SE510813C2 - Bakteriestam av arten Lactobacillus Paracasei subsp. paracasei, sammansättning därav för användning i livsmedel, samt produkt innehållande stammen - Google Patents

Description

lO 15 20 25 30 35 510 813 of Nlicroorganisms - BCCM, LMG collection, och där givits beteckningen LMG P-17806.

Stammens fördelar LMG P-17806 har, i förhållande till kända laktobacillstammar, avgörande fördelar vid användning som probiotika i livsmedel och naturläkemedel genom en unik kombination av goda egenskaper: - stammen har god resistens mot magsaft och gallsalter, men till skillnad från många andra stammar dekonjugerar stammen inte gallsalterna; den har stor förmåga att assimilera kolesterol; - stammen klarar väl passagen genom magsäcken; - stammen påverkar förhållandena i en modell av tjocktarmen genom att där höja produktionen av L-mjölksyra; - stammen är ej mer proinflammatorisk än vanliga yoghurtbakterier; - stammen förhindrar att tarmceller invaderas av patogena mikroorganismer såsom Salmonella typhmurium; - stammen har en antagonistisk inverkan mot magsårsbakterien Helícobacter py/ori; - stammen bildar bakteriociner som är verksamma mot clostridier; - stammen överlever väl i mjölk liksom i fryst och torkad form; - stammen påverkar till skillnad från de flesta andra laktobaciller smaken på fermenterade mjölkprodukter på ett gynnsamt sätt (ger ingen bismak).

Den aktuella stammen av Lactobacillus paracasei subsp. paracase/ kan användas som tillsats i livsmedel, eller som naturläkemedel, s k "l\lledical Food", eller som tillsats i naturläkemedel.

Sådant läkemedel kan användas för barn i syfte att lindra atopiska problem; för äldre personer för att korrigera förändrad mikroflora orsakad av normala åldersförändringar eller en förändrad saltsyrasekretion; och för personer i allmänhet för att normalisera tarmfloran, varvid halten klostridie- bakterier sjunker, laktobaciller och bifidobakterier ökar och höga halter av koliforma bakterier minskar.

Genom dessa egenskaper skiljer sig stammen LMG P-17806 från tidigare kända stammar, vilket kommer att visas i nedanstående exempel.

Framställning av stammen Stammen framställs på vanligt sätt för laktobaciller. Ett substrat lämpat 10 15 20 25 30 35 3 510 813 för laktobaciller används. Detta substrat bör t ex innehålla minst en av de kolhydrater som stammen kan förjäsa, enligt vad som anges ovan, i kombination med proteiner, vitaminer, mineraler och andra näringsämnen som normalt krävs av Iaktobaciller. Exempel på lämpliga kommersiella substrat är jästextrakt-glykosbuljong, MRS (de Man-Rogosa-Sharp-buljong), Rogosa, mjölk med tillsats av en mindre mängd jästextrakt, o s v. Stammen odlas mikroaerofilt eller helt syrefritt, lämpligen vid en temperatur av mellan 15 och 42°C. Om substratet ympas med 0,1 till 1% ymp är en odlingstid mellan 10 och 40 timmar lämplig. Stammen kan, om så önskas, koncentreras genom centrifugering eller filtrering varefter koncentratet tvättas för att avlägsna odlingsmediet. Koncentratet kan sedan frysas eller frystorkas på vanligt sätt.

Härigenom kan preparat med mellan 100 miljoner och 100.000 miljoner levande bakterier LMG P-17806 per g framställas. Ett preparat kan sedan användas som sådant eller användas som tillsats till livsmedel, t ex till mjölk eller annan produkt som ger LMG P-17806 möjlighet att överleva och om önskvärt tillväxa. uNDERsöKNmGAR A. Undersökning rörande stammens passage genom mag/tarmkanalen LMG P-17806 odlades på beskrivet sätt och tillsattes tillsammans med en yoghurtkultur till mjölk. En fermenterad produkt tillverkades genom att mjölken inkuberades fem timmar vid 42°C. En välsmakande produkt erhölls, vilken innehöll drygt 100 miljoner levande LMG P-17806 per g produkt. Friska personer fick under en vecka inta 3 x 200 g produkt dagligen. Det totala intaget av LMG P-17806 blev mellan 40 miljarder och 200 miljarder.

