KR20020012171A - 식품 보존을 위한 새로운 방어 배양균 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락트산(lactic acid) 박테리아를 함유하는 새로운 방어 배양균(protective cultures)에 관한 것으로 상기 박테리아는 냉장 하에서 제한된 기간 동안만 보존되는 식품 및 사료를 보관하는데 사용될 수 있는 것이다. 상기 방어 배양균은, 냉장 순환이 중단되거나 냉장 온도가 고정되지 않는 경우에도 소비자에서 위험한 박테리아의 성장을 억제한다. 본 발명은 진일보한 방어 배양균을 함유하는 식품 또는 사료에 관한 것이다.

Description

식품 보존을 위한 새로운 방어 배양균 및 이의 용도{NOVEL PROTECTIVE CULTURES AND USE THEREOF FOR PRESERVING FOODSTUFFS}
예를 들어, 다양한 육류 제품과 같은 일정한 식품 및 사료는 소비자가 구매하거나 이전까지는 반드시 냉장 보관되어야 한다. 즉, 7℃에서 8℃이하의 온도에서 상기 제품들은 식용으로 보존되어야 한다. 이러한 식품 및 사료의 경우는 냉장 하에서 제한된 기간만 보존되지만, 세심한 제품 관리에도 불구하고 소비자에게 위험한 박테리아가 오염된 원료나 미제품의 오염이나 최종 제품의 오염을 통하여 식품이나 사료에 침투할 가능성을 배제할 수 없다.
본 발명에서 의미하는 소비자에게 위험한 박테리아는 박테리아의 음식-독성을 생산하는 박테리아를 의미한다. 다른 측면에서, 상기 박테리아는 식품 또는 사료 내에 이미 독소를 빌생할 수 있는 독소 발생 박테리아를 포함한다. 독소 함유 식품 또는 사료의 소비는 독소-감염, 예를 들어 질병을 일으킨다. 다른 측면에서, 박테리아의 음식-독성은 식품 또는 사료에서 증식할 수 있는 독소-감염 박테리아에 의해 야기될 수 있으므로 위장관(gastrointestinal tract)으로 들어간다( G. Seidel, J. Kiesewalter: 박테리아의 식품 감염과 중독. 베를린: Akademie Verlag, 1992).
대부분의 박테리아에 의한 음식 독성은 식품 또는 사료 내에 병원균이 상대적으로 높은 세균 밀도로 있는 경우에 발생한다(J. Kramer: 식품 미생물학. Stuttgart: Ulmer, 1987). 상기 냉장 순환이 중단되거나 상기 냉장 온도가 유지되지 않는 경우에, 식품 또는 사료 내의 감염량(질병을 발생시키는데 필요한 최소한의 병원균의 세균량)은 일반적으로 초과한다. 상기 독소 발생 박테리아 및/또는 독소-감염된 박테리아의 감염량이 상기 식품 또는 사료에서 소비자가 감지할 수 있는 어떤 감각적 변화를 만들지 않고 초과될 수 있다는 것은 특히 위험한 것이다. 그러므로, 상기 냉장 순환이 중단되거나 상기 냉장 온도가 유지되지 않는 경우에, 약제(agent)는 상기 식품 또는 사료 내에서 독소 발생 박테리아 및/또는 독소-감염의 박테리아의 성장을 억제할 수 있는 것이 바람직하다.
성장의 억제, 즉 소비자를 만족시킬 수 있는 상기 위험한 박테리아의 성장률의 감소는 수 많은 제안에도 불구하고 현 기술 수준에서 성공하기 어렵다.
현재의 독소 발생 박테리아 및/또는 독소-감염의 박테리아의 성장은 많은 화학 첨가제(유럽령 No. 95/2/EEC 1995. 2. 20 참조) 또는 물리적 처리(열, 자외선, 이온선 등의 출원)로서 거의 모두 식품에서 억제된다. 그러나, 상기 방법은 소비자의 수용 가능성을 감소시킨다. 이는 부분적으로 많은 첨가제에 대한 알레르기 가능성 때문이다. 더 나아가, 상기 가능성은 식품이나 비보(vivo)내에 방부제가 물질 대사하는 가능성도 배제하지 않는다(H-G, 크레센, P.S. 엘리아스, W.P. 햄스: 식품 성분 및 첨가제의 독성학-위생학적 평가와 심각한 오염; 베를린 및 함부르그: 베르라그 파울 파레이, 1987).
하나의 예는 육류 제품의 저장인데, 아질산염 보존 소금의 형태로 상기 식품에 아질산염(nitrite)를 첨가하는 것이다. 상기 경우에 독성학적으로 문제되는 것은 발암물질인 니트로소아민(nitrosamine)의 생성 가능성보다는 아질산염의 심각한 독성이다(H. Druckery, R. Preussmann, S. Ivankovic, D. Schmahl,: BD 쥐에서 65종의 다른 N-니트로소 화합물의 항장기성의 발암물질의 영향. 크레브스포르슝 69, 1967, P. 102 ff.). 그러므로, 상기 아질산염 첨가제의 생략이나 감소는 상당히 바람직하다. 그러나, 현 기술 수준에서 저장 소금(curing salts)을 사용하지 않고 - 또한, 완전히 안전하지 않은 다른 방부제를 첨가함 없이 - 제품의 박테리아 부패위험을 증가시키는 것은 의문의 여지가 없게 되므로 소비자의 건강을 위협하게 된다(K. Hofmann : 동물 기원의 식품에서의 아질산염과 이의 결과. ADI-베르브라우체디엔스트 31, 1986, P. 98).
오직 냉장 하에서 제한된 기간 동안 보존하는 식품 또는 사료에서, "자연산"과 "첨가제가 없는" 식품의 증가되는 요구는 냉장에 의해 독소 발생 및/또는 독소 감염 박테리아의 성장이 현저히 감소되는 것을 의미한다. 만일 상기 안전 기준이 충실하게 되지 않는 경우, 즉 상기 냉장 순환이 중단되거나 상기 냉장 온도가 유지되지 않는 경우에, 소비자는 식중독의 위험에 노출되는 것이다.
상기 위험은 생물학적 공정의 사용으로 막을 수 있다. 락트산 박테리아를 함유하는 특정 박테리아는 원칙적으로 많은 물질 대사 물질을 생성함으로서 다른 박테리아의 성장을 억제할 수 있다(S.E. Lindgren, W.J. Dobrogosz, FEMS 미생물학적 관찰 87: 149-173(1990); H. Asperger, Osterreichische Milchwirtschaft 41 : 1-22(1986) 볼륨 4의 첨부 1).
방어 배양균으로서 락트산 박테리아의 사용은 소비자를 만족시키는데, 즉 독소 발생 및 독소-감염 박테리아의 성장을 억제하기 때문이지만, 상기 박테리아는 하기의 엄격한 요건을 충족하여야 한다 :
1. 기본적인 선결 조건은 건강에 완전히 무해한 것이어야 한다, 즉 사용되는상기 박테리아는 GRAS 상태여야 한다(GRAS : 안전인정식품첨가물일람표(Gnerally Recognized As Safe);식품의학품안전청, 미국 참조 : "안전인정식품첨가물일람표, 제안안" (적요 No. 97N-0103), 연방등록??부III; Vol. 62, 1997).
2. 사용되는 상기 박테리아는 부작용을 갖을 수 있는 소비자를 위하여 냉장 온도에서의 물질 대사 활성이 나타나지 않아야 한다(예를 들어, 산패(souring), 색에 영향 등).
3. 더 나아가, 냉장 보관되는 기간 동안, 가능한한 대사적으로 활성 박테리아는 상기 방어 배양균이 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제할 수 있도록 충분한 양으로 온도가 증가하는 경우나, 저장 기간이 종료되는 때에도 상기 방어 배양균에 포함되어야 한다. 가능한 한 대사적으로 활성 박테리아는 온도가 상승하는 경우에도 대사 활성을 나타내는 박테리아이다.
