JP2005517383A - プロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産する方法 - Google Patents

プロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産する方法 Download PDF

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Abstract

プロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産するための方法であって、その方法は、乳組成物を超高温殺菌し、当該組成物を２０〜３０℃に冷却し、そして当該組成物に、１又は複数の無菌的に調製したプロバイオティック培養物を接種することによる。生成される乳組成物はすぐに使用でき、棚寿命が延びており、９０日以上に伸びた棚寿命の後でさえも消費者に対して有利なプロバイオティクスを十分に含む。生成されるこの乳組成物は、消費者に対して消費者の腸の健康を向上させる十分な量のプロバイオティクスを供給するために用いられる。

Description

本発明は、２００１年６月１９日に提出された米国特許仮出願第６０/２９９，２８８号（本明細書中に参照として組み込まれている）の優先権を主張する。
技術分野
一般に、本発明は、乳組成物を生産するための方法に関連し、そして詳細には、ブロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産するための方法に関連する。
従来技術の説明
プロバイオティクス
プロバイオティクスは消費者に対する様々な健康上の利益を有することが報じられている。その利点とは、例えば、細菌性の病原体を抑制すること、結腸ガンの危険性を下げること、免疫反応の刺激、及び血清のコレステロール値を下げることなどである。プロバイオティクスを消費者に対して投与する様々な方法がある一方で、都合良い１つの方法とは、通常消費されるであろう牛乳及びヨーグルトなどの食品に対して単にプロバイオティクスを添加することである。しかし、健康上所望の利益を得るためには、プロバイオティクスが慎重に選択され且つ食品に対して推奨量のプロバイオティクスが消費される十分な量において、確実に添加されなければならない。そしてまた、食品も、製造過程及び食品が市販されて消費されるのを棚の上で待ち過ごす時間の間、プロバイオティック微生物の生存度を維持し続けるような方法で製造され、そして取り扱われなければならない。残念なことに、食品に対して添加されたプロバイオティクスの多くは製造過程中に殺されているかあるいは単に、製品が長期間に渡り棚に置かれている間に死んでしまう。
乳組成物中で用いられるプロバイオティクスは、当該プロバイオティクスが乳組成物と確実に適合するように慎重に選択されなければなない。乳組成物に有用なブロバイオティック細菌のいくつかの属は、公知のラクトバチルス（Lactobacillus）及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）などである。これらの中では、おそらく間違いなく、ビフィズス菌が最も良く研究されており且つ最も重要であろう。ビフィズス菌は乳幼児の糞便中での優占菌種である。ビフィドバクテリウムに固有のフローラ細菌学は、乳幼児において、大腸菌（coliform）及び連鎖球菌（streptococci）などの細菌性病原体により生じる腸並びに全身性の疾患に対する保護作用を供する。大腸菌及び連鎖球菌は、胃腸炎などの新生児感染症を生ずる共通のミクロフローラである。これらの感染症と戦うために、ビフィズス菌はラクトースを同化し、酢酸及び乳酸を生産して腸内の酸度を高める。腸内酸度が上昇することにより、かかる病原体の増殖が阻害され、乳幼児の、新生児疾患、例えば、感染性胃腸炎に対する耐性が高まると考えられている。
しかし、ビフィズス菌及び他のプロバイオティクスの有利な効果は、プロバイオティクスが生存し且つそれらがヒトの腸内でコロニー形成を可能にする親和性を有する場合に限りのみ生じうる。治療上の利点を生み出すために推奨された、ヨーグルト中での生存するビフィズス菌細胞の最低の量は、消費時において、製品のml又はgあたり約１０6コロニー形成単位（「cfu」）である。日本では、Fermented Milks and Lactic Acid Bacteria Beverages Association により、ビフィズス菌を含んでいると謳っている新鮮な乳製品中には、最低でもmlあたり１０7の生存するビフィズス菌細胞が存在することを求められている（Ishibashi、N.及びS.Shimamura.１９９３.Bifidobacteria: reserch and development in Japan. Food Technoloy vol.４７:１２６、pp.１２９〜３４）。Swiss Food Regulation and the International Standard of FIL／IDFは、ビフィズス菌を含む乳製品は、ml又はg製品あたり１０6cfu以上のビフィズス菌を含むことを求めている（Shin,H-S、Lee,J-H.