Fecesprov undersöktes före, efter en veckas konsumtion samt en vecka efter upphört intag. Som framgår av nedanstående tabeller 1 och 2 erhölls en kraftig höjning av antalet laktobaciller hos försökspersonerna. Två isolat per försöksperson bestämdes till species från varje tillfälle, dvs totalt 20 isolat. 18 av isolaten för konsumtionstiden visade sig enligt fenotypisk klassificering utgöras av LMG P-17806. Denna bakteriestam påträffades inte i proven före eller efter intaget av LMG P-17806.

Genomsnittligt var halterna i fecesproven under tillförseln mycket höga och varierade endast måttligt från 63 miljoner till 320 miljoner per g, dvs med en faktor 5. Anmärkningsvärt var att halterna var i stort sett desamma oberoende av vilka halter som uppmättes före försökets början. Efter upphörd 10 15 20 510 sis 4 tillförsel återgick halterna till vad som synes vara naturligt för aktuell försöksperson.

I nedanstående tabeller 1 och 2 bestämdes halten laktobaciller i feces, i miljoner per g, genom plattgjutning och med substratet Flogosa.

Tabell 1 5 försökspersoner med ursprungligen låg halt laktobaciller Försöksperson Före försöket Under försöket Efter försöket 1 0,05 120 0,07 2 0,15 320 0,12 3 0,08 97 0,14 4 0,009 63 0,02 5 <0,001 278 0,002 Tabell 2 5 försökspersoner med hög halt laktobaciller Försöksperson Före försöket Under försöket Efter försöket 6 1.2 297 1,3 7 0,7 83 0,6 8 0,2 136 0,18 9 4.3 74 3,5 10 0,6 21 2 0,8 Undersökningen visar att stammen har god överlevnad vid passagen genom mag/tarmkanalen B. Undersökning avseende stammens bildning av L-mjölksyra i en modell av tjocktarmen Den fermenterade produkten ovan tillfördes till en s k SHllVlE-reaktor, som är en in-vitromodell av tarmen. Prov togs ut från den del av reaktorn som motsvarar tjocktarmens tre viktigaste delar. Liknande jämförande försök gjordes med några andra laktobacillstammar, bl a med en närbestäktad L. paracase/ subsp. paracasei. Som framgår av följande tabell 3 nedan gav LMG P-17806 en kraftig ökning av L-mjölksyraproduktionen, vilket är just den mjölksyraisomer som LMG P-17806 bildar. En produktion av mjölksyra anses 10 15 20 25 30 5 510 813 som gynnsam av flera anledningar, bland annat med hänsyn till mjölksyrans antibakteriella inverkan liksom med hänsyn till att ett lågt pH antas minska tillgängligheten och bildningen av kväveföreningar.

Tabell 3 Produktion av L och D mjölksyra i SHIME-reaktor efter tillsats av skilda mjölksyrabakterier i mg per liter reaktorinnehåll Mjölksyrabakterie Reaktor 4 Reaktor 5 Reaktor 6 L D L D L D LMG P-17806 300 80 500 100 280 90 L. paracasei 40 80 200 70 130 40 L. rhamnosus 90 10 10 70 80 10 L. p/anïarum 60 50 60 70 40 50 I tabellen avser "L" den västervridna isomeren av mjölksyra och "D" den högervridna isomeren.

Reaktor 4 motsvarar övre delen av tjocktarmen, reaktor 5 den mittersta delen och reaktor 6 den nedre delen av tjocktarmen. Undersökningen visar att stammen bildar L-mjölksyra i en modell av tjocktarmen.