4. 사용되는 상기 박테리아는 적어도 7℃에서 8℃나 그 이상의 온도 범위 내에서 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제하여야 한다. 온도가 급격히 상승하는 경우나 냉장 순환이 중단된 때에도 상기 박테리아는 이러한 조건에서 매우 급속히 증식하는 장내세균과(the family of the enterobacteriaceae)의 박테리아(예. 살모넬라(salmonella))를 억제할 수 있어야 한다. 더 나아가, 사용되는 상기 방어 배양균은 다양한 다른 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아를 억제할 수 있어야 한다.
현 기술 수준에서 식품을 보존키 위해 사용되는 박테리아는 상기 조건을 충족하지 못했다.
현 기술 수준에서 사용되는 몇 박테리아의 억제 효과는 항균성 (antagonistic) 단백질 또는 단백질 복합체를 형성하는데 기초를 두고 있는 바, 이는 박테리오신(baxteriocin)으로 알려져 lT고 특정 다른 박테리아를 억제하기 위해 박테리아에 의해 특별히 생성된 것이다(넷틀 앤 베얼풋(Nettles and Barefoot). 식품 보호 저널 6:333 ff, (1993)). 상기 박테리오신은 밀접한 인접 종에 대하여 항박테리아 활성을 나타낸다. 그러므로, 현 기술 수준에서 양성 박테리아에 대부분 제한되어 매우 특정 범위의 박테리아만이 박테리오신에 의하여 억제될 수 있다(L. de Vuyst, E.J. Vandamme : 락트산 박테리아의 박테리오신. 런던, 글래스고우, 뉴욕, 토쿄, 멜버른, 마드리스; Blackie Academic & Professional, 1994). 또한, 상기 박테리오신 생성 배양균을 사용하는 것은 문제의 소지가 있는 바 이는 박테리오신이 종종 식품에서 안정성이 결핍되고 식품에서 낮은 합성율로 생성되며, 상기 박테리아에 저항하는 균주가 발생하기 때문이다(F.K. Lucks, Deutsche Milchwirtschaft 16:729 ff., 1994).
현 기술 수준에서 사용되는 다른 박테리아는 이미 냉장 저장을 하는 동안, 즉 7℃ 이하애서 대사 활성을 나타내므로 본 발명에서 의미하는 방어 배양균으로서 사용될 수 없다(Tanaka,N., 식품보호 48:697 ff., (1985); Schmidt, D. Fleischwirtsch., 식품 보호 45:305 ff., (1982); Andersen, L., Fleischwirsch., 75:705-712 (1995)). 상기 공지된 박테리아는 이미 방어 배양균으로서 사용하기 위해 실험된 바 있고 약간의 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아에 대해서만 억제 효과가 있음이 나타났으므로 광범위한 식품 및 사료에서 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아를 억제할 수 없다.
본 발명은 락트산(lactic acid) 박테리아를 함유하는 새로운 방어 배양균 (protective cultures)에 관한 것으로 상기 박테리아는 냉장 하에서 제한된 기간 동안만 보존되는 식품 및 사료를 보관하는데 사용될 수 있는 것이다. 상기 방어 배양균은, 냉장 순환이 중단되거나 냉장 온도가 고정되지 않는 경우에도 소비자에서 위험한 박테리아의 성장을 억제한다.
도 1은 3주의 냉장 저장(6℃) 및 냉장 순환(48시간/22℃)의 장애가 점차로 발생하는 동안 진공-팩 슬라이스 소시지 내의 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)의 특성을 나타낸 그래프. 상기 균주 밀도(log KbE/cm2의 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)가 실험을 하는 동안 좌측 y-축에, 소시지의 pH 값은 우측 y-축에 나타나 있다. 테스트 기간은 x-축에 나타나 있다. 상기 슬라이스 소시지는 진공-팩되어 있고, 상기 커버 필름은 OPP/SIOX/PE로 구성된다. 조사된 샘플의 경우에, 상기 샘플는 1300 lux로 조사되고, 진공-팩 샘플 및 형광 튜브 사이에 40cm의 거리가 있다.
도 2는 냉장 순환(22℃/48시간)의 장애 일어나는 동안락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)에 의해 살모넬라풀(pool)의 억제를 나타내는 그래프. y-축은 상기 박테리아의 세균 밀도를 나타내고, 한편 x-축은 실험 기간을 나타낸다.
도 3은 부적절한 냉장 저장(10℃) 및 상기 냉장 체인(22℃)의 장애를 점진적으로 일으키는 동안 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)에 의해 살모넬라 풀의 억제를 나타내는 그래프. y-축은 상기 박테리아의 세균 밀도를 나타내고 y축은 실험 시간을 나타낸다.
도 4는 상기 냉장 체인(22℃/48시간)의 장애가 일어나는 동안, 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)에 의해 스태필로코쿠스 아우에우스 아종 아우에우스(Staphylococcus aureus subso. aureus)의 억제를 나타내는 그래프. 상기 억제 활성은 상기 방어 배양균의 접종 밀도 및 첨가되는 글루코스의 양에 의존하는 것을 나타낸다. 상기 y-축은 스태필로코시의 세균 밀도를 나타내고, x-축은 실험 시간을 나타낸다.
도 5는 상기 냉장 체인(22℃/48시간)에 장애가 일어나는 동안 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)에 의해 바실루스 세레우스(Bacollus cereus)의 억제를 나타내는 그래프. 상기 억제 활성은 상기 방어 배양균의 접종 밀도 및 첨가되는 글루코스의 양에 의존하는 것을 나타낸다. 상기 y-축은 바실루스 세레우스(Bacollus cereus)의 세균 밀도를 나타내고, x-축은 실험 시간을 나타낸다.
도 6은 상기 냉장 체인(22℃/48시간)에 장애가 일어나는 동안 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)에 의해 크로스트리디움 펄프링겐스(Clostridium perfringens)의 억제를 나타내는 그래프. 상기 억제 활성은 상기 방어 배양균의 접종 밀도 및 첨가되는 글루코스의 양에 의존하는 것을 나타낸다. 상기 y-축은 크로스트리디움 펄프링겐스(Clostridium perfringens)의 세균 밀도를 나타내고, x-축은 실험 시간을 나타낸다.
그러므로, 본 발명의 목적은 상기 기준을 충족시키고 식품 및 사료에서 완전히 안전하게 사용할 수 있는 유용한 방어 배양균을 만드는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방어 배양균을 함유하는 유용한 식품을 만드는데 있다.
상기 목적을 이루기 위하여, 식품 또는 사료의 처리에 사용되는 새로운 방어 배양균이 제안된다. 본 발명에 따른 상기 방어 배양균은 비병원성(non-pathogenic), 락트산을 생성하는 박테리아(락트산 박테리아)를 포함하며, 이들은 냉장 온도가 일정한 경우에는 대사 활성을 나타내지 않는 반면 냉장 순환이 중단되거나 냉장 온도가 고정되지 않는 경우에는 물질 대사로 산물을 생성함으로서 다수의 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제할 수 있는 놀라운 특서을 갖는다. 또한, 상기 다수의 락트산 박테리아는 저장 기잔 동안 식품 또는 사료에 거의 일정하게 남아 있어 저장이 종결되어도 상기 위험한 박테리아의 성장을 억제할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 방어 배양균을 사용함으로서, 소비자는 살모넬라와 같은 다수의 독소 발생 및/또는 독소 감염 박테리아로부터 보호될 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 냉장 하에서 제한된 기간 동안 보존되는 식품 또는 사료를 저장하기 위한 방어 배양균에 있어서, 상기 방어 배양균은 다음을 특성을 갖는 비병원성 락트산 박테리아를 포함한다:
a) 7℃에서 8℃ 이하의 온도에서, 상기 락트산 박테리아는 대사 활성을 나타내지 않고;
b) 7℃에서 8℃ 이하의 온도에서 1주에서 2주일 기간 이상, 잠재 대사 활성의 상기 락트산 박테리아의 수는 2 소수 제곱(decimal power)이하로 감소하고; 및
c) 적어도 7℃에서 8℃의 온도에서, 상기 락트산 박테리아는 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제한다.