、Pestka.J.及び Ustunol,Z.２０００. Growth and viability of commercial Bifidobacterium spp in skim milk containing oligosaccharides and inulin.J. Food Sci. vol.６５（５）:pp.８８４〜８８７）。プロバイオティック生物がこれらの製品中で示す生存度は往々にして乏しい。生プロバイオティック細菌を含む市販の殺菌乳製品は、典型的に、棚寿命が約２週間しかない。更に、米国内で販売されている市販の未発酵乳中のビフィズス菌の１８日に渡る期間での生存度評価により、 製品の消費期限までにビフィズス菌集団は７１％減少し且つビフィズス菌数はml製品あたり１０6cfuを僅かに超えるだけだということが示されている（Shin,H-S、Lee,J-H.、Pestka.J.及びUstunol,Z.２０００. Viability of commercial bifidobacterium commercial dairy products during refrigerated storge.J. Food Protection. vol.６３（５）:pp.３２７〜３３１）。牛乳、ヨーグルト及びチーズなどの日常の製品中でのバイオプロティクスの生存度を向上させるために、いくつかの研究が行われてきた。その生存度向上のための方法とは、用いられるプロバイオティクスの種又は株、酸素、酸度、pH、温度を調節すること及びプロバイオティクスの生存度を増強するだろうビフィズス菌因子（bifidogenic factors）を使用することによる。しかし、棚寿命が延長された製品を生産する首尾良い方法はない。
幼児において確認された、ビフィドバクテリウム及び他のプロバイオティクスによる健康上の利点により、現在ヨーロッパ及びアジアなど世界のいくつかの地域で市場に出されているビフィズス菌含有乳児用製剤の開発がもたらされた。しかし、これらの幼児用製剤は、粉末形態の幼児用製剤であり、即ち、それらは、都合の良いすぐに使用できる乳組成物ではない。これら粉末化された幼児用製剤に伴ういくつかの問題がある。製造及び保存中にプロバイオティクスが死滅し、それ故に幼児に対して健康上の所望の利点をもたらすことができないから、それらは往々にして効果がない。更に、市販の、滅菌された、すぐに使用できる幼児用製剤は、往々にして粉末よりも好適である。その理由は、利便性と消費者に対する安全性にある。粉末幼児用製剤を再構築するために用いられる滅菌が不十分な水は、幼児に対して健康上の危険を課しうる。類似して、粉末製剤を不適切に再構築をすることは、幼児に対して有利な濃度よりも高いかあるいは低い栄養及びプロバイオティクスをもたらしうる。
乳組成物
市販の乳組成物は低温殺菌を用いて生産されている。低温殺菌には牛乳が特異的な温度で特異的な時間に渡り加熱されることが必要である。低温殺菌方法により全ての病原体及び腐敗の原因になる大部分の微生物が殺される。この方法により生産された乳は、約１５日に渡る冷蔵棚寿命を有する。プロバイオティクスを含有する市販の乳組成物は、プロバイオティックを乳に対して低温殺菌前に添加することによって生産できうるが、この低温滅菌方法で多くのプロバイオティック微生物が殺されるだろうし、それ故に、消費者が乳を消費する場合、十分な用量のプロバイオティクスを得ることの妨げとなる。類似して、プロバイオティクスを含有する乳組成物は、プロバイオティックを乳に対して低温殺菌後に添加することによってのみ生産できうる。例えば、米国特許第５，９０２，５７５号には、低温殺菌及びビタミン添加した１％低脂肪乳に対して、プロバイオティック混合物を、当該乳がそれ用の容器に詰められる直前に添加することにとって製造された、プロバイオティクスを含有する市販の乳組成物が開示されている。
好適な方法において、プロバイオティクスを含有する市販の乳組成物は、プロバイオティックを乳に対して低温殺菌後に添加することによって生産されている。プロバイオティクスは、組成物中で増殖する他の微生物と競合しなければならない。研究により、ビフィドバクテリウムspp.及びラクトバチルスspp.などのプロバイオティクスを含有する乳組成物は、典型的に、約４℃で保存された場合には約２０日の棚寿命有し、そして棚寿命の最後で生存しているプロバイオティクスはたった約３０％のみであることが示されている（Shin,H-S、Lee,J-H.、Pestka.J.及び Ustunol,Z.２０００. Viability of commercial bifidobacterium commercial dairy products during refrigerated storge.J. Food Protection. vol.６３（５）:pp.３２７〜３３１）。棚寿命を延ばし且つ生存度を向上させるための方法には、改良された菌株を探すこと並びにアスコルビン酸及び増殖因子などの様々な化合物を組成物に対して添加することも伴う。これらに限定した結果、プロバイオティクスを含有する現在の市販の乳組成物は、健康上の所望の利点を与えるのに必要な数の微生物を有し得ない。そしてまた、かかる組成物は約２０日で腐敗し、それは販売されず、そして消費されたものは廃棄物として捨てられている。
