KR100901190B1

KR100901190B1 - 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는미생물제제

Info

Publication number: KR100901190B1
Application number: KR1020070101014A
Authority: KR
Inventors: 박홍제; 권대준
Original assignee: 박홍제; 권대준
Priority date: 2007-10-08
Filing date: 2007-10-08
Publication date: 2009-06-04
Also published as: KR20090035960A

Abstract

본 발명은 어류 장내에서 유래하는 유산균으로서, 담수 및 해수에서 높은 젖산 생성과 높은 생육을 나타내는, 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것으로서, 어류의 위장관 내에서 분리되며, 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64(KACC 91328P) 및 해수 및 담수어류의 사료 중에 혼합되어 이루어짐을 특징으로 하는 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64를 포함하는 미생물제제를 제공함을 특징으로 한다.

어류, 항균활성, 유산균, 락토코쿠스 락티스 젠64, 위장관, 미생물제제

Description

항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는 미생물제제 {Lactococcus lactis zen64 having antibacterial activity and probiotics comprising lactococcus lactis zen64}

본 발명은 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것으로 특히, 어류 장내에서 유래하는 유산균으로서, 담수 및 해수에서 높은 젖산 생성과 높은 생육을 나타내는, 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것이다.

계절, 서식환경에 관계없이 발병하는 병원미생물로 인하여 어류의 감염 피해 및 경제적 손실이 막대하며, 병원성 미생물에 의한 질병예방을 위해 여러 가지 항생제가 많이 사용되고 있으나, 이들 항생제가 어류나 최종소비자인 사람의 체내에 장기간 축적될 경우 항생제의 내성은 물론 알러지 유발 등의 안전성에 문제가 발생하게 된다. 따라서 어류의 세균성 질병을 야기 시키는 병원성세균에 대하여 항균작용을 나타내는 천연 항균제 개발은 어류 질병 예방은 물론 수산물 안정성 확보라는 차원에서 그 의의가 매우 크다.

어류의 장내에는 다양한 장내세균이 서식하면서 장내로 유입되는 먹이 등을 소화 분해하고, 영양소 합성 및 생체유지에 필요한 에너지를 생성하는 등 중요한 작용을 하고 있다. 그러나 열악한 환경조건, 영양불량상태, 기후, 약품, 그리고 스트레스 등에 의해 장내세균총의 균형이 파괴되면 장내 생태계가 불안정화 되어 생체에 악영향을 미치게 된다. 따라서 장내세균총의 안정성 유지라는 점이 강조되어 생체에 유익한 작용을 하는 미생물제재로서 프로바이오틱스(probiotics) 또는 생균활성제나 생균제의 개념이 등장하게 되었다. 프로바이오틱스는 숙주의 장내 미생물 균형을 향상시킴으로서 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물 사료 첨가제로 최근 들어 유산균이 장에 정착하여 장내 정상세균총을 유지시키고 유해세균의 증식억제 및 증체효과와 독성물질의 흡수를 저해하는 효과가 있다고 밝혀짐에 따라 유산균을 이용한 프로바이오틱스의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

유산균은 비병원성으로 인간의 장내에서 정상세균총을 형성하며 그람양성, 구균 또는 간균형태, 카탈라제(catalase) 음성(혐기성발효 입증)으로 항균물질을 생산하여 유해세균을 억제시키는 기능을 가진다. 유산균의 경우, 그 생리적 유용성과 상품성의 편의성에 따라 락토바실러스(Lactobacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 및 엔테로코커스(Enterococcus)속 등에 속하는 균주들의 이용성이 높다.

대부분의 프로바이오틱스로서의 유산균이 동물의 장내에서 분리되어 가축에 이용되고 있지만, 어류에 기인한 유산균은 세계적으로 아직 몇 종만 분리되고 있다.

본 발명에서는 양식장 환경에 적합한 프로바이오틱스 개발을 위해 어류의 위장관으로부터 항균활성이 우수한 유산균을 분리, 동정하고, 그 특성을 조사하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 어류의 위장관 내에서 분리되며, 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64(KACC 91328P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 염분농도 0 내지 7.0중량%에서 우수한 젖산 생성과 높은 생육을 나타내어 해수 및 담수어류의 사료 중에 혼합되어 이루어짐을 특징으로 하는 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64를 포함하는 미생물제제를 제공한다.

