ES2232436T5 - Nuevos cultivos protectores y su utilizacion para la conservacion de alimentos o piensos. - Google Patents

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Abstract

Cultivos protectores para la conservación de alimentos o piensos con una conservabilidad limitada bajo refrigeración, caracterizados porque comprenden bacterias ácido lácticas no patogénicas que presentan las características siguientes: a) las bacterias ácido lácticas no presentan una actividad metabólica detectable sensorialmente por debajo de 7ºC, ni una actividad acidificadora ni de crecimiento; b) el número de bacterias ácido lácticas con un metabolismo potencialmente activo disminuye por debajo de 7ºC durante un periodo de tiempo de una a dos semanas en menos de dos potencias de diez; y c) las bacterias ácido lácticas inhiben a temperaturas de por lo menos 7ºC el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas, y porque las bacterias ácido lácticas pertenecen a la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 (DSM 12415).

Description

Nuevos cultivos protectores y su utilización para la conservación de alimentos o piensos.
La presente invención se refiere a la utilización de cultivos protectores para la conservación de alimentos o piensos durante su almacenamiento a temperaturas por debajo de 7ºC, conteniendo dichos cultivos protectores bacterias ácido lácticas no patogénicas. Los cultivos protectores son capaces de inhibir el crecimiento de bacterias peligrosas para el consumidor en el caso de interrumpirse la cadena de refrigeración o de no observarse la temperatura de refrigeración prescrita. La invención se refiere asimismo a alimentos o piensos susceptibles de ser obtenidos mediante dicha utilización así como a cultivos protectores que contienen bacterias ácido lácticas que pertenecen a la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 (DSM 12415).
Alimentos o piensos determinados, tales como por ejemplo varios productos de carne, deben almacenarse hasta el momento de consumirse o de preparase por el consumidor en un lugar frío, es decir, a temperaturas por debajo de 7ºC a 8ºC, para mantener su comestibilidad. En dicho grupo de alimentos o piensos, que por lo tanto se conservan bajo refrigeración sólo durante un periodo limitado, no puede excluirse, incluso cuando se utiliza una práctica de producción cuidadosa, que, a través de materia prima contaminada o de una contaminación de precursores individuales del producto o del producto final, se produzcan en el alimento o pienso bacterias peligrosas para el consumidor.
Las bacterias que son peligrosas para el consumidor en el sentido de la invención son las bacterias que puedan iniciar una intoxicación alimentaria por bacterias. Entre dichas bacterias se incluyen por un lado bacterias toxinogénicas, que pueden formar toxinas ya en el alimento o pienso. El consumo del alimento o pienso cargado con toxinas puede dar lugar a infecciones por toxina, es decir, a una enfermedad. Por otro lado, las intoxicaciones alimentarias por bacterias pueden ser causadas por bacterias toxiinfecciosas, que pueden multiplicarse en los alimentos o piensos y llegar de esta forma como consecuencia del consumo al tracto gastrointestinal (G. Seidel y J. Kiesewalter: Bakterielle Lebensmittelinfektionen und -intoxikationen. Berlín: Akademie Verlag, 1992).
La mayoría de las intoxicaciones alimentarias causadas por las bacterias se producen sólo cuando los agentes patogénicos alcancen densidades de gérmenes relativamente altas en el alimento o pienso consumido (J. Krämer: Lebensmittel-Mikrobiologie. Stuttgart: Ulmer, 1987). Un exceso de la dosis de infección (cantidad mínima de germen de un agente patogénico necesaria para causar una enfermedad) normalmente se produce en los alimentos o piensos si tiene lugar una interrupción de la cadena de refrigeración o si no se observa la temperatura de refrigeración prescrita. En este contexto, es particularmente crítico que la dosis de infección pueda ser superada por las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas sin que se perciba un cambio sensorial del alimento o pienso. Por tanto, es deseable disponer de agentes capaces de inhibir el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas en los alimentos o piensos en el caso de una interrupción de la cadena de refrigeración o de una no observación de la temperatura de refrigeración prescrita.
Una inhibición del crecimiento satisfactoria para el consumidor, es decir, una reducción de la tasa de crecimiento de dichas bacterias peligrosas, no se ha conseguido en el estado de la técnica hasta la actualidad a pesar de un gran número de propuestas.
Es cierto que en la actualidad puede inhibirse en casi todos los alimentos el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas por medio de una multitud de aditivos químicos (ver Directiva UE, No. 95/2/CE del 20/2/1995) o por tratamientos físicos (aplicación de calor, rayos ultravioletas, rayos ionizantes, etc.). Sin embargo, la aceptación de dichas medidas por parte del consumidor va reduciéndose. Entre las razones de esto se incluye entre otras el potencial causante de alergias de muchos aditivos. Además, no puede excluirse la posibilidad de que los conservantes se metabolizen en los alimentos o en vivo formando sustancias tóxicas (H.-G. Classen, P. S. Elias y W. P. Hammes: Toxikologisch-hygienische Beurteilung von Lebensmittelinhalts-und-zusatzstoffen sowie bedenklicher Verunreinigungen; Berlín y Hamburgo: Verlag Paul Parey, 1987).
Un ejemplo de ello es la salazón de productos de carne, en el que se adiciona a los alimentos nitrito en forma de salmuera de nitrito. Lo arriesgado de este método desde el punto de vista toxicológico no es tanto la toxicidad aguda del nitrito sino más bien la formación posible de nitrosaminas carcinogénicas en el alimento o incluso en vivo (H. Druckery, R. Preussmann, S. Ivankovic, D. Schmähl: Organotrope karzinogene Wirkungen bei 65 verschiedenen N-Nitroso-Verbindungen in BD-Ratten, Krebsforschung 69, 1967, p. 102 y siguientes). Por tanto, sería extremadamente deseable prescindir de o reducir la adición de nitrito. No obstante, en el estado de la técnica "no cabe duda que prescindir completamente de la utilización de salmuera - y sin la utilización de otros conservantes que tampoco serían seguros - aumentaría el riesgo de que se estropeen los productos a causa de bacterias y con ello el riesgo para la salud del consumidor" (K. Hofmann: Nitrat und seine Folgen in Lebensmitteln tierischer Herkunft. ADI-Verbraucherdienst 31, 1986, p. 98).
La demanda cada vez mayor de alimentos "en su estado natural" y "libres de química" tiene por resultado que, en caso de los alimentos y piensos conservables durante un periodo limitado sólo por refrigeración, el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas puede evitarse en muchos casos sólo por medio de la refrigeración. Si no se observa dicha medida de seguridad, es decir, si la cadena de refrigeración se ve interrumpida o la temperatura de refrigeración necesaria no se observa, el consumidor se ve sometido al riesgo de una intoxicación alimentaria.
Dicho riesgo podría combatirse utilizando métodos biológicos. Bacterias determinadas, entre ellas las bacterias ácido lácticas, son básicamente capaces de inhibir el crecimiento de otras bacterias mediante la producción de un gran número de productos de metabolismo (S.E. Lindgren y W.J. Dobrogosz, FEMS Microbiology Reviews 87:149-173 (1990); H. Asperger Österreichische Milchwirtschaft 41:1-22 (1986) Beilage 1 zu Heft 4 (Suplemento 1 para número 4).
Sin embargo, una utilización de bacterias ácido lácticas satisfactoria para el consumidor, es decir, para la inhibición del crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas sólo es posible si las bacterias utilizadas cumplen los requerimientos rígidos citados a continuación:
1.
