CN115812968A - 哈尔滨乳杆菌在抗氧化、抗衰老和减脂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了哈尔滨乳杆菌WY202201菌株及其应用，本发明从水开菲尔分离得到一株具有抗氧化、减少脂肪积累及线粒体损伤、抗衰老且延长寿命的哈尔滨乳杆菌WY202201菌株，该菌株于2022年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62535。本发明研究表明，WY202201菌株能增强秀丽隐杆线虫的抗氧化能力，减少机体氧化损伤，延长线虫寿命，增加线虫体长，提高线虫行动力以及繁殖能力，减少脂肪积累及线粒体损伤。说明该菌可作为益生菌用于制备或开发抗氧化、抗衰老、减脂的产品。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及哈尔滨乳杆菌在抗氧化、抗衰老和减脂中的应用。
背景技术
衰老自由基学说认为机体衰老的相关变化源于机体受到内、外环境的影响，造成抗氧化酶活性下降，体内活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)物质过剩，最终破坏氧化还原系统的平衡，导致机体氧化损伤。随着人类平均寿命的延长和世界人口老龄化的加剧给全球经济带来巨大影响，且老龄化也伴随着许多并发症的发生，如代谢综合征、心血管疾病等，围绕老龄化的健康问题及如何健康衰老已成为研究的热点和难点。自1907年Metchnikoff提出了“酸奶长寿”理论：“酸奶中的益生菌可改变肠道菌群组成，减少肠道中有害细菌的含量和有毒害物质的产生，有效地延缓衰老”开始，越来越多的研究证实益生菌在抗氧化、减少脂肪积累、延长寿命、改善健康衰老中有着非常重要的作用，且该作用具有菌株特异性。因此，继续挖掘具有抗氧化、抗衰老、减脂等功效的益生菌菌株具有广泛和实际的应用价值。
乳酸菌是益生菌中最大的一类，多种乳酸杆菌已被报道具有抗氧化、抗衰老、减少脂肪积累等作用，如：中国新疆传统发酵干酪中分离的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、韩国泡菜中分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、马苏里拉奶酪中的德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)，西班牙食用橄榄中分离出来的戊糖乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)和棒状乳杆菌(Lactiplantibacillus coryniformis)等，然而哈尔滨乳杆菌的抗氧化、抗衰老、减脂等功效鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供哈尔滨乳杆菌的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
本发明首先提供一株哈尔滨乳杆菌Lactobacillus harbinensis WY202201菌株，所述菌株于2022年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62535。所述WY202201菌株是来源于我国水开菲尔中分离获得的，其16S rDNA基因序列全长约1400bp，测序后在NCBI使用Blast比对，鉴定为哈尔滨乳杆菌(Lactobacillusharbinensis)。菌株在MRS培养基上培养，其菌落形态为不透明乳白色凸起，呈圆形，表面粗糙，为革兰氏染色呈阳性，细短杆状。本发明研究表明，WY202201菌株喂食秀丽隐杆线虫后能延长寿命、增加体长、提高产卵量以及行动力，增强线虫抗氧化能力，减少脂肪积累及线粒体损伤，延缓机体衰老。
本发明使用的衰老研究模型动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)N2，属于寿命研究模式动物，是一种简单的无脊椎动物模型，具有寿命短、生存环境简单、可大量同期化、遗传背景清晰、许多基因与哺乳动物(包括人类)在进化上保守性/同源性高等优点，可以从行为、分子和基因层次来研究衰老机制，且目前衰老机制的几大理论都是在线虫中被证实，因此，秀丽隐杆线虫是寿命、衰老研究常见的模式生物，对线虫有延长寿命、抗衰老作用的产品通常也被认为对人类也具有同样功效。