따라서 본 발명에 의하면 어류 장내에서 유래하는 유산균으로서, 담수 및 해수에서 높은 젖산 생성과 높은 생육을 나타내는, 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는 미생물제제를 제공하는 효과가 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

또한, 본 발명은 해수 및 담수어류의 사료 중에 혼합되어 이루어짐을 특징으 로 하는 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64를 포함하는 미생물제제를 제공한다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험어류 및 사용균주

대한민국 포항시 수산시장 및 횟집에서 구입한 국내에서 가장 양식빈도가 높은 어종 중 광어와 우럭, 그리고 민물장어와 야생상태에서 주로 서식하는 바다장어(아나고)를 실험어류로 사용하였고, 항균력 측정에 사용된 균주는 어류질병을 야기하는 세균으로 한국수산과학원 어병방역센터에서 분양받아 20% 글리세롤(-70℃)에 보관하면서 사용하였다.

사용배지

유산균의 배양은 MRS 브로스(MRS broth ; 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 10g/ℓ, 비프 추출물(beef extract) 10g/ℓ, 이스트 추출물(yeast extract) 5g/ℓ, 덱스트로스(dextrose) 20g/ℓ, 폴리소르베이트80(polysorbate80) 1g/ℓ, 시트르산암모늄(ammonium citrate) 2g/ℓ, 아세트산나트륨(sodium acetate) 5g/ℓ, K₂HPO₄ㆍ2g/ℓ, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.1g/ℓ, MnSO₄ㆍ7H₂O 0.05g/ℓ, pH 6.5ㅁ 0.2)를 사용하였고, 분리는 0.01% 브로모크레졸 그린(bromocresol green)이 첨가된 MRS 한천 배지를 사용하였다. 또 항균력 측정을 위하여 어류질병을 야기하는 세균의 배양은 1% NaCl이 첨가된 뮐러 힌톤 브로스(Mueller Hinton Broth)를 전배양한 후, 1% NaCl이 첨가된 MRS 브로스를 사용하였다.

실시예 1

유산균의 분리 및 항균활성 조사

위장관 내에 서식하는 유산균 생성 활성이 강한 균종의 분리를 위해 각 어종의 위와 내장을 적출해 내어 최대한 세절하여 0.8%의 생리식염수로 진탕 배양하여 현탁액을 얻었다. 각 현탁액 0.1㎖씩을 미리 조성된 MRS 한천 배지에 도말하여 30℃에 48시간 배양하면서 물고기 내장에 서식하는 세균들의 콜로니를 얻었다. 형성된 콜로니를 0.01% 브로모크레졸 그린이 첨가된 MRS 한천 배지에 천자배양하여 30℃에 48시간 배양하면서 클리어존(clear zone)을 나타내는 콜로니들을 1차 선별하였다. 선별된 균주들은 MRS 한천 배지에 2회 반복하여 얻어진 단일 콜로니들을 순수 분리하여 사용하였다.

선별된 유산균의 어류질병을 야기하는 세균에 대한 항균력을 측정하기 위하여 먼저 1% NaCl이 첨가된 MRS 배지에 한국수산과학원 어류방역센터에서 분양받은 병원미생물 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 에드워드시엘라 타르타(Edwardsiella tarta), 스트렙토코쿠스 에스피(Streptococcus sp.)와 자체 분리한 스타필리코쿠스 에스피(Staphylicoccus sp.)를 45℃로 유지된 MRS 연질 한천(0.7% 한천)에 200㎕씩 접종하여 MRS 경질 한천(1.5% 한천) 플레이트에 부어 중층 시켰다. 연질 한천 표면에 선별된 유산균을 천자배양하여 30℃에서 배양하면서 병원미생물 4 균주 모두에서 클리어존을 형성하는 균주를 최종 선별하였다.

국내에서 가장 양식빈도가 높은 광어, 우럭, 그리고 민물장어와 야생상태에서 주로 서식하는 바다장어(아나고)에서 분리된 총 균수는 345콜로니이었다. 그 중 하기 표 1에서와 같이, 0.01% 브로모크레졸 그린이 첨가된 MRS 한천 배지에 천자배양하여 30℃에 48시간 배양하면서 클리어존을 뚜렷하게 나타내는 총 70콜로니의 유산균을 분리하여 이들을 각각 젠1 내지 젠70으로 명명하고, 형태학(Morphology) 및 16S rRNA의 염기서열 분석을 통한 동정 결과, 웨이셀라 종(Weissella spp.) 1종, 락토코쿠스 종(Lactococcus spp.) 25종, 류코노스톡 종(Leuconostoc spp.) 3종, 카르노박테리움 종(Carnobacterium spp.) 14종, 엔테로코쿠스 종(Enterococcus spp.) 4종, 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp.) 3종, 코쿠리아 종(Kocuria spp.) 3종의 분포를 보였다.

