삼의 추출물을 제조할 수 있으므로, 제조된 추출물을 화장품, 식품, 약학 조성물 등 다양한 분야에 응용할 수 있다.
다른 양상에 따른 신규한 아스페르길루스 크리스타투스 균주에 의하면, 배당체를 가수분해하는 효소 활성에 의해 다양한 기능성을 가지는 비배당체를 생산할 수 있다.
도 1은 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8 (수탁번호: KCCM12432P)로 고체 배양된 발효 인삼을 나타낸 사진이다.
도 2는 비교예 1의 인삼 추출물, 비교예 2의 A. cristatus Cosmax-GF (수탁번호: KCCM11820P) 고체발효 인삼 추출물, 실시예 2의 A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물에 존재하는 β-glucosidase의 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 비교예 1의 인삼 추출물, 비교예 2의 A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물, 실시예 2의 A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물에 존재하는 진세노사이드 성분을 분석한 HPLC 결과이다.
도 4는 보습인자인 HAS3의 mRNA 상대수준(relative level)을 나타낸 그래프이다. (-): 음성대조군인 아무 것도 처리하지 않은 각질형성세포; Retinoic acid: 양성대조군인 레티놀 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 5는 보습인자인 AQP3의 mRNA 상대수준(relative level)을 나타낸 그래프이다. (-): 음성대조군인 아무 것도 처리하지 않은 각질형성세포; Retinoic acid: 양성대조군인 레티놀 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 6은 필라그린(Filaggrin)의 mRNA 상대수준(relative level)을 나타낸 그래프이다. (-): 음성대조군인 아무 것도 처리하지 않은 각질형성세포; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 7은 주름인자인 MMP-1의 발현 억제 효과를 확인한 결과로서, 총 MMP-1의 상대농도(%)를 나타낸 그래프이다. Con은 TNF-α를 처리하지 않은 섬유아세포이고, 두 번째 내지 일곱 번째 막대는 TNF-α를 처리하여 노화반응을 유도한 섬유아세포이다. Retinol: 양성대조군인 레티놀 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 8는 항염증 효과를 확인한 결과로서, 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 억제능 (%)을 나타낸 그래프이다. LPS: 음성대조군으로서, LPS 처리 후 아무 것도 처리하지 않은 Raw264.7 세포; Indo 10: 양성대조군인 인도메타신 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 9은 멜라닌 생성 억제 효과를 확인한 결과로서, 멜라닌 함량(%)을 나타낸 그래프이다. Con은 α-MSH를 처리하지 않은 색소세포이고, 두 번째 내지 일곱 번째 막대는 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 색소세포이다. Kojic acid: 양성대조군인 코직산 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 10은 멜라닌 생성 효소인 티로시나제 활성 억제 효과를 확인한 결과로서, 세포 내 티로시나제 활성능(%)을 나타낸 그래프이다. Con은 α-MSH를 처리하지 않은 색소세포이고, 두 번째 내지 일곱 번째 막대는 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 색소세포이다. Kojic acid: 양성대조군인 코직산 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 11은 피부 세포 재생 효과를 확인한 결과로서, 세포를 긁어낸 후 24시간 후의 세포의 증식 정도를 cell counter로 세포수를 측정한 결과이다. Con: 음성대조군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 12는 미토콘드리아 활성을 확인한 결과로서, ATP 생성(%)을 상대 형광강도로 나타낸 그래프이다. Con: 음성대조군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아스페르길루스 크리스타투스( A. cristatus ) GF8 균주의 분리 및 동정
중국에서 제조된 복전차 10g을 0.85%(w/w) NaCl 용액으로 적절하게 연속 희석한 다음 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 감자한천배지(Potato Dextrose Agar: PDA, Himedia, India, M1942)에 도말 한 후, 30℃에서 60시간 동안 배양하였다. 우점한 균주들 중에 금색의 콜로니를 형성하는 균주를 선별하여 동정하였다. 동정은 찰스리버래보토리즈코리아㈜에 의뢰하여 Internal Transcribed Spacer(ITS1 (서열번호 1) 및 ITS4 (서열번호 2))부분을 분석하였다. 동정 결과 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus)와 98.8%의 상동성을 나타내어 본 발명에 이용하였다. 상기에서 분리된 균주는 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 명명하였으며, 이를 한국 미생물 보존센터에 2019년 1월 23일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM12432P를 부여받았다.
