KR101889647B1 - 신규한 락토바실러스 하비넨시스 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 락토바실러스 하비넨시스 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새롭게 분리된 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주 및 이의 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는 피부보호, 주름개선 및 항산화 효능을 갖는 신규한 유산균 균주 및 이를 이용한 화장료 조성물, 약학조성물 및 건강기능식품에 대한 것이다.
본 발명에 따른 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물은 기존 주름 개선제나 항산화제의 부작용을 최소화하여 피부에 안전하면서도, 피부노화의 주요 원인인 자외선 노출에 대하여 피부세포를 보호하는 작용을 나타내며, 피부 주름을 유발하는 효소를 효과적으로 감소 또는 억제할 수 있으므로, 피부 노화 방지 및 주름 개선에 유용하다. 아울러, 효과적으로 항산화 활성을 보이는바 항산화제로서 또한 유용하다.

Description

신규한 락토바실러스 하비넨시스 및 이의 용도{Novel Lactobacillus Harbinensis and Use thereof}
본 발명은 새롭게 분리된 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주 및 이의 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는 피부보호, 주름개선 및 항산화 효능을 갖는 신규한 유산균 균주 및 이를 이용한 화장료 조성물, 약학조성물 및 건강기능식품에 대한 것이다.
유산균은 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 젖산을 생성하는 세균을 총칭하는 것으로, Lactobacillus, Lactococcus , Leuconostoc , Pediococcus , Bifidobacterium 등의 균속으로 정의된다. 이중 락토바실러스 속 균주들은 대표적인 유산균으로 각종 발효식품에 사용되고, 유제품, 고기제품, 빵종, 사과국, 사일레이지에서 사람이나 동물의 구강, 장관, 소의 제1위(rumen)까지 자연계에 널리 분포하고, 또한 각 균종의 확실한 분포 서식처로 분류되는 것으로 알려져있다. 본 속에는 생육온도역, 당류발효 양상, 생성유산의 광학이성체 등의 성질에 따라 60종 이상의 종(species)이 있다.
이러한 락토바실러스 속 균주들은 다양한 발효에 사용되고 있으며, 락토바실러스 하비넨시스 균주를 포함한 다양한 종의 락토바실러스 속 균주들의 미생물 혼합물을 이용한 어류 초기 사료 조성물 제조방법(KR10-1655981), 중금속 제거용 조성물(KR10-1669599) 등이 보고되었으나, 락토바실러스 하비넨시스를 이용한 피부노화 억제 등의 효과는 보고된 바 없다.
한편, 기능성 화장품 소재 개발은 크게, 피부노화를 억제하는 항노화 소재 개발과 표피층의 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성을 저해하거나 생성된 멜라닌이 표피세포로 전달되는 경로를 차단하는 미백 소재 개발이 주류를 이루고 있고, 항산화 소재는 항노화 소재 범주에 드는 소재로서 기능성 화장품 소재 개발의 주요 탐색 수단으로 사용되고 있다.
이에 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 탄력손실, 각질화, 주름생성 등의 피부 노화현상을 촉진시키게 되는데, 이러한 현상을 방지하고 보다 건강하고 탄력있는 피부를 유지하기 위하여 종래 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리활성물질들이 강화된 화장품을 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부세포를 활성화시켜 피부노화를 효과적으로 억제하고 주름을 재선시키기 위한 노력이 있어 왔다. 그러나 이러한 기존의 화장품 원료들은 대부분 그 효능이 미진하거나 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있었다.