C. Undersökning hur stammen skyddar tarmepitelceller mot invasion av Salmonella typhímurium Tarmepitelceller av typen CaCo-2 celler odlades in vitro. Dessa tillsattes en kombination av laktobaciller och Sa/mone//a typhímurium i förhållandet 100:1 med en tillsats av en miljon salmonella per ml. Effekten studerades efter inkubation i 120 min vid 37°C. Mängden invaderande salmonella bestämdes genom att plattorna med vidhäftade CaCo-2 celler tvättades tre gånger. De vidhäftade cellerna behandlades med antibiotikat gentamycin i en koncentration av 100 mg/l under en timme för att avdöda alla bakterier som ej invaderat celler. Därefter tvättades plattorna med PBS för att avlägsna all gentamycin och slutligen frigjordes de inneslutna bakterierna genom att CaCo-2 cellerna behandlades med 0,1 % Triton-X under omskakning. Antalet salmonella bestämdes därefter med vanlig plattgjutningsmetodik. LMG P-17806 hade en markant effekt på så sätt att den reducerade antalet invaderade celler. Den närbesläktade paracasei- varianten 506 tycktes däremot snarast stimulera invasionen av salmonella- 10 15 20 510 813 6 bakterier. Också i denna egenskap visade LMG P-17806 en positiv effekt.

Resultaten redovisas i nedanstående tabell 4.

Tabell 4 lnvasion av salmonella Mjölksyrabakterie % invaderande salmonella utan mjölksyrabakterier med mjölksyrabakterier LMG P-17806 2,5 0,75 L. paracase/'K 506 2,5 7 L. p/antar/'um 2 2 L. rhamnosus 2,5 0,75 Tabellen visar att stammen LMG P-17806 ger ett påtagligt skydd mot invasion av salmonellabakterier.

D. Undersökning av skydd mot Helicobacter pylori l en musmodell där mössen infekterats med He/icobacterpy/ori undersöktes effekten av att tillföra en fermenterad mjölkprodukt, dels med, dels utan stammen LMG P-17806 på halten H. pylori mätt i feces. Mössen infekterades med 100 miljoner av stammen H. py/ori 17874 i spiralform vid tre tillfällen med en dags mellanrum. Därefter gavs mössen försöksprodukter och halten H. py/orii feces mättes med hepariniserade magnetkulor och Enzyme lmmuno Assay. Tre produkter undersöktes. Alla fermenterade mjölkprodukter visade sig minska andelen H. pylori, men effekten inträffade väsentlig snabbare i de fall då produkten innehöll LMG P-17806 jämfört med vanlig yoghurt respektive jämfört med en stam av L. fermentum KLD. 7 510 813 Tabell 5 Halt H. py/orii feces mätt med hepariniserade magnetkulor och Enzyme lmmuno Assay Produkt före efter 2 efter 7 7 dagar dagars intag dagars intag efter avslutat intag vanlig yoghurt 1,48 1,86 0,63 2,25 Yoghurt med 1,65 1,62 0,94 1,61 L. fermentum Yoghurt med 1,80 0,68 0,61 1,71 LMG P-17806 Siffrorna i tabellen anger absorbansen vid 405 nm och är relativa halter.

E. Undersökning av stammens LMG P-17806 inverkan på immunförsvaret lmmunförsvarssystemet styrs av en rad signalsubstanser, s k cytokiner. En del av dessa kan vara proinflammatoriska. LlVlG P-17806's 10 inverkan på produktion av cytokinerna TNF-alfa och |L-6 jämfördes med inverkan av de två arter som ingår i yoghurtkultur, L. de/bruckeí subsp. bu/gar/cus och Streptococcus thermophi/us. Vita blodkroppar avskiljdes från humant blod och tillsattes levande eller med glutaraldehyd-avdödade bakerier i en halt av 10 miljoner leukocyter. Som kontroll användes Iipopolysacharider 15 (LPS) från E-coli. Resultaten redovisas i nedanstående tabell 6. Resultaten visar att i den använda modellen har LMG P-17806 samma inflammatoriska egenskaper som en vanlig yoghurtkultur.

