ES2631908T3 - Una cepa nueva de bacterias de ácido láctico y su uso para la protección de productos alimenticios - Google Patents
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Landscapes
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
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Abstract
Cepa de Lactobacillus curvatus depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con el numero de registro DSM 18775 caracterizada por el hecho de que tiene la capacidad, a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 oC, inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos sin provocar cambios sensoriales en los alimentos.
Description
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DESCRIPCION
Una cepa nueva de bacterias de acido lactico y su uso para la proteccion de productos alimenticios
[0001] La presente invention se refiere a una bacteria de acido lactico nueva que produce agentes antimicrobianos (bacteriocinas) sensibles a proteasa a bajas temperaturas de almacenamiento. Particularmente, la presente invencion se refiere al Lactobacillus curvatus DSM 18775, el cual se ha descubierto que es util para la bioproteccion de productos refrigerados tales como la carne y los productos lacteos listos para el consumo (Ready-To-Eat (RTE)).
antecedentes de la tecnica
[0002] Se sabe que la contamination bacteriana de productos alimenticios es responsable del desperdicio de comida y de la transmision de enfermedades causadas por alimentos. Este problema es particularmente importante en carnes RTE y productos lacteos que los consumidores no precalientan antes de consumir y que se almacenan durante periodos largos de tiempo en frigorificos entre 2-10 0C. Un caso ejemplar es la Listeria monocytogenes, que es una bacteria patogena de especial interes en productos alimenticios tales como los productos carnicos RTE empaquetados al vado o en atmosfera modificada, debido a su tolerancia a temperaturas de refrigeration, concentraciones de NaCI relativamente altas y condiciones anaerobicas o en productos como el queso fresco, debido a la falta de una fase de inactivation termica. Como resultado, se ha invertido mucho esfuerzo tratando de identificar productos naturales que se puedan anadir de forma segura a los alimentos para inhibir el crecimiento bacteriano.
[0003] Es ripico usar bacterias de acido lactico como cultivos iniciadores para inducir la fermentation de productos carnicos, normalmente carnes crudas saladas. El termino "cultivo iniciador" se refiere a una preparation que contiene celulas microbianas que pretende inocular una matriz de alimentos que sera objeto de fermentacion. Los cultivos iniciadores para la fermentacion de carne normalmente se componen de una o mas bacterias de acido lactico. El cultivo iniciador pretende producir el cambio deseado en las caracteristicas de la matriz de alimentos durante la fermentacion (p. ej. una acidification deseada, y otros parametros sensoriales y tecnologicos determinados). Normalmente, un cultivo iniciador proliferara durante el proceso de fermentacion. Durante el proceso de fermentacion las bacterias de acido lactico principalmente producen acido lactico, por lo cual el pH disminuye hasta el valor deseado de pH dependiendo del cultivo y de las condiciones de procesamiento (temperatura, tipo/contenido de azucar etc.), y de manera importante, las propiedades sensoriales del producto cambian perceptiblemente.
[0004] Los cultivos antagonistas anadidos a los alimentos para inhibir patogenos y/o alargar el periodo de caducidad sin cambiar las propiedades sensoriales del producto se denominan "cultivos protectores". A diferencia de los cultivos iniciadores, los cultivos protectores no pretenden cambiar las propiedades sensoriales del producto. A su uso o el de sus productos metabolicos (acidos organicos, peroxido de hidrogeno, enzimas y bacteriocinas) frecuentemente se le denomina "biopreservacion" o "bioproteccion" (Castellano, P. y Vignolo, G., "Inhibition of Listeria and y Brochothrix thermosphacta in vacuum-packaged meat by addition of bacteriocinogenic Lactobacillus curvatus CRL705 and its bacteriocins", 2006, Letters in Applied Microbiology. VoI. 43: 194-199). Este estudio demuestra un efecto bacteriostatico en una especie no patogena de Listeria. No se aprecia efecto bactericida en la Listeria. Ademas la evaluation "sensorial" realizada estaba limitada a las mediciones de pH.
[0005] Ademas del establecimiento de la bioconservacion como un metodo para asegurar la seguridad microbiologica sin cambiar las caracteristicas sensoriales del producto, los cultivos bioprotectores tambien se han evaluado por su potencial para prevenir el crecimiento de bacterias causantes de deterioro (Vermieren, L. et al., "Evaluation of meat born lactic acid bacteria as protective cultures for the biopreservation of cooked meat products", 2004, International Journal of Food Microbiology, 96: 149-164).
[0006] La aceptabilidad sensorial de productos carnicos cocinados tratados con cultivos bioprotectores puede limitar el uso del metodo de conservation, y la capacidad reguladora junto al contenido de glucosa han resultado ser elementos clave para evitar las desviaciones sensoriales cuando se aplican cultivos bioprotectores (Vermieren et Al., supra).
[0007] Frecuentemente se ha observado un rebrote de Listeria monocytogenes con el uso de cultivos bioprotectores despues de una fase inicial de inhibition. El rebrote se atribuye al desarrollo de la resistencia de L. monocytogenes a las bacteriocinas, a la degradation de las moleculas de bacteriocina con proteasas endogenas producidas durante la fase de crecimiento, a la adsorcion de las bacteriocinas a la superficie de la cepa productora, o a las interacciones espetificas con la matriz alimentaria (Dicks, L.M.T. et al., "Use of bacteriocin-producing starter cultures of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus curvatus in production of ostrich meat salami", 2004, Meat Science, 66: 703-708).
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[0008] La solicitud de patente europea EP 1.475.432 expone dos cepas de Lactobacillus curvatus, depositadas como PTA-5150 y PTA-5159 y su uso para reducir el crecimiento de un microbio en una composition alimentaria o farmaceutica.
[0009] La patente n.° US 4.886.673 expone tres cepas de bacterias Lactobacillus curvatus DSM 4265, Microccocus varians DSM4263, y Debaromyces hansenii DSM 4260 y su uso para conservar productos carnicos. El ejemplo 1 describe el uso de Lactobacillus curvatus DSM 4265 en la production de embutidos crudos.
[0010] La solicitud de patente europea EP 0.640.291 expone el uso de Lactobacillus curvatus DSM 8430 como un cultivo iniciador en la produccion de salami. Se menciona espedficamente que tiene lugar una produccion optima de bacteriocina a temperaturas entre 15 y 20 0C y que la actividad se reduce a temperaturas bajas (+4 0C).
[0011] Vogel, R.F. et al., (1993, System. Appl. Microbiol., 16: 457-462) expone el uso de la cepa LT 1174 de Lactobacillus curvatus como un cultivo iniciador en la produccion de salami. Se menciona espedficamente que tiene lugar una produccion optima de bacteriocina a temperaturas entre 15 y 20 0C y que la actividad se reduce a temperaturas bajas (+4 0C).
[0012] Benkerroum, N. et al. (2005, J. Appl. Microbiol., 98: 56-63) expone el uso de una cepa LBPE de Lactobacillus curvatus como un cultivo iniciador en la produccion de salchichas fermentadas deshidratadas. La fermentation se lleva a cabo a 30 0C, y el secado a 14-16 0C. No se demostro ningun efecto bioprotector a temperaturas bajas.
