CN114591861B

CN114591861B - 一株发酵乳杆菌wc2020及其应用

Info

Publication number: CN114591861B
Application number: CN202210283365.4A
Authority: CN
Inventors: 王洁; 杨翕淼; 陈健文; 房倩安; 方祥; 廖振林; 钟青萍; 王丽
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-03-22
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-03-22
Also published as: CN114591861A

Abstract

本发明公开了一株发酵乳杆菌WC2020及其应用。本发明提供的发酵乳杆菌WC2020不仅能够延长秀丽隐杆线虫的寿命，减少脂肪积累、线粒体损伤、丙二醛含量，提高谷胱甘肽含量、超氧化歧化酶和过氧化氢酶的活性，该菌株可保护秀丽隐杆线虫免于致病菌的感染及抑制致病菌在体内繁殖。通过研究表，发酵乳杆菌WC2020在延长寿命、御致病菌等效果上是显著优于MBC2和JDFM216，同时，表明WC2020菌株在加热灭活后仍可以延长线虫寿命，且不会对线虫繁殖力造成影响。本发明提供的WC2020菌株扩充了发酵乳杆菌的微生物菌种资源库，提供了一株具备更多功能和作用的优良菌株。

Description

一株发酵乳杆菌WC2020及其应用

技术领域

本发明属于生物医药和微生物技术领域。更具体地，涉及一株发酵乳杆菌WC2020及其应用。

背景技术

衰老是指机体各种组织和器官功能随年龄增长发生的逐渐退行性变化的过程，其可降低机体对环境胁迫维持自身稳态的能力，从而增加机体患病和死亡的概率。随着老龄化进程的加速，抗衰老食品、保健品、药物等的开发成为当前老年医学领域重要的研究方向。

益生菌是指具有生物活性、适当摄入可以对宿主产生有益作用的活微生物，其益生作用包括调节肠道菌群结构、免疫调节、延长寿命等。益生菌的抗衰老作用早于1908年保加利亚人食用大量发酵乳和乳杆菌的农民寿命延长现象中被证实。近年来，越来越多的益生菌如棒状乳杆菌、戊糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌等被证实具有抗衰老作用，成为抗衰老领域研究的热点。

发酵乳杆菌作为一种益生菌，可代谢乳糖、半乳糖等多种糖类产生乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇等代谢产物，普遍存在于传统发酵食品如乳制品、肉制品、豆制品、蔬菜制品等中。现有技术中也仅有来自意大利的发酵乳杆菌MBC2及韩国来源的发酵乳杆菌JDFM216、LA12被证实能延长线虫寿命、延缓线虫衰老；但目前还是缺乏能够用于延长寿命、抗衰老、抗氧化，以及具有更多不同功能和作用的菌株，因此限制了发酵乳杆菌的发展和应用。同时，具有我国自主知识产权的具有延长寿命、抗衰老作用及更多功能和作用的发酵乳杆菌还鲜有报道，有待于进一步探索与开发。为了扩充具备更多功能的微生物菌种资源库，有必要筛选出更多、更高效、具备更多功能的发酵乳杆菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一株发酵乳杆菌WC2020及其应用。

本发明的第一个目的是提供一株发酵乳杆菌WC2020菌株。

本发明的第二个目的是提供所述菌株的应用。

本发明的第三个目的是提供一种具有抗氧化、延长动物寿命、抗衰老、促进生长发育、抗病菌感染和/或抑制病菌繁殖作用的产品。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)WC2020菌株，已于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62191。所述WC2020菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，全长约1500bp，测序后在NCBI使用Blast比对，鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。WC2020菌株呈圆形、不透明、白色突起、表面光滑有光泽、边缘整齐。通过本发明研究表明，WC2020菌株能有效地延长秀丽隐杆线虫的寿命，减少脂肪积累、线粒体损伤、丙二醛含量，提高谷胱甘肽含量、超氧化歧化酶和过氧化氢酶的活性，且该菌株可保护秀丽隐杆线虫免于致病菌的感染及抑制病菌在体内繁殖，在线虫肠道内可有效地抵御金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的感染，具有很好的抗致病菌感染的效果。