바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스(Lactococcus), 페디오코쿠스(Pediococcus), 락토바실루스 (Lactobacillus), 루코노스토크(Leuconostoc), 웨셀라(Weissella), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및/또는 스포로락토박시러스 (Sporolactobacillus) 의 속 들(genera) 또는 이의 혼합물의 락트산 박테리아를 함유한다.
보다 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스(Lactococcus), 페디오코쿠스(Pediococcus), 락토바실루스 (Lactobacillus), 루코노스토크(Leuconostoc), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 또는웨셀라(Weissella)의 속 들(genera) 또는 이의 혼합물의 락트산 박테리아를 함유하며, 특히 바람직한 일 실시예에 따라서 상기 방어 배양균은 락토코쿠스 (Lactococcus) 속의 락트산 박테리아를 함유한다.
다른 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코쿠스 가리에(Lactococcus garieae), 락토코쿠스 피시움(Lactococcus piscium), 락토코쿠스 플랜타룸(Lactococcus plantarum), 및/또는 락토코쿠스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis)의 종(specie) 들 또는 이의 혼합물의 락트산 박테리아를 함유한다.
특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스 릭티스(Lactococcus lactis) 종의 락트산 박테리아를 함유한다.
다른 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris) 및/또는 락토코쿠스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) 아종(subspecie)들 또는 이의 혼합물의 락트산 박테리아를 포함하고, 특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스 락티스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) 아종의 락트산 박테리아를 함유한다.
다른 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 디아세틸락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis)의 변종의 락트산 박테리아를 함유한다.
다른 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis1526) 균주의 락트산 박테리아를 함유한다. 상기 락토코쿠스 락티스 락티스 아종 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis1526)은 1998년 9월 21일에 번호 DSM 12415로 DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D 38124 Brunswick에 기탁되었다.
본 발명에 의한 특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 방어 배양균은 다양한 상기 속, 종, 아종, 및/또는 균주의 혼합물을 함유한다.
바람직한 일 실시예에 따라서, 본 발명에서 의미하는 식품 또는 사료는 식품 또는 사용의 생산시 사용되는 사체 또는 천연 원료와 같은 예비 단계를 포함한다.
특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품 또는 사료는 육류 및 육류 제품, 어류 및 어류 제품, 델리카테센 샐러드(delicatessen salad) 및 저장 곡류 및/또는 판매되는 선조리물(pre-cooked)이다. 상기 식품 또는 사료는 더욱 특히 하기의 식품을 포함한다.
7℃에서 8℃ 이하의 온도에서, 본 발명에 의한 상기 방어 배양균의 락트산 박테리아는 인식할 만한 대사 활성을 나타내지 않는다. 인식할 만한 대사 활성은 소비자에 의해 감지될 수 잇는 여하한의 대사 활성을 의미한다. 특히, 상기 락트산 박테리아는 성장 활동이 없고 산패가 없으며, 식품이나 사료의 색에 영향을 미칠 수 있는 물질 대사의 산물을 생산하지 않는다.
7℃에서 8℃ 이하의 온도에서, 증식 가능한 락트산 박테리아는 수는 1주에서 2주의 기간 이상 동안 바람직하게 1 소수 제곱 이하로 감소하고 특히 바람직하게는 1.5 소수 제곱 이하로 감소한다.
적어도 7℃에서 8℃의 온도에서, 본 발명에 의한 상기 방어 배양균의 락트산 박테리아는 다음의 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제한다. 다만, 본 발명은 이하의 박테리아를 억제하는 데만 한정되는 것은 아니다 :
스타필코쿠스 아우에우스(Staphylococcus aureus), 살모넬라(Salmonella), 휴먼패토제닉 E. 콜리 (humanpathogenic E. coil) 균주(EIEC, ETEC, EPEC, EHEC), 시겔라(Shigella), 세우도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolytius), 에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 캠필로보박터 제쥬니(Camphylobacter jejuni), 바시루스세레우스(Bacillus cereus), 크로스트리디움 페르핀젠스(Clostridium perfingens) 및 크로스트리디움 보투린움(Clostridium botulium).
특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장은 억제되어, 이들의 수는 증가하지 못하고 48시간 안에 2 소수 제곱 이상으로 증가하지 못하고 바람직하게는 1 소수 제곱 이하이다.
본 발명에 의한 방어 배양균의 락트산 박테리아는 다른 것들 중에서 하기의 항미생물적 활성 물질을 생성함으로서 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제하고, 본 발명에 따라서 상기 락트산 박테리아는 일부 또는 모든 상기 물질을 생성할 수 있는 것을 포함하고 또한 상기 락트산 박테리아의 억제 가능성은 다른 물질에 의해서도 가능한 것을 포함한다: 유기산(락트산(lactic acid), 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid), 벤조산(benzoic acid)), 디아세틸(diacetyl), 이산화탄소(carbon dioxide), 극소량의 레독스 퍼텐셜(redox potential), 과산화수소수(hydrogen peroxide), 살균소(bactericin)를 이르게 하는 감소 물질들.
바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 락트산 박테리아는 유기산, 바람직하게는 락트산을 생성함으로서 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제한다.
특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 적어도 7℃에서 8℃의 온도나 그 이상에서 방어 배양균의 락트산 박테리아는 상당한 대사 활성을 나타내고, 바람직하게는 식품 또는 사료의 산패(souring)을 나타낸다.
보다 특히 바람직한 일 실시예에 따라, 상기 온도 이하에서 방어 배양균의 락트산 박테리아의 대사 비활성이 나타나고, 상기 락트산 박테리아가 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제할 수 있는 그 이상의 온도는 7℃이다.
본 발명에 의한 상기 방어 배양균의 락트산 박테리아는 하기의 방법에 의해 얻어진다:
1. 우선, 락트산 박테리아가 분리되어 상기 언급한 속, 종 및/또는 균주 또는 이의 혼합물의 하나로 분류된다. 이들은 후에 사용될 락트산 박테리아의 식품이나 사료용으로 분리되는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어 성장, 영양소 이용 또는 락트산 생성에 따라서 상기 식품 E또는 사료에 최적의 적합성을 나타낸다.
상기 락틱산 박테리아를 분리하는 방법은 알려져 있다(J. Baumgart, W. Heeschen(Hrsg.): 시품 위생학 핸드북. 함부르그: Behr's, 1 ff.,(1994), 특히 4장, p 216ff.). 이는 또한 상기 분리된 박테리아가 락트산 박테리아 인지 여부를 실험하는 방법도 설명되어 있다.
2. 7℃에서 8℃이 및 그 이상의 온도에서, 성장 방식 및 대사 활성이 실험된다. 7℃에서 8℃이하에서 상기 박테리아는 대사 활성을 인식할 수 없어야 하고, 특히 산패 활성이 없어야 한다. 적어도 7℃에서 8℃의 온도나 그 이상의 온도에서, 상기 박테리아는 상당한 대사 활성, 특히 산패 활성을 나타낸다.
7℃에서 8℃이하의 온도에서 1 - 2주의 기간 동안, 상기 락트산 박테리아가 첨가된 식품 또는 사료에서 상기 증식할 수 있는 분리된 락트산 박테리아의 수는 2 소수 제곱 이하로 감소됨을 실험할 수 있다. 이러한 목적으로 상기 식품 또는 사료의 특정 양은, 바람직하게는 상기 식품 또는 사료 표면적의 107박테리아/cm2, 1-2주 동안 상기 식품 또는 사료와 함께 배양된다. 그 후 알려진 방법을 사용하여 박테리아 수를 결정한다(J. Baumgart, loc. cit., 5장, p.74 ff.).