それ故に、棚寿命を例えば９０日超に延ばし、且つかかる長期に渡り生存し続けるプロバイオティクスを含有する新規且つ改良された乳組成物に対する要請がある。
発明の概要
従って、本発明の目的は、プロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産するための方法を供することである。
本発明の他の目的は、プロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を提供することである。
本発明の更なる目的は、延びた棚寿命の間生存し続けるプロバイオティクスを含む棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を提供することである。
本発明の更なる目的は、消費者に対して推奨量の生存プロバイオティクスを供給するのに十分な量においてプロバイオティクスを含有する、棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を提供することである。
本発明の更なる目的は、消費者の健康に利益をもたらす十分な量においてプロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を提供することである。
これら及び他の目的は、新規の方法を用いることで達成されている。この方法において、乳組成物は超高温殺菌され（ultrapasteurized）、約２０〜３０℃に冷却され、そして無菌条件下で調製されたプロバイオティック培養物を接種されている。生成される乳組成物はすぐに使用でき、棚寿命が延び、そして驚くことに、９０日超に延びた棚寿命後も、消費者に対して有利であろう十分なプロバイオティクスを含む。プロバイオティクスは、消費者が、有利な量のプロバイオティックを獲得するように特異的な量で組成物に対して添加されている。好適な実施態様において、前記方法は、プロバイオティクスを含有する幼児用製剤を生産するために用いられている。かかる幼児用製剤は、幼児の腸内のミクロフローラを改善するために幼児に対して与えることができうる。
本発明の、他の目的及び更なる目的、特徴及び利点は、当業者に明らかであろう。
発明の詳細な説明
定義
用語「棚寿命の延長」とは、本明細書中で用いられた場合、期間を意味し、その期間とは、製品を、その質が所定の最低限許容できるレベルを下回ることなく保存できる期間である。本発明の乳組成物に関する最低限の許容できる量には、組成物が９０日以上に渡り実質的に同じ物理的及び化学的特性、例えば、風味、におい、色、粘度、沈殿作用などを維持し、且つその組成物が冷蔵条件下、即ち、約４℃で保存されている場合に、生存するプロバイオティクスを接種された量の８０％以上の量において含有することが求められる。
用語「すぐに使用できる」とは、本明細書中で用いられた場合、他の成分もしくは更なる水を加えることがない、消費のための準備が整っている液体形態の乳組成物もしくは幼児用製剤を意味する。
用語「プロバイオティック」とは、本明細書中で用いられた場合、ヒト又は動物に対して、腸中で固有のマイクロフローラの特性を改善することによって、有利な影響を及ぼす、生きている微生物の培養物を意味する。
用語「無菌条件」とは、本明細書中で用いられた場合、微生物を本質的に伴わない雰囲気を意味し、そして商業上滅菌され、冷却された乳組成物を、予め滅菌しておいた容器に詰め、しかる後に、微生物を本質的に伴わない雰囲気中で予め滅菌したクロージャーで無菌ハーメティックシーリングをすることを含む。
用語「低温殺菌」とは、本明細書中で用いられた場合、乳組成物が（１）１４５°Fで３０分（２）１６１°Fで１５秒（３）１９１°Fで１秒（４）２０４°Fで０．０５秒、又は（５）２１２°Fで０．０１秒のいずれかに渡り加熱される方法を意味する。
用語「超高温殺菌」とは、本明細書中で用いられた場合、冷蔵条件下での棚寿命が延長された乳組成物を生産するために、乳組成物が２秒以上に渡り２８０°F以上に加熱されていることを意味する。
用語「商業上の滅菌」とは、本明細書中で用いられた場合、（1）（a）通常の、保存及び流通における非冷蔵条件下で食品中での再増殖が可能な微生物；並びに（b）公衆衛生上有意な、生存する微生物（胞子を含む）を伴わないように熱を適用することによって達成された条件；又は（２）水の活量を調節すること及び熱を適用することによって、食品が、通常の保存及び流通における非冷蔵条件下で食品中での再増殖が可能な微生物を伴わないようにすることによって達成された状態を意味する。
用語「幼児用製剤」とは、本明細書中で用いられた場合、人乳に代わり幼児の栄養要求を満たす組成物を意味する。米国では、幼児製剤の内容は、２１CFRの節１００、１０６及び１０７に公開されている連邦規則集によって定められている。これらの規則は、人乳の栄養及び他の特性を模擬するために、主要栄養素、ビタミン、鉱物、及び他の栄養のレベルを規定している。
本発明