因此，本发明还提供所述的哈尔滨乳杆菌WY202201菌株在抗氧化、抗衰老和减脂中的应用。
本发明还提供所述的哈尔滨乳杆菌WY202201菌株在制备抗氧化、抗衰老和减脂的产品中的应用。
优选的，所述抗氧化是提高机体抗氧化能力，降低机体氧自由基的积累，减缓机体氧化损伤。更优选的，是提高线虫抗氧化能力，降低线虫体内氧自由基的积累，减缓线虫体内氧化损伤。
作为一种有优选的实施方式，是指哈尔滨乳杆菌WY202201菌株可通过增加SOD酶活、CAT酶活和GSH含量，减少体内MDA含量和ROS水平，来提升线虫细胞的抗氧化能力。
优选的，所述抗衰老是指延长机体寿命、增加机体体长。运动力、繁殖能力、减少机体的线粒体损伤。更优选的，是指延长线虫寿命，增加线虫体长、运动力及繁殖力，减少线粒体损伤。
作为一种优选的实施方式，是指哈尔滨乳杆菌WY202201显著延长了线虫的寿命、同时显著延长线虫体长，增强线虫的行动能力和繁殖能力。
另一方面，哈尔滨乳杆菌WY202201还显著减缓线虫体内线粒体膜电位的下降程度，从而减少线粒体氧化受损。
优选的，所述减脂是指减少机体脂肪积累。更优选的，是指减少线虫机体的脂肪积累。作为一种优选的具体实施方式，哈尔滨乳杆菌WY202201显著降低线虫体内的脂肪沉积。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)WY202201菌株在抗氧化、减少脂肪积累及线粒体损伤、抗衰老且延长寿命中的应用，该菌株能增强秀丽隐杆线虫的抗氧化能力，减少机体氧化损伤，延长线虫寿命，增加线虫体长，提高线虫行动力以及繁殖能力，减少脂肪积累及线粒体损伤。说明可将哈尔滨乳杆菌WY202201用于制备或开发抗氧化、抗衰老、减脂的产品中。
附图说明
图1为哈尔滨乳杆菌WY202201进化树；
图2为哈尔滨乳杆菌WY202201活菌、死菌及其代谢物对秀丽隐杆线虫N2寿命的影响；
图3为哈尔滨乳杆菌WY202201饲喂秀丽隐杆线虫后的体长(A)、行动力(B)及繁殖力(C)变化情况；
图4为饲喂哈尔滨乳杆菌WY202201对线虫脂肪含量(A)、线粒体膜电位(B)的影响；
图5为哈尔滨乳杆菌WY202201影响线虫ROS产量及抗氧化特性(A：MDA含量；B：ROS含量；C：SOD活性；D：GSH含量；E:CAT活性)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备。
NGM培养基：3g氯化钠，2.5g胰蛋白胨，17g琼脂粉，25mL磷酸钾缓冲液(1mol/L)、1mL CaCl2溶液(1mol/L)、1mL MgSO4溶液(1mol/L)，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。待温度降到60℃左右无菌条件下加入l mL胆固醇溶液(5mg/mL，95％乙醇溶解)，摇匀后，倒平板。
LB液体培养基：5g酵母粉，10g胰蛋白胨，10g NaCl，加蒸馏水定容到1000mL，121℃高压灭菌20min。
MRS液体培养基：5g酪蛋白胨，10g牛肉膏，5g酵母膏，2g柠檬酸氢二胺，20g葡萄糖，5g乙酸钠，2g磷酸二氢钾，0.58g硫酸镁，0.25g硫酸锰，然后再加1mL吐温-80，蒸馏水定容至1000mL。
野生型秀丽隐杆线虫N2、大肠杆菌OP50：购自于线虫中心CGC(CaenorhabditisGenetics Center)。
测量丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、活性氧(ROS)含量、谷胱甘肽(GSH)含量及过氧化氢酶(CAT)酶活性的试剂盒来源于碧云天生物技术。
实施例1菌体的分离及鉴定
1、菌株的分离
采用9mL无菌生理盐水稀释1mL水开菲尔发酵液，进行梯度稀释。将稀释液在MRS固体培养基上涂布，37℃培养，分离、纯化平板菌落，并将其在MRS的液体培养基中培养进行初步筛选，得到一株菌株命名为WY202201。
2、传统的生物学鉴定
菌落形态特征：所述菌株的菌落形态为不透明乳白色凸起，呈圆形，表面粗糙，为革兰氏染色呈紫色，细短杆状，说明该菌株为革兰氏阳性菌。
3、分子生物学鉴定