이러한 특징을 나타내기 위하여, 바람직하게는 상기 분리된 락트산 박테리아의 정확한 특징이 추가될 수 잇다. 이러한 목적에 유용한 일련의 방법이 있는 바, 예를 들어 지시 균주와 소형화된 "api 50 CHL" 배양기를 사용(bioMerieux, Marcy-1'Etoile, France)하여 생화학적 검증 또는 165 rDNA 서열의 분석(B. Pot et al.: 릭틱산 박테리아의 검증 및 분류를 위한 현대 방법; in: L. de Vuyst, E. J. Vandamme: 락트산 박테리아의 박테리아신. 런던, 글래스고우, 뉴욕, 토쿄,멜버른, 마드리스: Blackie Academic & Professional 1991; 2.3장, p. 40 ff).
3. 그 후, 상기 분리된 락트산 박테리아가 식품 또는 사료에서 독소 발생 및/또는 독소 감염균의 성장을 억제할 수 있는지 실험하여야 한다. 상기 목적으로, 상기 식품 또는 사료내의 상기 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아는 상기 분리된 락트산 박테리아와 함께 배양된다(실시예 8 참조). 바람직하게는, 상기 배양은 7-8℃ 이하의 온도에서 이루어지고, 그 후 적어도 7-8℃나 그 이상의 온도에서 이루어진다. 성장 억제 결과는 상기 분리된 락트산 박테리아와 함께 배양된 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아가 상기 분리된 락트산 박테리아의 첨가 없이 배양된 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아보다 보다 느리게 성장하는지 여부로 나타난다.
본 발명의 또 다른 목적은 균주 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis1526)에 속하는 릭트산 박테리아이다. 상기 균주는 7-8℃ 이하의 온도에서 대사 활성을 나타내지 않는 놀라운 특성을 갖는 반면, 적어도 7-8℃의 온도에서는 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제할 수 있다. 또한, 7-8℃ 이하의 온도에서 1-2주의 기간 동안, 상기 식품 또는 사료에서 상기 균주의 잠재적인 대사 활성 락트산 박테이라의 수는 2 소수 제곱 이하로 감소는 놀라운 특성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 목적은 냉장 하에서 제한된 기간 동안 보존할 수 있는 식품 및 사료의 보존을 위한 방어 배양균의 용도이다. 이는 본 발명에 따라 상기 방어 배양균으로 식품 및 사료를 처리하는 것과 관련되며, 상기 식품 또는 사료를 상기 방어 배양균과 접촉시킴으로서 상기 방어 배양균이 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제할 수 있다.
바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품 또는 사료는 본 발명에 의한 상기 방어 배양균으로 처리되는 바, 상기 방어 배양균을 상기 제품의 표면에 적용함으로서 처리하며, 바람직하게는 뿌리거나(spray) 비벼서(rubbing) 처리한다. 또 다른 일 실시예에 따라서, 상기 제품은 방어 배양균으로 처리되는 바, 상기 방어 배양균을 상기 제품에 혼합(mixing)하고/또는 휘저음(stirring)으로서 처리한다.
바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품 또는 사료는 상기 방어 배양균을 함유하는 분말 및 가능한한 적합한 캐리어로 처리된다. 적합한 캐리어는 예를 들어 사카라이드(saccharides), 바람직하게는 모노(mono) 또는 디사카라이드 (disaccharides)를 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에 따라서, 상기 식품 또는 사료는 상기 방어 배양균을 함유하는 액체 매질(liquid medium)로 처리된다. 상기 액체 매질은 처리되는 동안 상기 배양균의 생존 가능성을 보장하는 방식으로 고안된다.
특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 액체 매질은 생리학적으로 일반적인 소금물이나 식수와 같은 액체 매질이다.
바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품 또는 사료는 상기 식품 또는 사료의 표면적 g 또는 ml 또는 cm2당 락트산 박테리아 104-108의 양으로 처리며, 바람직하게는 표면적 g 또는 ml 또는 cm2당 락트산 박테리아 105-106의 양으로 처리된다.
바람직하게는 상기 처리를 하는 동안 상기 식품 또는 사료에 카본(carbon)원료가, 보다 바람직하게는 카본하이드레이트(carbonhydrate)가, 특히 바람직하게는 글루코스(glucose), 사카로스(saccharose) 또는 락토스(lactose)가 첨가된다.
바람직한 일 실시예에 따라서, 본 발명에 의한 상기 식품 또는 사료가 처리된 상기 방어 배양균은 상기 속, 종, 아종 및/또는 균주의 혼합물을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 식품 또는 사료가 본 발명에 의한 상기 방어 배양균을 함유하는 것을 포함한다. 상기 목적을 위하여, 상기 식품 또는 사료는 상기 설명된 실시예에 따라서 상기 방어 배양균으로 처리된다.
바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품 또는 사료는 육류 또는 육류 제품의 군에서 선택되고, 특히 바람직하게는 다음을 포함하는 군으로부터 선택된다:
- 상기 표면에 본 발명에 의한 방어 배양균을 적용함으로서 처리되는 포션 (portioned) 신선한 육류, 잔여 육류, 가금류 및 가금류의 부위.
- 본 발명에 의한 상기 방어 배양균을 적용함으로서 처리되는 카르카세스 (carcasses), 이의 부분, 이의 뼈가 없는 부위, 슬라이스(sliced) 소시지 (sausage), 요리된 슬라이스 소시지, 슬라이스 요리되거나 천연 보존 제품과 같은 슬라이스 냉동 육류 제품.
- 상기 표면에 본 발명에 의한 상기 방어 배양균을 적용하거나 휘저음으로서 처리되는 저민 고기(mince)(저민 스테이크, 찹 스테이크, 스테이크 타르타르 (tartar), 저민 포크, 찹 포크)와 같은 찹(chpo) 육류 제품, 저민 고기의 준비 또는 브라트부르스트(bratwurst)제품.
또한, 보다 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품 또는 사료는 상기 표면에 본 발명에 의한 상기 방어 배양균이 적용되거나 처리된 어류 및 어류 제품의 군으로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 미가공 어류(생선 필릿(fillet), 생선 스테이크), 냉동 슬라이스 제품과 같은 훈제 어류 또는 연체류 및 갑각류로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 보다 특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품은 델리카테션 샐러드(delicatessen salad)이다. 특히 바람직하게는 육류, 어류, 연체류, 갑각류 및 야채로 된 샐러드 또는 파스타로 된 샐러드로 구성된 군의 식품이고, 특히 바람직한 실시예에 따라서 상기 델리카테션 샐러드는 마요네즈, 샐러드-마요네즈 또는 리모울레이드(remoulade)로 만들어지고, 상기 각각의 델리카테션 샐러드는 본 발명에 의한 방어 배양균의 혼합이나 휘저음에 의해 처리되거나 상기 표면에 본 발명에 의한 상기 방어 배양균의 적용에 의해 처리된다.
또 다른 특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품은 선조리 즉석음식물 (pre-cooked ready meal)이다. 본 발명에서 의미하는 선조리 즉석음식물은 미리 조리되어 저장 및/또는 판매되는 음식물이다. 상기 음식물은 본 발명에 의한 상기 방어 배양균의 혼합/휘저음에 의해 처리되거나 상기 표면에 본 발명에 의한 상기 방어 배양균의 적용에 의해 처리된다.
또 다른 특히 바람직한 일 실시예에 따라서, 상기 식품은 유제품의 군으로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 미가공 우유, 요구르트, 쿼크(quark) 및 치즈로 구성된 군으로부터 선택된다.