실시예 2. 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus ) GF8 고체발효 인삼 추출물의 제조
상기 실시예 1에서 분리된 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 인삼을 고체 발효하여 발효 인삼을 제조하고, 발효 인삼의 추출물을 제조하였다.
구체적으로, 상기 고체 발효에 사용된 인삼은 한명장 인삼에서 고려인삼 5년근을 구입하여 준비하였다. 준비된 인삼은 121℃에서 30분간 멸균하였다. 이 후, 감자한천배지에서 키운 상기 실시예 1의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8을 포자 현탁액으로 제조하고, 이를 멸균된 인삼에 넣어 33℃, 60~65시간, 75~85%의 습도에서 고체 발효를 하였다. 고체 발효한 인삼은 60℃에서 수분함량이 12% 미만이 될 때까지 건조한 후 분쇄하였다.
분말화된 발효 인삼 100g을 추출용기에 넣고, 추출 용매로서 70중량% 에탄올 수용액 1L에 침적하여 24시간 동안 실온에 방치하여 추출액을 얻었다. 3000rpm, 10분간 원심분리한 상등액을 0.45μm 막 여과를 하여 여액을 제조하였다. 상기 여액을 회전식 증발건조기로 감압 농축하여 8~10g의 농축 추출물을 얻었다. 얻어진 농축 추출물은 진세노사이드 분석 및 인 비트로(in vitro) 피부 효능 실험에 사용하였다. 도 1은 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8 (수탁번호: KCCM12432P)로 고체 배양된 발효 인삼을 나타낸 사진이다.
이와 별도로 상기 분말화된 발효 인삼 10g에 멸균수 100ml을 넣고 30분간 250 rpm에서 추출한 후, 0.45μm 막 여과한 여액은 효소를 정성적으로 분석하는데 사용하였다. 효소의 정성 분석은 API® ZYM kit(bioMerieux, France)를 이용하여 판독하였다.
비교예 1. 인삼 추출물의 제조
한명장 인삼에서 고려인삼 5년근을 구입하여 세척하였다. 세척한 인삼을 60℃에서 수분함량이 12% 미만일 때까지 건조한 후 분쇄하였다. 분말화된 인삼 100g을 추출용기에 넣고, 추출 용매로서 70중량% 에탄올 수용액 1L에 침적하여 24시간 동안 실온에 방치하여 추출액을 얻었다. 3000rpm, 10분간 원심분리한 상등액을 0.45 μm 막 여과를 하여 여액을 제조하였다. 상기 여액을 회전식 증발건조기로 감압 농축하여 9~10g의 농축 추출물을 얻었다. 얻어진 농축 추출물은 진세노사이드 분석 및 인 비트로(in vitro) 피부 효능 실험에 사용하였다.
이와 별도로 상기 분말화된 인삼 10g에 멸균수 100ml을 넣고 30분간 250 rpm에서 추출한 후, 0.45μm 막 여과한 여액은 효소를 정성적으로 분석하는데 사용하였다. 효소의 정성 분석은 API® ZYM kit(bioMerieux, France)를 이용하여 판독하였다.
비교예 2. 아스페르길루스 크리스타투스( A. cristatus ) Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물의 제조
상기 실시예 2에서 발효 균주로 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF(수탁번호: KCCM11820P)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일하게 인삼을 고체 발효하여 발효 인삼을 제조하고, 발효 인삼의 추출물을 제조하였다.
비교예 3. 아스페르길루스 오리제( A. oryzae ) 고체발효 인삼 추출물의 제조
상기 실시예 2에서 발효 균주로 아스페르길루스 오리제(A. oryzae) ATCC22788를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일하게 인삼을 고체 발효하여 발효 인삼을 제조하고, 발효 인삼의 추출물을 제조하였다.
제조예 1. 인삼 또는 발효 인삼 추출물이 첨가된 에센스 제형의 제조
하기 표 1의 조성 및 함량에 따라 통상적인 방법으로 에센스 제형을 제조하였다.