(1)采用DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492r(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)经PCR扩增其16S rDNA基因。
PCR扩增程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸25s，72℃终延伸2min，循环30次。
PCR扩增体系为：27f 1μL，1492r 1μL，DNA模板2μL，Taq酶22μL。
(2)系统发育分析
PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后测序分析，将长约为1500bp的16SrDNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对及进化树比对分析，结果如图1所示，发现WY202201菌株与哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)最相似，相似度为99.73％。
综合上述的形态特性和16S rDNA基因序列结果，表明本发明所筛选的细菌应归属于乳杆菌属(Lactobacillus)-哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)，命名为哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)WY202201菌株，该菌株于22022年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No：62535，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2哈尔滨乳杆菌WY202201对秀丽隐杆线虫寿命试验
1、菌种的活化
取冻存于-80℃下的哈尔滨乳杆菌WY202201 100μL，接种于5mL MRS液体培养基中，放入37℃生化培养箱中静置培养12～16h，使菌株活化。
2、秀丽隐杆线虫的培养
在NGM培养基上涂布大肠杆菌OP50(1.8×108CFU/mL)作为线虫食物，然后挑取野生型秀丽隐杆线虫N2置于NGM培养基表面，并放置于20℃生化培养箱里培养，培养期间需每隔2天将线虫转移到新鲜的涂有大肠杆菌OP50的NGM平板上。若传代单只线虫，需用酒精灯灼烧挑虫针冷却后挑取一只线虫到新的NGM培养基上；若传代大量线虫，则用M9缓冲液将培养基中的线虫洗下，静置沉淀后去上清液将虫体转移到新的NGM培养基上。
3、秀丽隐杆线虫的同期化
将线虫L4期(第3天)收集到离心管里，加入1mL M9缓冲液洗去多余的大肠杆菌OP50，静置沉淀后去除上清液，重复洗3次。然后加入1mL裂解液充分振荡1min，去除上清液后，再用M9缓冲液进行离心(3000r/min，1min)洗涤3次，去除多余上清液并保留虫卵，将虫卵转移至新的NGM平板上，于20℃生化培养箱孵化，大约16h后生长成L1期幼虫。
4、秀丽隐杆线虫寿命的测定
将哈尔滨乳杆菌WY202201和大肠杆菌OP50分别在液体培养基培育至对数期，在4℃条件下8000r/min离心10min，收集哈尔滨乳杆菌WY202201菌体及发酵上清液，经过0.22μm滤膜过滤的发酵上清液作为待测菌株的代谢物。同时，将待测哈尔滨乳杆菌WY202201菌体经过100℃15min灭活，制备得到待测哈尔滨乳杆菌WY202201菌株的死菌体；分别将哈尔滨乳杆菌WY202201代谢物与大肠杆菌OP50按1：1比例复配，哈尔滨乳杆菌WY202201死菌体与无菌水重悬，以及采用哈尔滨乳杆菌WY202201的活菌作为食物，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照，分别喂养秀丽隐杆线虫N2并测定寿命。
挑取90条上述步骤同期化的L0期野生型秀丽隐杆线虫N2，分别放置到含有哈尔滨乳杆菌WY202201活菌、死菌及其代谢物以及大肠杆菌OP50的NGM平板上，并置于20℃生化培养箱培养。在秀丽隐杆线虫产卵期间(第3～6天)，每24h挑取全部存活的线虫转移到新鲜的涂布菌液的NGM平板上，防止有新孵化的线虫影响实验结果。在线虫产卵结束后，可每2天将存活线虫转移到相应的新鲜食物NGM平板上，实验持续到线虫全部死亡，并绘制线虫寿命曲线。
5、试验结果