이에 본 발명자들은 기존 항노화제나 항산화제의 부작용을 최소화하고, 노화 방지 효과 및 항산화 효과가 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 신규 분리된 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003 균주가 피부 노화 방지 및 주름 개선, 그리고 항산화에 있어 뛰어난 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
한국등록특허 10-1655981 (2016.09.08. 공고) 한국등록특허 10-1669599 (2016.10.20. 공고)
본 발명의 목적은 피부보호, 주름개선 및 항산화 효능을 갖는 신규한 유산균 균주 및 이를 이용한 화장료 조성물, 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주 및 이의 용도를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003 (기탁번호 KCCM11928P) 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항산화제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항산화제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 피부보호, 주름개선 및 항산화 효능을 갖는 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주 및 이를 이용한 화장료 조성물, 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물은 기존 주름 개선제나 항산화제의 부작용을 최소화하여 피부에 안전하면서도, 피부노화의 주요 원인인 자외선 노출에 대하여 피부세포를 보호하는 작용을 나타내며, 피부 주름을 유발하는 효소를 효과적으로 감소 또는 억제할 수 있으므로, 피부 노화 방지 및 주름 개선에 유용하다. 아울러, 효과적으로 항산화 활성을 보이는바 항산화제로서 또한 유용하다.
도 1은 자외선(UVB) 처리 시 본 발명에 따른 균주 처리 후 MTT 분석을 통하여 인간 각질형성세포(HaCaT)의 세포 생존률을 측정한 그래프이다. (No. 1: 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003 )
도 2는 자외선(UVB) 처리 시 인간 각질형성세포(HaCaT)의 콜라겐분해효소(MMP-1) 발현율을 측정한 그래프이다. (No. 1: 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003)
도 3은 시료 농도별 DPPH 자유 라디칼 소거능력을 제시하는 그래프이다. (L-3: 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003 )
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서의 용어 "파쇄물"이란 균주를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 균주의 "배양액"이란 균주를 배양시킨 다음, 균주를 제외하고 남은 세포 배양용액을 의미한다. 추가적으로 본 발명에서 "배양물"이란 배양액 및/또는 배양된 균주를 포함하는 물질이다.
이하, 구체적으로 본 발명을 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 신규한 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) 균주에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주는 지렁이 분변토에서 분리한 유산균이다.
본 발명에 따른 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열 단편을 가지는 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) 균주임을 특징으로 한다. 한국미생물 보존센터(KFCC)에 미생물 분석을 의뢰한 결과, 본 발명에 따른 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열 단편을 가지는 신규 균주로서 도 1과 같이 계통상 락토바실러스 하비넨시스 AB196123 균주와 가장 근접하게 나타났다. 분리된 신규 균주는 배양 온도 등 균주 특성이나 효능 면에서도 기존 균주와 상이한 효과를 보임을 확인하였다.
이에 본 발명자는 분리된 신규한 락토바실러스 하비넨시스 균주를 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003라 명명하고, 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms)에 2016년 11월 1일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11928P). 이에 본 발명은 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003(기탁번호 KCCM11928P) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주가 피부 노화 방지 및 주름 개선 효과를 가짐을 확인하였다. 먼저, 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주가 자외선으로부터 피부세포를 보호하여 피부의 노화를 방지할 수 있는지 확인하기 위하여, UVB를 처리 시 인간 각질형성세포주의 생존률을 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 시료를 처리한 실험군에서 자외선 처리에도 불구하고 높은 생존율을 확인할 수 있었으며 이에 본 발명의 균주가 피부 노화 방지 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 추가적으로, 피부주름을 생성시키는 콜라겐 분해효소(MMP-1) 억제 여부를 테스트한 결과, 본 발명의 시료를 처리하지 않은 대조군의 경우 자외선 처리에 의하여 MMP-1 발현이 3배 이상 현저히 증가함에 반하여, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주를 처리한 시험군에서는 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 현저히 낮은 MMP-1 발현을 나타내었다. 즉, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주가 피부노화방지 및 주름개선용 조성물로서 매우 유용한 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 대한 것이다. 이때, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 및 그 파쇄물이나 배양물은 피부 노화 방지 또는 주름 억제용 약학 조성물의 형태나 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 건강기능식품의 형태로도 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주가 항산화 활성을 가짐을 확인하였다. 즉, DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과, DPPH 자유 라디칼 소거능력이 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 농도 의존적임을 확인하였으며, 특히 시료를 10mg/ml 투여한 군에서는 양성대조군으로서 비타민 C를 125μM 투여한 군보다 소거능이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 시료는 매우 우수한 항산화 효과를 보유함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항산화제에 대한 것이다. 이는 약학 조성물, 기능성 식품 또는 화장료 조성물에 포함될 수 있으며, 이에 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항산화제를 포함하는 화장료 조성물에 대한 것이다.