El requisito básico es la seguridad referente a la salud, es decir, las bacterias utilizadas deben poseer un estado GRAS (GRAS: Generally Recognised As Safe; ver Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, EE.UU: "Substances generally recognized as safe; Proposed Rule" (documento nº 97N-0103), Federal Register Part III; Vol. 62, 1997).
2.
Las bacterias utilizadas no deben desarrollar ninguna actividad metabólica a la temperatura de refrigeración, que pueda afectar al consumidor de forma negativa desde el punto de vista sensorial (por ejemplo acidificación, influencia del color, etc.).
3.
Además, durante el almacenamiento refrigerante deben mantenerse en el cultivo protector durante todo el periodo de tiempo un suficiente número de bacterias con un metabolismo potencialmente activo, con el fin de asegurar que el cultivo protector es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas incluso hacia el final del tiempo de almacenamiento en el caso de un aumento de la temperatura. Por bacterias con un metabolismo potencialmente activo se entienden las que presentan una actividad metabólica en el caso eventual de un aumento de temperatura.
4.
Las bacterias utilizadas deben inhibir el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas en el intervalo de temperatura de por lo menos 7ºC y más. Incluso en el caso de un aumento rápido de temperatura, tal como cuando se interrumpe la cadena de refrigeración, deben ser capaces por ejemplo de inhibir las bacterias de la familia Enterobacteriaceae (por ejemplo salmonelas) que se imponen muy rápidamente en estas condiciones. Además, el cultivo protector utilizado debe ser capaz de suprimir una ancha banda de diferentes bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias utilizadas en el estado de la técnica hasta la actualidad para la conservación de alimentos no cumplen dichos requerimientos.
En una parte de las bacterias utilizadas en el estado de la técnica, el efecto inhibidor radica en la formación de proteínas o de complejos de proteínas antagonistas, las denominadas bacteriocinas, las cuales son fabricadas por las bacterias selectivamente para la supresión de otras bacterias determinadas (Nettles y Barefoot, Journal of Food Protection 6:338 y siguientes (1993)). Dichas bacteriocinas presentan una actividad antibacteriana contra especies estrechamente relacionadas (Tagg et al. (Bacteriological Reviews 40:722-756, 1976)). Por tanto, las bacteriocinas conocidas en el estado de la técnica sólo permiten inhibir una gama de bacterias muy limitada, limitándose las mismas en su mayor parte a las bacterias grampositivas (L. de Vuyst y E.J. Vandamme; Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Londres, Glasgow, Nueva York, Tokyo, Melbourne, Madras; Blackie Academic & Professional, 1994). La utilización de cultivos formadores de bacteriocinas es problemática por el hecho de que las bacteriocinas presenten a menudo una estabilidad insuficiente en los alimentos y se produzcan en los alimentos a menudo a bajas tasas de síntesis y de que puedan producirse cepas que son resistentes a las bacteriocinas (F.K. Lücke, Deutsche Milchwirtschaft 16:729 y siguientes, 1994).
Otras bacterias utilizadas en el estado de la técnica ya presentan una actividad metabólica durante el almacenamiento de refrigeración, es decir, por debajo de 7ºC, y por tanto no pueden utilizarse como cultivo protector en el sentido de la invención (Tanaka, N., et al., Journal of Food Protection 48:679 y siguientes (1985); Schmidt, U., Fleischwirtsch., 75:24 y siguientes (1995); Collins-Thompson, D.L., et al., Journal of Food Protection 45:305 y siguientes (1982); Andersen, L., Fleischwirtsch. 75:705-712 (1995)). Además, dichas bacterias conocidas y ya investigadas con relación a su utilización como cultivo protector presentan un efecto inhibidor contra sólo pocas bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas y por tanto no son capaces de inhibir una amplia gama de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas contenidas en los alimentos y piensos.
La patente US nº 4.894.243 describe un procedimiento mediante el cual se pretende conservar leche tratada en caliente. Para conseguir dicho objetivo, se ha propuesto adicionar a la leche bacterias ácido lácticas en baja concentración. Cuando se interrumpe la cadena de refrigeración, las espuelas que permanecen en la leche incluso tras el tratamiento en caliente y las bacterias ácido lácticas pueden crecer. El sabor ácido producido por el crecimiento de las bacterias ácido lácticas indica al consumidor que la leche ya no es consumible.
Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar cultivos protectores que permitan una protección contra las bacterias toxinogénicas bajo los criterios citados anteriormente, por lo cual su utilización en los alimentos y piensos es segura. Otro objetivo de la invención es proporcionar alimentos que contienen los cultivos protectores.
Con el fin de alcanzar dicho objetivo, se han propuesto nuevos cultivos protectores que comprenden bacterias ácido lácticas de la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 (DSM 12415) y están previstas para el tratamiento de alimentos y piensos. Los cultivos protectores según la invención comprenden bacterias no patogénicas que producen ácido láctico (bacterias ácido lácticas) que presentan las características sorprendentes de no poseer una actividad metabólica al observarse la temperatura de refrigeración, pero de poder inhibir, al interrumpirse la cadena de refrigeración o al no observarse la temperatura de refrigeración, el crecimiento de un gran número de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas mediante la producción de productos metabólicos. Además, el número de bacterias ácido lácticas en los alimentos y piensos se mantiene aproximadamente constante durante el tiempo de almacenamiento, lo cual permite una inhibición del crecimiento de las bacterias peligrosas incluso hacia el final del tiempo de almacenamiento. Por tanto, la utilización de los cultivos protectores según la invención permite proteger el consumidor contra un gran número de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas, tales como por ejemplo salmonelas.
La invención se refiere asimismo a la utilización de cultivos protectores para la conservación de alimentos y piensos, que pueden conservarse durante un tiempo limitado por refrigeración, estando los cultivos protectores caracterizados porque comprenden bacterias ácido lácticas no patogénicos que presentan las características siguientes:
a)
las bacterias ácido lácticas no presentan una actividad metabólica detectable sensorialmente por debajo de 7ºC, ni una actividad acidificadora o de crecimiento;
b)
el número de bacterias ácido lácticas con un metabolismo potencialmente activo disminuye por debajo de 7ºC durante un periodo de tiempo de una a dos semanas en menos de dos potencias de diez; y
c)
las bacterias ácido lácticas inhiben a temperaturas de por lo menos 7ºC el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas, incluyéndose entre dichas bacterias Staphylococcus aureus, salmonelas, cepas de E. coli humanopatogénicas (EIEC, ETEC, EPEC, EHEC), Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila, Camphylobacter jejuni, Bacillus cereus, Clostridium perfringens y Clostridium botulinum, pudiendo multiplicarse las bacterias ácido lácticas a 15ºC, siendo inhibido el crecimiento de bacterias toxiinfecciosas y/o toxinogénicas de tal manera que su número aumenta en 48 h no más de dos potencias de diez, y pudiendo inhibir las bacterias ácido lácticas el crecimiento de bacterias toxiinfecciosas y/o toxinogénicas a través de la producción de ácidos
\quad
durante el almacenamiento a temperaturas por debajo de 7ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Según una forma de realización preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan cultivos protectores que comprenden bacterias ácido lácticas de las especies Lactococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Weissella, Bifidobacterium, Enterococcus y/o Sporolactobacillus o mezclas de las mismas. Según una forma de realización particularmente preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan cultivos protectores que comprenden bacterias ácido lácticas de las especies Lactococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus o Weissella o mezlas de las mismas y según una forma de realización especialmente preferida se utilizan bacterias ácido lácticas que comprenden la especie Lactococcus.