１つの観点において、本発明は、プロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産するための方法である。この方法は：
乳組成物を超高温殺菌し；
当該超高温殺菌した乳組成物を無菌条件を維持しながら約２０〜３０℃の温度に冷却し；
ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたプロバイオティック培養物を無菌条件下で調製し；そして
無菌条件下で、プロバイオティック培養物を、冷却された超高温殺菌された乳組成物中へと、１×１０8プロバイオティック微生物／ml以上のプロバイオティック濃縮組成物を有する乳組成物を生産するのに十分な量で接種する、
段階を含んで成る。
プロバイオティクスを含有する生成される乳組成物は、無菌条件下で無菌容器中に詰められ、そして無菌クロージャーでシールされている。好適な実施態様において、冷却された超高温殺菌された乳組成物は、無菌容器中に詰められ、プロバイオティックが当該容器中の組成物中へと無菌条件下で接種され、そして当該容器は無菌条件下で、無菌クロージャーによりシールされている。１つの実施態様において、容器は無菌条件下で無菌不活性化ガス、典型的に窒素でフラッシングされ、シーリングされる直前に当該容器から空気（酸素）が取り除かれる。空気を取り除くことで、ビフィドバクテリウムなど多くの嫌気性微生物が酸素の毒性により死滅するのが防がれる。もし空気が残留したままであれば、酸素の毒性により、生産及び保存の間でのプロバイオティクスの濃度の有意なロスがもたらされる。
本発明中で有用な乳組成物は、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ウマなどの哺乳動物から獲得された乳である。典型的な動物には、ウシ、ヤギ、ヒツジ、バッファロー、ラクダ、ラマ、ロバ、及びシカなどが挙げられる。本発明の乳組成物は、豆乳をも含む。本明細書中で用いられた場合、豆乳とは、脱皮ダイズを粉砕し、粉になったマメを水と混合し、混合物を火に掛け（cooking）、マメを溶解した豆乳から回収することによって作製された液体を意味する。かかる豆乳は、動物乳に類似する味、質感、及び外見を有する乳様製品へと形を変えることができうる。類似して、乳組成物は乳清水解物ベースの乳組成物又はカゼイン水解物ベースの乳組成物であって良い。乳組成物は、単一の種からかあるいは1もしくは複数の種又はダイズに由来する乳の組み合わせから製造された組成物、例えば、ヒトの乳とウシの乳の混合物又はダイズの乳とウシの乳の混合物に由来しうる。好適な実施態様において、乳組成物は、ウシの全乳、脱脂粉乳、無乳糖乳、ダイズベースの乳、乳清水解物ベースの乳、カゼイン水解物ベースの乳及びこれらの混合物からなる群から選択されている。
好適な実施態様において、乳組成物は幼児用製剤である。その幼児用製剤は、与える準備が整っている（使用する準備が整っている）。それは即ち、消費前に、水（好適には無菌水）を添加することなど、更なる組成物変化をする必要がない製剤、又は水とMead Jhonson ＆ Company（Enfamili（登録商標）Infant Formula）もしくRoss Laboratories（Similac（登録商標）Infant Formula）などから市販され入手可能な粉末製剤とを混合することによって作製された、再構築された粉末幼児用製剤でありうる。
本発明中で有用なプロバイオティクスは、典型的な乳組成物、幼児用製剤などと適合する全てのプロバイオティクスである。好適に、プロバイオティクスは、ビフィドバクテリウム属及びラクトバチルス属、例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）及びビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）からなる群から選択されている。最も好適には、プロバイオティクスは、ビフィドバクテイルム・ラクチスspp.（Bifidobacterium lactis spp.）からなる群から選択されている。
前記プロバイオティックは、前記超高温殺菌された乳組成物中へと、プロバイオティックに関する特定の保健専門家により推奨されたプロバイオティック量を担う十分な量で添加されている。一般に、プロバイオティックは乳組成物に対して、１×１０8プロバイオティック微生物／ml以上のプロバイオティック濃度を有する乳組成物を生産するのに十分な量で添加されるだろう。好適に、ビフィドバクテリウム・ラクチスspp.は、組成物に対して、１×１０8プロバイオティック微生物／ml以上の濃度を生ずるのに十分な量で添加されている。
本発明の乳組成物は１もしくは複数の異なるプロバイオティクス又は様々な種類のプロバイオティクスを含有することができる。