어 종	시료 번호	콜로니 수	우점종(Dominant group) (종의 수)
광어 (Paralichthys olivaceus ; flatfish)	위장 1	-
	내장 1	3	웨이셀라 종 (1)
	위장 2	4	락토코쿠스 종 (1) 엔테로코쿠스 종 (2)
	내장 2	10	락토코쿠스 종 (5) 엔테로코쿠스 종 (2) 스트렙토코쿠스 종 (2)
우럭 (Sebastes schlegeli ; jacopever)	위장	4	락토코쿠스 종 (3) 엔테로코쿠스 종 (1)
우럭 (Sebastes schlegeli ; jacopever)	내장	9	류코노스톡 종 (3) 엔테로코쿠스 종 (1) 카르노박테리움 종 (1) 코쿠리아 종 (1)
바다장어 (Conger verreauxi ; conger eel)	위장	-
바다장어 (Conger verreauxi ; conger eel)	내장	1	없음
민물장어 (Anguilla japonica ; Japanese eel)	위장	5	락토코쿠스 종 (2) 카르노박테리움 종 (2)
민물장어 (Anguilla japonica ; Japanese eel)	내장	34	락토코쿠스 종 (14) 카르노박테리움 종 (11) 스트렙토코쿠스 종 (1) 코쿠리아 종 (2)

7종 70균주 중, 유산생성능력이 우수한 균주 zen2(웨이셀라 종), zen10(류코노스톡 종), zen14(카르노박테리움 종), zen61(엔테로코쿠스 종), zen64(락토코쿠스 종) 5종의 균종을 대상으로 어류질병 세균에 대한 항균활성을 실험하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

균주	동정	미생물
균주	동정	비브리오 안길라룸 (Vibrio anguillarum)	에드와드시엘라 타르타 (Edwardsiella tarta)	스트렙토코쿠스 종	스타필리코쿠스 종
zen 2	웨이셀라 종	+++	++	+	++
zen10	류코노스톡 종	+++	++	-	++
zen14	카르노박테리움 종	+	+	-	-
zen61	엔테로코쿠스 종	+	+	-	-
zen64	락토코쿠스 종	+++	+++	+	++
: 저해 영역(Inhibitor zone) ; - : 음성, + : 약한 양성, ++ : 양성, +++ : 강한 양성

zen14와 zen61은 그람음성균에서는 미약하지만 항균활성을 약하게 나타내었고, 그람양성균에서는 항균활성이 나타나지 않았다. 반면 zen2, zen10 및 zen64는 그람음성균에는 강한 항균활성을 나타내었고, zen2, zen10 및 zen64는 그람양성균 스타필리코쿠스 종(Staphylicoccus sp.)에는 강한 활성을 나타내었지만, 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.)에 대해서는 zen2와 zen64는 약한 항균력을 나타냈지만, zen10는 항균활성이 나타나지 않았다. 결과적으로 그람음성균 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 에드와드시엘라 타르타(Edwardsiella tarta)와 그람양성균 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.), 스타필리코쿠스 종(Staphylicoccus sp.)에 대해 항균력을 모두 나타내며, 그람양성균에서 보다 더 우수한 항균활성을 가지고 있는 zen64를 최종 분리균주로 선정하였다.

실시예 2

분리균의 동정

선발된 유산균(lactic acid bacteria)의 동정을 위하여 그람염색을 실시하여 현미경으로 형태를 관찰한 후 생화학적 특성은 API 50 CHL 킷트(프랑스 소재 Biomereux사 제품)를 사용하여 조사하였다. 또한 대한민국 소재 솔젠트 주식회사(Solgent Co., Ltd.)에 의뢰하여 프라이머 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)을 이용, 선발균주의 16S rRNA를 PCR(polymerase chain reaction) 증폭 후 증폭된 시퀀스를 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information ; NCBI)에 등록된 염기서열과 비교하여 상동성을 조사한 후 상기 실험결과를 바탕으로 최종 동정하였다.