Según otra forma de realización preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan cultivos protectores que comprenden bacterias ácido lácticas de las especies Lactococcus lactis, Lactococcus garieae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum y/o Lactococcus raffinolactis o mezlas de las mismas.
Según una forma de realización especialmente preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan bacterias ácido lácticas que comprenden la especie Lactococcus lactis.
Según una forma de realización preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan cultivos protectores que comprenden bacterias ácido lácticas de las subespecies Lactococcus lactis subsp. cremoris y/o Lactococcus lactis subsp. lactis o mezlas de las mismas.
Según otra forma de realización preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan cultivos protectores que comprenden bacterias ácido lácticas de la variedad Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis.
Según otra forma de realización preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan cultivos protectores que comprenden bacterias ácido lácticas de la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526. La cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 se depositó en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, el 21 de septiembre de 1998 bajo el número DSM 12415.
Según otra forma de realización preferida, para la utilización citada según la reivindicación 3 se utilizan cultivos protectores que comprenden una mezcla de las diferentes especies, variedades, subespecies y/o cepas citadas anteriormente.
Según una forma de realización preferida, entre los alimentos y piensos para los fines de la invención se incluyen también precursores, tales como cuerpos de matanza o materias primas utilizadas para la preparación de los alimentos o piensos.
Según una forma de realización particularmente preferida, entre los alimento o piensos se incluyen carne y productos de carne, pescado y productos de pescado, ensaladas de ultramarinos así como comidas que se almacenan y/o se venden precocinadas a fuego lento. Entre dichos alimentos o piensos se incluyen en particular los alimentos descritos más adelante.
Las bacterias ácido lácticas de los cultivos protectores según la invención no presentan a temperaturas por debajo de 7ºC ninguna actividad metabólica detectable sensorialmente. Por actividad metabólica detectable sensorialmente se entiende cualquier actividad metabólica que puede ser percibida por el consumidor. En particular, las bacterias ácido lácticas no presentan ninguna actividad de crecimiento y ninguna actividad acidificadora y no producen productos de metabolismo que pueden afectar al color de los alimentos o piensos.
Preferentemente, el número de las bacterias ácido lácticas multiplicables a temperaturas por debajo de 7ºC aumenta durante un periodo de tiempo de una a dos semanas en menos de una potencia de diez, de forma particularmente preferida en menos de media potencia de diez.
Las bacterias ácido lácticas de los cultivos protectores según la invención inhiben a temperaturas de por lo menos 7ºC el crecimiento de las siguientes bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas, estando la invención no limitada a la inhibición de dichas bacterias: Staphylococcus aureus, salmonelas, cepas de E. coli humanopatogénicas (EIEC, ETEC, EPEC, EHEC), Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila, Camphylobacter jejuni, Bacillus cereus, Clostridium perfringens y Clostridium botulinum.
Según la invención, el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas se inhibe de tal manera que su número no aumenta en más de dos potencias de diez, preferentemente no en más de una potencia de diez, dentro de 48 h.
Las bacterias ácido lácticas de los cultivos protectores según la invención inhiben el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas entre otros mediante la producción de las sustancias siguientes de efecto antimicrobiana, estando incluido según la invención que las bacterias ácido lácticas pueden producir algunos o todas estas sustancias y que el potencial inhibidor de las bacterias ácido lácticas puede basarse también en otras sustancias: ácidos orgánicos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico, ácido benzoico), diacetil, dióxido de carbono, agentes reductores que conducen a una disminución del potencial redox, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, siempre y cuando las bacterias ácido lácticas inhiban el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas mediante la producción de ácidos orgánicos, preferentemente ácido láctico.
Según una forma de realización particularmente preferida, las bacterias ácido lácticas de los cultivos protectores según la invención presentan, a temperaturas de por lo menos 7ºC o más, una actividad metabólica detectable sensorialmente, preferentemente una acidificación del alimento o del pienso.
Según la invención, la temperatura por debajo de la cual las bacterias ácido lácticas de los cultivos protectores según la invención no presentan ninguna actividad metabólica y por encima de la cual las bacterias ácido lácticas pueden inhibir el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas es de 7ºC.
Las bacterias ácido lácticas de los cultivos protectores según la invención pueden prepararse por medio del procedimiento siguiente:
1.
Primero se aíslan las bacterias ácido lácticas que pueden asignarse a una de las especies, variedades y/o cepas citadas anteriormente o a las mezclas de las mismas. Su aislamiento se realiza preferentemente a partir de los alimentos o piensos en los que se utilizarán las bacterias ácido lácticas más tarde. De esta forma, se asegura una adaptación óptima al alimento o pienso, por ejemplo con relación al crecimiento, aprovechamiento de las sustancias nutritivas o producción de ácido láctico.
Los procedimientos para el aislamiento de bacterias ácido lácticas son conocidos en el estado de la técnica (J. Baumgart, W. en Heeschen (Ed.): Handbuch Lebensmittelhygiene. Hamburgo: Behr's, 1 y siguientes (1994), en particular el capítulo 4, página 216 y siguientes). Allí se han descrito también procedimientos que permiten investigar si las bacterias aisladas son efectivamente bacterias ácido lácticas.
2.
A continuación, se investiga el comportamiento de crecimiento así como la actividad metabólica a temperaturas por debajo y por encima de 7ºC. Por debajo de 7ºC, las bacterias no deben presentar ninguna actividad metabólica detectable sensorialmente, en particular ninguna actividad acidificadora. A temperaturas de por lo menos 7ºC o más, las bacterias deben presentar una actividad metabólica detectable sensorialmente, en particular una actividad acidificadora. Además, se examina si el número de las bacterias ácido lácticas multiplicables aisladas disminuye en el alimento o pienso en menos de dos potencias de diez al ser adicionado a un alimento o pienso en un periodo de tiempo de una a dos semanas a temperaturas por debajo de 7ºC. A tal fin, se incuba una cantidad determinada de bacterias, preferentemente 10^{7} bacterias/cm^{2} de superficie del alimento o pienso, junto con el alimento o pienso durante una a dos semanas. A continuación, se determina el número de las bacterias según los métodos conocidos por los expertos en la materia (J. Baumgart, obra cit., capítulo 5, p. 74 y siguientes).
A esta caracterización puede seguir preferentemente una caracterización exacta de las bacterias ácido lácticas aisladas. Para ello existen toda una serie de métodos, tales como por ejemplo una identificación bioquímica por medio de la galería de 50 carbohidratos con indicación de color "api 50 CHL" (bioMerieux, Marcy-L'Etoile, Francia) o de un análisis de las secuencias 16S rADN (B. Pot et al.: Modern methods used for identification and classification of lactic acid bacteria; en: L. de Vuyst y E.J. Vandamme: Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Londres, Glasgow, Nueva York, Tokyo, Melbourne, Madras: Blackie Academie & Professional 1991; capítulo 2.3, p. 40 y siguientes).
3.
Seguidamente, hay que comprobar si las bacterias ácido lácticas aisladas son capaces de inhibir el crecimiento de gérmenes toxinogénicas y/o toxiinfecciosas en alimentos o piensos. A tal fin, se incuban las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas en los alimentos o piensos juntas con las bacterias ácido lácticas aisladas (ver también el Ejemplo 8). Preferentemente, la incubación se lleva a cabo primero a temperaturas por debajo de 7ºC y entonces a temperaturas de por lo menos 7ºC o más. Se obtiene una inhibición del crecimiento si, en la incubación de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas juntas con las bacterias ácido lácticas aisladas, las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas crecen más lentamente que en la incubación de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas sin adición de las bacterias ácido lácticas aisladas.