먼저, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 다음에 의하여 제공될 수 있다.
즉, 본 발명에 따르면, 상기 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 및 그 파쇄물이나 배양물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 상기 균주 등은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 균주 등의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량% 를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학 조성물은 다음에 의하여 제공될 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 이들을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 균주 등은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
아울러, 본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 균주 또는 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.
본 발명의 기능성 식품은 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은, 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
이때, 식품 또는 음료 중의 상기 균주 등의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 균주 등을 함유하는 것 외에 액체 성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 화합물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
신규한 락토바실러스 하비넨시스 ( Lactobacillus harbinensis ) RPG -L0003 균주의 분리 및 시료의 준비
1-1: 신규한 락토바실러스 하비넨시스 ( Lactobacillus harbinensis ) RPG-L0003 균주의 분리
지렁이 분변토에서 다수개의 균주 분리 후 선별과정을 거쳐 새로운 균주 RPG-L0003을 분리하였다. 이는 한국미생물 보존센터(KFCC)에 미생물 분석을 의뢰한 결과, 서열번호 1의 16S rRNA 서열 단편을 가지는 신규 균주로 확인되었고, 신규 균주 RPG-L0003는 계통상 락토바실러스 하비넨시스 AB196123 균주와 가장 근접하게 나타났다. 이에 본 발명자는 분리된 신규한 RPG-L0003 균주를 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003라 명명하였다.
분리된 신규 균주는 다음의 표 1과 같은 특성을 보였다.
락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003의 특성
Lactobacillus harbinensis RPG-L0003
균의 형태 간균
운동성 -
그람 (Gram) 염색 +
산소 영향 통성 혐기성
생육 온도 (℃) 25-45
생육 pH 5.0-7.5
당발효실험 (포도당) +
본 발명에서 분리된 신규 균주는 특히 일반적인 락토바실러스 속 균주들이 24~30도에서 배양되는 것과 달리, 고온에서 배양되는 특성을 보였다. 즉, 31 내지 45도에서, 바람직하게는 36도 정도에서 생육되는 고온성 특성을 보였다. 이외에도 발효 진행, 맛, 미생물 군집 형태에서도 상이한 모습을 나타내었다.
이에 본 발명자는 분리된 신규한 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003를 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms)에 2016년 11월 1일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11928P).
1-2: 락토바실러스 하비넨시스 ( Lactobacillus harbinensis ) RPG -L0003 균주 시료의 준비
실시예 1-1에서 분리된 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003 균주의 효능을 추가적으로 테스트하기 위하여 다음과 같이 시료를 준비하였다.
즉, MRS broth(BD, USA)에서 분리된 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003 균주를 16시간 배양한 다음 120도에서 15분간 열처리한 후 냉각하여 사균화한 뒤, 1.0 x 105 ~1.0 x 106 cells/ml로 희석하여 시료를 준비하였다.
신규한 락토바실러스 하비넨시스 ( Lactobacillus harbinensis ) RPG -L0003 균주의 피부 노화 방지 및 주름 개선 효능 확인
2-1: 자외선에 대한 락토바실러스 하비넨시스 ( Lactobacillus harbinensis ) RPG-L0003 균주의 인간 각질형성세 포주 보호 효과
본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주가 자외선으로부터 인간 피부세포를 보호할 수 있는지 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
먼저, 인간 각질형성세포주(HaCaT: CLS, Germany)는 10% 우혈청을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다.