[0013] Mauriello, G. et al. (2004, j. Appl. Microbiol., 97: 314-322) expone el uso de pelfculas de polietileno para empaquetar alimentos las cuales se tratan con bacteriocina parcialmente purificada de la cepa 32Y de Lactobacillus curvatus. Para producir la bacteriocina esta cepa concreta se cultiva a 30 0C.
[0014] Mataragas et al. (2003, Food Microbiology, 20: 259-265) expone un Lactobacillus curvatus L442 que tiene actividad antimicrobiana contra la Listeria monocytogenes. Se han investigado los cambios de pH y los resultados se proveen en la Fig. 3 mostrando una disminucion del pH de 6,5 a aproximadamente 5,5 debido a la produccion de acetato (Fig. 4). Se sabe que tal descenso del pH reduce la cantidad de microorganismos patogenos por s^ mismo. La cantidad de acetato producido es bastante alta y puede producir cambios sensoriales, p.ej. tener un impacto en el sabor.
resumen de la invencion
[0015] El problema a resolver mediante la presente invencion es el suministro de una cepa bacteriana que inhiba el crecimiento de bacterias patogenas producidas en la carne y causantes de deterioro a temperaturas bajas (2-10 0C) sin cambiar las propiedades sensoriales del producto alimenticio.
[0016] La solution se basa en una cepa de Lactobacillus curvatus depositada bajo el numero de registro DSM 18775.
[0017] Como se ilustra abajo de manera no restringida, se ha descubierto que la cepa de Lactobacillus curvatus depositada bajo el numero de registro DSM 18775 es util para la bioproteccion de productos alimenticios. La cepa de Lactobacillus curvatus depositada bajo el numero de registro DSM 18775 puede ser util y ha demostrado ser particularmente util para la inhibition de bacterias patogenas procedentes de los alimentos debido a la produccion de bacteriocinas.
[0018] Las bacterias patogenas procedentes de los alimentos y las bacterias causantes de deterioro, pueden ser aerobicas, anaerobicas u opcionalmente anaerobicas, y as^ la elimination de solo oxfgeno de un paquete de alimentos o de un ambiente de almacenamiento de alimentos no eliminara eficazmente todos los tipos de bacterias indeseadas. Ademas, el control de la temperatura en el almacenamiento de alimentos no es totalmente eficaz para excluir el crecimiento de bacterias de este tipo porque pueden crecer varios tipos de bacterias patogenas y bacterias causantes de deterioro a varias temperaturas. En cambio, hay otras bacterias patogenas, que debido a su tolerancia a las temperaturas de refrigeration, a las concentraciones relativamente altas de NaCI y a las condiciones anaerobicas, son de especial interes en los productos alimenticios RTE.
[0019] Los inventores de la presente invencion han observado que bajo condiciones de refrigeracion, la cepa de Lactobacillus curvatus depositada bajo el numero de registro DSM 18775 produce bacteriocinas, lo cual causa reducciones considerables en la cantidad de bacterias patogenas procedentes de los alimentos sin provocar cambios sensoriales indeseados, y tambien impide el crecimiento de bacterias causantes de deterioro en el producto alimenticio. El hecho de que el Lactobacillus curvatus depositado bajo el numero de
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registro DSM 18775 sea capaz de producir bacteriocinas a una temperatura de refrigeracion implica que dicha cepa puede usarse para la bioproteccion de productos refrigerados, y particularmente de productos refrigerados listos para comer envasados al vado o en atmosfera modificada.
[0020] As^ en un aspecto la presente invention se refiere a una cepa de Lactobacillus curvatus depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bajo el numero de registro DSM 18775 caracterizada por el hecho de que tiene la capacidad de, a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 0C, inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos sin provocar cambios sensoriales en los alimentos.
[0021] Una muestra de cultivo del microorganismos se deposito el 09.11.2006 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bajo el numero de registro DSM 18775.
[0022] Un aspecto importante en la evaluation del uso de una cepa como un cultivo bioprotector es la capacidad de la cepa de funcionar en el producto alimenticio para el cual esta destinada. En este aspecto no solo es importante que la cepa sea capaz de inhibir cualquier bacteria patogena indeseada procedente de los alimentos en el producto bajo condiciones de almacenamiento pertinentes, sino tambien que no produzca ningun efecto sensorial indeseado (perdida de sabor, perdida de olor o cambios de color indeseados). La cepa de Lactobacillus curvatus depositada bajo el numero de registro DSM 18775 inhibe considerablemente las bacterias patogenas procedentes de los alimentos cuando se aplica a una gama amplia de productos carnicos RTE reales a lo largo del almacenamiento en condiciones de almacenamiento relevantes. Los inventores han demostrado mediante analisis sensoriales que el cultivo de la cepa de Lactobacillus curvatus depositada bajo el numero de registro DSM 18775 no afecta negativamente a la calidad sensorial de los productos alimenticios (tales como varios productos de carne RTE) bajo condiciones de almacenamiento pertinentes, como se ilustra abajo.
[0023] Ademas, a diferencia de otras cepas usadas como cultivos bioprotectores, cuando el cultivo de la cepa de Lactobacillus curvatus depositada bajo el numero de registro DSM 18775 se usa como un cultivo bioprotector, no se aprecia rebrote de L. monocytogenes.
[0024] Por lo tanto, cuando se usa un cultivo de una cepa segun la presente invencion hay riesgos de salud reducidos asociados a la ingestion de productos refrigerados, debido al aumento en la seguridad del producto durante el periodo de caducidad. Consecuentemente, la perdida economica para la industria alimentaria se puede reducir considerablemente.
[0025] En un tercer aspecto, la presente invencion se refiere a un proceso para preparar una composition capaz de inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos, y dicho proceso comprende: (a) cultivar celulas de una cepa de Lactobacillus curvatus segun el primer aspecto de la invencion, que despues del cultivo en un medio de cultivo produce una bacteriocina que produce actividad inhibitoria contra cepas bacterianas, incluida la Listeria monocytogenes, para obtener un sobrenadante que comprende la bacteriocina; y (b) separar el sobrenadante de las celulas cultivadas para obtener el sobrenadante, obteniendo as^ una composicion sobrenadante formada por la bacteriocina.
[0026] En una forma de realization de este aspecto la bacteriocina formada por la composicion sobrenadante es posteriormente sometida a una fase de secado para obtener un producto de eluato de cultivo deshidratado. La fase de secado puede convenientemente ser criodesecacion o secado por atomization. Como se describe en el ejemplo 8 el proceso resulta en un producto de eluato de cultivo deshidratado que inhibe la Listeria monocytogenes en productos de carne empaquetados en atmosfera modificada o al vado.