本発明のプロバイオティック培養物を無菌的に調製するために、当業者に公知の様々な方法を用いることができうる。好適な方法には、必要量の微生物を無菌ガラスボトル中へと無菌的に秤量し、無菌キャップで容器を密閉し、逆浸透圧水をオートクレーブで１２１℃で２０分に渡り滅菌し、この無菌水をプロバイオティックが入っているボトルへと無菌的に入れて混合し、そして当該ボトルを滅菌容器でキャッピングすることよってプロバイオティック懸濁を調製することを含んで成る。もし所望されれば、振とうすることよってプロバイオティックを分散できうる。類似して、当業者に公知の方法を用い、プロバイオティクスを無菌冷却乳組成物中へと接種できうる。一般に、プロバイオティクスは、単にピペット又は針などの無菌注入器具を用いて、必要量のプロバイオティック溶液を無菌条件下で組成物中へと注入することによって添加されている。
本発明の乳組成物は、９０日以上、好適には１２０以上に棚寿命が延長されている。実際には、本発明の乳組成物の安定性の回帰分析により、それらは約３０００日に渡り安定であることが示されている。
酸素スカベンジャーを組成物に対して添加し、プロバイオティクスの生存度の喪失を防ぐことができうる。アスコルビン酸又は食品産業界で公知且つ組成物と適合する任意の酸素スカベンジャーが用いられて良い。ヨーグルト中のプロバイオティック細菌の生存度を向上するために行われた研究では、２５０mg／kg製品の量のアスコルビン酸が、ラクトバチルス・デルブルエキssp.ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus）の生存度の向上に役立った（Dave,R.I.及びShah,N.P.,１９９７. Vaiability of yogurt and probiotic bacteria in yogurts made from commercial starter cultures. Int Dairy Journal vol.７;pp.３１〜４１）。類似して、プロバイオティクスの生存度を維持する全ての増殖因子が組成物に対して添加されて良い。食品産業界で公知且つ組成物と適合する増殖因子が組成物に対して添加されて良い。それは例えば、フルクトオリゴサッカライド、ガラクトオリゴサッカライド及びイヌリンなどである。前記増殖因子は、生存度の喪失を防ぐのに必要な量で組成物に対して添加されている。典型的には、重量ベースで最大約５％の量で添加されている。脱脂粉乳中でのビフィドバクテリウムspp.の生存度は、高い順に、フルクトオリゴサッカライド、ガラクトオリゴサッカライド及びイヌリン（それらが、最大量の５％（w/v）で存在下する場合）である（Shin,H-S、Lee,J-H.、Pestka.J.及び Ustunol,Z.２０００. Growth and viability of commercial Bifidobacterium spp in skim milk containing oligosaccharides and inulin.J. Food Sci. vol.６５（５）:pp.８８４〜８８７）。
生産及び保存中に無菌条件を維持することができる全ての容器又はクロージャーが用いられて良い。ガラスボトル、ダンボール紙、及びプラスチックボトルが許容されている。各容器は酸素透過性が低く、光を透過しにくく、そしてそれらの取り扱い中に完全性を維持する、例えば、ガラスボトル又はアルミニウムを張った容器などが好ましい。
他の観点において、本明細書中に方法により生産された、プロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産するための方法を供する。
本発明の乳組成物は有用である。何故なら、それらは、消費者に対して、生存するプロバイオティクスを消費者の健康に利益を与えるのに必要な量でデリバリーするための好都合且つ経済的な方法を供するからである。
一般的に以下の例は、本発明の特定の実施態様を示し、そしてその実施及び利点を示しているように、本発明が記載されている。例は、例示の目的で記載されており、以下の態様に明細書又は請求の範囲を限定してないと解される。
実施例１
大量の、すぐに使用できる幼児用製剤の調製
水（２７，０００g）を約１２０°F（１１０〜１３０°F）に加熱した。液体脱脂粉乳、液体乳清、ラクトース、鉱物調製物（リン酸カルシウム塩、クエン酸カリウム塩、クエン酸ナトリウム塩及び塩化カルシウム塩を６，１２０gの１５０〜１６０°Fの水に溶かすことによって作製した）、鉱物／微量鉱物調製物（硫酸第一鉄、塩化ナトリウム及び微量鉱物を１２０gの１００〜１２０°Fの水中で予混合することによって作製した）を添加した。油調製物を、混合脂肪、レクチン及びビタミンADEK1を１６０〜１７０°Fに加熱し濃縮することによって作製した。次いで、モノグリセリド及びジグリセリド及びカラーギナンを前記油調製物に添加して十分に混合した。その後、乳／鉱物調製物及び油調製物を一緒に混合した。次いで、混合物を約２５０°F（２４５〜２５５°F）で４５秒に渡り、直接スチーム注入（direct steam injection）を用いて過熱し、そして約１６０°F（１５０〜１７０°F）に冷却した。１６０°F（１５０〜１７０°F）で、第２段階の圧力、合計５００psig及び３０００psigで混合物を２度ホモジナイズした。混合物を４０°F（３５〜５０°F）に冷却した。全固形物量（約１８％とすべき）を測定した。最終調製物中１２．４％の固形物を得るために添加する水（qs水）の量を計算した。乾燥ビタミン予備混合物及びヌクレオチド予混合物をqs水中に溶かし、そして前記混合物に添加した。最終調製物を、カバーしたタンク中で保存した。生成されたのは、表１に示す成分を含む、１２０Lバッチの、すぐに使用できる幼児用製剤であった。