상기의 분리균 zen64를 현미경으로 관찰한 결과, 그람양성 구균으로 확인되었으며, 이를 동정하기 위해 균의 특성을 조사하였다. 분리균의 생화학적 특성은 API 50 CHL 킷트를 사용하여 조사하였다. 이를 위해 분리균을 MRS 액체배지에서 하룻밤 진탕배양하고, 균체를 회수하여 현탁배지(Suspension medium)에 현탁한 후, 맥파랜드(McFarland) 2표준 탁도가 되도록 AIP 50 CHL 배지로 희석하였다. 이러한 균 현탁액을 튜브에 주입하여 접종한 후, 24 내지 48시간 배양하면서 탄수화물의 발효여부를 확인한 결과, 분리균은 엘-아라비노스(L-arabinose), 리보스(ribose), 자일로스(Xylose), 갈락토스(galaxtose), 글루코스(glucose), 프룩토스(frucose), 만노스(mannose), 말토스(maltose), 셀로비오스(cellobiose), 락토스(lactose), 슈크로스(sucrose), 트레할로스(trehalose) 등을 이용하였으며, 디-아라비노스(D-arabinose), 멜리비오스(melibiose), 디-타가토스(D-tagatose) 등을 발효하지 못하였다(표 3). 이들 탄수화물의 발효여부 결과를 데이터베이스와 비교한 결과, 분리균은 락토코쿠스 락티스(L. lactis subsp. lactis)와 99.8%의 유사도를 보인 것으로 확인되었다.

특징들	반응	특징들	반응
형태학적 형상	구균	아미그달린	+
그람염색법	+	알부틴	+
포자	-	에스쿨린	+
운동성	-	살리신	+
카탈라아제	-	셀로비오스	+
글리세롤	-	말토스	+
에리쓰리톨	-	락토스	+
디-아라비노스	-	멜리비오스	-
엘-아라비노스	+	슈크로스	+
리보스	+	트레할로스	+
디-자일로스	+	이눌린	-
엘-자일로스	-	멜레지토스	-
아도니톨	-	라피노스	-
메틸-β디-자일로피라노시드	-	녹말	+
디-갈락토스	+	글리코겐	-
디-글루코스	+	자일리톨	-
디-프룩토스	+	겐티오비오스	+
디-만노스	+	디-투란노스	-
엘-소르보스	-	디-릭소스	-
람노스	-	디-타가토스	-
둘시톨	-	디-푸코스	-
이노시톨	-	엘-푸코스	-
만니톨	+	디-아라비톨	-
소르비톨	-	엘-아라비톨	-
α-메틸-디-만노시드	-	글루코네이트	+
α-메틸-디-글루코시드	-	2-케토-글루코네이트	-
N-아세틸-글루코사민	+	5-케토-글루코네이트	-
+ : 양성 반응, - : 음성 반응

분리균의 16S rRNA의 염기서열을 분석하기 위해서 16S rRNA 유전자 단편을 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. 중합효소 연쇄반응은 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(27F), 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(1492R)을 프라이머들로 사용하였으며, 분리균 Zen64로부터 분리한 총 염색체 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 반응액 조성과 반응조건은 쿠엔(Kweun) 등이 실시한 조건과 동일하게 사용하였다(Felsenstein, J.(2002) PHYLIP (phylogenyinference package), version 3.6a, seattle: Department of Genetics, University of Washington, Seattle, WA, USA.을 참조하시오). 증폭된 16S rRNA 유전자 단편을 정제하여 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 킷트(dye terminator cycle sequencing kit)와 373 자동화 DNA 시퀀서(automate DNA sequencer ; 미합중국 소재 퍼킨엘머 컴퍼니(Perkin Elmer Co)제품)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 미국 NCBI의 블라스트(BLAST) 검색방법을 사용하여 기존에 등록된 다양한 세균들의 상응하는 염기서열과 비교하여 높은 상동성을 나타내는 세균 그룹을 1차적으로 선발하였다. 분리균의 정확한 계통학적 분석을 위해서 CLUSTAL W 소프트웨어를 사용하여 선별된 균주들의 16S rRNA 염기서열과 비교하고 5′, 3′의 갭(gap)을 제거하거나 적절히 수정한 후, 분자계통학적 계통수의 작성은 PHYLIP 프로그램 패키지를 사용하여 수행하였다(Jukes, T. H. and cantor, C. R.(1969) Evolution of protein molecules. pp. 21-132. In H. N. Munro. (ed.), Mammalian protein Metabolism, Academic Press, New York.을 참조하시오). 분자진화거리는 DNADIST 프로그램 속의 neighbor-joining method에 기초해서 작성하였다(Sautou, N. and Nei, M.(1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.를 참조하시오). 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 분리균의 16S rRNA는 락토코쿠스 락티스(L. lactis subsp. lactis)와 가장 유사도가 높았고, 이러한 결과는 생화학적 특성의 결과와 일치하였으므로 분리균을 락토코쿠스 락티스 젠64로 명명하였다(Chung, H. M. and Kim, J. M.(2001) Isolation and identification of Probiotic candidate Isolated from the Gastrointestinal(GI) Track of Flounder. Bull. Fish. Sci.Inst., Yosu Nat'l Univ. 10, pp.14-17, 2001을 참조하시오).