그 다음, 배양된 HaCaT 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 1×104 개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그런 다음, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 실시예 1의 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 시료를 1×106 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하였다. 이후 인산완충용액(PBS)으로 세척하고, PBS를 넣은 상태에서 200mＪ/㎠농도의 UVB를 조사하였다. 시료를 처리하지 않은 세포들은 대조구로 동일하게 배양하였다.
자외선 조사 24시간 후, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 시료를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT, Sigma) 용액을 넣고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 DMSO를 넣고 녹인 후 ELISA reader(Thermo Max, Molecular Devices Co.)를 이용하여 540㎚의 파장에서 형성된 포르마잔 다이의 광학적 농도(OD)을 측정하였다. 자외선을 조사하지 않은 세포의 OD값을 100%로 계산하여 상대적인 값을 세포의 생존수로 나타내었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군(도 1의 UVB)의 경우 자외선(UVB) 처리에 의하여 인간 각질형성세포주가 자외선 비처리군에 비하여 세포 생존도가 50% 이하로 떨어짐에 반하여, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주를 처리한 시험군(도 1의 No. 1)에서는 시료 비처리군보다 현저히 높은 생존도를 보였으며 특히 자외선 비처리군과 비교하여서도 이의 90% 이상의 생존도를 보였다. 이는 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주가 자외선에 대한 높은 피부세포 보호 효과가 있음을 나타낸다.
2-2: 자외선 조사에 의하여 유도되는 콜라겐분해효소(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 생성 억제효과 확인
자외선 노출에 의하여 MMP가 증가되는 경우, 증가된 MMPs는 피부의 콜라겐을 분해하여 피부주름을 형성시키는바, 자외선에 의해 증가된 MMP-1 발현이 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주에 의해 억제되는 효과를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
먼저 실시예 2-1의 HaCaT 세포를 실시예 2-1과 동일한 방법으로 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 시료를 처리하고 UVB를 조사하였다. 그 다음, 배양한 배지를 수거하여 MMP-1 발현량 측정은 머크(MERCK)사의 QIA55 MMP-1 ELISA Kit 장비를 사용하여 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군(도 2의 UVB)의 경우 자외선(UVB) 처리에 의하여 인간 각질형성세포주에서 자외선 비처리군에 비하여 콜라겐 분해효소(MMP-1) 발현이 3배 이상 현저히 증가함에 반하여, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주를 처리한 시험군(도 2의 No. 1)에서는 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 현저히 낮은 MMP-1 발현을 나타내었다.
즉, 본 발명에 따른 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주가 우수한 MMP-1 발현 억제능을 보이는 것으로 피부노화방지 및 주름개선용 조성물로서 매우 유용한 것으로 확인되었다.
신규한 락토바실러스 하비넨시스 ( Lactobacillus harbinensis ) RPG -L0003 균주의 항산화 효능 확인
3-1: 락토바실러스 하비넨시스 ( Lactobacillus harbinensis ) RPG -L0003 균주 시료에 의한 DPPH 라디칼 소거활성 측정
락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 1 mg을 취하여 MRS 액체배지 (10 ㎖)에 접종하여 37℃에서 24-36시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 3,000 rpm, 상온에서 20분간 원심분리한후 상등액을 분리하였다.
그 다음, 배양액에 의한 DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl)에 의한 수소 공여효과를 측정하였다. 본 발명의 균주를 배양한 상등액을 10배, 100배 희석한후, 각 희석용액 50 ㎕와 DPPH 용액 200 ㎕를 가하여 잘 혼합한 후 암소의 37˚C 장소에서 30분간 반응시켰다. 이후 515 nm에서 흡광도를 측정하여 상기 용액의 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인하였다. 수소 공여효과는 시료 무첨가군의 흡광도와 비교하여 시료첨가군의 흡광도를 다음 식에 의하여 계산함으로써 계산하였다.
