KR20200083710A - 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 항산화, 항염증, 피부 미백 및 주름개선 효과가 있는 산초 추출물을 발효시켜 제조된 유효성분을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 산초 발효 추출물을 포함하는 조성물은 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수하여 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강 식품으로 활용할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 산초 발효 추출물을 포함하는 조성물은 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수하여 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강 식품으로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 항산화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 있는 산초 추출물을 발효시켜 제조된 유효성분을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
천연물로부터 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 질병에 대한 치료 및 예방제 또는 건강보조제로서 식물 자원이 널리 이용되고 있다.
피부 노화는, 시간이 경과함에 따라 기관과 동반하여 피부의 구조와 기능이 지속적으로 감퇴되어지는 내인성 노화와 장기간에 걸친 태양 광선의 노출로 인한 피부 조직의 변화인 외인성 노화가 있다. 이러한 노화 과정으로 피부가 건조해지며, 주름이 생기고 피부는 탄력을 잃게 된다.
피부 노화에 관한 연구에서 가장 중요하게 다루어지는 것은 자유 라디칼(free radical)과 활성 산소종(reactive oxygen species)이다. 이들은 자연적으로 생체 내에서 만들어지기도 하지만 공해, 태양 자외선, 화학 산화제 및 미생물 등에 의해 발생된다. 이 때 발생된 자유 전자기나 활성 산소종은 피부 세포에 산화적 스트레스를 가하게 되고, 이러한 과정에서 생긴 물질은 멜라닌과 주름 생성의 원인물질로 여겨진다.
이때 발생되어진 자유 전자나 활성 산소종은 피부세포에 산화적 스트레스를 가하게 되고, 이러한 과정에서 생긴 물질은 멜라닌과 주름 생성의 원인 물질로 여겨진다.
이들 활성 산소종은 효소적, 비효소적 항산화제로 이루어진 피부 항산화 방어막을 붕괴시키고 생체 분자의 산화적 변형, 피부 장벽의 손상과 결합 조직인 콜라겐, 히아루론산 등의 사슬 절단 및 비정상적인 교차결합에 의한 주름생성 등 피부 노화를 가속시킨다.
결과적으로 피부 노화 방지를 위해서는 과잉의 활성 산소종 생성을 억제하고 또한 생성된 활성 산소를 효율적으로 제거할 수 있어야 한다. 또한 피부 주름을 일으키는 효소들의 억제와 색소 침착을 진행하는 효소 활성 억제 등에 관한 연구가 필요하다.
한편, 멜라닌 생성 혹은 멜라노사이트의 증식에 의해 야기되는 색소 침착은 다양한 방법으로 억제가 가능하다. 일반적으로는 멜라닌 합성의 중요한 효소인 티로시나제(Tyrosinase) 활성 억제, 멜라노사이트의 기능 감소, 자동산화 반응의 억제를 통한 멜라닌 생성의 감소, 홍반과 같은 염증반응 억제등 다양한 경로를 이용할 수 있다.
결과적으로 피부노화 방지를 위해서는 과잉의 활성 산소종 생성을 억제하고 또한 생성된 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있어야 하며, 피부의 주름을 일으키는 효소들의 억제, 색소침착을 진행하는 효소의 활성억제 등에 관한 연구가 필요하다.
이와 관련하여, 피부노화 및 미백 관련해서 식물을 이용한 연구가 시행되어 왔다.
산초(Zanthoxylum Schinifolium)는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과의 낙엽관목으로 산지에서 자란다. 높이는 3m이고 잔가지는 가시가 있으며 붉은빛이 도는 갈색이다. 잎은 어긋나고 13-21개의 작은 잎으로 구성된 깃꼴겹잎이다. 작은 잎은 길이 1-5cm의 넓은 바소꼴이며 양끝이 좁고 가장자리에 물결 모양의 톱니와 더불어 투명한 유점이 있다. 산초는 잎을 따서 생으로 사용하거나, 열매껍질을 벗겨 말린 후 달이거나 농축해서 사용한다. 산초 열매는 소화불량, 식체, 위하수, 위확장, 구토, 이질, 설사, 신경쇠약, 기침, 회충 구제 등에 효능이 있다. 요리에는 후추와 비슷한 방법으로 사용된다.
이러한 산초 추출물을 포함하는 조성물의 항균 용도(특허문헌 1 참조) 또는 산초 유래의 산초유를 포함하는 조성물의 아토피 피부 개선 용도(특허문헌 2 참조)에 대한 연구는 진행되었으나 항산화, 항노화, 항염증 및 미백 효능에 대한 연구는 진행되지 않은 상황이다.