本发明使用的衰老研究模型动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)N2，是一种简单的无脊椎动物模型，具有生命周期短、构造简单、繁殖能力强、许多基因与哺乳动物(包括人类)在进化上保守性/同源性高等优点，可以从行为、分子和基因层次来研究衰老的机制，且目前衰老机制的几大理论都是在线虫中被证实。因此，秀丽隐杆线虫是寿命、衰老研究的重要模式生物，对线虫有延长寿命、抗衰老作用的产品通常也被认为对人类也具有同样功效。

因此，本发明提供发酵乳杆菌WC2020菌株或其发酵液、发酵上清液、代谢物在抗氧化、延长动物寿命、抗衰老、促进生长发育、抗病菌感染和/或抑制病菌繁殖，或在制备具有抗氧化、延长动物寿命、抗衰老、促进生长发育、抗病菌感染和抑制病菌繁殖作用的产品中的应用。

优选地，所述抗氧化指提高机体抗氧化能力，减少体内氧自由基的积累，减缓机体氧化损伤；所述延长动物寿命指延长线虫的寿命，提高线虫行动力；所述抗衰老指在减少线虫脂肪积累及线粒体损伤，减缓机体衰老；同时能增加线虫体长，促进生长发育。

优选地，所述病菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。

更优选地，所述革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌。

进一步优选地，所述产品为食品、药品、保健品。

本发明提供一种具有抗氧化、延长动物寿命、抗衰老、促进生长发育、抗病菌感染和/或抑制病菌繁殖作用的产品，含发酵乳杆菌WC2020菌株和/或其菌液。

优选地，所述菌液的浓度为1.2×10⁸～1.6×10⁹CFU/mL。

优选地，所述菌液为菌悬液、发酵液、发酵上清液或代谢物。

优选地，所述发酵液、发酵上清液或代谢物的培养条件为：温度35～40℃，培养时间为12～16h。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的发酵乳杆菌WC2020(Lactobacillus fermentum)菌株，具有延长线虫寿命的功能，能显著增加线虫体长，促进线虫的生长发育；增强线虫的行动能力，改善其肌肉功能，促使线虫能量代谢，并且能一定程度减轻衰老对线虫行动的影响；采用发酵乳杆菌WC2020喂养秀丽隐杆线虫后能够减少线粒体氧化受损，保护线粒体。

同时，发酵乳杆菌WC2020可通过增加SOD酶活、CAT酶活和GSH含量，减少体内MDA含量，提升线虫细胞的抗氧化能力，从而延长线虫的寿命。另外，本发明提供的发酵乳杆菌WC2020对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的毒害起到干扰和保护作用，在线虫肠道内可有效地抵御金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的感染，具有很好的抗病菌的效果。

本发明还通过与MBC2、JDFM216相对比，表明WC2020菌株在线虫L₄期的延寿效果更具优势，抵御致病菌的能力效果更好，其加热灭活后仍可以延长线虫寿命，且不会对线虫繁殖力造成影响；因此，本发明提供的发酵乳杆菌WC2020对线虫的抗氧化、抗衰老及抗病菌感染作用效果更佳。

附图说明

图1为发酵乳杆菌WC2020的系统进化树；

图2为发酵乳杆菌WC2020饲喂秀丽隐杆线虫后寿命变化；

图3为发酵乳杆菌WC2020饲喂秀丽隐杆线虫后的变化情况(A：线虫体体长变化；B：行动力的变化；C：产卵数)；

图4为发酵乳杆菌WC2020对线虫体内的影响(A：脂肪含量；B：线粒体膜电位)；

图5为发酵乳杆菌WC2020饲喂秀丽隐杆线虫后体内生物量水平变化(A：MDA含量；B：SOD活性；C：GSH含量；D：CAT酶活性)；

图6为发酵乳杆菌WC2020在秀丽隐杆线虫体内抵御金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的感染效果(其中，Sa为金黄色葡萄球菌组，Pa为铜绿假单胞菌组，WC2020为添加发酵乳杆菌WC2020组，A：感染金黄色葡萄球菌组；B：感染铜绿假单胞菌组；C：混合液饲喂组)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中采用的试剂或配方：