전성분명(함량: 중량%) 비교제형예 1 비교제형예 2 제형예 1
세테아릴 알코올 0.5 0.5 0.5
글리세릴 스테아레이트/PEG-100 스테아레이트 0.5 0.5 0.5
PEG-40 스테아레이트 0.8 0.8 0.8
C14-22 알콜/C12-20 알킬 글루코시드 0.2 0.2 0.2
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3 3 3
하이드로제네이티드 폴리데센 1 1 1
사이클로펜타실록산 3 3 3
정제수 54.1 54.1 54.1
글리세린 1 1 1
디프로필렌 글리콜 4 4 4
카보머 8.5 8.5 8.5
잔탄검 10 10 10
아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 크로스폴리머 8.5 8.5 8.5
디소듐 EDTA 0.4 0.4 0.4
트로메타민 4.5 4.5 4.5
인삼 추출물 (비교예 1) 2
A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 (비교예 2) 2
A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 (실시예 2) 2
1,2-헥산디올 1 1 1
합계 100 100 100
실험예 1. 아스페르길루스 크리스타투스( A. cristatus ) GF8의 고체 발효에 의해 생성된 효소의 정성 확인
아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼 내에 발현되어 있는 효소의 종류를 API®ZYM kit (Biomerieux, France)으로 조사하였다. 이는 정제되지 않은 혼합시료에서 효소의 활성을 검사할 수 있도록 제작되어 고체 발효 시 발현되는 여러 종류의 효소 활성을 조사하는데 적합하다. 실험 방법은 제조사에서 제공되는 매뉴얼에 따라 진행하였다. 이때 실시예 2 및 비교예 1에서 제조한 여액을 분석하였다. 하기 표 2는 비교예 1의 발효시키지 않은 인삼과 실시예 2의 발효 인삼 내 효소를 비교한 표이다.
No. 효소 인삼
(비교예 1)		 발효 인삼
(실시예 2)
1 Control - -
2 알칼리 포스파타제 (Alkaline phosphatase) - +
3 에스테라제 (C4)(Esterase (C4)) - +
4 에스테라제 리파제 (C8)(Esterase Lipase (C8)) - +
5 리파제 (C14)(Lipase (C14)) - -
6 류신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) - -
7 발린 아릴아미다제(Valine arylamidase) - -
8 크리스틴 아릴아미다제(Crystine arylamidase) - -
9 트립신(Trypsin) - -
10 α-키모트립신(α-chymotrypsin) - -
11 산성 포스파타제(Acid phospatase) - +
12 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라제(Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase) + +
13 α-갈락토시다제(α-galactosidase) - +
14 β-갈락토시다제(β-galactosidase) - +
15 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) - -
16 α-글루코시다제(α-glucosidase) - -
17 β-글루코시다제(β-glucosidase) - +
18 N-아세틸-β-글루코사미니다제(N-acetyl-β-glucosaminidase) - +
19 α-만노시다제(α-mannosidase) - +
20 α-푸코시다제(α-fucosidase) - -
상기 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 발효 인삼은 비교예 1의 발효되지 않은 인삼에 비해 9종의 효소들이 추가로 발견되었다. 추가로 발견된 효소의 종류는 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase), 에스테라제(Esterase(C4)), 에스테라제 리파제(Esterase Lipase(C8)), 산성 포스파타제(Acid phosphatase), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-글루코시다제(beta-glucosidase), N-아세틸-베타-글루코사미니다제(N-acetyl-beta-glucosaminidase), 알파-만노시다제(alpha-mannosidase)이다. 따라서, 상기 9종의 효소는 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8의 세포외 효소인 것으로 판단되었다.
실험예 2. β-glucosidase 활성 비교
A. cristatus의 아종에 따른 세포외 효소 활성을 비교하기 위하여, 비교예 2의 A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 및 실시예 2의 A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물에 존재하는 β-glucosidase의 활성을 비교분석하였다.