[0027] La composicion inhibidora del crecimiento tiene un efecto bactericida en al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos cuando se proveen cantidades suficientes. Un ejemplo es una composicion inhibidora del crecimiento que tiene un efecto bactericida en la Listeria monocytogenes cuando se proveen cantidades suficientes. Esto se ilustra en el ejemplo 8 Fig. 7a.
[0028] Una composicion de eluato de cultivo puede originarse de los procesos arriba mencionados, p. ej. de la fase (a) del proceso del tercer aspecto de la invencion o de la fase (b) del proceso del tercer aspecto de la invencion.
[0029] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a composiciones para la conservation de productos alimenticios que se componen de la cepa de Lactobacillus curvatus segun el primer aspecto de la invencion.
[0030] En otro aspecto adicional, la presente invencion se refiere al uso de una cepa de Lactobacillus curvatus segun el primer aspecto de la invencion o a la composicion de sobrenadante de la fase b) del proceso segun el tercer aspecto de la invencion para la conservacion de productos alimenticios.
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[0031] Ademas, la presente invencion se refiere al uso de una cepa de Lactobacillus curvatus segun el primer aspecto de la invencion o a la composicion sobrenadante de la fase b) del proceso segun el tercer aspecto de la invencion para inhibir el crecimiento de bacterias patogenas procedentes de los alimentos o bacterias causantes de deterioro en productos alimenticios que se conservan en un estado refrigerado a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 0C.
[0032] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para controlar la contamination por Listeria en un producto alimenticio, en equipamiento de procesamiento de alimentos, o en contenedores de almacenaje de alimentos, el cual comprende la aplicacion de la cepa de Lactobacillus curvatus con el numero de registro DSM 18775, caracterizada por el hecho de que tiene la capacidad, a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 oc, de inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos sin provocar cambios sensoriales en los alimentos, en un producto alimenticio o en equipamiento de procesamiento de alimentos en una cantidad suficiente como para reducir la cantidad o evitar el crecimiento de Listeria.
[0033] A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y las variaciones de la palabra, tales como "que comprende", no pretenden excluir otras caracteristicas de tecnicas, aditivos, componentes, o fases. Otros objetos, ventajas y caracteristicas adicionales de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica tras examinar la descripcion o se podran apreciar al poner en practica la invencion. Los ejemplos y dibujos siguientes se proveen como ilustracion, y no pretenden limitar la presente invencion.
breve descripcion de los dibujos
[0034]
La FIG. 1 representa el recuento de celulas de L. monocytogenes en lonchas de mortadela inoculadas con (■) o no inoculadas con (♦) DSM 18775 (nivel inicial de 107 CFU/g). Las lonchas de mortadela se empaquetaron en atmosfera modificada (30 % CO2 y 70 % N2) y se almacenaron a 7 0C. El recuento de celulas se baso en las determinaciones tomadas respecto a dos lonchas diferentes de carne, y las barras indican las desviaciones estandar entre estos valores duplicados.
La FIG. 2 representa el recuento de celulas de L. monocytogenes en lonchas de mortadela hechas de carne finamente troceada inoculada con (■) o no inoculada con (♦) DSM 18775 (nivel inicial de 107 CFU/g). Las lonchas de mortadela se empaquetaron en atmosfera modificada (30 % CO2 y 70 % N2) y se almacenaron a 7 0C. El recuento de celulas se baso en las determinaciones tomadas respecto a dos lonchas diferentes de carne, y las barras indican las desviaciones estandar entre estos valores duplicados.
La FIG. 3 representa el recuento de celulas de L. monocytogenes en lonchas de jamon cocido ahumado, inoculado con (■) o no inoculado con (♦) DSM 18775 (nivel inicial de 107 CFU/g). Las lonchas de jamon se empaquetaron en atmosfera modificada (30 % CO2 y 70 % N2) y se almacenaron a 7 0C. El recuento de celulas se baso en las determinaciones tomadas respecto a dos lonchas diferentes de carne, y las barras indican las desviaciones estandar entre estos valores duplicados.
La FIG. 4 representa el recuento de celulas de L. monocytogenes en salchichas vienesas, inoculadas con (■) o no inoculadas con (♦) DSM 18775 (nivel inicial de 107 CFU/g). Las salchichas vienesas se envasaron al vado y se almacenaron a 7 0C. El recuento de celulas se baso en las determinaciones tomadas respecto a dos salchichas diferentes, y las barras indican las desviaciones estandar entre estos valores duplicados.
La FIG. 5 representa el recuento de celulas de L. monocytogenes en lonchas de jamon cocido, inoculado con (■) o no inoculado con (♦) DSM 18775 (nivel inicial de 107 CFU/g). Las lonchas de jamon se empaquetaron en atmosfera modificada (30 % CO2 y 70 % N2) y se almacenaron a 5 0C. El recuento de celulas se baso en las determinaciones tomadas respecto a dos lonchas diferentes de jamon cocido, y las barras indican las desviaciones estandar entre estos valores duplicados.
La FIG. 6 representa el desarrollo en pH en quesos inoculados con DSM 18775 (■) o no inoculados con DSM 18775 (♦) (nivel inicial de 107 CFU/g). Los quesos se empaquetaron al vado y se almacenaron a 9 0C. El pH se mide en una suspension de queso y agua (1:1) agitada durante 30 min antes de la medicion de pH (usando un pH-metro, radiometro PHM 92, Copenhague, DK).
La FIG. 7. Recuento de celulas de L. monocytogenes expuestas a eluato de cultivo de DSM18775 o MicroGARD 730 en concentraciones diferentes, tal y como se explica en las cifras de la leyenda de la
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derecha, en lonchas de salchicha emulsionada almacenadas en atmosfera modificada (atmosfera modificada, 30 % CO2 y 70 % N2) 7a, o al vado (7b) a 7 0C. El recuento de celulas se baso en las determinaciones tomadas respecto a dos lonchas diferentes de carne, y las barras indican las desviaciones estandar entre estos valores duplicados.
descripcion detallada de formas de realizacion particualres
[0035] La cepa de Lactobacillus curvatus DSM 18775 de la presente invention es una bacteria de aeido laetieo. Se aislo de alimentos fermentados y se identified como Lactobacillus curvatus mediante la electroforesis en gel de protemas seguida del analisis y la reagrupaeion eon los perfiles de referenda de la base de datos de reeogida de eultivos del LMG. Ademas, usando una earaeterizaeidn de perfil API, el DSM 18775 se identified como Lactobacillus curvatus eon una probabilidad de un 63,4 %. La eepa se earaeterizd por la metabolizaeion eompleta de: D-Ribosa, D-Galaetosa, D-Glueosa, D-Fruetosa, D-Manosa, N- Aeetilglueosamina, Esculina, D-Maltosa y D-Trehalosa y por la metabolizaeion pareial de D-Saearosa despues de una incubation de 48 h a 30 0C. La eepa se deposito el 9 de noviembre de 2006 segun las eondieiones del tratado de Budapest en la 'Deutsche Sammlung von Mieroorganismen und Zellkulturen' GmbH (DSMZ). Se le asigno el numero de deposito DSM 18775. La baeterioeina antilisterial produeida por el DSM 18775 fue determinada en un ensayo de agar por difusion en pocillo usando Lactobacillus sakei NCFB 2714 como el organismo indieador.