NGM培养基：3g氯化钠，2.5g胰蛋白胨，17g琼脂粉，25mL磷酸钾缓冲液(1mol/L)、1mL CaCl₂溶液(1mol/L)、1mL MgSO₄溶液(1mol/L)，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。待温度降到60℃左右无菌条件下加入l mL胆固醇溶液(5mg/mL，95％乙醇溶解)，摇匀后，倒平板。

LB液体培养基：5g酵母粉，10g胰蛋白胨，10g NaCl，加蒸馏水定容到1000mL，121℃高压灭菌20min。

MRS液体培养基：5g酪蛋白胨，10g牛肉膏，5g酵母膏，2g柠檬酸氢二胺，20g葡萄糖，5g乙酸钠，2g磷酸二氢钾，0.58g硫酸镁，0.25g硫酸锰，然后再加1mL吐温-80，蒸馏水定容至1000mL。

野生型秀丽隐杆线虫N2、大肠杆菌OP50：购自于线虫中心CGC(CaenorhabditisGenetics Center)。

测量丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、谷胱甘肽(GSH)含量及过氧化氢酶(CAT)酶活性的试剂盒来源于碧云天生物技术。

实施例1菌株的分离及鉴定

1、菌株的分离

采用90mL无菌生理盐水稀释1g捣碎的传统酸菜，进行梯度稀释。将稀释液在以香豆素为唯一碳源的固体培养基中涂布，37℃培养，分离、纯化平板菌落，并将其在以香豆素为唯一碳源的液体培养基中培养进行初步筛选，得到一株菌株命名为WC2020。

2、传统的生物学鉴定

菌落形态特征：所述菌株的菌落形态为圆形、不透明、白色突起、表面光滑有光泽、边缘整齐。其革兰氏染色呈紫色、单细胞成杆状，说明该菌株为革兰氏阳性菌。

2、分子生物学鉴定

(1)采用DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492r(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)经PCR扩增其16S rDNA基因。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性1min，54℃复性1min，72℃延伸2min，循环30次。

PCR扩增体系为：27f 1μL，1492r 1μL，模板5μL，Taq酶25μL，ddH₂O 18μL。

(2)系统发育分析

PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后测序分析，将长约为1500bp的16S rDNA基因序列SEQ ID NO.1与Genbank中已登录的基因序列进行比对及进化树比对分析，结果如图1所示，发现WC2020菌株与发酵乳杆菌(Lactobac illus fermentum)最相似，相似度为99.80％。

综合上述的形态特性和16S rDNA基因序列结果，表明本发明所筛选的细菌应归属于乳杆菌属(Lactobacillus)-发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)WC2020菌株，该菌株于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC NO:62191，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2发酵乳杆菌WC2020对秀丽隐杆线虫寿命试验

1、菌种的活化

取冻存于-80℃环境条件下的发酵乳杆菌WC2020 100μL，接种于5mL MRS液体培养基中，放入37℃生化培养箱中静置培养12～16h，使菌株活化。

2、秀丽隐杆线虫的培养和传代

在NGM培养基上涂布大肠杆菌OP50(OD₆₀₀＝0.5)作为线虫食物，然后挑取野生型秀丽隐杆线虫N2置于NGM培养基表面，并放置于20℃生化培养箱里培养，培养期间需每2天将线虫转移到新鲜的涂有大肠杆菌OP50的NGM平板上。若传代单只线虫，需用酒精灯灼烧挑虫针冷却后挑取一只线虫到新的NGM培养基上；若传代大量线虫，则用M9缓冲液将培养基中的线虫洗下，静置沉淀后去上清液将虫体转移到新的NGM培养基上。

3、秀丽隐杆线虫的同期化

将线虫L₄期(第3天)收集到离心管里，加入1mL M9缓冲液洗去多余的大肠杆菌OP50，使用离心机离心洗涤3次去除上清液，然后加入1mL裂解液充分振荡1min，去除上清液后，再用M9缓冲液进行离心(3000r/min，1min)洗涤3次，去除多余上清液并保留虫卵，将虫卵转至新的NGM平板上，于20℃生化培养箱孵化，16h后同期化L₁幼虫。

4、秀丽隐杆线虫寿命的测定

将发酵乳杆菌WC2020和大肠杆菌OP50分别在液体培养基培育至对数期，在4℃条件下8000r/min离心10min，去除上清液并用无菌水清洗沉淀3～4次。获得纯菌体后加入无菌水吹打均匀，调配至浓度为OD₆₀₀＝0.5，然后各取100μL的菌液涂布到NGM平板上，以只添加大肠杆菌OP50的NGM平板作为对照。