실험예 1

락토코쿠스 락티스 젠64 분리균의 내산성과 내담즙성

분리된 락토코쿠스 락티스 젠64 균주가 생균제용 미생물로서 요구되는 기본성질을 보유하고 있는지 확인하기 위해 내산성과 내담즙성을 조사하였다. 내산성을 측정하기 위한 실험은 생체내(in vivo)에서 직접 생존율을 확인하는 방법과 인공위액을 이용한 간접적으로 측정하는 방법이 있는데, 생균의 사멸은 주로 낮은 pH에 의해 일어나므로 생체내(in vivo) 와 시험관내(in viro)에서의 실험결과가 거의 일치하는 사실이 보고된 바 있다. 본 발명에서 선발된 락토코쿠스 락티스 젠64 균주의 내산성을 조사하기 위해서는 MRS에서 배양된 균체를 0.85% 염화나트늄 용액으로 2차례 세척한 후, pH를 3, 4 및 5로 조절한 50mM 인산나트륨(sodioum phosphate) 용액에 방치하였다. 방치 후, 10 내지 120분 사이에 일정 간격으로 균액을 취해 MRS 평판배지에 도말하여 도 1과 같이 생존율을 조사한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, pH 4 이상에서는 120분간 방치 후에도 100%의 생존율을 보였으며, pH 3에서는 10분에서 120분까지 90% 이상의 생존율을 나타내어 산에 의한 사멸정도가 큰 것은 아니라 판단되었다. 한편 길리랜드(Gilliland) 등은 생균제가 가져야 할 담즙액에 대한 내성은 옥스갈(oxgall ; 0.3중량%)이 함유된 배지에서 성장할 수 있어야 한다고 보고한 바 있다(Gilliland, S. E., Staley, T. E. and Bush, L. J.(1984) Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. J. dairy Sci. 67, 3045-3051 및 Lee, M. S. and Yoon, K. H.(2006) Characterization of Pediococcus pentosaceus isolated from Porcine intestine. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 34, 74-77. 들을 참조하시오). 그러므로 젠64 균주의 담즙에 대한 내성을 조사하기 위해 0.3%(W/V) 옥스갈이 함유된 MRS 브로스와 옥스갈이 함유되지 않은 MRS 브로스에 각각 접종하여 37℃에서 2시간 동안 방치한 후, 생균수를 측정하였다. 그 결과 옥스갈의 첨가여부에 관계없이 정상적인 생육을 보여주어, 분리균 젠64는 옥스갈에 내성을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 도 2에서, ●는 pH 3, △는 pH4 그리고 ■는 pH 5에서의 생존율을 나타내는 곡선들이다.

실험예 2

락토코쿠스 락티스 젠64( Lactococcus lactis zen64) 분리균의 배양특성

락토코쿠스 락티스 젠64의 성장과 젖산 생산성을 조사하기 위해 MRS 브로스의 pH를 7.0으로 조정하여 멸균한 500㎖에 1% 접종하여 30℃ 인큐베이터에서 배양하면서 3시간 단위로 36시간까지 광학밀도(optical density ; OD), pH 및 총산도 값의 변화를 측정하였다. OD는 분광광도계(UV-1601 자외선-가시광선 분광광도계(UV-Vis Spectrophotometer), 일본국 소재 시마쯔 주식회사(Shimadzu Co., Ltd.) 제품)로 600㎚에서 측정하였고, pH는 pH측정기(PHM210, 프랑스 소재 라디오미터 아날리티칼(Radiometer analytical)로 측정하였으며, 총산도는 AACC(02-31) 방법(Approved methods of the American Association of Cereal chemists(AACC) (1985) Minnesota, pp.2-31을 참조하시오)에 따라 배양액 10㎖를 삼각플라스크에 취하여 증류수 90㎖를 혼합 후, 1.0% 페놀프탈레인 50% 에탄올 지시약을 가하여 0.1N 수산화나트륨(F=1.0)(대한민국 소재 덕산화학 주식회사(DukSan pure Chemical Co.) 용액으로 적정하여 소모 ㎖를 총산도로 하였다. 락토코쿠스 락티스 젠64의 염화나트륨 농도에 미치는 영향을 조사하였다. 우선 선정된 락토코쿠스 락티스 젠64를 MRS배지에 전배양한 후, 바다양식어류에 적용하기 위해 바다의 염 농도 3.5중량%를 기준으로 0, 1, 3.5, 5, 7, 10중량%로 조정하여 측정하였다.