[0036] El objetivo de la presente invencion tambien eomprende una eepa de Lactobacillus curvatus obtenida mediante la mutation de la eepa de Lactobacillus curvatus DMS 18775, a condition de que la eepa resultante tenga la eapaeidad, a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 oc, de inhibir el ereeimiento de al menos una bacteria patogena proeedente de los alimentos sin provoear eambios sensoriales en los alimentos.
[0037] En el proeeso para preparar la baeterioeina, la eepa de la presente invencion que produce la baeterioeina, se eultiva en un medio y bajo eondieiones que son favorables al ereeimiento, el sobrenadante se afsla del cultivo resultante separando el sobrenadante de las celulas eultivadas para obtener un sobrenadante que eontiene la baeterioeina, y para llevar a eabo la separation, el cultivo resultante se eentrifuga y se obtiene un extraeto sobrenadante que eontiene la baeterioeina. El sobrenadante se puede eoneentrar para obtener un eoneentrado que eomprende la baeterioeina, y se puede obtener una baeterioeina aislada y purifieada del sobrenadante eoneentrado que se puede deshidratar.
[0038] En una forma de realizacion preferida particular de este proeeso la composition sobrenadante es posteriormente sometida a una fase de seeado para obtener un eluato de cultivo deshidratado. La fase de seeado puede eonvenientemente ser criodeseeaeion o seeado por atomization, pero se eontempla eualquier proeeso de seeado que sea eonveniente para el seeado de baeterioeinas, ineluidos el seeado al vado y el seeado mediante aire. Aunque la baeterioeina produeida a temperaturas bajas por Lactobacillus curvatus DSM 18775 no esta aun earaeterizada en euanto a los detalles, se sabe que algunos Lactobacillus curvatus pueden producir baeterioeinas de la elase I la, ineluida la Sakaeina. Las baeterioeinas la elase lla son pequenas protemas termoestables, por lo que esperamos que incluso los metodos de seeado, que suponen un ealentamiento moderado del eluato de cultivo, resultaran en composieiones activas.
[0039] La baeterioeina segun la presente invencion se earaeteriza en mas detalle abajo eon la ayuda de varios deseubrimientos mierobiologieos, bioqdmieos y genetieos que ilustran sus propiedades. Los poreentajes se dan por peso. La unidad de aetividad antibaeteriana es aeorde a la "prueba de agar en pocillo". Dentro del contexto de la presente exposition, la aetividad inhibitoria se define en euanto a unidades arbitrarias.
[0040] La prueba de agar en pocillo se utiliza para determinar si el sobrenadante del cultivo que eontiene la baeterioeina segun la presente invencion muestra aetividad inhibitoria contra diferentes eepas de esporas y baeterias. Se determina asf el espectro de inhibition del sobrenadante.
[0041] El termino "producto alimentieio" tal y como se utiliza en este doeumento se refiere a eualquier alimento que se pueda deteriorar como resultado del ereeimiento baeteriano y la proliferation. Diehos produetos alimentieios ineluyen, pero no se limitan a, carne, produetos lacteos, verduras, frutas y eereales.
[0042] Los terminos "producto refrigerado" o "eonservado en estado refrigerado" se usan de la misma forma y se refieren a produetos alimentieios que se almaeenan a temperaturas que varian entre los 2 y los 10 oc. El producto alimentieio puede envasarse tanto al vado como en atmosfera modificada.
[0043] Tal y como se utiliza en este doeumento, el termino "carne" se refiere a eualquier producto de carne o subprodueto de carne (ineluidos los proeesados) de un animal consumido por seres humanos o animales, ineluyendo, sin limitarse a, earne de especies bovinas, ovinas y porcinas, aves, peseados y erustaceos. Tal y como se usa en la presente solicitud, el termino "producto earnieo listo para comer", al que tambien se haee
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referenda como producto carnico RTE, pretende incluir cualquier producto carnico que no requiera que se cocine antes de consumirlo.
[0044] El termino "producto lacteo" pretende incluir cualquier producto alimenticio hecho con leche o productos lacteos, incluyendo, pero sin limitarse a, leche, yogur, helado, queso, mantequilla y nata.
[0045] Tal y como se utiliza en este documento, el termino "periodo de caducidad" se refiere al periodo de tiempo en que un producto alimenticio es comerciable para los clientes de comercio al por menor. En el procesamiento tradicional de carne, el periodo de caducidad de la carne y subproductos carnicos es de aproximadamente 30 a 40 d^as despues de haber matado al animal. Se supone que la refrigeracion de la carne durante este periodo de tiempo detiene y/o retrasa en gran medida el crecimiento de bacterias patogenas, y en menor medida, las bacterias causantes de deterioro. Despues de aproximadamente 30 a 40 dfas, no obstante, la refrigeracion ya no es capaz de controlar eficazmente la proliferacion de bacterias causantes de deterioro por debajo de niveles aceptables.
[0046] El termino "efecto bactericida", tal y como se utiliza en este documento, se refiere a cualquier tipo de tratamiento que mata bacterias (es decir, que reduce la cantidad). Esto contrasta con el "efecto bacteriostatico" que hace referenda a la situacion en la que el tratamiento solo inhibe el crecimiento o la reproduccion de las bacterias. Se dice que un agente es un bactericida o un bacteriocida si el agente es capaz de matar uno o mas tipos de bacterias. Se dice que un bactericida posee actividad bactericida o bacteriocida.
[0047] Por "bacteriocinas" nos referimos a peptidos o moleculas de protema liberadas extracelularmente que son capaces de matar otras bacterias determinadas muy relacionadas mediante un mecanismo por el que la celula productora muestra cierto grado de inmunidad espedfica.
[0048] El termino "bacterias causantes de deterioro", tal y como se utiliza en este documento, se refiere a cualquier tipo de bacterias que causa el deterioro de los alimentos. Las bacterias causantes de deterioro pueden crecer y proliferar hasta tal punto que un producto alimenticio resulte inadecuado o indeseado para el consumo humano o animal. Las bacterias son capaces de proliferar en superficies de alimentos, como en superficies de carne, asimilando los azucares y protemas en tales superficies. Para metabolizar estos componentes, las bacterias causantes de deterioro crean subproductos como dioxido de carbono, metano, compuestos de nitrogeno, acido buttrico, acido propionico, acido lactico, acido formico, compuestos de azufre, y otros gases y acidos indeseados. La produccion de subproductos de este tipo altera el color de las superficies de la carne, frecuentemente haciendo que la carne pase de un color rojo a un color marron, gris o verde. Los subproductos gaseosos generados por las bacterias causantes de deterioro le dan tambien a la carne deteriorada un olor indeseable. Las alteraciones en el color y el olor de la carne debido al crecimiento de bacterias causantes de deterioro en la superficie de un producto carnico frecuentemente hace que los consumidores no puedan comprar dicho producto alimenticio.