효소 활성 측정은 Kochchi법에 따라 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 5.5)에 용해한 5 mM p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG) 1 ml를 각각 비교예 1의 인삼 추출액, 비교예 2의 A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출액, 실시예 2의 A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출액 0.1 ml와 혼합한 다음, 50℃에서 10분간 반응시키고, 0.5 M Na2CO3 1 ml를 가하여 반응을 정지시킨 후, 발색된 황색의 흡광도를 400 nm에서 측정하였다. 유리된 p-nitrophenol (pNP)을 표준곡선에서 정량하였으며, 효소 활성도의 1 unit은 1분 동안 1 umole의 pNPG를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 단백질 정량은 BCA 시약을 사용하여 측정하였으며, 이때 표준단백질로 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)을 사용하여 750 nm 에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 작성하여 정량하였다. 상기 사용된 시약들은 Sigma chemical Co.(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
도 2는 비교예 1의 인삼 추출물, 비교예 2의 A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물, 실시예 2의 A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물에 존재하는 β-glucosidase의 활성을 비교한 그래프이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 비교예 1은 실험예 1에서와 같이 인삼 내에 β-glucosidase가 발현되어 있지 않아 효소 활성이 0으로 나타났으며, 실시예 2는 비교예 2에 비해 효소 활성이 증가된 것으로 나타났다. 이는 동속동종의 A. cristatus 균주라고 하더라도 구체적인 아종에 따라서 효소 활성 정도에 차이가 있을 수 있으며, A. cristatus GF8 균주가 세포외 효소의 활성을 보다 증가시키는 균주임을 의미한다.
실험예 3. 발효시키지 않은 인삼과 A. cristatus 균주로 고체발효 시킨 발효 인삼의 진세노사이드 비교
비교예 1의 인삼 추출물, 비교예 2의 A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물, 실시예 2의 A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물에 대하여, 다음 고속액체크로마토그래피(HPLC) 조건에서 진세노사이드 성분 변화를 비교 분석하였다. 진세노사이드는 인삼의 배당체(glycoside)를 의미한다.
<HPLC 분석 조건>
- HPLC 모형: HPLC-PDA
- 용매 구배 모드(Gradient mode):
시간 (min) 용매 A (%) 용매 B (%)
0 80 20
4 78 22
20 67 33
26 62 38
40 62 38
58 50 50
73 50 50
73.1 0 100
80 0 100
80.1 80 20
90 80 20
- 용매 A; 증류수 (distilled water: DW), 용매 B; 아세토니트릴(Acetonitrile)
- 주입 용량(Injection volume): 10 ㎕
- 실행 시간(Run time): 90 min
- 파장: 203 nm
- 컬럼: Kinetix 5㎛ C18 100A, 4.6x250 ㎜ (Phenomenex)
- 유속: 0.8 ㎖/min
도 3은 비교예 1의 인삼 추출물, 비교예 2의 A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물, 실시예 2의 A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물에 존재하는 진세노사이드 성분을 분석한 HPLC 결과이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 발효 전과 발효 후인 비교예 1과 비교예 2 및 실시예 2는 진세노사이드 성분의 변화가 있었다. 즉, 각각 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 비교예 2와 실시예 2의 발효 인삼에서 비배당체 진세노사이드 성분이 생성되었다. 이는 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus)의 세포외 효소에 의해 발효된 배당체인 비배당체 진세노사이드 성분이 생성되는 것으로 판단되었다. 뿐만 아니라, A. cristatus 아종에 따라 비교예 2와 실시예 2에서 생성된 비배당체 진세노사이드 성분이 상이한 것으로 나타났다. 이는 동속동종의 균주라도 구체적인 아종에 따라 배당체로부터 비배당체로의 세포외 효소에 의한 전환 양상이 상이할 수 있음을 의미한다.