이에 본 발명자들은 산초 발효 추출물을 이용한 연구를 수행하여 산초 발효 추출물의 항산화, 항염증 및 미백 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 산초 추출물을 발효시켜 항산화, 항노화, 항염증 및 피부 미백 효과가 있는 유효 성분을 제조하는 방법 및 상기 유효성분을 포함하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화, 항염증 및 피부 미백 효과가 있는 건강 식품을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 있을 수 있다.
상기 유효성분은 산초 추출물을 유산균을 발효시켜 제조될 수 있고, 상기 유산균은 락토바실러스 균주 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) A-65이다.
상기 발효는 다양한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주를 사용하여 실시할 수 있는데 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) A-65 이외의 균주를 사용하여 발효를 실시하는 경우에는 발효 효율이 낮아서 비효율적이다.
상기 발효는 37℃에서 2 내지 7일간 실시할 수 있는데, 37℃ 보다 낮은 온도에서 발효하는 경우 발효 효율이 낮고, 2일 미만 또는 7일을 초과하여 발효하는 경우에는 발효 효율이 낮아서 비효율적이다.
본 발명에 따른 유효성분인 산초 발효 추출물은 화장료 조성물 전체에 대하여 100 내지 600㎍/mL로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 125 내지 500㎍/mL로 포함될 수 있다.
상기 산초 발효 추출물의 함량이 100㎍/mL 미만인 경우에는 미백 효능, 주름 개선 효능, 항산화 활성, 항노화 활성 및 항염증 활성이 나타나지 않을 수 있으며, 500 ㎍/mL을 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미할 수 있고 경제적이지도 못하다.
상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 또는 스프레이로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나. 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 산초 발효 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항노화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명은 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화 효과 및 항염증 효과가 있는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제로 제형화될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로치제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 우성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀롤로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 센티페드그라스 추출물, 이의 분획물 또는 분획물로부터 분리한 활성분획을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 ㎏당 본 발명의 추출물을 0.0001 ~ 500 ㎎의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 0.001 ~ 100 ㎎의 양으로 투여하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 있는 건강 식품을 제공한다.
본 발명의 산초 발효 추출물은 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수하므로 건강 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품은 산초 발효 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 산초 발효 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 산초 발효 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 산초 발효 추출물은 천연 과일주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 따라 제조된 산초 발효 추출물을 포함하는 조성물은 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수하여 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강 식품으로 이용할 수 있다.
도 1은 산초 발효 추출물의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용한 발효 균주인 락토바실러스 균주의 계통도에 관한 것이다.
도 3은 산초 발효 추출물의 제조 과정에서 최적의 발효 조건(온도-3a, 시간-3b)을 설정한 결과에 관한 것이다.
도 4는 산초 발효 추출물의 제조 과정 중 발효 과정에서의 pH 변화를 측정한 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 세포 독성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 DPPH 활성 측정에 의해 항산화 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 폴리페놀 함량 측정에 의해 항산화 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 NO 저해 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 멜라닌 생성 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용한 발효 균주인 락토바실러스 균주의 계통도에 관한 것이다.
도 3은 산초 발효 추출물의 제조 과정에서 최적의 발효 조건(온도-3a, 시간-3b)을 설정한 결과에 관한 것이다.
도 4는 산초 발효 추출물의 제조 과정 중 발효 과정에서의 pH 변화를 측정한 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 세포 독성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 DPPH 활성 측정에 의해 항산화 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 폴리페놀 함량 측정에 의해 항산화 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 NO 저해 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 멜라닌 생성 활성을 측정한 결과에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 산초 발효 추출물 제조
1.1 산초 추출물 제조
산초 열매를 수확하여 세척하고, 동결 건조 후 150 mesh 이상으로 파쇄하였다. 상기 파쇄된 건조 산초 분말 100g에 증류수를 첨가하여 수분 함량을 60%로 조절하였다. 수분 함량을 조절한 시료는 121℃에서 15분간 멸균을 실시하여 산초 추출물 시료를 제조하였다(도 1 참조).
1.2 발효 균주 제조
본 발명에서 사용하기 위한 유산균의 분리를 위해 20~40대 남여 40명에게 실험실시 약 7일 전에 참여하도록 요청하였으며, 실험을 실시하기 전 실험에 참여할 참가자들이 따로 세척 및 처리를 하지 않도록 불특정일에 실험을 실시하였다.