[0049] Ademas del control de las bacterias causantes de deterioro, otro aspecto importante en la industria del procesamiento de alimentos es el control del crecimiento de bacterias patogenas procedentes de los alimentos. Tal y como se utiliza en este documento, el termino "bacterias patogenas procedentes de los alimentos" se refiere a cualquier organismo de intoxicacion alimentaria que sea capaz de provocar una dolencia o enfermedad en animales o seres humanos. El termino "bacterias patogenas procedentes de los alimentos" debe considerarse que incluye bacterias que infectan el producto alimenticio (la carne, por ejemplo) y de ese modo causa una dolencia o una enfermedad, al igual que las bacterias que producen toxinas que causan dolencias o enfermedades. Preferiblemente, la bacteria patogena procedente de los alimentos se selecciona del grupo: Aeromonas caviae; Aeromonas hydrophila; Aeromonas sobria; Bacillus cereus; Campilobacter jejuni; Citrobacter ssp.; Clostridium botulinum; Clostridium perfringens; Enterobacter ssp.; Enterococcus ssp.; cepas de Escherichia coli enteroinvasora; cepas de Escherichia coli enteropatogena; cepas de Escherichia coli enterotoxigenica; Escherichia coli 0157:H7. Klebsiella ssp.; Listeria monocytogenes; Plesiomonas shigelloides; Salmonella ssp.; Shigella ssp.; Staphylococcus aureus; Streptococcus ssp.; Vibrio cholerae; Yersinia enterocolitica. Mas preferiblemente, las bacterias patogenas son Listeria monocytogenes.
[0050] Tal y como se utiliza en este documento, la expresion "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de bacterias de Lactobacillus curvatus segun el primer aspecto de la invencion que da lugar a una inhibicion del crecimiento bacteriano o a una reduccion de la cantidad de otras bacterias del producto alimenticio.
[0051] Abajo se ofrecen aspectos y formas de realizacion preferidos de la invencion.
[0052] Una cepa de Lactobacillus curvatus depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bajo el numero de registro DSM 18775 caracterizada por el hecho de que tiene la capacidad, a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 0C, de inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos sin provocar cambios sensoriales en los alimentos.
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[0053] Una composicion para conservar un producto alimenticio caracterizada por el hecho de que comprende una cepa de Lactobacillus curvatus segun la invencion.
[0054] La composicion segun la invencion, donde la composicion retrasa el desarrollo de bacterias patogenas procedentes de los alimentos o las bacterias causantes de deterioro.
[0055] La composicion segun la invencion, donde el producto alimenticio es carne lista para el consumo Ready-To-Eat (RTE) o un producto lacteo.
[0056] Un proceso para preparar una composicion capaz de inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos y dicho proceso comprende:
(a) cultivar celulas de una cepa de Lactobacillus curvatus de la invencion, que tras su cultivo en un medio de cultivo produce una bacteriocina que tiene actividad inhibidora contra las cepas bacterianas incluida la Listeria monocytogenes para obtener un sobrenadante que comprende la bacteriocina; y
(b) separar el sobrenadante de las celulas cultivadas para obtener el sobrenadante, obteniendo as^ una composicion sobrenadante que comprende la bacteriocina.
[0057] El proceso puede ademas comprender aislar la bacteriocina de la composicion sobrenadante para obtener un producto de bacteriocina purificada.
[0058] El proceso puede ademas comprender concentrar la composicion sobrenadante para obtener un concentrado que comprende la bacteriocina.
[0059] Uso de una cepa de Lactobacillus curvatus segun la invencion o la composicion sobrenadante de la fase (b) del proceso segun la invencion para conservar productos alimenticios.
[0060] Uso de una cepa de Lactobacillus curvatus segun la invencion o la composicion sobrenadante de la fase (b) del proceso segun la invencion para inhibir el crecimiento de bacterias patogenas procedentes de los alimentos o las bacterias causantes de deterioro en productos alimenticios conservados en estado refrigerado a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 0C.
[0061] Las cepas y cultivos de Lactobacillus curvatus o el sobrenadante pueden ser utiles para retrasar la aparicion de efectos sensoriales indeseados (perdida de sabor, perdida de olor o cambios de color indeseados) en productos alimenticios conservados en estado refrigerado.
[0062] El producto alimenticio puede envasarse al vado o en atmosfera modificada. El producto alimenticio puede ser un producto carnico RTE o un producto lacteo.
[0063] La bacteria patogena procedente de los alimentos puede ser Listeria monocytogenes.
[0064] Un proceso de conservacion de productos alimenticios puede ser caracterizado por el hecho de que el Lactobacillus curvatus segun la invencion o la composicion sobrenadante de la fase (b) del proceso segun la invencion se anade en una cantidad eficaz para dichos productos alimenticios.
[0065] La cepa de Lactobacillus curvatus o la composicion sobrenadante se puede anadir durante el proceso de produccion del producto alimenticio o al producto alimenticio para formar una barrera en la superficie de dicho producto.
[0066] El producto alimenticio puede ser una carne RTE o un producto lacteo.
[0067] Un metodo para controlar la contaminacion de Listeria en un producto alimenticio, en un equipamiento para el procesamiento de alimentos, o en contenedores de almacenaje de alimentos, que comprende aplicar la cepa de Lactobacillus con el numero de registro DSM 18775 caracterizada por el hecho de que tiene la capacidad, a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 oc, de inhibir del crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos sin provocar cambios sensoriales en los alimentos, en un producto alimenticio o en un equipamiento para el procesamiento de alimentos en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de Listeria.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Identificacion de la cepa y produccion de bacteriocina
[0068] Despues del crecimiento del DSM 18775 en caldo MRS (De Man, Rogosa y Sharpe, Difco, VWR, Herlev, Dinamarca) durante 22 h a 25 oc, la suspension celular se centrifugo a 4.000 x g durante 15 min. El
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sobrenadante se ajusto a pH 6,0 ± 0,1 con 1 N NaOH y se esterilizo mediante filtro (0,45 gm). Se hicieron diluciones dobles del sobrenadante en agua esteril de intercambio ionico y se anadieron 50 gl de cada dilucion de bacteriocina a pocillos en Agar MRS que contiene el organismo indicador, Lactobacillus sakei NCFB 2714, en una concentration de 10® CFU/ml. Para verificar la naturaleza proteinacea de las sustancias inhibidoras, una solution de la enzima proteoKtica, proteinasa K, se aplico junto a un pocillo del ensayo de agar por difusion en pocillo. La actividad de bacteriocina del sobrenadante celular se definio como el redproco de la dilucion maxima que provoca una zona de inhibition en el ensayo de agar. En las zonas de inhibition causadas por un compuesto proteinaceo, la bacteriocina, se observo una actividad de 500 unidades/ml de sobrenadante celular, que indica claramente la capacidad del DSM 18775 de producir cantidades considerables de bacteriocina antilisterial.