Tabell 6 20 Stammens LMG P-17806's inverkan på immunförsvaret Mjölksyrabakterie TNF-alfa mg/l |L-6 mg/l levande avdödade levande avdödade S. thermophi/us, E584 12 1 0,4 <0,1 L. bu/garicus, E585 2 3 0,5 0,1 LMG P-17806 4 1 0,7 <0,1 F. Undersökning av stammens LMG P-17806 resistens mot antibiotika Probiotika kan vara värdefullt att använda i samband med störningar i 10 15 20 25 30 35 sin sis 8 balansen hos tarmfloran under medicinering med antibiotika. Samtidigt är det viktigt att probiotika inte bidrar till att sprida antibiotikaresistens, och detta är speciellt viktigt vid en samtidig användning av probiotika och antibiotika.

Stammens Ll\/IG P-17806 resistens mot skilda antibiotika har därför fastställts. Stammens LMG P-17806 känslighet för skilda antibiotika bestämdes genom att fastställa den halt vid vilken en 50% tíllväxtreduktion av stammen, mätt i optisk densitet, erhölls.

Det visade sig att stammen LMG P-17806 var resistent mot vancomycin och hämmades ej ens av 256 mg/i. Stammen var något resistent mot trimetoprim och cefotaxim, en optisk densitet (OD) av 50% erhölls vid 12 respektive 4 mg/I. Stammen LMG P-17806 var däremot känslig för kloramfenikol, erytromycin, rifampicin och tetracyklin, där redan nivåer under 1 mg/I resulterade i en 50% tillväxthämning. inverkan av antibiotika undersöktes också översiktligt genom användning av s k Sensi disks från Oxoid. Enligt dessa resultat var LMG P- 17806 resistent mot aztronam, ceftaximid, cefoxitin, colistinsuifat, kanamycin, polymyxin B, streptomycin och vancomycin.

LMG P-17806 skulle således enligt dessa resultat vara speciellt intressant att använda samtidigt med terapi med antibiotika som vancomycin, trimetoprim liksom fiera cefioxaciner, vilka samtliga är antibiotika med kända biverkningar på tarmflora och tarmfunktion.

ANVÄNDNING AV STAMMEN LMG P-17806 Exempel 1, Framställning av bakteriekoncentrat: Ett fryst bakteriekoncentrat med 10 miljarder LMG P-17806 per g framställdes på ovan angivet sätt genom att iaktobacillen odlades i ett substrat av vassie tillsatt med 1 g jästextrakt per liter vid ett konstant pH på 5,5 under 14 timmar vid 36°C. Bakterien avskiljdes genom centrifugering med samtidig tvättning av centrifugatet. Koncentratet frystes i flytande kväve och förvarades sedan vid -80°C till dess det skulle användas.

Exempel 2, Framställning av en fermenterad mjölkprodukt: Av mjölk framställdes en produktmjölk genom att mjölken homogeniserades, värmebehandlades vid 95°C i fem minuter och tempererades till 37°C. Produktmjölken ympades med 0,01% av en kommersiell, fryst yoghurtkultur och 0,5% av LMG P-17806 koncentratet, 10 15 20 25 30 9 510 813 Kulturerna fick tillväxa under 6 timmar vid angiven temperatur. Mjölken hade då koagulerat och pH fallit till 4,55. Koaglet bröts och produkten kyldes till 12°C, varefter den förpackades i vanliga plastbägare, som normalt används till yoghurt, och efterkyldes i ett kylrum med en temperatur av 5°C under 1 dygn. pH hade då fallit till 4,4. Produkten lagrades därefter vid 8°C i upp tiil tre veckor.