挑取100条上述步骤同期化的L₀期野生型秀丽隐杆线虫N2，涂布到同时含有发酵乳杆菌WC2020和大肠杆菌OP50的NGM平板上以及对照平板上，并置于20℃生化培养箱培养。在秀丽隐杆线虫产卵期间(第3～6天)，每24h挑取全部存活的线虫转移到新鲜的涂布菌液的NGM平板上，防止有新孵化的线虫影响实验结果。在线虫产卵结束后，可每2天将存活线虫转移到相应的新鲜食物NGM平板上(只含有大肠杆菌OP50的平板)，实验持续到线虫全部死亡，并绘制线虫寿命曲线。

5、试验结果

结果如图2A所示，采用发酵乳杆菌WC2020进行喂养的线虫寿命相对于采用大肠杆菌OP50的对照组显著延长(p<0.05)，且经计算，喂食发酵乳杆菌的线虫平均寿命为14天，而喂食大肠杆菌OP50的平均寿命为10天，表明发酵乳杆菌WC2020有延长寿命的功效。

实施例3发酵乳杆菌WC2020的不同菌活性及其代谢物对线虫寿命的影响

1、试验方法

采用发酵后的发酵乳杆菌WC2020，进行离心，收集对数期的待测WC2020菌株的菌体及发酵上清液，经过0.22μm滤膜过滤的发酵上清液作为待测菌株的代谢物。同时，将待测WC2020菌体经过70℃15min灭活，制备得到待测WC2020菌株的死菌体；分别将WC2020代谢物与大肠杆菌OP50按1：1比例复配，WC2020死菌体与无菌水重悬，以及采用发酵乳杆菌WC2020的活菌作为食物，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照，分别喂养秀丽隐杆线虫N2并测定寿命。

2、试验结果

试验结果如图2B所示，与大肠杆菌OP50对照组相比，发酵乳杆菌WC2020的活菌、死菌及其代谢物均能在一定程度上延长线虫的寿命。与大肠杆菌OP50对照组线虫相比，发酵乳杆菌WC2020的活菌、死菌及其代谢物的平均寿命分别显著延长23.5％、11.7％、15.8％(p<0.05)，最长寿命分别延长4天、1天、3天，表明发酵乳杆菌WC2020的活菌明显延长线虫寿命，其次是其代谢物和死菌。

实施例4发酵乳杆菌WC2020对秀丽隐杆线虫生长发育的影响

1、试验方法

(1)为验证发酵乳杆菌WC2020的延寿作用是否影响线虫的身体长度，从而影响线虫的生长发育。分别挑取同期化培养到第1天、16天的线虫，用70℃热水浴浸泡30min，使线虫身体僵直然后吸取虫体于载玻片上，用光学显微镜观察并测量线虫的体长，每组实验至少重复10条线虫。线虫的培养和同期化方法同实施例2所示，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组。

(2)线虫逐渐衰老会导致其肌肉退化，行动能力减弱，在生命末期线虫的运动变慢，对外界的刺激反应迟缓。秀丽隐杆线虫在NGM平板上身体弯曲的摆动频率，在一定程度上可以说明其衰老的状态。采用WC2020菌株培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组；在培养的第3天、16天、20天随机挑取20条线虫到新鲜的NGM平板上，线虫自由活动30s后用体视显微镜观察20s内线虫身体弯曲摆动频率，一次的身体弯曲是指身体从一个方向弯曲到另一个方向，然后恢复原来的方向。

(3)线虫产卵量的多少，可以作为评价线虫繁殖能力的根据，也是线虫营养和身体状况评价的标准。筛选的抗衰老药物或菌株应以不损害机体生殖能力为前提条件，有研究发现，生殖能力的强弱与衰老紧密相关。因此我们验证了发酵乳杆菌对线虫繁殖能力的影响。按实施例2所述方法用待测菌株培养秀丽隐杆线虫直至L₄期，随机挑取10条以上线虫分别到涂有发酵乳杆菌WC2020、E.coli OP50的NGM平板上。在线虫产卵期间，每隔1d将产卵的成虫转移到新的平板上，旧平板则继续放置20℃生化培养箱培养至虫卵孵化，统计新鲜平板上线虫总共孵化的幼虫条数，直到线虫产卵结束。