Ejemplo 2. Prueba de aplicacion con Lactobacillus curvatus DSM 18775 en embutido de mortadela a lonchas
[0069] El efecto antilisterial del DSM 18775 y el impacto sensorial del cultivo se evaluo en embutido de mortadela a lonchas. Se anadio un coctel de 5 cepas de L. monocytogenes a la superficie del producto carnico RTE (103 CFU/g) y a continuation se inoculo el cultivo bioprotector (107 CFU/g). El producto se empaqueto en atmosfera modificada (30 % CO2 y 70 % N2) y se almaceno a 7 °C durante 27 dfas.
[0070] El recuento de celulas del cultivo bioprotector se determino colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucion salina de peptona sobre placas de agar MRS e incubandolas anaerobicamente durante 3 d^as a 30 °C. El DSM 18775 prolifero en el producto y alcanzo aprox. 108 CFU/g despues de 1 semana de almacenamiento y aprox. 109 CFU/g al final del almacenamiento. El recuento de celulas de Listeria se determino colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucion salina de peptona sobre placas de agar PALCAM seleccionador de Listeria (Oxoid A/S, Glostrup, Dinamarca) e incubando microaerofilos durante 48 h a 37 °C. Este recuento de celulas se puede ver en la Fig. 1, y muestra un efecto bactericida del DSM 18775 en L. monocytogenes.
[0071] Las pruebas sensoriales descriptivas de triangulo realizadas por un jurado de 10 jueces no mostraron ningun efecto significativo de anadir el cultivo bioprotector tras 11 d^as de almacenamiento. Despues de 21 dfas de almacenamiento (fin del periodo de caducidad), los productos con cultivo bioprotector anadido se percibieron como mas frescos en cuanto al sabor y al olor en comparacion con los productos sin el DSM 18775 anadido, que fueron caracterizados como mas insfpidos.
Ejemplo 3. Prueba de aplicacion con Lactobacillus curvatus DSM 18775 en embutidos de mortadela a lonchas (II), troceada muy finamente
[0072] El efecto antilisterial del DSM 18775 y el impacto sensorial del cultivo se evaluo en embutido de mortadela a lonchas hecho de carne troceada muy finamente. Se anadio un coctel de 5 cepas de L. monocytogenes a la superficie del producto carnico RTE (103 CFU/g) y a continuacion se inoculo el cultivo bioprotector (107 CFU/g). El producto se empaqueto en atmosfera modificada (30 % CO2 y 70% N2) y se almaceno a 7 °C durante 27 dfas.
[0073] El recuento de celulas del cultivo bioprotector se determino poniendo diluciones apropiadas base 10 hechas en solucion salina de peptona sobre placas de agar MRS e incubandolas anaerobicamente durante 3 dfas a 30 °C. El DSM 18775 prolifero en el producto y alcanzo aprox. 108 CFU/g despues de 1 semana de almacenamiento y aprox. 109 CFU/g al final del almacenamiento.
[0074] El recuento de celulas de Listeria se determino poniendo diluciones apropiadas base 10 hechas en solucion salina de peptona sobre placas de agar PALCAM seleccionador de Listeria (Oxoid A/S, Glostrup, Dinamarca) e incubando microaerofilos durante 48 h a 37 °C. El recuento de celulas de Listeria se puede ver en la Fig. 2, y muestran claramente un efecto bactericida del DSM 18775 en L. monocytogenes durante los 27 dfas de almacenamiento.
[0075] Las pruebas sensoriales descriptivas de triangulo realizadas por un jurado de 10 jueces no mostraron ningun efecto significativo por anadir el cultivo bioprotector tras 11 dfas de almacenamiento o al final del periodo de caducidad, es decir despues de 21 dfas de almacenamiento.
Ejemplo 4. Prueba de aplicacion con Lactobacillus curvatus DSM 18775 en jamon cocido ahumado en lonchas
[0076] El efecto antilisterial del DSM 18775 y el impacto sensorial del cultivo se evaluo en jamon cocido ahumado en lonchas. Se anadio un coctel de 5 cepas de L. monocytogenes a la superficie del producto carnico RTE (103 CFU/g) y a continuacion se inoculo el cultivo bioprotector (107 CFU/g). El producto se empaqueto en atmosfera modificada (30 % CO2 y 70 % N2) y se almaceno a 7 °C durante 27 dfas.
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[0077] El recuento de celulas del cultivo bioprotector se determine colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucien salina de peptona sobre placas de agar MRS e incubandolas anaerebicamente durante 3 d^as a 30 0C. El DSM 18775 prolifere en el producto y alcanze aprox. 10s CFU/g despues de 1 semana de almacenamiento y aprox. 109 CFU/g al final del almacenamiento.
[0078] El recuento de celulas de Listeria se determine poniendo diluciones apropiadas base 10 hechas en solucien salina de peptona sobre placas de agar PALCAM seleccionador de Listeria e incubando microaerefilos durante 48 h a 37 0C. Este producto no fue compatible con el crecimiento de L. monocytogenes (probablemente debido a la fase de ahumado), pero se observaron reducciones mayores en el recuento de celulas de L. monocytogenes durante los 27 dfas de almacenamiento en presencia de DSM 18775, en comparacien con su ausencia (Fig. 3).
[0079] Las pruebas sensoriales descriptivas de triangulo realizadas por un jurado de 10 jueces no mostraron ningun efecto significativo de anadir el cultivo bioprotector tras 11 d^as de almacenamiento o al final del periodo de caducidad, es decir despues de 21 d^as de almacenamiento.
Ejemplo 5. Prueba de aplicacien con Lactobacillus curvatus DSM 18775 en salchichas vienesas
[0080] El efecto antilisterial del DSM 18775 y el impacto sensorial del cultivo se evalue en salchichas vienesas. Se anadie un cectel de 5 cepas de L. monocytogenes a la superficie del producto carnico RTE (103 CFU/g) y a continuacien se inocule el cultivo bioprotector (107 CFU/g). Las salchichas se empaquetaron al vado y se almacenaron a 7 °C durante 27 d^as.
[0081] El recuento de celulas del cultivo bioprotector se determine colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucien salina de peptona sobre placas de agar MRS e incubandolas anaerebicamente durante 3 dfas a 30 °C. El DSM 18775 prolifere en el producto y alcanze aprox. 10s CFU/g despues de 1 semana de almacenamiento y aprox. 5x10s CFU/g al final del almacenamiento.
[0082] El recuento de celulas de Listeria se determine colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucien salina de peptona sobre placas de agar PALCAM selectivas de Listeria e incubando microaerefilos durante 48 h a 37 °C. Se descubrie un efecto bactericida instantaneo del DSM 18775 en L. monocytogenes y el recuento de celulas reducido fue constante a lo largo de todo el almacenamiento a diferencia del crecimiento pronunciado de L. monocytogenes descubierto en ausencia del cultivo bioprotector en este producto carnico RTE (Fig. 4).