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La invención se refiere además a las bacterias ácido lácticas que pertenecen a la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 (DSM 12415, ver arriba). Dicha cepa posee la característica sorprendente de no presentar ninguna actividad metabólica detectable sensorialmente a temperaturas por debajo de 7ºC, pero de ser capaz de inhibir el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas a temperaturas de por lo menos 7ºC. Además, posee la característica sorprendente de que el número de las bacterias ácido lácticas con metabolismo potencialmente activo de la cepa disminuye en el alimento o pienso en cuestión en menos de dos potencias de diez a temperaturas por debajo de 7ºC durante un periodo de tiempo de una a dos semanas.
La invención se refiere además a la utilización de los cultivos protectores según la invención para la conservación de alimentos y piensos con conservabilidad limitada bajo refrigeración. Los alimentos o piensos se tratan con los cultivos protectores según la invención poniendo los alimentos o piensos en contacto con los cultivos protectores de tal manera que los cultivos protectores son capaces de inhibir el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas.
Según una forma de realización preferida, se tratan los alimentos o piensos con los cultivos protectores según la invención aplicando los cultivos protectores a la superficie de los productos, preferentemente por proyección o frotamiento. Según otra forma de realización, se tratan los productos con los cultivos protectores introduciendo los cultivos protectores en el producto por mezclado y/o agitación.
Según una forma de realización preferida, se tratan los alimentos o piensos con un polvo que comprende los cultivos protectores y, si se desea, vehículos adecuados. Entre los vehículos adecuados se incluyen por ejemplo sacaridas, preferentemente mono- o disacaridas.
Según otra forma de realización preferida, se tratan los alimentos o piensos con un medio líquido que comprende los cultivos protectores. El medio líquido debe estar diseñado de tal forma que garantiza la supervivencia del cultivo durante el tratamiento.
Según una forma de realización particularmente preferida, el medio líquido es un medio acuoso, tal como una solución salina fisiológica o agua potable.
Según una forma de realización preferida, se tratan los alimentos o piensos con una cantidad de bacterias ácido lácticas comprendida entre 10^{4} y 10^{8} bacterias ácido lácticas por g o ml o cm^{2} de superficie del alimento o pienso, preferentemente con una cantidad de bacterias ácido lácticas comprendida entre 10^{5} y 10^{6} bacterias ácido lácticas por g o ml o cm^{2} de superficie.
Preferentemente, a los alimentos o piensos se adiciona además durante el tratamiento una fuente de carbono, preferentemente carbohidratos, de forma particularmente preferida glucosa, sacarosa, lactosa.
Según una forma de realización preferida, los cultivos protectores según la invención con los que se tratan los alimentos o piensos constituyen una mezcla de las especies, variedades, subespecies y/o cepas citadas anteriormente.
La invención se refiere además a un alimento o pienso, caracterizado porque contiene los cultivos protectores según la invención. A tal fin, se trata el alimento o pienso con los cultivos protectores según la invención según las formas de realización expuestas anteriormente.
Según una forma de realización preferida, el alimento o pienso se ha seleccionado de entre el grupo constituido por las carnes y los productos de carne, de forma particularmente preferida de entre el grupo constituido por:
-
carne fresca porcionada, asaduras, carne de ave y piezas de carne de ave que han sido tratadas por aplicación de los cultivos protectores según la invención a la superficie;
-
cuerpos de matanza, piezas parciales, piezas parciales sin huesos, lonchas, tales como por ejemplo lonchas de salchichas cocidas, lonchas de salchichas cocidas, lonchas de productos cocidos o productos crudos salados que han sido tratados por aplicación de los cultivos protectores según la invención;
-
productos de carne troceada, tales como por ejemplo carne picada (carne cruda troceada, carne picada de bistec, carne cruda picada, carne picada de ternera, carne picada de cerdo, carne troceada de cerdo), preparaciones de carne picada, productos de salchichas tipo "bratwurst" que han sido tratados por adición con agitación o aplicación a la superficie de los cultivos protectores según la invención.
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Según otra forma de realización particularmente preferida, el alimento o pienso se ha seleccionado de entre el grupo constituido por pescado y productos de pescado, de forma especialmente preferida de entre el grupo constituido por pescado fresco (filete de pescado, chuletas de pescado), pescado ahumado, tales como por ejemplo lonchas o moluscos y crustáceos cada uno de los cuales ha sido tratado por aplicación de los cultivos protectores a la superficie.
Según otra forma de realización particularmente preferida, los alimentos son ensaladas de ultramarinos. De forma particularmente preferida, los alimentos se han seleccionado de entre el grupo constituido por ensaladas a base de carne, pescado, molusco, crustáceo y verdura o ensaladas con pasta, preparándose las ensaladas de ultramarinos, según una forma de realización particularmente preferida, a base de mayonesa, de mayonesa de ensalada o de salsa tártara, habiéndose preparado cada una de las ensaladas de ultramarinos por introducción por mezclado/agitación o por aplicación de los cultivos protectores según la invención a la superficie.
Según otra forma de realización particularmente preferida, los alimentos son comidas precocinadas a fuego lento. Por comidas precocinadas a fuego lento se entienden para los fines de la invención comidas que se almacenan y/o se venden cocinadas a fuego lento. Dichas comidas se tratan por introducción por mezclado o agitación o por aplicación de los cultivos protectores según la invención a la superficie.
Según otra forma de realización particularmente preferida, los alimentos se han seleccionado de entre el grupo constituido por productos lácteos, de forma especialmente preferida de entre el grupo constituido por leche fresca, yogurt, queso fresco y queso.
Por tanto, la presente invención proporciona por primera vez cultivos protectores que inhiben el crecimiento de las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas a temperaturas de por lo menos 7ºC, pero a temperaturas inferiores a 7ºC no presentan una actividad metabólica detectable sensorialmente. Los cultivos protectores según la invención pueden utilizarse directamente en alimentos o piensos que están previstos para el hombre o animales y que presentan una conservabilidad limitada sólo bajo refrigeración, puesto que no son patogénicos para el consumidor.
A continuación, la invención se ilustrará haciendo referencia a figuras, tablas y ejemplos.
Descripción de las figuras
Figura 1 Comportamiento de Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 en lonchas de salchicha cocida envasadas al vacío durante un almacenamiento refrigerante de 3 semanas (6ºC), seguido de una interrupción de la cadena de refrigeración simulada (48 h/22ºC). En el eje Y izquierdo se ha trazado la densidad de gérmenes (log KbE/cm^{2}) de L. lactis subsp. lactis 1526, mientras que en el eje Y derecho se ha trazado el valor pH en la salchicha cocida durante el ensayo. En el eje X, se ha trazado la duración del ensayo. Las lonchas de salchicha cocida se envasaron al vacío, y la hoja de cubierta consistió en OPP/SiO_{x}/PE. En caso de que las muestras se expusieron a la luz, la luz era de 1300 lux, siendo la distancia entre las muestras envasadas al vacío y los tubos fluorescentes de 40 cm.
Figura 2 Inhibición de un "pool" de salmonelas durante un almacenamiento refrigerante (6ºC/14 días), seguido de una interrupción de la cadena de refrigeración simulada (22ºC/48 h) por medio de L. lactis subsp. lactis 1526. En el eje Y se ha trazado la densidad de gérmenes de la bacterias, mientras que, en el eje X, se ha trazado la duración del ensayo.