Figure 2005517383
実施例２
ビフィズス菌の液体懸濁の調製
幼児用製剤はその棚寿命を通じてmlあたり１×１０7以上の生ビフィズス菌を含むべきである。その棚寿命中の生存度の潜在的喪失を補うために、初期の量でmlあたり１×１０7以上の生ビフィズス菌を含む幼児用製剤が目標であった。
ビフィドバクテリウム・ラクチスをこの研究で用いた。その理由は、最も文献に載っている系統であり且つブロバイオティクス研究において最も研究された系統の１つでだからである。幼児及び子供におけるビフィドバクテリウム・ラクチスの使用による多くの臨床的研究が行われてきた。
０．８５gのビフィドバクテリウム・ラクチスBB１２（登録商標、Chr Hansen Bio Systems、Milwaukee,WI）（１×１０10生ビフィドバクテリウム・ラクチス／mlを含む）を無菌的に、３ozの空の滅菌したガラスボトルに入れて当該ボトルを無菌キャップで密閉することによってビヒドバクテリウム懸濁を調製した。空のガラスボトル及びキャップをオートクレーブ中２５０°Fで２０分に渡り置くことによって滅菌した。８５mlの逆浸透水が入っているガラスボトルをオートクレーブ中２５０°Fで２０分に渡りした。このガラスの無菌水（８５ml）を全て、０．８５gのビフィドバクテリウム・ラクチスBB１２が入っているガラスボトル中へと無菌的に入れ、フタをし、そして振ることによって分散させた。幼児用製剤（又は他の乳組成物）３ozと組み合わされた場合、この３mlの接種物は、mlあたり１×１０8生ビフィズス菌を含む製品を生み出すだろう。
実施例３
生ビフィズス菌を含有するすぐに使用できる幼児用製剤の調製
実施例１の多量に調製したすぐに使用できる幼児用製剤を、Micro Theramics UHT／HTST Lab２５ユニット（Micro Thermics,Inc., Raleigh, NC）を用いて間接スチーム注入することによって超高温殺菌した。超高温殺菌する前、前記ユニットを、流入管及び流出管のスチームを２７０°Fで３０分に渡り保つことによって滅菌した。全ての接触表層を２００ppmの塩素消毒薬で洗浄することによってフード領域を消毒した。フード領域にはエアフィルターをも備え付けた。正気流も、外部からの空気が消毒したフード領域に至るのを妨げるために持続させた。
幼児用製剤を２８０°F（１３８℃）で８秒加熱し、そして７３〜８０°F（２３〜２７℃に）冷却した。前記幼児用製剤を滅菌した３ozのガラスボトルへと入れ、そして滅菌したクロージャーでキャップをした。パッケージング用具としてガラスボトルを選択した。何故なら、それは生存度研究を妨害する気体状酸素を透過しないからである。実施例２により調製した３mlのビフィズス菌懸濁を無菌的にガラスボトルに接種し、そしてヘッドスペースの酸素を除去するために、窒素でフラッシング（約５psiの圧力で１０秒）した。このボトルを滅菌したクロージャーでキャップをした。幼児用製剤の汚染を避けるための予防措置を厳正に確認した。
ボトルとキャップに関して無菌条件が十分であることを確かめるために、滅菌したボトル及びキャップの微生物学的（スワブ）試験を行った。試験により得たことは、全菌数が１０cfu／ボトル及びキャップ未満であったことである。
ビフィズス菌を接種する前の幼児用製剤には、ビフィズス菌と競合するであろう生存している他の微生物が含まれていないことが重要である。ビフィズス菌と競合するであろう他の微生物が存在することで、製品の棚寿命が短くなるだろう。ビフィズス菌は他の微生物の存在下では殆ど競合できない。従って、容易に数が増えないであろう（Genoms,A,M,P. 及びMalcata,F.X.,１９９９.Bifidobacterium ssp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properities relevant for use as probiotics. Food Science and Technology １０: pp.１３９〜１５７）。
２７０°F（１３８℃）で８時間に渡る超高温殺菌条件の、ビフィズス菌と競合しうる微生物を死滅させることにおける効果を測定するために、このような加熱条件下に委ねた製品試料を微生物学的に試験した。試料は全菌数がmlあたり１０cfu未満に至った。
充填、ガス充填、及びキャッピングの状態にありうる、ビフィズス菌を接種した超高温殺菌した幼児用製剤中の汚染微生物の存在を確認するために、ネガティブコントロールの試料（ビフィズス菌を伴わない、超高温殺菌した幼児用製剤）も調製した。
実施例４
保存、及び生存度の観察