Halten av stammen LMG P-17806 följdes, och som framgår av resultaten i nedanstående tabell 7 skedde en begränsad tillväxt av stammen LMG P-17806 under odlingen, och LMG P-17806 överlevde mycket väl lagring under tre veckor vid ett pH lägre än 4,4.

Tabell 7 Stammens LMG P-17806 lagringsduglighet i mjölkprodukt Ymp Halt i Halt efter Efter 1 v Efter 2 v Efter 3 v produktmjölk odling lagring lagring lagring 9900 49 97 132 118 121 Halterna anges i miljoner per gfam.

Produkten hade ett normalt utseende med en vassleavskiljning efter 14 dagars lagring på knappt 1%. Produkten smakade förträffligt och hade en jämn konsistens och en frisk, mild smak. Försöksprodukten fick bättre omdömen än normal yoghurt vid en oberoende konsumentundersökning utförd av ett utredningsinstitut. Produkten jämfördes i en konsument- undersökning, där den som smakade inte kände till vilken produkt som provsmakades, med motsvarande produkt utan stammen LMG P-17806.

Produkten med LMG P-17806 föredrogs av 74% av provsmakarna, och den fick i en 9-gradig skala medelvärdet 7,6 poäng, vilket är signifikant högre än resultatet för vanlig yoghurt. Omdömet var drygt 1 poäng högre än för en tidigare känd probiotisk kultur med Lactobacillus ac/'doph//us Resultaten skiljer sig också från de som tidigare erhållits vid jämförelser mellan ren yoghurt och blandprodukter av yoghurt och de probiotiska bakterierna L. acidophi/us respektive Bifidobacterium longum. Vid dessa jämförelser har inte några signifikanta skillnader kunnat noteras mellan ren yoghurt och respektive blandprodukt.

Exempel 3, Lämplig tillsats av stammen LMG P-17806 Försök gjordes också för att utröna lämpligt område för tillförsel av 10 15 20 25 510 sis " 10 stammen LlVlG P-17806. Mjölk behandlades och tillsattes yoghurtkultur enligt ovan, medan tillsatsen av koncentrat av stammen LMG P-17806 varierade från 5% till 0,01%. Vid så hög halt som 5% ymp av LMG P-17806 erhölls en bismak, troligen härrörande från komponenter i själva ympen. pH-utvecklingen var dock normal och produktens utseende var normalt. Halten LMG P-17806 var i färsk produkt 504 miljoner per g, och halterna höll sig på denna nivå under lagringen. Vid tillsats av 0,01% LMG P-17806 koncentrat kunde inte produkten sensoriskt skiljas från vanlig yoghurt, och halten LMG P-17806 understeg redan efter 1 vecka en miljon per ml, vilket är den minsta halt som en produkt skall få innehålla för att man enligt förslag till internationell lagstiftning skall få ange att produkten innehåller ett speciellt probiotikum.

Exempel 4, Framställning av fermenterad specialprodukt Försöket utfördes som ovan bortsett från att mjölken också tillsattes 0,4 g jästextrakt per liter. Ymp skedde med 0,01% av samma yoghurtkultur som ovan men endast 0,1 % LMG P-17806 koncentrat tillsattes. lnkubering skedde vid 34°C under 8 timmar, varefter processen bröts och produkten kyldes, förpackades och lagrades som i ovanstående exempel 3. LMG P- 17806 tillväxte under dessa betingelser 10 gånger, och i likhet med ovan överlevde bakterien väl under lagring. Resultaten redovisas i nedanstående tabell .

Tabell 8 Stammens LMG P-17806 lagringsduglighet specialmjölkprodukt Ymp Halt i Halt efter Efter 1 v Efter 2 v Efter 3 v produktmjölk odling lagring lagring lagring 9900 10 103 114 109 107 Halterna i tabellen anges i miljoner per g produkt.