그러므로, 본 발명은 1차적으로 적어도 7-8℃ 또는 그 이상의 온도에서 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아를 금지하는 유용한 방어 배양균을 만드는 한편, 7-8℃ 이하의 온도에서 대사 비활성을 나타낸다. 본 발명에 의한 방어 배양균은 인간 또는 동물용의 식품 또는 사료에 직접적으로 사용되며, 이는 소비자에게 병을 생기지 않기위해 냉장 하에서 제한된 기간 동안 보존된다.
본 발명은 하기 도면, 표 및 실시예를 이용하여 설명한다.
실시예 1
식품으로부터 락트산 박테리의 균주의 분리
균주를 모으기 위하여, 락트산 박테리아가 육류 제품으로부터 우선적으로 분리된다. 이는 상기 분리된 락트산 박테리아가 기질 "육류"에 적응되는 유기체이지를 검증하기 위함이다. 상기 분리는 완전한 세균종(flora)을 지배하는데 필수 요건이다. 그러므로, 상기 육류 제품은 분리전 48시간 동안 30℃에서 저장된다. 그리하여, 상기 락트산 박테리아 세균종은 샘플 상에 높은 세포 밀도로 지배 락트산 박테리아가 될 수 있다.
또한, 진공-팩 제품에 첨가되어 사용되는 느슨하게 밀착된 샘플의 경우에는 상기 세균들은 분리된 부분으로부터 전적으로 분리되며, 테스트 샘플의 내부로부터 살균된다.
5-10g의 무게를 갖는 상기 테스트 조각은 90ml의 살균 링겔스(Ringer's) 용액(Unipath GmbH, D-46467 Wesel, BR 52)에 있게 되고, 상기 화합물에 따라서 2분동안 13500 RPM의 Ultra-Turrax(T 225, JANKE & KUNKEL/Staufen)이나 10분 동안 Stomacher(LabBlender 400, SEWARD-MEDICAL/London)에서 안개 모양으로 되고 분산된다. 그러므로 상기 생성된 분산물로부터 살균 링걸스 용액의 9 ml내의 각 경우에서 연속적인 일련의 희석액이 생성된다. 상기 희석 단계 10-4-10-8로부터 각 경우의 100㎕이 Chalmer(변형된) 및 MRS 배양기(표 2의 배양기 참조)상에 뿌려진다. 상기 배양은 30℃의 무산소의 포트(pot)(Unipath, HP 11)에서 발생하고, 무산소 분위기는 혐기성 세균(AnaeroGen)(Unipath, AN 35)을 사용하여 형성한다.
3-4일 후에, 거시적 형태가의 기본이 다른 제품 당 5개의 콜로니의 최고치가 상기 배양기에서 제거된다.Chalmers 배양기의 경우에, 높은 할로우 직경(변색, 투명)으로 특징되는 콜로니들은 특별한 주의를 한다. 이는 강산 형성의 표시로 판단한다. 상기 제거된 배양균은 MRS 부로스(broth) 5 ml에 분산되고 48시간 동안 30℃에서 무산소에서 배양된다. 상기 2일의 배양 후에 뚜렷하게 흐린 것이 나타나면, 희박 점성이 Chalmers 및 MRS에 적용 된다. 배양(4일/30℃/무산소)에 따라서, 개별적 콜로니가 제거되므로 순수한 배양균이 다시 생성되어 MRS에서 배양된다. 상기 분리물은 냉동 표본으로서 상기 균주체내에서 위치한다. 표본을 생성하기 위하여, 상기 신선하게 배양된 순수 배양균은 MRS 배양기 상에 뿌려지고 이미 전술한 조건에 따라 배양된다. 4-5일 후에 상기 코팅(coating)된 박테리아는 카세인 펩톤-소이밀 펩톤(caseine peptone-soymeal peptone) 용액 USP(Unipath, CM 129) 1.5 ml로씻겨지고 살균한 우유 용액(Unipath, L 31)에서 유지를 걷어 낸다. 혼합 후에, 상기 박테리아 분산은 배양 튜브에 놓이고 -20℃에서 냉동 보관된다.
실시예 2
일반적 특성에 기초한 상기 분리된 락트산 박테리아 균주의 분류
상기 분리물은 배양기(MRS, Chalmers, Rogosa)에 따라서 성장 반응에 관하여 개략적으로 그램-반응(gram-reaction), 카탈라아제(catalase) 및 산화-발효를 기초로 하여 분류되고, 또한 이들의 형태의 현미경 및 현미경 평가에 기초하여 분류된다. 변형된 Chalmers 배양기(산에 의한 할로우 형성)상의 양성 그램 반응, 음성 카탈라아제, 발효성의 카본하드레이트 분석 및 콜로니 형태는 락트산 박테리아의 군에 속하는 상기 분리물을 만들게 하는 일반적인 특성으로 여겨진다(Baumgart, J. et al., loc. cit., 4.8장, p. 245 ff.). Rogosa 배양기 상의 성장 OF 테스트에서 글루코스(glucose)로부터 가스의 생성, 상기 현미경 이미지 및 성장 반응은 다른 측면에서, 이미 특정 속들에 속하는 징후가 제공된다(Baumgart, J. et al., loc. cit., 4.8장, p. 245 ff.).
그램 반응
그램 착색법은 미가공의 배양된 배양균에 이루어진다(표면 콜로니). 착색그램(ColorGram) 2 테스트 키트(kit)는 착색법에 사용된다(bioMerieux/ Marcy-l'Etoile, France). 각각의 경우에 상기 착색 반응, 그램-양성(바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)) 및 그램-음성(에스체리시아 코리(Eschericia coil)) 배양균은 동시에 처리된다.
카타라아제 테스트
실험되는 상기 분리물의 표면 콜로니는 희석 루프(loop)로 제거되고 3%의 H2O2용액으로 측면 상에 바르게 된다(박티덴트(Bactident) 카타라아제, Merck, 11351). 상기 카타라아제의 존재는 가스의 생성으로 나타난다.
산화-발효 테스트
Hugh, R.과 Leifson, E., J. Bact., 66: 24 ff. (1953)에 따른 OF 테스트는 상기 박테리아 분리물이 글루코스를 발효에 의해 산 및 가능한한 가스의 형성에 이용하는지 여부를 확실히하기 위하여 상기 박테리아 분리물을 이용한다. 카본 하이드레이트가 없는 OF-기저 배양기(Merck, 10282)가 테스트 재질로 사용되고, 여기에 오토클래브(autoclave) 후에 10%의 살균-여과된 글루코스 용액이 첨가된다. 접종 바늘로 이동된 상기 순수한 배양균은 각각의 경우에서 2개의 튜브에서 배양되고 스태빙(stabbing) 공정으로 유사한 배양기에 채워진다. 상기 2개의 튜브 중의 하나는 배양 후에 산소를 본존하기 위하여 살균한 파라핀 오일로 손가락 벙위로 씌워진다. 37℃에서 2-4일 동안 배양된 후, 발효성 글루코스를 사용하는 경우 앵 튜브에 브롬모티몰 블루(bromothymol blue) 지시약을 사용하여 변색을 관찰한다. 도한, 평가하는 동안 가스 형성(상기 배양기 컬럼 내에 거품 및/또는 공극) 및 유동성(채워진 배양기를 통해)이 고려된다.
분리물의 생물학적 식별
락트산 박테리아로 분류된 상기 분리물의 생화학적 식별은 지시 균주(bioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)와 소형화된 "api 50 CHL" 배양기를 사용하여 이루어진다. 상기 apl 50 CHL 시스템에서, 물질 대사는 49 카보하이드레이트를 사용하여 실험된다. 상기 생화학적 결과는 본 목적에 유용한 APILAB Plus 소프트웨어로 해석된다.