Figura 3 Inhibición de un "pool" de salmonelas por Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 con una densidad de inoculación de 10^{5} KbE/cm^{2} durante un almacenamiento refrigerante (10ºC/14 días), seguido de un aumento de temperatura (22ºC/24 h). En el eje Y se ha trazado la densidad de gérmenes de las bacterias, mientras que, en el eje X, se ha trazado la duración del ensayo.
Figura 4 Inhibición de S. aureus por L. lactis subsp. lactis 1526 sobre una muestra de salchicha cocida durante un almacenamiento refrigerante (6ºC/6 días), seguido de un aumento de temperatura (22ºC/2 días). La actividad de inhibición se ha indicado en función de la densidad de inoculación del cultivo protector y en función de la cantidad de glucosa adicionada. El eje Y muestra la densidad de gérmenes de los estafilococos, mientras que, en el eje X, se ha indicado la duración del ensayo.
Figura 5 Inhibición de B. cereus por L. lactis subsp. lactis 1526 sobre una muestra de salchicha cocida durante un almacenamiento refrigerante (6ºC/6 días), seguido de un aumento de temperatura (22ºC/2 días). La actividad de inhibición se ha indicado en función de la densidad de inoculación del cultivo protector y en función de la cantidad de glucosa adicionada. El eje Y muestra la densidad de gérmenes de Bacillus cereus, mientras que, en el eje X, se ha indicado la duración del ensayo.
Figura 6 Inhibición de C. perfringens por L. lactis subsp. lactis 1526 sobre una muestra de salchicha cocida durante un almacenamiento refrigerante (6ºC/6 días), seguido de un aumento de termperatura (22ºC/2 días). La actividad de inhibición se ha indicado en función de la densidad de inoculación del cultivo protector y en función de la cantidad de glucosa adicionada. El eje Y muestra la densidad de gérmenes de los clostridios, mientras que, en el eje X, se ha indicado la duración del ensayo.
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Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de cepas de bacterias ácido lácticas a partir de alimentos
Para crear una colección de cepas, se aislaron bacterias ácido lácticas principalmente a partir de productos de carne. Con esto se pretende garantizar que las bacterias ácido lácticas aisladas son organismos que se han adaptado al substrato "carne". Otro requerimiento era que los aislados pueden imponerse sobre una flora de competición. Por ello, los productos de carne se almacenaron antes de su aislamiento a 30ºC durante 48 h. Esto permitió a la flora de bacterias ácido lácticas imponerse, alcanzando las bacterias ácido lácticas dominantes altas densidades de gérmenes en las muestras.
En caso de muestras envasadas de forma suelta, que se utilizaban además de los productos envasados al vacío, se aislaron los gérmenes exclusivamente a partir de piezas que se habían separado del interior de las muestras de forma estéril.
Las muestras con un peso comprendido entre aproximadamente 5 y 10 g se introdujeron en 90 ml de una solución de Ringer (Unipath GmbH, D-46467 Wesel, BR 52) y se trituraron, según su condición, con un Ultra-Turrax (T 25, de la empresa JANKE & KUNKEL/Staufen) durante dos minutos a 13.500 rpm o en un Stomacher (LabBlender 400, SEWARD-MEDICAL/Londres) durante diez minutos y se suspendieron. A partir de las suspensiones así obtenidas, se prepararon series de dilución continuas cada una en 9 ml de solución de Ringer. 100 \mul de cada nivel de dilución entre 10^{-4} y 10^{-8} se aplicaron con espátula sobre un medio de cultivo Chalmers (modificado) así como sobre un medio de cultivo MRS (acerca de los medios de cultivo, ver la Tabla 2). La incubación se realizó a 30ºC en potes anaerobios (Unipath, HP 11), en los que se produjo una atmósfera anaerobia por medio de AnaeroGen (Unipath, AN 35).
Tras 3 a 4 días, se retiraron de los medios de cultivo cinco colonias como máximo por producto, que se diferenciaban en su morfología macroscópica. En caso de los medios de cultivo Chalmers, se utilizaban sobre todo las colonias que se distinguían por un diámetro de halo largo (descolorado, claro). Esto puede considerarse como un indicio de una formación de ácido extensivo. Los cultivos retirados se suspendieron en 5 ml de un caldo MRS y se incubaron a 30ºC durante 48 horas de forma anaerobia. Si mostraban un enturbamiento pronunciado tras dos días de incubación, se realizó un frotis de dilución sobre Chalmers y MRS. Tras una incubación adecuada (4 días/30ºC/anaerobia), se retiraron colonias individuales, y el cultivo puro así obtenido se cultivó otra vez en un caldo MRS. Los aislados se incluyeron como preparados congelados en la colección de cepas. Para la preparación de un preparado, los cultivos puros recién cultivados se aplicaron con espátula a un medio de cultivo MRS y se incubaron según las condiciones ya citadas. Tras 4 a 5 días, el moho de bacterias podía aislarse por flotación con 1,5 ml de una solución de peptona de caseína/peptona de harina de soja USP (Unipath, CM 129) e introducirse en 6 ml de una solución de leche desnatada estéril (Unipath, L 31). Tras el mezclado, la suspensión de bacterias se envasó en tubitos de cultivo y se almacenó congelada
a -20ºC.
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Ejemplo 2 Clasificación de las cepas de bacterias ácido lácticas a base de sus características generales
Los aislados introducidos en la colección de cepas se clasificaron aproximadamente a base de la reacción gram, del ensayo de catalasa así como del ensayo de oxidación/fermentación con relación a su comportamiento de crecimiento sobre medios de cultivo adecuados (MRS, Chalmers, Rogosa) así como a base de la evaluación microscópica y macroscópica de su morfología. En dicha evaluación, una reacción grampositiva, un resultado negativo en el ensayo de catalasa, una degradación de carbohidratos por fermentación así como la morfología de colonias sobre un medio de cultivo Chalmers modificado (formación de halo por ácido) se consideran como características generales que hacen probable la pertenencia de los aislados al grupo de bacterias ácido lácticas (Baumgart, J. et al., obra cit. capítulo 4.8, p. 245 y siguientes). En cambio, una formación de gases a partir de glucosa en el ensayo OF, el cuadro microscópico así como el comportamiento de crecimiento sobre un medio de cultivo Rogosa ya pueden dar indicaciones de la pertenencia a una especie determinada (Baumgart, J. et al., obra cit. capítulo 4.8, p. 245 y siguientes).
Reacción gram
La coloración gram se realizó en cultivos recién cultivados (colonias de superficie). Para la coloración, se utilizó el kit de ensayo ColorGram 2 (bioMerieux/Marcy-l'Etoile, Francia). Como control del método de coloración, se trataron también un cultivo grampositivo (Bacillus subtilis) y un cultivo gramnegativo (Escherichia coli).
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Ensayo de catalasa
Colonias de superficie del isolado a ensayar se retiraron utilizando un ojete de inoculación y se trituraron sobre un portaobjetos con una solución de H_{2}O_{2} al 3% (Bactident Katalase, Merck, 11351). Una formación de gases indica la presencia de catalasa.