미리 제작한 MRS Agar 배지에 실험 참자가의 손바닥을 찍어서 초기 미생물을 접종하였다. 접종된 초기 샘플은 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 얻어진 미생물 콜로니를 다시 MRS Agar 배지에 2차 접종을 하여 균주를 얻어냈다. 2차 접종에서 얻어진 콜로니별로 발효를 한 결과 가장 활성이 뛰어난 미생물을 선택하였다. PCR을 이용하여 본 발명의 유산균락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus, A6-5)을 동정하여 사용하였다(도 2 참조).
유산균(Lactobacillus rhamnosus A6-5, 도 2 참조)을 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 균주는 3,000 rpm 및 4 ℃에서 15 min 동안 원심분리를 통해 균체를 회수한 후, 상기 균체는 인산염 완충액(Phosphate buffer solution)으로 3회 세척을 실시하였다. 세척된 균체는 인산염 완충액을 사용하여 O.D(Optical Density) 1.0의 균주액을 제조하였다(도 1 참조).
1.3 발효 조건 설정
상기 유산균에 대하여 최적의 발효 조건을 설정하기 위해, 비세포 티로시나아제 억제 활성을 측정하였다. 발효 조건에 관련하여, 온도 및 기간을 다양하게 설정하여 제조된 발효물에 대하여 하기와 같이 비세포 티로시나아제 억제 활성을 측정하였다.
0.175M sodium phosphate buffer (pH 6.5) 0.5 mL와 10 mM L-DOPA 용액 0.2 mL을 가한 후 제조된 시료를 0.1 mL을 가하고 mushroom tyrosinase (100 unit/mL) 0.2 mL를 첨가하여 37℃에서 2 분간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해율은 다음과 같이 계산하였다.
Tyrosinase inhibition(%) =[1-(B-C)/(A-D)] × 100
A : 효소만 첨가된 반응용액
B : 효소와 시료가 모두 첨가된 반응 용액
C : 시료만 첨가된 반응 용액
D : 효소와 시료가 모두 첨가되지 않은 반응 용액의 475 nm에서의 흡광도 값
도 3에 나타낸 바와 같이, 발효 조건으로서 발효 온도는 37℃, 발효 기간은 5일을 설정하였다.
추가적으로, 상기 발효 조건에 따라 발효를 실시하는 경우, 시간에 따른 PH 변화를 측정하였다.
| Time (hour) |
0 | 12 | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 | 96 | 120 |
| pH | 5.46 | 5.12 | 5.08 | 5.01 | 4.87 | 4.87 | 4.85 | 4.85 | 4.83 |
2일 내지 5일의 발효를 진행하는 경우 산초 발효 추출물은 적정 pH를 나타냄을 확인하였다(표 1 및 도 4 참조).
1.4 산초 발효 추출물 제조
실시예 1.1에 따른 산초 추출물 시료를 기준으로 실시예 1.2에 따른 균주액을 5중량% 비율로 접종하였다.
접종 후에, 37℃에서 5일간 발효시켜 발효물을 제조하였다. 상기 발효물에 대하여 20% 에탄올을 추출 용매로 사용하여 5시간 추출을 실시하여 추출물을 제조하였다. 상기 추출물 내 고형물을 완전히 제거한 후 동결 건조를 통해 산초 발효 추출물을 완성하였다(도 1 참조).
실시예 2. 세포 독성 측정
실험에 사용된 세포에 대한 독성을 평가하기 위하여 MTT assay에 따라 세포생존율을 평가하였다. 계대 배양된 Raw 264.7 cell을 DMEM 배지를 사용하여 96-well plate에 1 × 105 cell/well씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양하였다. 배양 후 세포 외 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 조성한 DMEM 용액을 100 ul 처리한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 반응시켰다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 DMEM 용액을 처리하여 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 반응이 끝난 후 잔류 배지를 제거하고 5 mg/ml MTT (3-(4,5-dimethylthi azol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 well 당 50 ul 씩 처리하여 37℃에서 4 h 반응시켰다. 이후 MTT 용액 제거하고 37℃에서 30 분간 건조과정을 진행하였으며, DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액을 100 ul 첨가하여 생성된 formazan을 완전히 용해시킨 후 microplate reader를 사용하여 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 세포의 흡광도를 분석하여 사용하였으며, 대조군의 흡광도를 100% 기준으로 처리구의 흡광도를 백분율로 계산하여 세포의 생존율을 환산하였다.
세포 생존율을 측정한 결과, 산초 발효 추출물 및 발효를 실시하지 않은 산초 추출물은 세포 독성이 유사함을 확인하였다(도 5 참조).