Produkten hade ett normalt utseende med en vassleavskiljning efter fjorton dagars lagring på 1,5%. Produkten hade en god, torr smal och hade en jämn konsistens. 10 15 20 25 30 11 510 813 Exempel 5, Framställning av grönsaksjuice innehållande stammen LMG P-17806 En grönsaksjuice bereddes genom att man blandade ett morots- koncentrat och ett apelsinjuicekoncentrat i lika delar, så att pH i den färdiga blandningen blev pH 3,9. Den blandade drycken värmebehandlades och tillsattes 1% respektive 0,1 % av ett LMG P-17806 koncentrat. Halten LMG P-17806 blev 100 respektive 10 miljoner per ml. Drycken förvarades vid 7°C i fyra veckor. Produktens smak påverkades ej, och någon inverkan av lagring eller tillsats av LMG P-17806 konstaterades ej. Tillsats av LMG P-17806 i en halt överstigande 50 miljoner tycktes dock kunna reducera minskningen av C- vitamin. I en produkt utan LMG P-17806, liksom i en produkt med 10 miljoner bakterier per ml sjönk C-vitamin-halten från 25 mg/100g före lagringen till 18 mg efter 4 veckor. Med tillsats av 100 miljoner LMG P- 17806 per ml sjönk halten C-vitamin endast till 22 mg/100 g, dvs en mer än 50% lägre sänkning av C-vitaminhalten. LMG P-17806 överlevde väl, och halten LMG P-17806 efter 4 veckor var endast cirka 40% lägre än i färsk produkt oberoende av tillsatt mängd.

I ett annat försök tillsattes samma fruktdryck 5% LMG P-17806. Detta gav en bismak som förvärrades under lagringstiden.

Exempel 6, Framställning av vällingpulver Vällingpulver tillverkades på vanligt sätt. LMG P-17806 koncentrat enligt ovan frystorkades efter utblandning med majsstärkelse och förvarades sedan förpackat i ett syretätt emballage vid -20°C temperatur. Det frystorkade preparatet innehöll 61 miljarder LMG P-17806 per g.

Vällingpulvret torrblandades med 0,03% LMG P-17806 och förpackades i kvävgasatmosfär i syretätt emballage. Pulvret förvarades först under en tre månader vid +12°C och därefter i rumstemperatur i ytterligare 4 månader.

Halten LMG P-17806 framgår av nedanstående tabell 9. Vällingpulvret gav LMG P-17806 goda överlevnadsmöjligheter, och det är därför möjligt att framställa t ex barnmatsprodukt med hög halt av LMG P-17806. 10 15 20 25 30 510 813 12 Tabell 9 Frystorkat Pulver Pulver Efter 3 Efter 7 preparat före tillsats efter tillsats månader månader 61.000 < 0,0001 20 18 6,5 Halterna i ovanstående tabell anges i miljoner per g pulver.

Vällingpulvret löstes i 9 delar 50°C vatten och halten LMG P-17806 bestämdes. Halten var, i det fall att ett 6 månader gammalt pulver användes, en miljon LMG P-17806 per ml dryck. vällingen kunde inte skiljas från vanlig produkt. Efter förvaring över en natt i rumstemperatur smakade dock vällingen med tillsatt LMG P-17806 svagt sur och hade ett pH på 5,7.

I ett andra försök undersöktes effekten av att tillsätta 1% respektive 0,001 % frystorkat LMG P-17806 preparat. Halterna i Vällingpulvret blev efter tillsats 570 respektive 0,8 miljoner per g. Pulvren förvarades på motsvarande sätt och undersöktes efter 5 månaders lagring. Efter upplösning som ovan var halten i den färdiga vällingen 800 miljoner, respektive för den låga tillsatsen lägre än 10.000 per ml. Med den höga tillsatsen noterades en svagt syrlig smak redan efter 4 timmars förvaring av vällingen vid kroppstemperatur.

Exempel 7, Framställning av torrt pulver för användning som "Medical Food" Ett frystorkat LMG P-17806 koncentrat blandades med skilda halter majsstärkelse i proportionerna 1:1, 1:9, 1:99 respektive 11999. De utblandade pulvren förpackades i små dospåsar med 1 till 100 g per påse.