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Ensayo de oxidación/fermentación
Con el ensayo de OF según Hugh, R. y Leifson, E., J. Bact. 66: 24 y siguientes (1953) se investigó si el aislado de bacterias utiliza glucosa fermentativamente con la formación de ácido y posiblemente de gases. El medio de ensayo utilizado era un medio de cultivo a base de OF libre de carbohidratos (Merck, 10282), al cual se adicionó, tras el tratamiento en autoclave, una solución de glucosa al 10% filtrado en condiciones estériles (100 ml por 1 l de medio de cultivo). El cultivo puro retirado por medio de una aguja de inoculación se inoculó en dos tubitos cada uno lleno del medio de cultivo en paralelo por el método de punción. Una vez completada la inoculación por punción, uno de los dos tubitos se recubrió con una capa de aceite parafínico del ancho del dedo, para impedir una admisión de oxígeno. Tras una incubación de 2-4 días a 37ºC, podía observarse en ambos tubitos, en caso de una transformación fermentativa de glucosa, un cambio de color del indicador azul de bromotimol. Además, en la evaluación se examinó si había una posible formación de gases (burbujas y/o hendiduras en la columna del medio de cultivo) así como una posible movilidad (enjambre en el medio de cultivo).
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Identificación bioquímica de los aislados
La identificación bioquímica de los aislados clasificados como bacterias ácido lácticas se realizó por medio de la galería de 50 carbohidratos con indicador de color api 50 CHL (bioMerieux, Marcy-l'Etoile, Francia). En el sistema api 50 CHL, se examina el metabolismo mediante 49 carbohidratos. El perfil bioquímico resultante se interpretó utilizando el software APILAB Plus disponible para este fin.
Los aislados a identificar se cultivaron a partir de un cultivo congelado en un caldo MRS, se retiraron por centrifugación y luego se suspendieron en una solución de Ringer. La sustancia de inoculación necesaria para los ensayos se ajustó por medio del estándar McFarland 2,0 (bioMérieux, 70900). Los microtubos de la banda de ensayo se inocularon con 100 \mul de la suspensión de gérmenes, se recubrieron con una capa de aceite parafínico estéril y se incubaron en una cámara húmeda a 30ºC. La evaluación de los microtubos se realizó tras 24 y 48 h, considerándose un cambio de color del indicador púrpura de bromocresol causado por una fermentación como un resultado positivo.
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Ejemplo 3 Determinación del crecimiento así como de la actividad acidificadora de las cepas de bacterias ácido lácticas aisladas
La detección del comportamiento de crecimiento de las bacterias ácido lácticas se realizó según el método de Reuter, G. Archiv für Lebensmittelhygiene, 12: 257 y siguientes (1970). El medio de cultivo utilizado era un caldo MRS, del cual se introdujeron 10 ml en cada tubo de ensayo. A continuación, se inocularon los medios de cultivo con 10^{5} gérmenes cada uno. Las temperaturas ensayadas eran 6ºC, 10ºC y 15ºC, dependiendo la duración de incubación de la temperatura correspondiente. Las muestras almacenadas a 6ºC se evaluaron tras 14 días, las de 10ºC tras 7 días y las de 15ºC tras 5 días. Tras el periodo de ensayo de dos semanas, las muestras almacenadas a 6ºC se incubaron a 22ºC durante 24 horas, con el fin de determinar si el cultivo presentaba una vitalidad suficiente tras el almacenamiento refrigerante.
Una vez terminadas las duraciones de ensayo correspondientes, se detectó una multiplicación de gérmenes a base de un enturbamiento del caldo o debido a un sedimento. Además, se determinó el valor pH del medio de cultivo, con el fin de detectar las actividades de acidificación de los aislados. Se evaluaron positivamente los cultivos que no presentaban ningún crecimiento y ninguna acidificación a 6ºC. Al contrario, a 15ºC debe observarse una multiplicación pronunciada y el valor pH debe situarse por debajo de 5,0.
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Ejemplo 4 Caracterización del cultivo MSB de L. lactis subsp. lactis 1526
Los cultivos de bacterias ácido lácticas con la denominación de cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 se aislaron a partir de lonchas de salchichas cocidas, adquiridas en Hongkong, según los Ejemplos 1 a 3. El crecimiento por la superficie del cultivo a 30ºC en condiciones anaerobias en los medios de cultivos según de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) así como en un medio de cultivo según Chalmers (modificado) puede denominarse como bueno. En un medio de cultivo MRS, el cultivo muestra, tras una incubación de tres días a 30ºC, colonias redondas, lisas con un diámetro de halo > 1 mm. En un medio de cultivo según Chalmers, se forman colonias que se distinguen en particular por una formación de halo muy pronunciada, lo cual indica una formación de ácido extensiva. En cambio, el crecimiento sobre un medio de cultivo Rogosa, diseñado para un aislamiento selectivo de lactobacilos, es muy
débil.
La morfología microscópica es muy irregular en condiciones de cultivo diferentes. La descripción varía desde "cocida" hasta "varillas cortas", pudiendo ambas formas ocurrir en un preparado. En su mayor parte, los gérmenes están presentes en cadenas, algunos de ellos también en pares. El cultivo presenta una vitalidad muy buena al ser cultivado tras el cultivado congelado. En el caldo de cultivo (caldo de MRS), se alcanzaron densidades de gérmenes de más de 109 KbE/ml tras 24 h a 30ºC.
La identificación bioquímica con el ensayo rápido api 50CH de bioMérieux dio, como el taxón de la primera selección, la especie "Lactococcus lactis subsp. lactis" con un porcentaje de identificación de un 98,4%. Un secuenciado de ADN realizado por la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH en Braunschweig confirmó la identificación bioquímica. La investigación de la similaridad de la secuencia 16S rADN con el secuenciado del área con la mayor variabilidad dio una concordancia de un 99,8% con Lactococcus lactis subsp. lactis. El producto final de la fermentación de glucosa es el ácido láctico con una configuración L(+). El lactato puede formarse, entre otros, a partir de glucosa, fructosa, manosa y lactosa, así como a partir de ribosa, trehalosa y
sacarosa.
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Ejemplo 5 Determinación de las densidades de gérmenes
Las densidades de gérmenes se determinaron según los métodos descritos por J. Baumgart, W. en Heeschen (Ed.): Handbuch Lebensmittelhygiene, Hamburgo: Behr's, 1 y siguientes (1994). La muestra a ensayar (20 g) se pesó en una balanza con platillos superiores con 80 ml de solución de Ringer estéril en una bolsa Stomacher. La homogeneización se llevó a cabo con un aparato amasador de bolsas (Stomacher 400). El tiempo de homogeneización a una velocidad de marcha mediana era de 10 min. al contrario de la recomendación de Baumgart, puesto que los tiempos de homogeneización propuestos en la literatura de 60 s como máximo resultan insuficientes para el alimento a
investigar.
De la muestra homogeneizada se retiró 1 ml y se pipeteó en 9 ml de solución de Ringer. El número de las diluciones decimales preparadas en total dependía del número de gérmenes a esperar. De los niveles de dilución individuales se retiraron o bien 100 \mul para un cultivo de superficie o bien 1 ml para un cultivo vertido en placa y, según el método aplicado, o bien se aplicaron por espátula al medio de cultivo correspondiente o bien se mezclaron con el medio de cultivo líquido. Los medios de cultivo utilizados para los grupos de gérmenes individuales así como las condiciones de incubación correspondientes se han referenciado en los Ejemplos 6 y 7.