실험예 4. 발효 인삼의 보습인자 발현 증가 효과 확인
발효 인삼의 보습기능 증가 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
먼저, 사람 각질형성세포를 6-웰 세포 배양 접시에 4ⅹ105의 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 양성대조군인 레티놀과 비교예 1, 비교예 2, 비교예3, 실시예 2의 샘플을 100μg/ml의 농도로 배양배지에 희석하여 각각 해당하는 웰에 처리한 다음 추가로 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포에서 RNA의 분리는 RNA iso (DAKARA, 일본) 용액을 이용하여 진행하였으며, Nanodrop 2000 (Thermo, USA)을 이용해 각각의 RNA양을 정량한 후 42℃에서 55분, 70℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). 합성된 cDNA는 타겟 단백질인 HAS3(Hyaluronic acid synthase-3), AQP3(Aquaporins 3)의 주형과 시아닌 염료인 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 첨가한 혼합물을 이용하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 HAS3, AQP3 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 하기 표 4에 실시간 PCR에 사용한 프라이머 서열을 나타내었으며, 실시간 PCR 반응은 94℃, 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분 조건에서 40 사이클의 조건으로 수행하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
유전자 서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 프라이머 서열
HAS3 3 HAS3-F 정방향 5'-CTTAAGGGTTGCTTGCTTGC-3'
4 HAS3-R 역방향 5'-GTTCGTGGGAGATGAAGGAA-3'
AQP3 5 AQP3-F 정방향 5'-AGACAGCCCCTTCAGGATTT-3'
6 AQP3-R 역방향 5'-TCCCTTGCCCTGAATATCTG-3'
β-Actin 7 Beta-Actin-F 정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
8 Beta-Actin-R 역방향 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'
도 4는 보습인자인 HAS3의 mRNA 상대수준(relative level)을 나타낸 그래프이다. (-): 음성대조군인 아무 것도 처리하지 않은 각질형성세포; Retinoic acid: 양성대조군인 레티놀 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 5는 보습인자인 AQP3의 mRNA 상대수준(relative level)을 나타낸 그래프이다. (-): 음성대조군인 아무 것도 처리하지 않은 각질형성세포; Retinoic acid: 양성대조군인 레티놀 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 3에 비해 실시예 2의 발효 인삼 처리군에서 보습인자인 HAS3의 발현이 매우 증가하였으며, 그 양은 양성대조군과 동등 수준 이상이었다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼은 보습기능 증가 효과가 매우 우수하며, 특히 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 보습 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
실험예 5. 발효 인삼의 피부 장벽 강화 효과 확인
발효 인삼의 피부 장벽 강화 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
먼저, 사람 각질형성세포를 6-웰 세포 배양 접시에 4ⅹ105의 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 비교예 1, 비교예 2, 비교예3, 실시예 2의 샘플을 100μg/ml의 농도로 배양배지에 희석하여 각각 해당하는 웰에 처리한 다음 추가로 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포에서 RNA의 분리는 RNA iso (DAKARA, 일본) 용액을 이용하여 진행하였으며, Nanodrop 2000 (Thermo, USA)을 이용해 각각의 RNA양을 정량한 후 42℃에서 55분, 70℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). 합성된 cDNA는 필라그린(Filaggrin)의 주형과 시아닌 염료인 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 첨가한 혼합물을 이용하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 필라그린 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 하기 표 5에 실시간 PCR에 사용한 필라그린 프라이머 서열을 나타내었으며, 실시간 PCR 반응은 94℃, 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분 조건에서 40 사이클의 조건으로 수행하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
유전자 서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 프라이머 서열
Filaggrin 9 Filaggrin-F 정방향 5'-GGCACTGAAAGGCAAAAAGG-3'
10 Filaggrin-R 역방향 5'-AAACCCGGATTCACCATAATCA-3'
도 6은 필라그린(Filaggrin)의 mRNA 상대수준(relative level)을 나타낸 그래프이다. (-): 음성대조군인 아무 것도 처리하지 않은 각질형성세포; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 6에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 3에 비해 실시예 2의 발효 인삼 처리군에서 필라그린의 발현이 매우 증가하였다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼은 피부 장벽 강화 효과가 매우 우수하며, 특히 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 피부 장벽 강화 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
실험예 6. 발효 인삼의 MMP-1 생성 억제 효과 확인
발효 인삼의 주름개선 및 주름억제 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
먼저, 사람 섬유아세포를 48-웰 플레이트에 4ⅹ105의 밀도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 TNF-α 10ng/ml을 이용하여 노화반응을 유도하고, 비교예 1, 비교예 2, 비교예3, 실시예 2의 샘플을 100μg/ml의 농도로 배양배지에 희석하여 각각 해당하는 웰에 처리한 다음 추가로 48시간 동안 배양하였다. 양성대조군은 레티놀(retinol)을 처리하였다. 이후 배양배지를 회수하여 배지로 방출된 MMP-1의 양을 MMP-1 키트(Human Total MMP-1 DY901)를 사용하여, 항원-항체 반응, 블로킹(blocking), 기질-발색 반응을 제조사의 매뉴얼에 따라 순서대로 진행한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 값을 세포수로 보정하여, 각 조건별, 농도별 총 MMP-1 양을 계산하였다.