2、实验结果

对秀丽隐杆线虫的身体长度的影响统计结果如图3A所示，与大肠杆菌OP50对照组第1天、16天的体长相比，发酵乳杆菌WC2020组的线虫体长分别延长19.2％和11.8％(p<0.05)，表明发酵乳杆菌WC2020在延长线虫寿命的前提下，也能显著增加线虫体长，促进线虫的生长发育。

秀丽隐杆线虫的行动力结果如图3B所示，与只喂养大肠杆菌OP50对照组在第16天和第20天相比，喂养发酵乳杆菌WC2020组的线虫身体摆动频率增加了14.1％和67.7％(p>0.05)。表明发酵乳杆菌能增强线虫的行动能力，改善其肌肉功能，促使线虫能量代谢，并且能一定程度减轻衰老对线虫行动的影响。通过喂养发酵乳杆菌WC2020后统计线虫的产卵数结果如图3C所示，结果表明饲喂E.coli OP50和发酵乳杆菌WC2020的线虫的总产卵量没有明显差异，发酵乳杆菌WC2020不改变线虫的繁殖力。因此，表明发酵乳杆菌WC2020对线虫的生殖能力不产生影响。

实施例5发酵乳杆菌WC2020对线虫体内生理指标的影响

1、试验方法

(1)发酵乳杆菌WC2020对线虫体内脂肪含量的影响

采用WC2020菌株培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，同时以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组；在第3天随机挑取20条以上线虫用红油O染色法测量线虫脂肪。挑取线虫，用无菌M9缓冲液冲洗3次，25mM盐酸左旋咪唑封闭咽喉，加入200μL 4％多聚甲醛溶液静置15～20min，后移除溶液再用液氮冻融3次，然后用60％异丙醇红油O染色，3h后用M9缓冲液冲洗3次，并采用光学显微镜观察。

(2)发酵乳杆菌WC2020对秀丽隐杆线虫体内线粒体膜电位的影响

采用WC2020菌株培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，同时以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组，在第3天随机挑取20只线虫用JC-1染料测定线粒体膜电位，将线虫与500μL现配的JC-1染色工作液放至24孔板中避光孵育2小时，M9缓冲液冲洗3次去除线虫表面的染料，通过荧光显微镜观察红色荧光(发射波长约590nm)和绿色荧光(发射波长529nm)，拍照记录，并用Image J软件对荧光照片进行定量计算。

2、试验结果

秀丽隐杆线虫的体内脂肪含量结果如图4A所示，表明发酵乳杆菌WC2020菌株能明显减少线虫体内脂肪积累。与大肠杆菌OP50对照组相比，采用发酵乳杆菌WC2020喂养的线虫肠道脂肪红光光密度减少32.4％(p<0.05)，表明WC2020影响线虫脂肪代谢从而减少线虫脂肪积累。

秀丽隐杆线虫体内线粒体膜电位的影响结果如图4B所示，线粒体减缓膜电位的下降程度可以通过荧光照片的定量计算得出，大肠杆菌OP50对照组的红绿荧光比值为0.34±0.13，而发酵乳杆菌WC2020红绿荧光比值为0.69±0.05。表明发酵乳杆菌WC2020喂养秀丽隐杆线虫后的线粒体膜电位下降程度明显减缓(p<0.05)。相比于大肠杆菌OP50对照组，发酵乳杆菌WC2020喂养秀丽隐杆线虫后线粒体膜电位的红绿荧光强度相差较少，表明发酵乳杆菌能够减少线粒体氧化受损，保护线粒体。

实施例6发酵乳杆菌WC2020对秀丽隐杆线虫的抗氧化能力的影响

1、试验方法

(1)采用WC2020菌株培养秀丽隐杆线虫，培养方法同实施例2，以只喂养大肠杆菌OP50作为对照组。挑取第3天线虫，经M9缓冲液清洗3次后，静置5min待线虫自然沉降。然后移走大部分上清液，虫体待用，根据试剂盒操作说明测量丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、谷胱甘肽(GSH)含量及过氧化氢酶(CAT)酶活性。