본 발명을 통해 분리된 락토코쿠스 락티스 젠64도 생균제로 이용하기 위해서는 여러 가지 연구가 요구된다. 항균력과 생육이 가장 우수한 젠64 유산균이 생산하는 젖산은 정장효과에 관련이 있으므로 분리균 젠64의 젖산 생성능을 조사하였다. 분리균을 36시간 배양하면서 3시간 단위로 균 증식과 그에 따른 pH 및 총산도 변화값을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 균주 젠64의 배양시간에 따른 600㎚에서의 OD 값의 변화는 초기 0.018, 배양 3시간에 0.075로 증가폭이 작았으나, 배양 6 내지 18시간에 증가폭이 급격히 높아져서 배양 18시간에는 OD 값이 2.61을 나타냄을 확인할 수 있었다. 그리고 배양 21시간 이후에 증가폭이 둔화되어 균의 성장에 변화가 없는 양상(pattern)을 보여주고 있다. 따라서 젠64 균주의 대수기는 6 내지 18시간의 범위인 것으로 나타났다. 한편 균의 성장과 반비례적으로 배양액의 pH 변화는 초기 6.28에서 배양 3시간에 6.11로 저하율이 적었으나, 균의 급격한 생육시기인 배양 6 내지 18시간까지 pH가 급격히 낮아져 21시간 이후 최종 pH 4.31까지 낮아지는 것으로 나타났다. 도 3에서, ●는 OD를, ○는 총산도(Total Titratible acidity ; TTA)를 그리고 ▲는 pH를 각각 나타낸다.

또한 배양액의 총산도 값은 균의 성장과 비례적인 양상을 보였는데 초기 2.84에서 배양 6시간에 4.97, 그리고 배양 21시간이 되어 거의 12.89까지 급격한 증가되는 것으로 나타났다. 그 후 변화폭이 거의 없는 것으로 나타났고, 27시간 이후부터는 산도가 낮아지는 것으로 나타났다.

락토코쿠스 락티스 젠64의 어류 질병세균에 대해 항균력은 우수하지만 염 농도에 영향을 미치는 지 조사한 결과를 도 4에 나타내었다. 젠64는 바다의 염 농도 3.5중량% 염화나트륨 농도 이하에서는 높은 생육과 산도를 나타내었고, 3.5% 염화나트륨의 농도에서도 균의 성장과 산도가 낮아졌지만, 비교적 높은 생육과 산도를 나타내었다. 그 결과 바다 양식어류에 적용하기 위해서는 3.5% 염화나트륨 농도에서 생육이 가능한 바다어류 유래의 락토코쿠스 락티스 젠64가 프로바이오틱스(미생물제제)로서의 개발 가치가 있다고 판단된다. 도 4에서, ●는 OD를 그리고 ○는 총산도를 각각 나타낸다.

본 발명은 어류 장내에서 유래하는 유산균으로서, 담수 및 해수에서 높은 젖산 생성과 높은 생육을 나타내는, 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는 미생물제제를 제공하여 수산업 등에서 이용될 수 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 락토코쿠스 락티스 젠64의 동정결과를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명에 따른 락토코쿠스 락티스 젠64 균주의 내산성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 락토코쿠스 락티스 젠64를 36시간 배양하면서 3시간 단위로 균 증식과 그에 따른 pH 및 총산도 변화값을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 락토코쿠스 락티스 젠64의 염 농도에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.

Claims

바다어류의 위장관 내에서 분리되며, 항균활성을 갖는 바다어류 유래의 락토코쿠스 락티스 젠64(KACC 91328P).
해수어류의 사료 중에 혼합되어 이루어짐을 특징으로 하는 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64(KACC 91328P)를 포함하는 해수어류용 미생물제제.