도 7은 주름인자인 MMP-1의 발현 억제 효과를 확인한 결과로서, 총 MMP-1의 상대농도(%)를 나타낸 그래프이다. Con은 TNF-α를 처리하지 않은 섬유아세포이고, 두 번째 내지 일곱 번째 막대는 TNF-α를 처리하여 노화반응을 유도한 섬유아세포이다. Retinol: 양성대조군인 레티놀 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 7에 나타낸 바와 같이, TNF-α에 의해 노화반응을 유도하면 섬유아세포에서 주름인자인 MMP-1의 생성량이 증가하나, 실시예 2의 발효 인삼 처리군은 비교예 1 내지 3에 비해 MMP-1의 생성량이 월등히 감소함을 확인할 수 있었다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼은 주름억제 효과가 매우 우수하며, 특히 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 주름억제 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
실험예 7. 발효 인삼의 염증 인자 개선 효과
발효 인삼의 항염증 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
먼저, Raw264.7 세포를 48-웰 플레이트에 접종하여 24시간 배양하였다. 이후 배지를 교체하고 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)를 처리한 후, 양성대조군으로 인도메타신(indomethacin) 10 μg/ml, 비교예 1, 비교예 2, 비교예3, 실시예 2는 각각 100 μg/ml을 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 회수하고, 회수된 배양액의 IL-6 및 TNF-α의 농도를 ELISA법으로 측정하였다. 각 염증인자의 농도 측정은 BioLegend에서 공급한 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다.
도 8는 항염증 효과를 확인한 결과로서, 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 억제능 (%)을 나타낸 그래프이다. LPS: 음성대조군으로서, LPS 처리 후 아무 것도 처리하지 않은 Raw264.7 세포; Indo 10: 양성대조군인 인도메타신 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 8에 나타낸 바와 같이, 염증인자인 IL-6 및 TNF-α의 억제율이 모두 실시예 2의 발효 인삼 처리군에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼은 항염증 효과가 매우 우수하며, 특히 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 항염증 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
실험예 8. 발효 인삼의 미백 효과 확인
발효 인삼의 미백 효과를 확인하기 위한 실험으로서, 멜라닌 생성 억제 효과 및 세포 내 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인하는 실험을 하였다.
(1) 멜라닌 생성 억제 효과 확인
색소세포(B16F10)를 12-웰 플레이트에 접종하여 24시간 배양하였다. 이후 배지를 교체하고, α-멜라닌세포자극호르몬(α-melanocyte stimulating hormone: α-MSH) 10 nM과 함께 비교예 1, 비교예 2, 비교예3, 실시예 2 각각의 샘플을 100 μg/ml로 처리하여 48시간 배양하였다. 그리고 인산완충생리식염수(Phosphate Buffered Saline: PBS)로 세척 후, 트립신(Trypsin)-EDTA를 처리하여 세포를 회수하였다. 양성대조군으로 코직산(Kojic acid)을 사용하였다. 회수한 세포를 PBS로 세척 후 10% DMSO가 함유된 1N NaOH 100 ㎕를 처리하고 80℃에서 1시간 열을 가한 후 이를 식혔다. 그리고 ELISA microplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성능을 확인하였다.
도 9은 멜라닌 생성 억제 효과를 확인한 결과로서, 멜라닌 함량(%)을 나타낸 그래프이다. Con은 α-MSH를 처리하지 않은 색소세포이고, 두 번째 내지 일곱 번째 막대는 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 색소세포이다. Kojic acid: 양성대조군인 코직산 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 9에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 3에 비해 실시예 2의 발효 인삼 처리군에서 멜라닌 생성능이 효과적으로 억제됨을 확인하였다.