実施例３に由来する実験試料（ビフィズス菌を伴う）及びコントロールの試料（ビフィズス菌を伴わない）を冷蔵条件（４〜７℃）下で９１日に渡り保存した。実験及びコントロールの試料の各２つのボトルを週ごとに回収した。ビフィズス菌を下のようにして数えた。試料をLactobacilli MRSアガー（Difco＃０８８２−１７−０）に塗布した。この接種したプレートを嫌気条件下（５％CO2、５％H2及び９０％N2）で９８°F（３７℃）で７２時間に渡りForma Scientific Model １０２４（Thermo Forma Marietta 、OH）チャンバーでインキュベートした。控えのボトルも、酸度の増加について、滴定法を用いて試験し、そしてpHをOrion Reserch デジタル pHメーター（Orion Reserch, Chambride, MA）を用いて測定した。実験試料及びコントロール試料の生存度を表２に示している。
Figure 2005517383
表２によれば、コントロールの試料では、保存期間を通じて全試料上で、１０cfu／ml未満の測定値に基づき、嫌気条件下で生存できる微生物が全く生じていなかった。このことは、試料の調製中での汚染がないことを証明している。実験試料は９１日の保存期間を通じて目標量の、１×１０7生菌／ml製品、以上のレベルを維持していた。この量は９１日を超えても維持されることは確実である。生存度の値（log cfu／mlの２つの側定値の平均）をｙ軸上に、ｘ軸上の時間（日）に対してプロットした。得られた曲線は、ｙ＝−０．０００８＋８．００９７の直線回帰方程式であった。もしこのプロットで、９１日を越えた保存を推測すれば、この製品に関して、治療上有利なビフィズス菌の推奨された最小量である、１×１０6生菌／ml試料の量に到達するには約２５００日を要するだろう。従って、このデータにより示されることは、本発明は、プロバイオティクスを含有する乳組成物の棚寿命を１００日超、最も可能性としては数百日に延ばすことができるということである。それとは対照的に、市販の未発酵乳製品(１×１０6生菌／mlを主張する)の冷蔵条件での棚寿命は非常に限られており、それはたった２１日である（Shin,H-S、Lee,J-H.、Pestka.J.及び Ustunol,Z.２０００. Viability of commercial bifidobacterium commercial dairy products during refrigerated storge.J. Food Protection. vol.６３（３）:pp.３２７〜３３１）。これらの市販の製品は、プロバイオティック培養混合物を、殺菌及びビタミン添加された牛乳に対して、カートンに詰める直前に添加することによって生産されている（米国特許第６，１９４，５７８号を参照のこと）。
保存期間中に観測した実験試料及びコントロールの試料の酸度及びpHを表３に示している。
Figure 2005517383
表３を参照すると、保存期間中に実験及びコントロールの両方の試料のpH及び酸度における有意な変化はなかった。酸度の増加及びその後のpHの低下はビフィズス菌の代謝活性を示すものだろう。ビフィズス菌によるラクトースの発酵により生じた酸度は、酸性ショックを生じそしてビフィズス菌を死滅させるだろう。従って、このデータが示すことは、本発明は、プロバイオティクスを含有する乳組成物の棚寿命を有意に延ばすことができるとういことである。乳組成物を滅菌し、ビフィズス菌を接種して冷蔵保存する前に、ビフィズス菌と競合するだろう微生物を死滅させることで、ビフィズス菌の生存度が維持され、それにより棚寿命を有意に延ばすことができる。
本発明の修飾と改変は、上記の内容の範囲から可能であることは明らかであろう。それ故に、詳細に説明された以外に本発明が実施されうることは、添付の請求の範囲内であると解される。

Claims (25)

  1. １又は複数のプロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産するための方法であって、当該方法は：
    乳組成物を超高温殺菌（ultra-pasteurizing）し；
    当該超高温殺菌した乳組成物を無菌条件下で冷却し；
    プロバイオティック培養物を調製し；そして
    当該プロバイオティック培養物を冷却した超高温殺菌した乳組成物中へと無菌条件下で接種する、
    段階を含んで成る方法。
  2. 前記プロバイオティック培養物が、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium genera）、ラクトバチルス属（Lactobacillus genera）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されている、請求項１に記載の方法。
  3. 複数のプロバイオティック培養物が調製され、そして、より冷えた超高温殺菌された乳中へとに接種されている、請求項１に記載の方法。
  4. 前記プロバイオティック培養物が、１×１０8プロバイオティック微生物／ml以上のブロバイオティック濃縮組成物を有する乳組成物を生産するのに十分な量で接種されている、請求項１に記載の方法。
  5. 前記プロバイオティック培養物が、ビフィドバクテリウム・ラクチスspp.（Bifidobacterium lactis spp．）である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記超高温殺菌された乳組成物が約２０℃〜約３０℃の温度に冷却されている、請求項１に記載の方法。