상기 식별된 분리물은 MRS 브로드내 냉동된 배양균으로부터 배양되고, 원심 분리되고, 그 후 링걸스 용액에 놓인다. 테스트에 필요한 접종물은 맥팔랜드 스탠다드 2.0(McFarland Standard 2.0, bioMerieux, 70900)을 이용하여 조절한다. 상기 테스트 세편의 마이크로-튜브는 100㎕의 세균 분산물로 접종되고, 살균 파라핀 오일로 씌워지고, 30℃에서 습기 챔버에서 배양된다. 상기 마이크로-튜브의 평가는 24 및 48 시간 후에 이루어지고, 브로모-크레졸 퍼플(bromo-cresol purple) 지시약이 발효에 의해 변화될 때 양성으로 판단한다.
실시예 3
상기 분리된 락트산 박테리아 균주의 성장 및 산패 활성의 측정
상기 락트산 박테리아의 분리물의 성장 특성의 기록은 Reuter, G., Archiv fur Lebensmittelhygiene, 12: 257 ff. (1970) 법을 사용하여 이루어진다. MRS 브로드는 배양기로 사용되고, 각각의 경우에 10ml 씩 테스트 튜브에 놓인다. 상기 배양 용액은 각각의 경우에 105세균을 배양한다. 테스트 온도는 배양 기간 동안 적용되는 온도로 6℃, 10℃, 15℃이다. 6℃에서 저장되는 샘플은 14일 후에 평가되고, 7일 후에 10℃이, 5일 후에 15℃ 샘플이 평가된다. 2주의 테스트 기간 후에, 6℃에서 저장되는 상기 샘플은 상기 배양균이 냉장 후에도 여전히 충분한 생명력을 갖는 지를 측정하기 위하여 24시간 동안 22℃에서 배양된다.
상기 테스트 기간 후에, 세균의 증식은 브로드의 흐림(clouding) 또는 침전물에 기초하여 확인한다. 더 나아가, 상기 매양 용액의 pH가 상기 분리물의 산패 활성을 탐지하기 위하여 측정된다. 6℃에서 성장/산패를 나타내지 않는 배양균은 양성으로 판단된다. 한편, 15℃에서 별도의 증식이 이루어지며, 상기 배양 용액의 pH 는 5.0 이하여야 한다.
실시예 4
락트산 박테리아 배양균 L. 락티스 아종 락티스 1526의 특성
균주 명칭으로 락토코스 락키스 락키스 1526(Lactococcus lactis subsp.lactis 1526)으로 된 락트산 박테리아 배양균은 실시예 1 및 3에 따라서 진공팩 슬라이스 소시지로부터 홍콩에서 분리된다. 30℃에서 무산소 조간하의 상기 배양균의 표면 성장은 de Man, Rogosa 및 Sharpe(MRS)에 따른 배양기 및 Chalmers(변형된)에 따른 배양기에 의한다. MRS 배양기 상에서, 30℃에서 3일간 배양한 후에 상기 배양균은 할로우 직경 > 1mm 인 부드러운 원형 콜로니를 나타낸다. Chalmers에 따른 배양기에서, 상기 알려진 할로우 형성과 구별되는 형성된 콜로니는 강산의 형성을 나타낸다.락토밝시리의 선택적 분리를 나타내는 Rogosa 배양기에서의 성장은 반대로 매우 약하다.
상기 현미경의 형태는 다른 배양 조건으로 매우 다양하다. "코코이드 (coccoid)"에서부터 "짧은 막대"에 까지 다양하며 하나의 표본에 양 쪽 형태가 나타나는 것이 가능하다. 상기 세균은 지배적으로는 체인으로 나타나고 때때로 쌍(pairs)으로도 나타난다. 상기 배양균은 냉동-배양 공정에 따라 배양될 때 훌륭한 생명력을 나타낸다. 109 KbE/ml 이상의 세균 밀도가 30℃에서 24시간 후에 배양 브로드(MRS 브로드)에서 이루어진다.
1차 선택된 분류군으로서 "락토코쿠스 락티스 아종 락티스" 종을 생성한 bioMerieux부터 api 50CH 급속 테스트를 이용한 생화학적 식별은 98.4%의 식별을 한다. Deutsch Sammlung von Mikrooragnismen und Zellkulturen GmbH in Brunswick에 의해 이루어진 DNA 염기서열은 생화학적 식별을 확인한다. 16s rDNA 서열과 가장 큰 다양성을 가진 범위의 서열과의 유사성 실험은 락토코쿠스 락티스 아종 락티스와 99.3%의 일치를 나타낸다. 글루코스 발효된 최종 제품은 L(+)- 형태의 락트산이다. 락트산염(ractate)은 다른 것, 글루코스, 프럭토스(fructose), 마노스(mannose), 락토스(lactose) 중에서 뿐만 아니라 리보오스(ribose), 트레할로스(trehalose) 및 사카로스(saccharose)로부터 형성된다.
실시예 5
세포 밀도의 측정
세포 밀도는 J. Baumgart, w. in Heeschen, (Hrsg): 식품 위생학 핸드북. Hamburg: Behr's l ff., (1994)에서 설명된 방법에 따라 측정된다. 실험된(20g)되는 샘플은 플랫폼-형태의 균형으로 스토마커 백(stomacher bag) 안에서 살균 링거스 용액 80 ml 로 더해진다. 균질화는 백-압축 장치(Stomacher 400)로 이루어진다. 상기 평균 작동 속도에서, 상기 균질화 시간은 10분으로 , Baumgart의 권고와는 달리 상기 균질화 시간의 최고치는 문헌에서 제안된 60초는 상기 식품을 실험하기에는 불충분함이 증명되었다.
상기 균질화된 샘플로부터 1 ml가 옮겨지고 링거스 용액 9 ml가 피펫으로 옮겨진다. 샘플의 소수 희석물의 총 수는 예상되는 세균의 수에 기초한다. 상기 개별적 희석 단계에서부터, 100 ㎕이 표면 배양균에 옮겨지고 또한 1 ml가 공급 배양균에 옮겨지고 관련 방법에 따라서 배양기 상에 뿌려지고 또한 아직 용액인 상기 배양기에 혼합된다. 세균의 각 군에 사용되는 배양기 및 이와 관련된 배양 조건이 실시예 6 및 7에 나타나 있다.
각 세균-수 측정을 위하여, 적어도 2개의 샘플이 사용되고, 각각은 2회의 희석이 이루어진다. 각 테스트 침전물에서 확인된 세균의 수로부터, 상기 세균 밀도가 산술 평균으로 결정된다. 만일 동일한 실험 침전물에서 세균 밀도가 log 1 이상(:log KbEtest1- KbEtest2: > 1)으로 다르게 나타나는 경우, 상기 테스트는 반복되어야 한다.
실시예 6
위생학적으로 위험이 존재하는 세균의 배양
위생학적으로 위험이 존재하는 냉동-배양된 세균의 배양은 24시간 이상 이루어지고 각각의 경우에 100 ml의 카세인 펩톤-소이밀 펩톤 용액 USP(Unipath, CM 129)가 이루어진다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 클로스트리디움 보투리눔(Clostridium botulinum)은 30℃에서 배양되고, 스타필로코쿠스 마우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 프레프링겐스(Clostridium prefringens) 및 각 살모넬라 군주는 37℃에서 배양된다. 상기 클로스트리디움 프레프링겐스(Clostridium prefringens)의 배양은 무산소 조건에서 이루어진다. 위생학적으로 위험이 존재하는 세균으로서 사용되는 테스트 세균의 세균 수 측정을 위한 사용되는 방법, 방법론 및 배양 조건은 표 1에 나타나 있다.