(2) 세포 내 티로시나아제 활성 억제 효과 확인
상기 실험예 8(1)과 동일한 방법으로 색소세포(B16F10)에 각각의 샘플을 처리한 후 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 1% 트리톤(Triton) x100이 포함된 0.1 M 인산나트륨 버퍼(pH 7.0)로 녹이고 4℃에서 1시간 동안 음파처리(sonication)하여 세포를 깨주었다. 그리고 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 샘플별로 단백질 정량을 통하여 동일한 단백질 40 ㎍에 5 mM L-DOPA와 0.1 M PBS (pH 6.8)를 40 ㎕ 첨가하고 96-웰 플레이트에서 37℃에서 반응시켰다. 이후 ELISA microplate reader를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제(tyrosinase) 효소의 활성능을 확인하였다.
도 10은 멜라닌 생성 효소인 티로시나제 활성 억제 효과를 확인한 결과로서, 세포 내 티로시나제 활성능(%)을 나타낸 그래프이다. Con은 α-MSH를 처리하지 않은 색소세포이고, 두 번째 내지 일곱 번째 막대는 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 색소세포이다. Kojic acid: 양성대조군인 코직산 처리군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 10에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 3에 비해 실시예 2의 발효 인삼 처리군에서 티로시나아제 활성이 더욱 높은 수준으로 감소함을 확인하였다.
따라서, 상기 도 9 및 10의 결과로부터 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼은 미백 효과가 매우 우수하며, 특히 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 미백 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
실험예 9. 발효 인삼의 피부 세포 재생 효과 확인
발효 인삼의 피부 세포 재생 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
먼저, 사람 섬유아세포를 6-웰 세포 배양 접시에 4ⅹ105의 밀도로 접종한 후 37, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 세포 스크래퍼(cell scrapper)를 이용하여 배양된 세포 중심을 긁어낸 후, 상기 비교예 1, 비교예 2, 비교예3, 실시예 2의 샘플을 첨가하여 24시간 동안 배양하고, 세포 증식된 정도를 cell counter 기기로 세포수를 측정하였다.
도 11은 피부 세포 재생 효과를 확인한 결과로서, 세포를 긁어낸 후 24시간 후의 세포의 증식 정도를 cell counter로 세포수를 측정한 결과이다. Con: 음성대조군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 11에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 3에 비해 실시예 2의 발효 인삼 처리군에서 세포 재생 정도가 가장 우수함을 확인하였다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼은 피부 세포 재생 효과가 매우 우수하며, 특히 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 피부 세포 재생 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
실험예 10. 발효 인삼의 피부 세포 내 미토콘드리아 활성 효과
발효 인삼의 피부 세포 내 미토콘드리아 활성 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
먼저, 사람 섬유아세포를 96-웰 세포 배양 접시에 4ⅹ104의 밀도로 접종한 후 37, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 비교예 1, 비교예 2, 비교예3, 실시예 2의 샘플을 첨가하여 24시간 동안 배양하고, MitoTracker Red CMXRos kit를 이용하여 형광 측정하였다.
도 12는 미토콘드리아 활성을 확인한 결과로서, ATP 생성(%)을 상대 형광강도로 나타낸 그래프이다. Con: 음성대조군; 비교예 1: 인삼 추출물 처리군; 비교예 2: A. cristatus Cosmax-GF 고체발효 인삼 추출물 처리군; 비교예 3: A. oryzae ATCC22788 고체발효 인삼 추출물 처리군; 실시예 2: A. cristatus GF8 고체발효 인삼 추출물 처리군.
도 12에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 3에 비해 실시예 2의 발효 인삼 처리군에서 미토콘드리아 활성능을 촉진시키는 효과가 매우 우수하였다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 발효시킨 발효 인삼은 피부 생기를 부여하는데 우수한 효과가 있으며, 특히 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 미토콘드리아 활성능을 촉진시키는 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
실험예 11. 모공 크기 감소 효과
제형예 1 및 비교제형예 1, 2의 모공 크기 감소 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다.