[0083] Se use un ensayo de agar por difusien en pocillo para detectar bacteriocinas producidas por el DSM 18775 en las salchichas vienesas usando Lactobacillus sakei como organismo indicador. Se extrajo bacteriocina de las salchichas homogenizando con 0,02m HCl (1:2, p/v), centrifugando a 16.000 x g durante 5 min a 5 0C, ajustando el sobrenadante a pH 6,0 ± 0,1 con 1 N NaOH y estirilizando mediante filtro (0,45 |jM). Para verificar la naturaleza proteinacea de las sustancias inhibidoras, se aplice una solucien de la enzima proteolftica, proteinasa K, junto al extracto de la salchicha en el ensayo de agar por difusien en pocillo. Se observaron zonas de inhibicien provocadas por un compuesto proteinaceo, supuestamente bacteriocina, de extractos derivados de las salchichas vienesas despues de 11, 21 y 28 d^as de almacenamiento. En las pruebas sensoriales descriptivas de triangulo realizadas por un jurado de 10 jueces, las salchichas vienesas con DSM 18775 anadido se consideraron ligeramente diferentes y mas frescas, que las salchichas sin cultivo bioprotector despues de 11 d^as de almacenamiento, mientras que no se detecte ningun efecto significativo en la calidad sensorial por anadir el DSM 18775 despues de 21 d^as de almacenamiento, es decir al final del periodo de caducidad.
Ejemplo 6. Prueba de aplicacien con Lactobacillus curvatus DSM 18775 en jamen cocido en lonchas
[0084] El efecto antilisterial del DSM 18775 y el impacto sensorial del cultivo se evalue en jamen cocido en lonchas. Se anadie un cectel de 5 cepas de L. monocytogenes a la superficie del producto carnico RTE (103 CFU/g) con y sin la inoculacien concomitante del cultivo bioprotector (107 CFU/g). El producto se empaquete en una atmesfera modificada (30 % CO2 y 70 % N2) y se almacene a 5 °C durante 4 semanas.
[0085] El recuento de celulas del cultivo bioprotector se determine colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucien salina de peptona sobre placas de agar MRS e incubandolas anaerebicamente durante 3 dfas a 30 °C. El DSM 18775 prolifere en el producto y alcanze aprox. 108 CFU/g al final del almacenamiento.
[0086] El recuento de celulas de Listeria se determine colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucien salina de peptona sobre placas de agar PALCAM selectivas de Listeria e incubando microaerefilos durante 48 h a 37 °C. Se descubrie un efecto bactericida claro del DSM 18775 en L. monocytogenes como se ha visto en la figura 6 con reducciones 1-2 logio unidades observadas durante todo el almacenamiento (FIG. 5).
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[0087] En las pruebas sensoriales descriptivas de triangulo realizadas por un jurado de 8 jueces, no se encontraron diferencias significativas en la calidad sensorial de los productos en presencia del cultivo bioprotector en comparacion con su ausencia durante todo el periodo de almacenamiento.
Ejemplo 7. Prueba de aplicacion con Lactobacillus curvatus DSM 18775 en queso fresco
[0088] A 20 kg leche entera (pasteurizada a 72-73 0C, homogenizada y estandarizada a 3,0 % de grasa lactea) se le anadieron 3,5 * io10 CFU del cultivo bioprotector DSM 18775, correspondiente a aprox. 107 CFU/g de queso. En el momento de la inoculacion la temperatura de la leche era de 35 °C. El DSM 18775 se premaduro en la leche durante 30 min a 35 °C antes de anadir el cuajo. La produccion del queso fresco siguio un protocolo estandar para queso fresco: cortar la cuajada, calentar la cuajada a 43 °C durante 30 min, escurrir el 50 % del suero de leche, salar en seco para obtener un contenido de sal final de un 2 % en el queso. Despues de la produccion, el queso se dividio en pedazos mas pequenos, se empaqueto al vado por separado y se almaceno durante 4 semanas a 9 °C.
[0089] El recuento de celulas del cultivo bioprotector se determino colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucion salina de peptona sobre placas de agar MRS e incubandolas anaerobicamente durante 3 d^as a 30 0C. El recuento de celulas inicial de DSM 18775 fue 10 veces inferior al previsto (aprox. 106 CFU/g de queso), pero durante el almacenamiento, el DSM 18775 prolifero en el queso y alcanzo aprox. 108 CFU/g despues de 4 semanas.
[0090] Durante todo el almacenamiento, se observo una reduccion mas rapida de pH en el queso con el cultivo bioprotector anadido, pero al final del almacenamiento no se observo ninguna diferencia significaiva en el queso con o sin el cultivo bioprotector como se ve en la FIG. 6.
[0091] Un jurado experto de tres evaluadores evaluaron el impacto sensorial de anadir el cultivo bioprotector al queso fresco. Los quesos se calificaron principalmente sobre el sabor y la textura. La valoracion se hizo a 10 0C. Los evaluadores describieron el queso con el DSM 18775 anadido como mas fresco, mas intenso, con una textura mejorada, en comparacion con el queso sin el DSM 18775, que se califico como neutro, sin sabor y con tendencia a desmenuzarse.
[0092] Las bacteriocinas producidas por el DSM 18775 en el queso fresco durante el almacenamiento se determinaron en ensayo de agar por difusion en pocillo usando Lactobacillus sakei NCFB 2714 como organismo indicador. Se extrajo bacteriocina del queso para homogenizar con 0,02m HCl (1:5, p/v), centrifugando a 16.000 x g durante 5 min a 5 0C, ajustando el sobrenadante a pH 4,5 ± 0,1 con 1 N NaOH y esterilizando el filtro (0,45 |jM). Para verificar la naturaleza proteinacea de las sustancias inhibitorias, se aplico una solucion de la enzima proteolftica, proteinasa K, junto al extracto de queso en el ensayo de agar por difusion en pocillo.
[0093] La bacteriocina se produjo y se detecto en el queso fresco durante el almacenamiento en cantidades en aumento durante las primeras 3 semanas (tabla 1) y en una gama de concentracion que debfa inhibir el crecimiento de L. monocytogenes en el queso.
Tabla 1.
- Dfa de analisis durante el almacenamiento
- Actividad de la bacteriocina en queso con DSM 18775 anadido (unidad/mg) Actividad de bacteriocina en queso sin DSM 18775 anadido (unidad/mg)
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Ejemplo 8. Comparacion del eluato de cultivo de Lactobacillus curvatus DSM18775 con un eluato de cultivo disponible en el mercado.
[0094] El efecto antilisterial del eluato liofilizado del DSM 18775 se comparo con el efecto de un tipo de producto similar de Danisco, MicroGARD 730, en salchichas emulsionadas a lonchas.
[0095] Se anadio un coctel de 5 cepas de L. monocytogenes en concentraciones finales de aprox. 5e03 CFU/g a lonchas de salchcichas emulsionadas. Se anadieron soluciones de eluatos de cultivo de DSM18775
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[0096] Despues de 1 y 7 dfas de almacenamiento, la carne envasada en atmosfera modificada y al vado se examino para comprobar el contenido de Listeria colocando en placas diluciones apropiadas hechas 10 veces en solucion salina de peptona sobre placas de agar MRS e incubandolas anaerobicamente durante 2 dfas a 30 0C. Las lonchas sin Listeria anadida se evaluaron sensorialmente despues de 1 y 7 dfas de almacenamiento.