* DPPH activity(%) = 100 - [(발효균 배양액 첨가군의 흡광도)/(발효균 미배양액 첨가군의 흡광도) x 100]
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, DPPH 자유 라디칼 소거능력이 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 농도 의존적임을 확인하였으며, 특히 시료를 10mg/ml 투여한 군에서는 양성대조군으로서 비타민 C를 125μM 투여한 군보다 소거능이 더 우수함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 락토바실러스 하비넨시스 RPG-L0003 균주 시료는 매우 우수한 항산화 효과를 보유함을 알 수 있었다.
제조예 1. 약학제제 제조예
제제예 1-1: 정제의 제조
실시예 1에서 제조된 균주 시료 100 ㎎을 옥수수 전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.
제제예 1-2: 캡슐제의 제조
실시예 1에서 분리된 건조 균주 500 ㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 1-3: 시럽제의 제조
실시예 1에서 분리한 균주 1 g, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100 mL의 시럽제를 제조하였다.
제제예 1-4: 주사제의 제조
실시예 1에서 분리한 균주 200 ㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 ㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.
제조예 2. 기능성 식품의 제조
제조예 2-1: 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 분리한 균주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
제조예 3. 화장품 제조예
제제예 1-1: 유연화장수(스킨로션)의 제조
다음 표의 조성을 갖는 유연화장수를 당업자의 통상적인 방법에 따라 제조하였다.
배합성분 중량%
본 발명의 균주 또는 배양물 0.1
글리세린 3
부틸렌글리콜 2
프로필렌글리콜 2
카르복시비닐폴리머 0.1
PEG 12 노닐페닐에테르 0.2
폴리솔베이트 80 0.4
에탄올 10
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
제제예 1-2: 팩의 제조
다음 표의 조성을 갖는 팩을 당업자의 통상적인 방법에 따라 제조하였다.
배합성분 중량 %
본 발명의 균주 또는 배양물 5
폴리비닐알콜 13
소듐카르복시메틸셀룰로오스 0.2
글리세린 5
알란토인 0.1
에탄올 6
PEG 12 노닐페닐에테르 0.3
폴리솔베이트 60 0.3
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
부호 없음
한국미생물보존센터(국외) KCCM11928P 20161101
<110> PARK, Byoung Hee <120> Novel Lactobacillus Harbinensis and Use thereof <130> Raphagen-L-3 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 884 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rRNA partial sequences of Lactobacillus harbinensis RPG-L0003 <400> 1 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgaggttt ggtcagtttg 60 cggtggtgct tgcatcacca attaccgatc aaaccgagtg gcggacgggt gagtaacacg 120 tgggtaacct gcccttcagc aggggataac atttggaaac agatgctaat accgtataac 180 cacggagacc gcatggtctc cgggtaaaag atggcgcaag ctatcactga aggatggacc 240 cgcggcgtat tagccagttg gtggggtaac ggcctaccaa agcgatgata cgtagccgac 300 ctgagagggt aatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag 360 cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga 420 aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttattg aagaagaacg tgtgtgacag taactggtca 480 tgcagtgacg gtattcaatc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 540 acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagtgcag gcggtctttt 600 aagtctgatg tgaaagcctt cggcttaacc gaagaagggc atcggaaact gggagacttg 660 agtgcagaag aggagagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag 720 aacaccagtg gcgaaggcgg ctctctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagcgtgg 780 gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat actaagtgtt 840 ggagggtttc cgcccttcag tgctgcagct aacgcattaa gtat 884

Claims (8)

  1. 지렁이 분변토에서 분리되고, MMP-1 억제능, 항산화 활성 및 자외선에 대한 피부세포 보호 효과를 갖는 락토바실러스 하비넨시스 (Lactobacillus harbinensis) RPG-L0003 (기탁번호 KCCM11928P) 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐 분해효소(MMP-1) 억제능을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항의 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 주름 개선용 건강기능식품.
  7. 제1항의 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항산화제.
  8. 제1항의 균주, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는 항산화제를 포함하는 화장료 조성물.
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