结果如图2所示，采用哈尔滨乳杆菌WY202201进行喂养的线虫寿命相对于采用大肠杆菌OP50的对照组显著延长(p<0.05)，且经计算，与喂食大肠杆菌OP50平均寿命(10d)及最长寿命(20d)相比哈尔滨乳杆菌WY202201的活菌、死菌及其代谢物的平均寿命分别显著延长32.5％、18.7％、20.7％(p<0.05)，最长寿命分别延长5天、1天、2天。
实施例3哈尔滨乳杆菌WY202201对秀丽隐杆线虫体长、运动力及繁殖力的影响
1、试验方法
(1)为验证哈尔滨乳杆菌WY202201是否影响线虫的身体长度，分别挑取同期化培养到第3天、15天的线虫，用70℃热水浴浸泡30min，使线虫身体僵直然后吸取虫体于载玻片上，用光学显微镜观察并测量线虫的体长，每组实验至少重复10条线虫。线虫的培养和同期化方法同实施例2所示，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组。
(2)运动能力是健康的关键指标之一，运动状况和运动能力会随着机体的衰老而逐渐变差和减弱。采用哈尔滨乳杆菌WY202201菌株培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组；在培养的第3天、6天、9天、12天随机挑取20条线虫到新鲜的NGM平板上，线虫自由活动30s后用体视显微镜观察1min内线虫头部摆动次数，一次头部摆动则为线虫头部从一侧摆动另一侧为一次。
(3)筛选的抗衰老药物或菌株应以不损害机体生殖能力为前提条件，生殖能力是健康中最为关键的指标之一。因此我们以后代数量为指标验证了哈尔滨乳杆菌WY202201对线虫繁殖能力的影响。按实施例2所述方法用待测菌株培养秀丽隐杆线虫直至L4期，随机挑取1条线虫分别到涂有哈尔滨乳杆菌WY202201、大肠杆菌OP50的NGM平板上，每组5个平行。在线虫产卵期间，每隔1d将产卵的成虫转移到新的平板上，旧平板则继续放置20℃生化培养箱培养至虫卵孵化，统计新鲜平板上线虫总共孵化的幼虫条数，直到线虫产卵结束。
2、实验结果
与大肠杆菌OP50对照组相比，哈尔滨乳杆菌WY202201组的线虫第3天体长无明显变化，15天的体长延长14.2％(图3A，p<0.05)，第3天、6天、9天、12天的头部摆动频率分别增加了13.1％、9.4％、25.2％、29.0％(图3B，p<0.05)，平均产卵量增加34.5％(图3C，p<0.05)。这些数据说明饲喂哈尔滨乳杆菌WY202201能显著增加线虫体长、增强线虫的行动能力与繁殖能力，具有较好的抗衰老性能。
实施例4哈尔滨乳杆菌WY202201对线虫脂肪含量、线粒体膜电位的影响
1、试验方法
(1)哈尔滨乳杆菌WY202201对线虫体内脂肪含量的影响
采用哈尔滨乳杆菌WY202201培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，同时以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组；在L4期继续培养3天后随机挑取20条线虫用红油O染色法测量线虫脂肪。挑取线虫，用无菌M9缓冲液冲洗3次，25mM盐酸左旋咪唑封闭咽喉，加入200μL4％多聚甲醛溶液静置15～20min，后移除溶液再用液氮冻融3次，然后用60％异丙醇红油O染色，4～5h后用M9缓冲液冲洗3次，并采用光学显微镜观察。
(2)哈尔滨乳杆菌WY202201对秀丽隐杆线虫体内线粒体膜电位的影响
采用哈尔滨乳杆菌WY202201培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，同时以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组，在L4期继续培养3天后随机挑取20只线虫用JC-1染料测定线粒体膜电位，将线虫与500μL现配的JC-1染色工作液放至避光孵育2小时，M9缓冲液冲洗3次去除线虫表面的染料，通过荧光显微镜观察红色荧光(发射波长约590nm)和绿色荧光(发射波长529nm)，拍照记录，并用Image J软件对荧光照片进行定量计算。
2、试验结果
与大肠杆菌OP50对照组相比，哈尔滨乳杆菌WY202201喂养的线虫肠道脂肪红光光密度减少35.2％(图4A，p<0.05)，第3天、13天的JC-1染色后的红绿荧光比值分别增加49.3％、55.1％(图4B，p<0.05)。这些数据说明哈尔滨乳杆菌WY202201显著降低线虫体内脂肪沉积；减缓线粒体膜电位下降程度、减少线粒体氧化受损。