  7. 更に、プロバイオティクスを含有するすぐに使用できる乳組成物を無菌容器中に置き、そして本質的に微生物を伴わない雰囲気中で当該容器を無菌クロージャーでシーリングすることを含んで成る、請求項１に記載の方法。
  8. 前記容器が、無菌条件下で、シーリングされる前に、無菌不活性化ガスによりフラッシングされている、請求項７に記載の方法。
  9. 前記乳組成物が、ウシの全乳、脱脂粉乳、無乳糖乳、ダイズベースの乳、乳清水解物ベースの乳、カゼイン水解物ベースの乳、及びこれらの混合物からなる群から選択されている、請求項１に記載の方法。
  10. 前記乳組成物が幼児用製剤である、請求項１に記載の方法。
  11. １又は複数のプロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物を生産するための方法であって、当該方法は：
    乳組成物を超高温殺菌し；
    当該超高温殺菌した乳組成物を無菌条件を維持しながら約２０℃〜約３０℃の温度に冷却し；
    ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属及びそれらの組み合わせからなる群から選択された１つ以上のプロバイオティック培養物を無菌条件下で調製し；そして
    当該プロバイオティック培養物を冷却した超高温殺菌した乳組成物中へと、無菌条件下で、１×１０8プロバイオティック微生物／ml以上のブロバイオティック濃縮組成物を有する乳組成物を生産するのに十分な量で接種する、
    段階を含んで成る方法。
  12. 前記プロバイオティクスがビフィドバクテリウム・ラクチスspp.である、請求項１１に記載の方法。
  13. 更に、前記プロバイオティクスを含有するすぐに使用できる乳組成物を無菌容器中に置き、そして本質的に微生物を伴わない雰囲気中で当該容器を無菌クロージャーでシーリングすることを含んで成る、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記容器が、無菌条件下で、シーリングされる前に、無菌不活性化ガスによりフラッシングされている、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記乳組成物が、ウシの全乳、脱脂粉乳、無乳糖乳、ダイズベースの乳、乳清水解物ベースの乳、カゼイン水解物ベースの乳、及びこれらの混合物からなる群から選択されている、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記乳組成物が幼児用製剤である、請求項１１に記載の方法。
  17. １又は複数のプロバイオティクス、請求項１に記載の方法により生産された乳組成物を含有する、棚寿命が延長されたすぐに使用できる乳組成物。
  18. １又は複数のプロバイオティクスを含有する棚寿命が延長されたすぐに使用できる幼児用製剤を生産するための方法であって、当該方法は：
    幼児用製剤を超高温殺菌し；
    当該超高温殺菌した幼児用製剤を、無菌条件を維持しながら約２０℃〜約３０℃の温度に冷却し；
    ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属及びそれらの組み合わせからなる群から選択されたプロバイオティック培養物を無菌条件下で調製し；そして
    当該プロバイオティック培養物を冷却した超高温殺菌した幼児用製剤中へと、無菌条件下で、１×１０8プロバイオティック微生物／ml以上のブロバイオティック濃縮組成物を有する幼児用製剤を生産するのに十分な量で接種する、
    段階を含んで成る方法。
  19. 前記超高温殺菌段階における幼児用製剤は、すぐに使用できる幼児用製剤である、請求項１８に記載の方法。
  20. 複数のプロバイオティック培養物が調製され、そして、より冷えた超高温殺菌された幼児用製剤中へと接種されている、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記超高温殺菌段階にある幼児用製剤が、再構築された幼児用粉末製剤である、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記プロバイオティックがビフィドバクテリウム・ラクチスspp.である、請求項１８に記載の方法。
  23. 更に、前記プロバイオティックを含むすぐに使用できる幼児用製剤を無菌容器中に置き、そして本質的に微生物を伴わない雰囲気中で当該容器を無菌クロージャーでシーリングすることを含んで成る、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記容器が、無菌条件下で、シーリングされる前に、無菌不活性化ガスによりフラッシングされている、請求項２３に記載の方法。
  25. １又は複数のプロバイオティクス、請求項１８に記載の方法により生産された幼児用製剤を含有する、棚寿命が延長されたすぐに使用できる幼児用製剤。
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