Para cada determinación de gérmenes, se utilizaban por lo menos dos muestras, preparándose de cada muestra dos series de dilución. A partir de los números de gérmenes determinados por cada carga de ensayo, se determinó la densidad de gérmenes como promedio aritmético. Los ensayos de repetición se llevaron a cabo desplazados temporalmente, utilizándose cargas de muestra diferentes para los ensayos. Si en las mismas cargas de ensayo se superaba una diferencia de las densidades de gérmenes de log 1 (| log KbE_{ensayo \ 1}-log KbE_{ensayo \ 2} | > 1), el ensayo tuvo que
repetirse).
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Ejemplo 6 Cultivo de gérmenes con riesgo de higiene
El cultivo de cada uno de los gérmenes con riesgo de higiene cultivados con congelación se realizó durante 24 h en 100 ml de solución de peptona de caseína/harina de soja USP (Unipath, CM 129). Bacillus cereus y Clostridium botulinum se incubaron a 30ºC, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens así como las cepas de salmonela individuales a 37ºC. El cultivo de C. perfringens se realizó en condiciones anaerobias. Los medios utilizados, la metodología así como las condiciones de incubación para la determinación de los gérmenes de los gérmenes de prueba utilizados como los gérmenes con riesgo de higiene se han referenciado en la Tabla 1.
Tabla 1 (ver p. 17)
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Ejemplo 7 Cultivo de cepas de bacterias ácido lácticas
Las cepas de bacterias ácido lácticas clasificadas en los Ejemplos 1 a 3 como positivas se cultivaron cada una al principio del experimento en 10 ml de caldo MRS (Unipath, CM 359) durante 24 h a 30ºC. Tras un almacenamiento refrigerante a 6ºC durante 10 días como máximo, del caldo de cultivo se retiraron 100 \mul de suspensión de bacterias y se introdujeron en 10 ml de solución de cultivo MRS para un nuevo cultivo. Tras el 2º cultivo (30ºC/24 h), la masa de bacterias se centrifugó durante 10 min a 8.000 rpm (Biofuge 28 RS, de la empresa HERAEUS SEPATECH/Osterode). A continuación, el sobrenadante se decantó, y el sedimento se suspendió en la misma cantidad de solución de Ringer estéril. La suspensión de células se centrifugó otra vez en las mismas condiciones, el sobrenadante se eliminó y se reemplazó otra vez con las misma cantidad de solución de Ringer. Los cultivos así purificados se almacenaron bajo refrigeración (6ºC, 7 días como máximo) hasta su uso y, tras la determinación de su densidad de gérmenes, se adicionaron a las muestras de salchichas cocidas.
Para la determinación de las densidades de gérmenes o la detección de los gérmenes, se utilizó un medio de cultivo de Chalmers modificado. Con las diluciones correspondientes se prepararon cultivos vertidos en placa que se incubaron durante 3-5 días a 30ºC.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
TABLA 2 
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2 
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Para la determinación del número de gérmenes de las gacterias ácido lácticas, se utilizó el medio de culrivo selectivo según Chalmers en una composición modificada según Vanos, V. y Cox, L., Food Microbiol, 3:233 y siguientes (1986):
3
Ejemplo 8 Inhibición de gérmenes toxinogénicos y/o toxiinfecciosos de lonchas de salchicha cocida envasadas al vacío por Lactococcus lactis subsp. lactis 1526
El requerimiento más importante que un cultivo protector debe cumplir es la protección higiénica de un alimento en caso de un almacenamiento no según las reglas. Por tanto, las bacterias utilizadas según la invención deben presentar un efecto lo suficientemente antagonista contra las bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas, suprimiendo de forma eficaz una multiplicación y/o formación de toxinos de las mismas. Los experimentos representados en los Ejemplos 1 a 4 dan por resultado que las bacterias que pertenecen a la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 podrían asumir dicha función. Por lo tanto, el objetivo de los experimentos que siguen a continuación era el de aclarar si el efecto antagonista podía conseguirse también en una superficie de corte de una salchicha cocida. Las salchichas cocidas se prepararon según los procedimientos conocidos en el estado de la técnica (referencia para la preparación de salchichas cocidas: A. Fischer: Produktbezogene Technologie-Herstelllung von Fleischerzeugnissen en: O. Prändl, A. Fischer, T. Schmidhofer, H.-J. Sinell (Ed.): Fleisch-Technologie und Hygiene der Gewinnung und Verarbeitung. Stuttgart: Ulmer, 1988, p. 505 y siguientes).
Los experimentos se llevaron a cabo en condiciones orientadas hacia la práctica. Para simular una infección por contacto directo, se distribuyeron las suspensiones que contenían los gérmenes patogénicos, tras su aplicación a la superficie de corte, por espátula. La contaminación de la salchicha a través de la máquina de corte, tal como se ha citado en la literatura (Schmidt, U. y Gardill, E., Jahresbericht der Bundesforschungsanstalt für Fleischforschung, S. C. 25 (1986), dio lugar a distribuciones muy irregulares. Durante el corte, el cuchillo ya quitó una gran parte de los gérmenes, en particular en la zona de margen, y en parte era posible determinar a causa de ello zonas relativamente grandes (> 1 cm^{2}) en las que no apareció ningún germen.
A continuación, se aplicó el cultivo protector por medio de aire comprimido a través de una boquilla rociadora. La aplicación por proyección de las suspensiones de gérmenes dio una distribución de gérmenes uniforme en la superficie. Sólo dicha distribución uniforme del cultivo protector puede provocar un efecto de inhibición óptimo en toda la superficie. Para impedir que una parte de los gérmenes patogénicos se adhiera a la hoja de envasado y por ello no se detecte, se colocó en cada salchicha contaminada otra loncha de salchicha cocida. A continuación, las muestras se envasaron al vacío y se almacenaron a las temperaturas especificadas. Puesto que para los experimentos microbiológicos era decisiva la superficie, se especificaron las densidades de gérmenes en los experimentos siguientes por área de superficie [KbE/cm^{2}].
En la Figura 1, se ha representado el comportamiento de Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 en lonchas de salchicha cocida envasadas al vacío durante un almacenamiento refrigerante de tres semanas a 6ºC, seguido de una interrupción simulada de la cadena de refrigeración (48 h/22ºC).
A) Inhibición del "pool" de salmonela
Las salmonelas se imponen muy rápidamente al no mantenerse las temperaturas de refrigeración requeridas. El "screening" de los aislados de las bacterias ácido lácticas se dirigió principalmente hacia el efecto antagonista contra las salmonelas. La inhibición en lonchas de salchicha cocida envasadas al vacío se investigó como función de la concentración de fuentes de C y de la densidad de siembra del cultivo protector, determinándose el efecto inhibidor de L. lactis subsp. lactis 1526 sobre un "pool" de salmonelas (consistente en 9 cepas silvestres, ver Tabla 1) a distintas densidades de inoculación del cultivo de bacterias ácido lácticas así como a distintas concentraciones de glucosa.
\newpage
Las muestras de salchicha cocida no saladas se "infectaron por contacto directo" con un total de 4,4x10^{4} salmonelas, en la que la comprobación de la densidad de inoculación dio una tasa de rehallazgo de un 70%, lo cual corresponde a una densidad de salmonelas real de 700 KbE/cm^{2}. Luego, se aplicaron por proyección Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 en una densidad de 10^{6} KbE/cm^{2}. Por encima de la suspensión de cultivo protector se aplicó por proyección a la superficie una cantidad de glucosa de 0,7 mg/cm^{2}. La densidad de lactococos deseada de 10^{6} KbE/cm^{2} se consiguió aproximadamente (1,1x10^{6} de KbE/cm^{2}). Encima de las lonchas tratadas por proyección se colocó otra loncha, y el conjunto se envasó al vacío. A continuación, las muestras se almacenaron en un armario de incubación refrigerante a 6ºC. Tras 14 días, la temperatura se aumentó a 22ºC, con el fin de simular una interrupción de la cadena de refrigeración.