(2)丙二醛含量测定：根据试剂盒说明配置好TBA储存液(避光储存)、MDA检测工作液，空白组(0.1mL PBS+0.2mLMDA检测工作液)、样品组(0.1mL样品+0.2mL MDA检测工作液)沸水浴加热15min，待冷却至室温后取上清液200μL加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。

(3)超氧化物歧化酶活性测定：配置好SOD检测缓冲液、WST-8/酶工作液和反应启动液，按照试剂盒加样量分别配置样品组和空白组，37℃孵育30min后在450nm出测吸光度。

(4)谷胱甘肽含量测定：根据试剂盒分别配置好GSH储备液、DTNB储备液和NADPH储备液之后，进行对照组和样品组的加样，立即用酶标仪在412nm处测定吸光度。

(5)过氧化氢酶活性测定：根据试剂盒说明配置好过氧化氢酶检测缓冲液、250mM过氧化氢溶液、过氧化氢酶反应终止液，进行对照组和样品组的加样，25℃至少孵育15分钟后在520nm处测定吸光度。

2、试验结果

结果如图5所示，喂养大肠杆菌OP50的对照组与发酵乳杆菌WC2020的线虫相比，在图5A中发酵乳杆菌WC2020喂养的线虫体内MDA含量显著减少9.0％(p<0.05)，在图5B中SOD活性显著提高了11.7％(p<0.05)，在图5C中GSH含量显著提高了25.0％(p<0.05)，在图5D中CAT活性显著提高了29.8％(p<0.05)，以上结果均表明发酵乳杆菌WC2020可通过增加SOD酶活、CAT酶活和GSH含量，减少体内MDA含量，来提升线虫细胞的抗氧化能力，从而延长线虫的寿命。

实施例7秀丽隐杆线虫对病菌的感染测定

1、试验方法

(1)采用发酵乳杆菌WC2020处理线虫后再饲喂金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，喂养和培养方法同实施例2，以喂养大肠杆菌OP50后再饲喂金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为对照组。

用WC2020菌株将秀丽隐杆线虫培养3天获得L₄时期线虫，挑取100条到含有浓度为OD₆₀₀＝1.0金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的NGM平板上于20℃生化培养箱进行培养。每2天换取到新鲜的涂有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的平板上，直至受试线虫全部死亡，并绘制线虫寿命曲线。

(2)采用发酵乳杆菌WC2020分别与金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌同时饲喂线虫，同时分别设置只饲喂金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的对照组，按实施例2所述的方法，取同期化生长至L₄时期的线虫，挑取100条分别转移至以上处理的NGM固体培养皿上，在20℃培养箱中培养，实验前期每隔1天更换新的培养皿，后期可延长至2天更换一次。每隔1天记录线虫死亡数量，直至线虫全部死亡，绘制寿命曲线。

2、实验结果

结果如图6所示，在图6A和图6B中与大肠杆菌OP50喂养线虫至L₄期再感染金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌组相比，发酵乳杆菌WC2020组线虫的最长寿命分别显著延长了2天、4天(p<0.05)。当发酵乳杆菌分别与金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌混合液饲喂L₄期线虫时，结果如图6C所示，含有发酵乳杆菌组线虫的寿命明显长于只有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌组。与金黄色葡萄球菌组和铜绿假单胞菌组的寿命最长寿命16天相比，含有发酵乳杆菌WC2020组线虫的最长寿命都显著延长了3天(p<0.05)。以上结果表明发酵乳杆菌WC2020对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的毒害起到干扰和保护作用，在线虫肠道内可有效地抵御金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的感染，具有很好的抗病菌的效果。

实施例8发酵乳杆菌WC2020与MBC2、JDFM216的效果对比分析

本实施例采用发酵乳杆菌WC2020按照现有研究公开的发酵乳杆菌的不同实验方法进行处理，分别与从意大利传统奶酪分离出的发酵乳杆菌菌株MBC2，以及从一名韩国婴儿的粪便中分离出来的发酵乳杆菌菌株JDFM216，进行效果对比，与MBC2菌株对比采用的方法见：Schifano E,Zinno P,Guantario B,et al.The Foodborne Strain Lactobacillusfermentum MBC2 Triggers pept-1-Dependent Pro-Longevity Effects inCaenorhabditis elegans[J].Microorganisms,2019,7(2).；与JDFM216菌株对比的方法见：Park M R,Ryu S,Maburutse B E,et al.Probiotic Lactobacillus fermentumstrain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditiselegans through a nuclear hormone receptor[J].Rep,2018,8(1):7441.。发酵乳杆菌WC2020与菌株MBC2菌株、JDFM216菌株的对比结果如下表所示。