모공 크기가 넓은 피험자 남녀 15명을 선정하여 5명씩 3개 군으로 나누고 각 군별로 얼굴에 제형예 1 및 비교제형예 1, 2의 에센스를 4주간 매일 아침과 저녁에 바르게 하였다. 모공 크기 감소 효과에 대한 판정은 실험 전과 4주 후에 사진을 찍어서 전문가들의 육안 평가로 이루어졌다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다 (평가 등급: 0-전혀 축소 되지 않았다; 5-매우 축소되었다).
시험물질 평가 등급
제형예 1 4.5
비교제형예 1 0
비교제형예 2 2
표 6에 나타낸 바와 같이, 인삼 추출물로 제조된 비교제형예 1은 모공 크기 감소 효과가 전혀 없었으나, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 고체발효시킨 인삼 추출물로 제조된 제형예 1의 경우 육안으로 확인 가능할 정도로 모공 크기 감소 효과가 가장 우수하였다. 따라서, 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) GF8로 고체발효시킨 인삼 추출물은 모공 크기 감소 효과가 매우 우수하며, 특히 비교제형예 2의 동속동종의 아스페르길루스 크리스타투스(A. cristatus) Cosmax-GF와 비교하여도 모공 크기 감소 효과가 현저히 증가된 것임을 알 수 있었다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12432P 20190123
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Claims (28)

  1. 인삼을, 수탁번호 KCCM12432P로 기탁된 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 화장료 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 피부미용 개선은 피부 보습, 장벽 강화, 주름 개선, 항염증, 미백, 피부 재생, 활력 증가, 또는 모공 크기 감소인 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 발효는 고체 발효인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 발효 인삼은 30 내지 35℃에서 48 내지 65시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 발효시킨 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물의 추출물인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 에탄올 추출물인 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 발효 인삼을 실온에서 추출용매에 침적하여 추출한 추출액인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 10 중량%로 포함되는 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 비배당체 진세노사이드를 포함하는 것인 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 비배당체 진세노사이드는 Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 인삼은 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 4 내지 5년근인 것인 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 HAS3 또는 AQP3의 발현을 증가시키는 것인 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 필라그린(Filaggrin)의 발현을 증가시키는 것인 조성물.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1의 발현을 억제하는 것인 조성물.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 IL-6 또는 TNF-α의 발현을 억제하는 것인 조성물.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제하는 것인 조성물.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 세포 내 미토콘드리아 활성을 증가시키는 것인 조성물.
  19. 인삼을, 수탁번호 KCCM12432P로 기탁된 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 식품 조성물.
  20. 인삼을, 수탁번호 KCCM12432P로 기탁된 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주로 발효시킨 발효 인삼의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 또는 흉터, 피부 염증 질환, 피부 색소 침착 질환, 피부 건조증, 습진, 및 건선으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 피부 염증 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름, 지루성 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 조성물.
  22. 인삼을, 수탁번호 KCCM12432P로 기탁된 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주로 발효시켜 발효 인삼을 제조하는 단계; 및
    상기 발효 인삼을 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 발효 인삼의 추출물을 제조하는 방법.
  23. 삭제
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 발효는 고체 발효인 것인 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 상기 발효는 30 내지 35℃에서 48 내지 65시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 수행되는 것인 방법.
  26. 배당체를 가수분해하는 효소 활성을 가지는, 수탁번호 KCCM12432P로 기탁된 아스페르길루스 크리스타투스(Aspergillus cristatus) GF8 균주.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 배당체를 가수분해하는 효소는 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase), 에스테라제(Esterase(C4)), 에스테라제 리파제(Esterase Lipase(C8)), 산성 포스파타제(Acid phosphatase), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-글루코시다제(beta-glucosidase), N-아세틸-베타-글루코사미니다제(N-acetyl-beta-glucosaminidase), 알파-만노시다제(alpha-mannosidase), 및 이의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 균주.
  28. 청구항 26에 있어서, 상기 배당체를 가수분해하는 효소는 인삼의 배당체를 가수분해하여 Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, 및 Rd로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비배당체 진세노사이드를 생성하는 것인 균주.
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