실시예 3. 항산화 활성 측정
3.1 DPPH 소거 활성
자유라디칼은 노화, 특히 피부 노화의 원인 물질로 알려진 것이다. 자유 라디칼 소거 활성 측정을 위해 메탄올을 사용하여 0.2 mM DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl) 용액을 제조한 이후 각 농도별로 조성된 추출물과 혼합하였다. 혼합액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후 UV-Vis spectrophotometer를 사용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 분석하였다. 대조군으로는 추출물을 첨가하지 않은 DPPH 용액을 같은 조건에서 흡광도를 분석하여 결과 값을 계산하기 위한 식에 사용하였으며, 흡광도 값을 사용하여 DPPH radical scavenging 활성을 확인하기 위해 다음과 같은 식에 의해 측정하였다.
DPPH radical scavenging 활성(%) = [(AbsDPPH - AbsSample)/AbsDPPH] × 100
여기서 Abssample은 시료 반응액의 흡광도이고, Absblank는 시료만의 흡광도, Abscontrol은 DPPH 용액의 흡광도이다.
발효 과정 없이 제조된 산초 추출물 및 발효 과정에 의해 제조된 산초 발효 추출물의 DPPH 제거 활성을 측정한 결과, 발효 과정에 의해 제조된 산초 발효 추출물을 사용하는 경우에 DPPH 제거 활성이 더 높음을 확인하였다(도 6 참조).
3.2 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량 (total polyphenol content) 측정은 Folin-reagent가 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 함량을 정량하였다. 표준물질은 gallic acid (Sigma)를 사용하여 0-100 ㎍/mL 농도로 제조한 후 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선을 기준으로 시료의 폴리페놀 함량을 당량으로 계산하였다. 각 시료의 추출물은 60% 에탄올에 희석한 후 희석한 시료와 Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 시약을 혼합하여 실온에서 차광된 상태로 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 96 well plate에 200 μL씩 분주한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하고 건조 시료 1 g에서 용출되는 총 폴리페놀의 함량을 gallic acid 기준으로 폴리페놀 함량을 측정하다.
발효 과정 없이 제조된 산초 추출물 및 발효 과정에 의해 제조된 산초 발효 추출물의 총 폴리페놀 함량을 비교한 결과, 유사한 수준임을 확인하였다(도 7 참조).
실시예 4. 항염증 활성 측정
본 발명에 따른 산초 발효 추출물에 대하여, 주름 형성의 주요한 원인 중 하나인 염증 반응의 완화 효과를 NO(Nitric Oxide) 생성 억제 효능을 측정하여 평가하였다.
NO 생성 억제 효능을 측정하기 위해, RAW264.7 세포(mouse monocyte/macrophage-like cell)를 10% FBS가 첨가된 phenol red free DMEM 배지를 이용하여 24-well plate에 5×105 cell/well씩 분주하였다. 시료를 처리하고 48시간 경과 후 배양액을 취하여 Griess reagent와 1:1로 96-well plate에 처리한 후 상온에서 15분간 반응 한 다음 540 nm 파장에서 측정하였다.
발효 과정 없이 제조된 산초 추출물 및 발효 과정에 의해 제조된 산초 발효 추출물의 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과, 발효 과정에 의해 제조된 산초 발효 추출물을 사용하는 경우에 NO 생성 억제 활성이 더 높음을 확인하였다(도 8 참조).
실시예 5. 미백 활성 측정
5.1 티로시나아제(Tyrosinase) 저해활성 측정
본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 미백 활성을 평가하기 위해, 티로시나아제 저해 활성을 측정하였다.
B16F10 melanoma를 이용하여 시료의 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다. B16F10 melanoma을 6 well plate에 각 well 당 1×104 cells가 되도록 10% FBS가 포함된 각 cell의 배지를 사용하여 2 mL씩 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 세포의 부착을 확인한 후, 시료를 농도별로 배지를 교환해주고, 1시간 후 100 nM α-MSH 자극제 처리 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 2일 간 배양하였다. 배지를 제거한 후 Triton X-100, 100 mM PMSF를 첨가한 Lysis buffer를 처리하고 10분 동안 15,000 rpm에서 원심분리 하였다. 이 후, 2% N,N-dimethyl formamide와 5 mM L-DOPA를 혼합한 mix buffer를 원심분리한 세포 상등액과 혼합하여 반응시키고 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. tyrosinase의 저해 활성은 α-MSH만 처리한 군과 비교하여 백분율로 표시하였다.
산초 발효 추출물의 미백 활성을 측정하기 위해 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과, 산초 발효 추출물의 사용량에 따라 티로시나아제 저해 활성이 증가하는 것으로 확인하였다. 또한, 동일한 양에서는 발효 과정 없이 제조된 산초 추출물보다는 발효 과정에 의해 제조된 산초 발효 추출물의 효과가 더 높은 것으로 나타났다(도 9 참조).