실험 미생물 배양기 방법 배양 조건 (온도/시간/분위기)
Staphylococcus aureus(DSM 346) Baird-Parker 배양기 주입판(pouring plate)법 37℃/24-48h/산소분위기
Salmonella1) Gassner 배양기/브라이언트 그린 페놀-락토스-나카로스-agar.mod. 스파툴라(spatula)법 37℃/24-48h/산소분위기
Bacillus cereus Bacillus cereus 선택 배양기 스파툴라법 37℃/24-48h/산소분위기
Clostridium perfringens(DSM 756 A형) OPSP 선택 배양기 주입판법 37℃/18-24h/무산소분위기
1)살모엘로루스를 위해 국가자료국의 다음의 살모넬라가 사용된다: 살모넬라 엔텔티디스(Samonella enteritidis, 3e 125/94 Lysotype 8/7, Se 203/94 Lysotype 8?7, Se 315/94 Lysotype 4/6), 살모넬라 파나마(Samonella panama, SZ 1107/93, SZ 1249/93, SZ 2365/93), 살모넬라 키피무리움(Salmonella typhimurium, SZ 218/94, SZ 235/94, SZ 284/94)
실시예 7
락트산 박테리아 균주의 배양
실시예 1에서3에서 양성으로 분류되는 락트산 박테리아의 균주는 실험 시작에서 배양되며, 각 경우에 24시간 동안 10 ml MRS 브로드(Unipath, CM 359)에서 30℃로 배양된다. 최고 10일 동안 냉장 저장한 후에, 100 ㎕의 박테리아 현탁액은 배양 브로드에서 옮겨지고 새로운 배양을 위하여 10 ml MRS 배양 용액이 들어온다. 상기 2차 배양(30℃/24시간) 후에, 상기 박테리아 매스(mass)는 8,000 RPM에서 10분(Biofuge 28RS, HERAEUS SEPATHEC/Osterode) 동안 원심 분리된다. 상기 부유물은 버려지고 상기 침전물은 살균 링거스 용액과 동일한 양으로 분산된다. 상기 세포 현탁물은 다시 동일한 조건 하에서 원심 분리되고, 상기 부유물은 제거되고 다시 살균한 링거스 용액과 동일한 양으로 대체된다. 그러므로, 상기 정제된 배양균은 사용될 때까지 냉장(6℃, 최고 7일) 조건하에서 저장되고 세균 밀도를 측정한 후에 소시지 샘플에 첨가된다.
상기 세균을 측정 및/또는 세균을 탐지기 위하여, 변형된 Chalmers 배양기가 사용된다. 부어진 배양균은 희석물로 처리되고 30℃에서 3-5일 동안 배양된다.
1)변형된 Chalmers에 따른 배양기
락트산 박테리아의 콜로니-수 측정을 위하여, Chalmers에 따른 선택 배양기가 사용되고 Vanos V. 및 Cox L. 식품 미생물. 3: 233 ff. (1986)에 따라 변형된 구성으로 사용된다:
락토오스(Lactose) 20.0g
글루코스(Glucose) 20.0g
소야-펩톤(Soya-peptone) 3.0g
육류 추출물 3.0g
탄산 칼슘 20.0g
아가르(Agar) 15.0g
천연 레드(red) 0.5 ml(1%)
아쿠아(Aqua) dest. ad 1.0 l
오토그래이브(121.1℃/15분) 후에 1 ml의 살균-여과된 폴리믹신-B-술페이트 (polymixin - S-sulphate)가 ca. 45℃로 냉장된 배양기에 첨가된다.
상기 배양기으 선택성은 pH 4.0에서 10% 락트산 용액으로 산패(souring)함으로서 증가된다.
실시예 8
락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526 (Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)을 이용한 진공팩슬라이스 소시지 내에서 독소발생 내지 독소감염 세균 억제
방어 배양의 가장 중요한 요구사항은 올바르게 냉동시키지 않았을 때 식품의 위생적인 보호이다. 그러므로, 본 발명에 따라 사용된 박테리아는 독소발생 내지 독소감염 박테리아에 대항하여 충분히 작용할 것이고, 그 결과 어떠한 증식 내지 독소형성을 분명히 억제할 것이다. 실시예 1∼4에 기술된 실험의 결과는 박테리아가 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526 (Lactococcus lactis subsp. lactis 1526) 계통에 속하고 이러한 기능을 추정할 수 있었음을 보여준다. 계속되는 실험들에서, 이는 상반효과 또한 소시지의 잘려진 표면상에서 얻을 수 있는지 여부가 그 결과로 인해 명백하게 될 것이다. 소시지는 동일 기술 분야에서 알려진 방법으로 생산되었다(소시지 생산에 관한 논문: A. Fisher: 생산관련 기술-육류 생산물의 가공: O. Prandl, A. Fisher, T. Schmidhofer, H. -J. Sinell (HRSG.): 육류 - 생산 및 공정에서 기술 및 위생. Stuttgart: Ulmer, 1988, P. 505 ff.).
상기 실험들은 실제 상황 하에서 실행되었다. 얼룩오염의 모의실험을 하기 위하여, 병원성 세균을 가진 분산물을 상기 자른 표면에 바른 후 스파툴라(spatula)에 퍼지게 하였다. 논문에 언급된 것과 같이(Schmidt, U. and Gaedill, E., 육류 연구를 위한 연방 학술회 의 연감 보고서, S.C. 25 (1986)), 절단 기계를 거친 소시지의 오염은 매우 고르지 않은 분포상태을 유도하였으며, 칼날로 대부분의 세균을 이미 긁어내고 떨어져, 실험 세균들이 전혀 나타나지 않은 곳인, 특히 그 가장자리에 비교적 커다란 범위(> 1㎤)의 검출이 생겼었다.
그리고 나서, 방어 배양은 압축 공기를 사용하는 분무 노즐을 통해 적용되었다. 세균 분산물의 분무는 표면 위에 고른 세균의 분포를 유도하였다. 방어 배양의 고른 분포만이 표면 전체에 최적의 억제 효과를 낼 수 있다. 약간의 병원 세균이 포장 필름에 점착하는 것을 방지하는 것과 그렇게 검출되지 않게 하였기 때문에, 그 외에 소시지의 슬라이스는 각 케이스에 오염된 슬라이스의 윗면에 위치하게 되었다. 상기 샘플들은 진공-포장되고 난 후 대응 온도에서 저장되었다. 상기 표면은 미생물학 실험을 위하여 결정적으로 중요하기 때문에, 상기 세균 밀도들은 상기 표면에 비례하여 다음의 실험들에 표시되었다[KbE/㎤].
도 1은 6℃에서 3주간의 냉동 저장하고 그 다음 모의 실험된 냉장 순환 장애(48h/22°C) 중에 진공팩 슬라이스 소시지에서 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526 (Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)의 반응을 보여준다.
A) 살모넬라 풀(pool)의 억제
만일 필요한 냉장 온도가 유지되지 않는다면 살모넬라는 매우 급속히 증식한다. 상기 락트산 박테리아 분리물의 관찰은 특히 살모넬라에 대하여 항균 효과에 적응되어야 한다. 상기 c-소스 응축의 억제 의존성 및 상기 방어 배양균의 소윙(sowing) 밀도는 상기 락트산 박테리아 배양균의 다양한 접종 밀도 및 다양한 글루코스 응축으로 살모넬라 풀(9개의 미가공 균주를 구성, 표 1참조) 상에 L. lactis subsp. lactis 1526 의 억제 효과를 확립함으로서 진공팩 슬라이스 소시지에서 실험된다.
미가공 소시지 샘플은 총 4.4X104의 살모넬라로 "얼룩-감염(smear-infect)" 되며, 이는 정확한 살모넬라 밀도 700 KbE/cm2에 따라서 70%f의 회복율을 나타내는 접종 밀도로 실험된다. 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)은 106KbE/cm2의 밀도로 뿌려진다. 0.7 mg/cm2의 글루코스 밀도가 상기 방어 배양균 현탁물에 뿌려진다. 바람직한 상기 락토코시(lactococci)의 밀도는 106KbE/cm2로 거의 이루어진다(1.1X106KbE/cm2). 상기 뿌려진 슬라이스는 다른 슬라이스 및 진공팩으로 씌어진다. 그 후 상기 샘플들은 6℃에서 냉장 인큐베이터(incubator)에 저장된다. 14일 후에 상기 온도는 상기 냉장 순환에 장애를 일으키기 위하여 22℃로 증가한다.