[0097] Los resultados del recuento de celulas se presentan en la figura 7 y muestran una capacidad superior del eluato de DSM 18775 de inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes bajo ambas condiciones de empaquetado. El MicroGARD 730 solo tiene un ligero efecto inhibitorio del crecimiento con la concentracion maxima (0,1 %) y bajo condiciones de atmosfera modificada. El eluato de cultivo de DSM 18775, al contrario, fue capaz de evitar el crecimiento de Listeria monocytogenes con una concentracion alta de 0,1 % en el empaquetado de atmosfera modificada y casi evito el crecimiento en el empaquetado al vado.
[0098] Las evaluaciones sensoriales no mostraron ningun efecto ni del DSM 18775 ni del MicroGARD en el color o el sabor de las salchichas emulsionadas cuando se empaquetan en atmosfera modificada o al vado. No obstante, el jurado encargado de las evaluaciones sensoriales percibio un olor ligeramente acido en las lonchas de salchicha emulsionada envasada al vado con MicroGARD 730 anadido.
Respecto a los Organismos Microbianos Depositados [SOLUCION EXPERTA, Norma 13 bis.6 (PCT)]
[0099] Para todos los organismos microbianos mencionados en la presente solicitud de patente se aplica lo siguiente.
[0100] Tal y como contemplan las respectivas Oficinas de Patentes de los respectivos estados designados, los solicitantes piden que solo se haga disponible una muestra de los microorganismos depositados declarados anteriormente a un experto nominado por el solicitante hasta la fecha en que se conceda la patente o la fecha en que se deniegue, se retire o se considere que ha de ser retirada.
[0101] En particular se solicita, que segun:
europa
[0102] Con respecto a aquellas designaciones en las que se solicita una Patente Europea, se hara disponible una muestra del microorganismo depositado hasta la publicacion de la mencion de la concesion de la Patente Europea o hasta la fecha en que la solicitud se haya denegado o retirado o se considere que haya de ser retirada, solo entregando tal muestra a un experto nominado por la persona que solicita la muestra, y aprobado bien I) por el solicitante y/o II) por la Oficina Europea de Patentes, lo que sea de aplicacion (norma 32 CPE).
canadA
[0103] El solicitante pide que, hasta que bien se haya expedido una Patente Canadiense basandose en una solicitud o la solicitud haya sido denegada, o abandonada y sin ser objeto de restablecimiento, o retirada, el Comisionado de Patentes solo autoriza la entrega de una muestra del material biologico depositado al que se hace referenda en la solicitud a un experto independiente nominado por el Comisionado, el solicitante debe, mediante una declaracion por escrito, informar a la Oficina Internacional como corresponde antes de la finalizacion de las preparaciones tecnicas para la publicacion de la solicitud internacional.
Australia
[0104] El solicitante por la presente avisa de que la entrega de una muestra de un microorganismo solo podra verse afectada antes de la concesion de una patente, o antes del vencimiento, denegacion o retirada de la solicitud, a una persona que sea un destinatario cualificado sin interes en la invencion.
singapur
[0105] El solicitante por la presente pide que la entrega de una muestra de un microorganismo solo solo se hara disponible para un experto.
Claims (14)
- 51015202530354045505560REIVINDICACIONES1. Cepa de Lactobacillus curvatus depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con el numero de registro DSM 18775 caracterizada por el hecho de que tiene la capacidad, a una temperatura que varia entre los 2 y los 10 0C, inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos sin provocar cambios sensoriales en los alimentos.
- 2. Cepa de Lactobacillus curvatus segun la reivindicacion 1 donde la bacteria patogena procedente de los alimentos es Listeria monocytogenes.
- 3. Cepa de Lactobacillus curvatus segun la reivindicacion 1 o 2 que, ademas de tener la capacidad de inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos, tambien tiene un efecto bactericida en al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos a una temperatura que vana entre los 2 y los 10 0C.
- 4. Composition para conservar un producto alimenticio caracterizada por el hecho de que comprende la cepa de Lactobacillus curvatus segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
- 5. Composicion segun la reivindicacion 4, donde la composicion retrasa el desarrollo de bacterias patogenas procedentes de los alimentos o las bacterias causantes de deterioro.
- 6. Composicion segun la reivindicacion 4 o 5, donde el producto alimenticio es carne lista para comer (RTE) o un producto lacteo.
- 7. Proceso para preparar una composicion capaz de inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos, y dicho proceso comprende:(a) cultivar celulas de una cepa de Lactobacillus curvatus segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que despues del cultivo en un medio de cultivo produce una bacteriocina que produce actividad inhibitoria contra cepas bacterianas, incluida la Listeria monocytogenes, para obtener un sobrenadante que comprende la bacteriocina; y(b) separar el sobrenadante de las celulas cultivadas para obtener el sobrenadante, obteniendo as^ una composicion sobrenadante formada por la bacteriocina.
- 8. Proceso segun la reivindicacion 7 que ademas comprende una fase de secado para obtener un eluato de cultivo deshidratado.
- 9. Proceso segun la reivindicacion 8 donde la fase de secado es criodesecacion o secado por atomization.
- 10. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde una cantidad eficaz de la composicion inhibitoria de crecimiento tiene un efecto bactericida en al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos.
- 11. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos es Listeria monocytogenes.
- 12. Uso de una cepa de Lactobacillus curvatus segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composicion sobrenadante de la fase (b) del proceso en la reivindicacion 7 para conservar productos alimenticios.
- 13. Uso de una cepa de Lactobacillus curvatus segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composicion sobrenadante de la fase (b) del proceso en la reivindicacion 7 para inhibir el crecimiento de bacterias patogenas procedentes de los alimentos o las bacterias causantes de deterioro en productos alimenticios conservados en estado refrigerado a una temperatura que vana entre los 2 y los 10 oc.
- 14. Metodo para controlar la contamination por Listeria en un producto alimenticio, en el equipamiento de procesamiento de alimentos, o en contenedores de almacenaje de alimentos, que comprende aplicar la cepa de Lactobacillus curvatus con el numero de registro DSM 18775 caracterizada por el hecho de que tiene la capacidad, a una temperatura que vana entre los 2 y los 10 oc, de inhibir el crecimiento de al menos una bacteria patogena procedente de los alimentos sin provocar cambios sensoriales en los alimentos, a un producto alimenticio o al equipamiento de procesamiento de alimentos o Ios contenedores de almacenaje de alimentos en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de Listeria.
Applications Claiming Priority (5)
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|---|---|---|---|
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| DK200700418 | 2007-03-19 | ||
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Publications (1)
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|---|---|
| ES2631908T3 true ES2631908T3 (es) | 2017-09-06 |
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Family Applications (1)
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2008
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK2132297T3 (en) | 2017-07-10 |
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