Durante el almacenamiento refrigerante a 6ºC, la densidad de gérmenes de las salomonelas y del cultivo protector así como el valor pH cambiaron sólo ligeramente (Figura 2). Tras el aumento de temperatura a 22ºC, se registraba en las muestras sin el cultivo protector el ascenso esperado del número de gérmenes de salmonelas. En cambio, las muestras que contenían el cultivo protector presentaban una clara acidificación. Tras sólo 24 horas, se midió un valor pH de 4,72 por la superficie. Esto permitió inhibir las salmonelas en un grado sustancial. Durante las primeras 24 horas, el número de células aumentó sólo ligeramente de 170 a 900 KbE/cm^{2}. Tras otras 24 horas, podían detectarse un promedio de 270 KbE/cm^{2}. Por tanto, el nivel del número de gérmenes se encontraba por debajo de la densidad de inoculación de 700 KbeE/cm^{2} (ver la Figura 2).
Los experimentos descritos hasta ahora se llevaron a cabo a una temperatura de 22ºC, con el fin de simular una interrupción de la cadena de refrigeración. Sin embargo, un riesgo de higiene puede presentarse también cuando las temperaturas de refrigeración superan los 7ºC requeridos. Por este motivo, se realizaron otros experimentos a una temperatura de 10ºC. En dichos experimentos, la densidad de inoculación deseada de las salmonelas era de 10^{3}/cm^{2}; la densidad real encontrada era de 1,36 x 10^{3} KbE/cm^{2}. Los lactococos se inocularon con densidades de gérmenes de 10^{5} KbE/cm^{2} (Figura 3). Además, se aplicaron 0,7 mg/cm^{2} de glucosa.
En la Figura 3, se han representado la actividad acidificadora del cultivo protector así como el comportamiento de crecimiento de las salmonelas en las muestras con y sin adición del cultivo protector. La población de salmonelas sin el cultivo protector era capaz de multiplicarse en mayor grado. En las muestras con el cultivo protector, Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 alcanzó ya el día siete el número máximo de gérmenes de 5,9x10^{7} KbE/cm^{2}. En el transcurso posterior del experimento, los números de células disminuyeron ligeramente. Durante la primera semana, el valor pH disminuyó claramente, midiéndose el día siete valores con un promedio de 5,02 en la superficie y alcanzándose valores de 4,76 tras 14 días. En presencia del cultivo protector, las salmonelas eran capaces de multiplicarse sólo ligeramente durante el almacenamiento a 10ºC. El día 14, podían determinarse números de gérmenes de salmonelas de sólo 6,1 x 10^{3} KbE/cm^{2}. Tras el almacenamiento de 14 días, se aumentó la temperatura a 22ºC. Sin embargo, debido a la dominancia de los lactococos, ya no podían imponerse las salmonelas.
B) Inhibición de Staphylococcus aureus
Los experimentos para examinar el efecto antagonista de L. lactis subsp. lactis 1526 frente a Staphylococcus aureus se realizaron metodológicamente según los experimentos descritos en A) con las salmonelas. Los resultados de los experimentos se han representado en la Figura 4. Por la Figura 4 puede apreciarse que L. lactis subsp. lactis 1526 es capaz de reducir sustancialmente el crecimiento de Staphylococcus aureus al interrumpirse la refrigeración.
C) Inhibición de Bacillus cereus
Los experimentos para examinar el efecto antagonista de L. lactis subsp. lactis 1526 frente a Bacillus cereus se realizaron metodológicamente según los experimentos descritos en A) con las salmonelas. Los resultados se han representado en la Figura 5. Por los resultados representados en la Figura 5 puede apreciarse que L. lactis subsp. lactis 1526 es capaz de suprimir completamente el crecimiento de Bacillus cereus al interrumpirse la refrigeración.
D) Inhibición de Clostridium perfringens
Los experimentos para examinar el efecto antagonista de L. lactis subsp. lactis 1526 frente a Clostridium perfringens se realizaron metodológicamente según los experimentos descritos en A) con las salmonelas. Adicionalmente, se adicionó un 0,5% de glucono-delta-lactona (p/v) al cultivo protector. Los resultados pueden apreciarse por la Figura 6. Se ve claramente que L. lactis subsp. lactis 1526 es capaz de suprimir el crecimiento de C. perfringens en presencia de glucono-delta-lactona al interrumpirse la refrigeración.
4
5

Claims (5)

1. Cultivos protectores para la conservación de alimentos o piensos con una conservabilidad limitada bajo refrigeración, caracterizados porque comprenden bacterias ácido lácticas no patogénicas que presentan las características siguientes:
a)
las bacterias ácido lácticas no presentan una actividad metabólica detectable sensorialmente por debajo de 7ºC, ni una actividad acidificadora ni de crecimiento;
b)
el número de bacterias ácido lácticas con un metabolismo potencialmente activo disminuye por debajo de 7ºC durante un periodo de tiempo de una a dos semanas en menos de dos potencias de diez; y
c)
las bacterias ácido lácticas inhiben a temperaturas de por lo menos 7ºC el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas,
\quad
y porque las bacterias ácido lácticas pertenecen a la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 (DSM 12415).
2. Bacterias ácido lácticas, caracterizadas porque pertenecen a la cepa Lactococcus lactis subsp. lactis 1526 (DSM 12415).
3. Utilización de cultivos protectores para la conservación de alimentos o piensos con conservabilidad limitada bajo refrigeración, caracterizados porque comprenden bacterias ácido lácticas no patogénicas que presentan las características siguientes:
a)
las bacterias ácido lácticas no presentan una actividad metabólica detectable sensorialmente por debajo de 7ºC, ni una actividad acidificadora ni de crecimiento;
b)
el número de bacterias ácido lácticas con un metabolismo potencialmente activo disminuye por debajo de 7ºC durante un periodo de tiempo de una a dos semanas en menos de dos potencias de diez; y
c)
las bacterias ácido lácticas inhiben a temperaturas de por lo menos 7ºC el crecimiento de bacterias toxinogénicas y/o toxiinfecciosas, incluyéndose entre dichas bacterias Staphylococcus aureus, salmonelas, cepas de E. coli humanopatogénicas (EIEC, ETEC, EPEC, EHEC), Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila, Camphylobacter jejuni, Bacillus cereus, Clostridium perfringens y Clostridium botulinum, pudiendo multiplicarse las bacterias ácido lácticas a 15ºC, siendo inhibido el crecimiento de bacterias toxiinfecciosas y/o toxinogénicas de tal manera que su número aumenta en 48h no más de dos potencias de diez, y pudiendo inhibir las bacterias ácido lácticas el crecimiento de bacterias toxiinfecciosas y/o toxinogénicas a través de la producción de ácidos orgánicos,
\quad
durante el almacenamiento a temperaturas por debajo de 7ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Alimentos o piensos, caracterizados porque pueden obtenerse mediante la utilización según la reivindicación 3.
5. Alimentos según la reivindicación 4, caracterizados porque el alimento se ha seleccionado de entre el grupo constituido por carne o productos de carne, pescado o productos de pescado, ensaladas de ultramarinos y comidas precocinadas a fuego lento.
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