表1 WC2020与MBC2的对比结果

综上结果所示，线虫在饲喂发酵乳杆菌WC2020与MBC2、JDFM216相比，线虫L₄期的延寿效果更具优势，抵御致病菌的能力效果更好，其加热灭活后仍可以延长线虫寿命，且不会对线虫繁殖力造成影响，因此，认为发酵乳杆菌WC2020对线虫的抗氧化、抗衰老及抗病菌感染作用效果更佳。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株发酵乳杆菌WC2020及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌WC2020的16S rRNA序列(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

gggcgggtga ctagtactgc agtcgaacgc gttggcccaa ttgattgatg gtgcttgcac 60

ctgattgatt ttggtcgcca acgagtggcg gacgggtgag taacacgtag gtaacctgcc 120

cagaagcggg ggacaacatt tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac gttgttcgca 180

tgaacaacgc ttaaaagatg gcttctcgct atcacttctg gatggacctg cggtgcatta 240

gcttgttggt ggggtaacgg cctaccaagg cgatgatgca tagccgagtt gagagactga 300

tcggccacaa tgggactgag acacggccca tactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 360

ttccacaatg ggcgcaagcc tgatggagca acaccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct 420

cgtaaagctc tgttgttaaa gaagaacacg tatgagagta actgttcata cgttgacggt 480

atttaaccag aaagtcacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 540

agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaaga gagtgcaggc ggttttctaa gtctgatgtg 600

aaagccttcg gcttaaccgg agaagtgcat cggaaactgg ataacttgag tgcagaagag 660

ggtagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc 720

gaaggcggct acctggtctg caactgacgc tgagactcga aagcatgggt agcgaacagg 780

attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttgg agggtttccg 840

cccttcagtg ccggagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt 900

gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 960

gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcttgcgcc aaccctagag atagggcgtt 1020

tccttcggga acgcaatgac aggtggtgca tggtcgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1080

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgttactagt tgccagcatt aagttgggca 1140

ctctagtgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca gatcatcatg 1200

ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacgg tacaacgagt cgcgaactcg 1260

cgagggcaag caaatctctt aaaaccgttc tcagttcgga ctgcaggctg caactcgcct 1320

gcacgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1380

gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta 1440

accttttagg agccagccgc ctaagcgcac ac 1472

Claims

1. 一株发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）WC2020菌株，其特征在于，该菌株于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62191。

2.权利要求1所述发酵乳杆菌WC2020菌株在抗氧化、延长动物寿命、抗衰老和/或促进生长发育中的应用。

3.权利要求1所述发酵乳杆菌WC2020菌株在制备具有抗氧化、延长动物寿命、抗衰老、促进生长发育、抗病菌感染和抑制病菌繁殖作用的产品中的应用，其特征在于，所述抗氧化指提高机体抗氧化能力，减少体内氧自由基的积累，减缓机体氧化损伤；所述延长动物寿命指延长线虫的寿命，提高线虫行动力；所述抗衰老指在减少线虫脂肪积累及线粒体损伤，减缓机体衰老。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述病菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌为铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌。

6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述产品为食品、药品或保健品。

7.一种具有抗氧化、延长动物寿命、抗衰老、促进生长发育、抗病菌感染和/或抑制病菌繁殖作用的产品，其特征在于，含权利要求1所述发酵乳杆菌WC2020菌株和/或其菌液。

8. 根据权利要求7所述产品，其特征在于，所述菌液的浓度为1.2×10⁸～1.6×10⁹CFU/mL。

9.根据权利要求7所述产品，其特征在于，所述菌液为菌悬液、发酵液、发酵上清液或代谢物。

10.根据权利要求9所述产品，其特征在于，所述发酵液、发酵上清液或代谢物的培养条件培养条件为：温度35～40℃，培养时间为12～16h。