6℃에서 냉장 저장을 하는 동안, 상기 살모넬라의 세균 밀도 및 방어 배양균 및 pH 수치는 미약하게 변한다(도 2). 상기 온도가 22℃로 증가한 후에 예상되는 것은 상기 방어 배양균 없이 상기 샘플에 살모넬라 세균의 수가 증가하는 것이다. 이와는 대조적으로, 상기 방어 배양균을 갖는 샘플은 명확히 산패된다. 24시간 후에, 표면 pH 는 이미 4.72이다. 상기 살모넬라는 이에 의해 매우 명확히 억제되었다. 최초 24시간 동안에는 170 KbE/cm2에서 9006KbE/cm2까지 정도의 세균수 증가가 약간 일어난다. 24시간이 더 지난후에는 270 KbE/cm2이 탐지된다. 그러므로 상기 세균수는 700 KbE/cm2의 접종 밀도 이하이다(도 2 참조).
더 설명될 실험은 냉장 순화에 장애을 일으키기 위하여 22℃의 온도에서 이루어진다. 상기 필요한 냉장 온도가 7℃를 초과하는 경우, 미생물의 위생학적 위험이 또한 발생한다. 그러므로, 10℃에서 더 많은 조사가 이루어진다. 이러한 테스트에서, 상기 살모넬라의 바람직한 접종 밀도는 103/cm2이고; 확인되는 정확한 밀도는 1.36X106KbE/cm2이다. 상기 락토코시는 103 KbE/cm2의 세균 밀도로 접종된다(도 3). 또한 0.7 mg/cm2글루코스가 적용된다.
도 3은 상기 방어 배양균의 산패 활성 및 방어 배양균이 있고 없는 샘플에서의 상기 살모넬라의 성장 특성을 나타낸 것이다. 상기 방어 배양균이 없는 살모넬라의 개체군수는 금속히 증식될 수 있다. 상기 방어 배양균이 있는 샘플에서, 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)은 이미 7일째 5.9X107KbE/cm2의 최고 세균수에 도달한다; 본 실험이 더 진행하면 상기 세균의 수는 약간 감소한다. 처을 1주일 동안, 상기 pH는 확연히 감소한다. 7일째에는 상기 표면에서 평균 5.02 수치가 측정되고, 14일 후에는 4.76이 된다. 상기 방어 배양균이 존재할 때, 10℃에서 저장되는 동안 상기 살모넬라는 다만 적게 증식할 수 있디. 14일째, 살모넬라 세균수는 단지 6.1X103 KbE/cm2가 측정된다. 14일 이후의 저장 온도는 22℃로 증가된다. 그러나, 상기 살모넬라는 상기 락토코시의지배력으로 인해 더 이상 증식할 수 없다.
B)스태필로코쿠스 아우에우스(Staphylococcus aureus)의 억제
락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)의 길항적인 효과를 조사하기 위한 테스트는 살모넬라와 A)에서 설명된 테스트의 방법에 따라서 이루어진다. 상기 테스트 결과 도 4에 나타나 있다. 도 4는 냉장에 장애가 된 경우 명확하게 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)가 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 성장을 상당히 감소시킬 수 있다.
C)바실루스 세레우스(Bacollus cereus)의 억제
락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)의 길항적인 효과를 조사하기 위한 테스트는 살모넬라와 A)에서 설명된 테스트의 방법에 따라서 이루어진다. 상기 테스트 결과 도 5에 나타나 있다. 도 5는 냉장에 장애가 된 경우 명확하게 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)가 바실루스 세레우스(Bacollus cereus)의 성장을 상당히 감소시킬 수 있다.
D)크로스트리디움 펄프링겐스(Clostridium perfringens)
락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis1526)의 길항적인 효과를 조사하기 위한 테스트는 살모넬라와 A)에서 설명된 테스트의 방법에 따라서 이루어진다. 또한 0.5%의 글루코누-델타-락톤(glucono-delta-lacton, W/N)은 상기 방어 배양균에 첨가도니다. 상기 테스트 결과 도 6에 나타나 있다. 도 5는 명확하게 냉장에 장애가 된 경우 글루코누-델타-락톤, 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526(Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)의 존재가 크로스트리디움 펄프링겐스(Clostridium perfringens)의 성장을 상당히 감소시킬 수 있다.
본 발명은 1차적으로 적어도 7-8℃ 또는 그 이상의 온도에서 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아를 금지하는 유용한 방어 배양균을 만드는 한편, 7-8℃ 이하의 온도에서 대사 비활성을 나타낸다. 본 발명에 의한 방어 배양균은 인간 또는 동물용의 식품 또는 사료에 직접적으로 사용되며, 이는 소비자에게 병을 생기지 않기 위해 냉장 하에서 제한된 기간 동안 보존된다.

Claims (15)

  1. 냉장 하에서 제한된 기간 동안 보존되는 식품 또는 사료를 저장하기 위한 방어 배양균에 있어서,
    상기 방어 배양균은 다음을 특성을 갖는 비병원성 락트산(lactic acid) 박테리아를 포함하는바:
    a) 7℃에서 8℃ 이하의 온도에서, 상기 락트산 박테리아는 대사 활성을 나타내지 않고;
    b) 7℃에서 8℃ 이하의 온도에서 1주에서 2주일 기간 이상, 잠재적 대사 활성인 상기 락트산 박테리아의 수는 2 소수 제곱(decimal power)이하로 감소하고; 및
    c) 적어도 7℃에서 8℃의 온도에서, 상기 락트산 박테리아는 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  2. 제1항에 있어서, 상기 상기 락트산 박테리아는 페디오코쿠스(Pediococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 루코노스토크(Leuconostoc), 웨셀라(Weissella), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 및/또는 락토코쿠스(Lactococcus)의 속 들(genera)에 속하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  3. 제2항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 락토코쿠스(Lactococcus) 속(genus)에 속하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  4. 제3항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코쿠스 가리비에(Lactococcus garvieae), 락토코쿠스 피시움(Lactococcus piscium), 락토코쿠스 플랜타룸(Lactococcus plantarum) 및/또는 락토코쿠스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis)의 종(specie) 들이 속하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  5. 제4항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 종에 속하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  6. 제5항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 락토코쿠스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris) 및/또는 락토코쿠스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) 의 아종(subspecie)에 속하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  7. 제6항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 락토코쿠스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis)의 아종에 속하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  8. 제7항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526 (Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)(DMS 12415)의 균주에 속하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 적어도 7-8℃의 온도에서 유기산을 생성함으로서 독소 발생 및/또는 독소-감염 박테리아의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락트산 박테리아는 적어도 7-8℃ 또는 그 이상의 온도에서 인식 가능한 대사 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도는 7℃인 것을 특징으로 하는 방어 배양균.
  12. 상기 락트산 박테리아는 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 1526 (Lactococcus lactis subsp. lactis 1526)(DMS 12415)의 균주에 속하는 것을 특징으로 하는 락트산 박테리아.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 냉장 하에서 제한된 기간 동안 보존될 식품 또는 사료의 보존을 위한 방어 배양균의 용도.
  14. 제1항 내지 제11항에 있어서, 상기 방어 배양균을 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 사료.
  15. 제14항에 있어서, 상기 식품은 육류 또는 육류 제품, 어류 또는 어류 제품,델리카테션 샐러드(delicatessen salads) 및 선조리 즉석음식물(pre-cooked ready meals)로 구성되는 군에 속하는 것을 특징으로 하는 식품.
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