4.2 멜라닌(Melanin) 생성 억제활성 측정
본 발명에 따른 산초 발효 추출물의 미백 활성을 평가하기 위해, 멜라닌 생성 저해 저해 활성을 측정하였다.
시료의 멜라닌 생합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 melanoma를 6 well plate에 1×104이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 세포의 부착을 확인한 후, 멜라닌 생성을 촉진하기 위하여 10% FBS를 포함된 배지에 농도별로 첨가하여 4시간 배양하고, 이후 100 nM α-MSH 자극제를 처리하여 2일간 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척하고 scrapping하였다. 15,000 rpm에서 20 분간 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고 pellet에 10% DMSO가 포함된 1 N NaOH 용액을 첨가하여 80℃에서 1시간 동안 용해하였으며, microplate reader를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 외부자극에 대한 melanoma cell 내 과생성 melanin에 대해 알아보기 위해 자극제로 100 nM α-MSH을 사용하였으며, 실험은 3회 이상 반복 실험하여 시료 무첨가구와 대조하여 그래프로 나타내었다.
산초 발효 추출물의 미백 활성을 측정하기 위해 멜라닌 합성 저해 활성을 측정한 결과, 산초 발효 추출물의 사용량에 따라 멜라닌 합성 저해 활성이 증가(멜라닌 함량 감소)하는 것으로 확인하였다. 또한, 동일한 양에서는 발효 과정 없이 제조된 산초 추출물보다는 발효 과정에 의해 제조된 산초 발효 추출물의 멜라닌 합성 저해 효과가 더 높은 것으로 나타났다(도 10 참조).
실시예 6. 화장료 조성물의 제조
하기 표 2에 나타낸 조건(단위, 중량%)으로 화장료 조성물을 제조하였다.
| 원료명 | 함량(중량%) |
| 정제수 | 잔량 |
| Glycerin | 5.000 |
| Sodium hyaluronate | 0.010 |
| hydrogel PFKC | 1.500 |
| Dissolvine NA2-S | 0.020 |
| Betaine | 1.500 |
| carbopol 980 | 0.250 |
| 1.3ㆍBG | 1.000 |
| Keltrol F | 0.060 |
| CS-165 | 1.200 |
| ARLACEL 60 | 0.800 |
| TWEEN 60 | 0.800 |
| M.C.T | 5.000 |
| Lanetto O | 1.500 |
| Lipex shea soft | 0.100 |
| Tocopheryl acetate | 0.100 |
| Bees wax | 0.500 |
| Dimethicone 6CS | 0.300 |
| TEA | 0.250 |
| SEPPIPLUS 400 | 0.150 |
| 향료 | 미량 |
| 본 발명의 산초 발효 추출물 | 7.000 |
| Phenoxyethanol | 0.300 |
| 1,2-HEXANEDIOL | 0.400 |
실시예 7. 추출물이 함유된 약제 제조
하기 표 3에 나타낸 조건(단위, 중량%)으로 약제 조성물을 제조하였다.
| 구성 성분 | 함량 (중량 %) |
| 본 발명의 산초 발효 추출물 | 2 |
| 사카린 | 0.8 |
| 당 | 25.4 |
| 글리세린 | 8 |
| 향미료 | 0.04 |
| 에탄올 | 4 |
| 소르브산 | 0.4 |
| 증류수 | 59.36 |
실시예 8. 추출물이 함유된 건강 식품 제조
산초 발효 혼합물 25 중량부를 과자 반죽에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다(표 4 참조).
| 구성 성분 | 함량 (중량부) | |
| 과자 반죽 | 밀가루 | 100 중량부 |
| 우유 | 10 내지 20 중량부 | |
| 달걀 | 10 내지 20 중량부 | |
| 설탕 | 5 내지 10 중량부 | |
| 베이킹파우더 | 0.5 내지 1.5 중량부 | |
| 베이킹소다 | 0.5 내지 1 중량부 | |
| 버터 | 5 내지 10 중량부 | |
| 본 발명의 산초 발효 추출물 | 상기 과자반죽 100 중량부 대비 25 중량부 | |
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (9)
- 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 유효성분은 산초 추출물을 유산균을 이용하여 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus A-65)인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 발효는 37℃에서 2 내지 7일간 실시하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름개선 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 유효성분은 125 내지 500㎍/mL을 포함하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것인 화장료 조성물.
- 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화 및 항염증 약학적 조성물.
- 산초 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화, 항염증, 피부 미백 및 주름 개선용 건강 식품.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E601 | Decision to refuse application |