实施例5哈尔滨乳杆菌WY202201对秀丽隐杆线虫的抗氧化能力的影响
1、试验方法
(1)采用哈尔滨乳杆菌WY202201菌株培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组，L4期继续培养3天后收集线虫，经M9缓冲液清洗3次后，静置5min待线虫自然沉降。将线虫放入匀浆器，冰上研磨5min,4℃,4 000r/min离心取上清液，即为蛋白匀浆。根据试剂盒操作说明测量丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、谷胱甘肽(GSH)含量及过氧化氢酶(CAT)酶活性。
(2)丙二醛含量测定：根据试剂盒说明配置好TBA储存液(避光储存)、MDA检测工作液，空白组(0.1mL PBS+0.2mLMDA检测工作液)、样品组(0.1mL样品+0.2mL MDA检测工作液)沸水浴加热15min，待冷却至室温后取上清液200μL加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。
(3)活性氧水平测定：将50μL蛋白匀浆和50μL现配的100mmol/L H2-DCF-DA溶液加入96孔黑板中(最终浓度为50mmol/L)处理3h，荧光酶标仪于激发波长485nm、发射波长535nm下测定体内活性氧含量。
(4)超氧化物歧化酶活性测定：配置好SOD检测缓冲液、WST-8/酶工作液和反应启动液，按照试剂盒加样量分别配置样品组和空白组，37℃孵育30min后在450nm出测吸光度。
(5)谷胱甘肽含量测定：根据试剂盒分别配置好GSH储备液、DTNB储备液和NADPH储备液之后，进行对照组和样品组的加样，立即用酶标仪在412nm处测定吸光度。
(6)过氧化氢酶活性测定：根据试剂盒说明配置好过氧化氢酶检测缓冲液、250mM过氧化氢溶液、过氧化氢酶反应终止液，进行对照组和样品组的加样，25℃至少孵育15分钟后在520nm处测定吸光度。
2、试验结果
与大肠杆菌OP50的对照组相比，哈尔滨乳杆菌WY202201喂养的线虫体内MDA含量显著减少27.2％(图5A，p<0.05)，ROS水平下降了18.6％(图5B，p<0.05)，SOD活性显著提高了45.2％(图5C，p<0.05)，GSH含量显著提高了24.7％(图5D，p<0.05)，CAT活性显著提高了83.3％(图5E，p<0.05)，以上结果表明哈尔滨乳杆菌WY202201可通过增加SOD酶活、CAT酶活和GSH含量，减少体内MDA含量和ROS水平，来提升线虫细胞的抗氧化能力。
综上可知，本发明提供的哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)WY202201菌株能延长线虫寿命及体长、增强行动力及繁殖能力，减少脂肪积累，减少线粒体氧化受损，提高SOD、GSH、CAT等产量而减少体内氧自由基合成，具有抗氧化、抗衰老、减脂功效。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一株哈尔滨乳杆菌Lactobacillus harbinensis WY202201菌株，其特征在于，所述菌株于2022年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62535。
2.权利要求1所述的哈尔滨乳杆菌WY202201菌株在抗氧化、抗衰老和减脂中的应用。
3.权利要求1所述的哈尔滨乳杆菌WY202201菌株在制备抗氧化、抗衰老和减脂的产品中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述抗氧化是提高机体抗氧化能力，降低机体氧自由基的积累，减缓机体氧化损伤。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老是指延长机体寿命、增加机体体长、运动力、繁殖能力、减少机体的线粒体损伤。
6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述减脂是指减少机体脂肪积累。
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