Påsens material var ogenomträngligt för syre och vattenånga. Påsarna förvarades i frys-, kylskåps- respektive i rumstemperatur. Innehållet användes sedan som tillsats till dryck genom att pulvret blandades med drycken innan den konsumerades. Motsvarande överlevnad som i exempel 6 ovan erhölls.

Pulvret med proportionerna 1:1 förpackades också i gelatinkapslar med 0,4 g per kapsel. Antalet bakterier per kapsel var 10 miljarder. Kapslarna blisterförpackades i ett material med goda barriäregenskaper mot syre och vattenånga. Kapslarna förvarades på samma sätt som anges ovan, och motsvarande goda överlevnadsresultat erhölls.

Exempel 8, Framställning och användning av bakteriemixer LMG P-17806 kan blandas med andra laktobaciller utan att hämma 10 15 20 25 30 13 510 813 dessa. LMG P-17806 tycks inte bilda några ämnen som hämmar andra laktobaciller eller Iaktokocker där LMG P-17806 samodlas med yoghurtkulturer, filkulturer med Iaktokocker eller andra lakobacillarter, såsom L. acidophílus, L. fermentum eller L. rhamnosus. Försök med blandning av frystorkade preparat innehållande samtliga dessa bakterier har visat på oförändrade lagringsegenskaper vare sig blandning skedde med majsstärkelse eller vällingpulver. Efter upplösning av vällingpulvret och förvaring i 2 timmar vid kroppstemperatur och 12 timmar i rumstemperatur kunde inte någon negativ inverkan av LMG P-17806 spåras vare sig på totalhalten laktobaciller eller på halten av endera av bakterierna.

I ett försök att framställa en probiotikafil tillsattes till normal behandlad produktmjölk O,5% filkultur och 0,6% av fryst koncentrat av vardera L. acidophi/us NCFB 7 748, L. fermentum KLD och LMG P-17806. Dock tillsattes endast 0,1 % KLD, då högre tillsatser gav upphov till bismak och till ett dåligt koagel. Mjölken förvarades 19 timmar vid rumstemperatur. Den hade då ett pH på 4,50. Mjölken kyldes till 10°C, förpackades och lagrades vid + 6°C i upp till 14 dagar. Resultaten framgår av följande tabell 10.

Tabell 10 Mjölksyrabakterie Före kylning Efter 5 dygn Efter 14 dygn Laktokocker 730 810 580 L. ac/'dophi/us 1 35 1 42 1 31 L. fermentum 12 14 9 LMG P-17806 112 126 109 Halterna i miljoner per ml av de skilda bakterierna 80 friska försökspersoner fick äta produkterna i samband med en konferensresa till Istanbul i Turkiet. Gruppen delades i två, en som åt en fil enligt ovan med endast LMG P-17806, medan återstoden åt probiotikafilen med tre skilda probiotikstammar. Försökspersonerna befann sig på konferensorten 8 dagar. De började äta produkterna 2 dagar före avresan till konferensorten och fortsatte att äta dem under fyra dagar efter hemkomsten.

Produkterna åts som 3 mellanmål jämnt fördelade under dagen med 150 g per mål. Samtliga försökspersoner utom 2 personer i filgruppen uppgav att de åt produkten enligt schemat. Genom en enkät fick man i en 3-gradig skala ange besvär från mag/tarmkanalen i form av magsmärtor, spänningar, diarré 510 813 14 eller förstoppning. Bortsett från diarré fanns en skillnad så till vida att 35% av försökspersonerna som endast ätit LMG P-l 7806 uppgav att de haft allvarliga eller mycket allvarliga diarréer under minst 2 dagar, medan denna frekvens endast var 22% i gruppen som åt probiotikafilen.

Det tycks således som om en mix av flera olika laktobaciller skulle kunna vara ännu effektivare än endast en ensam bakteriestam. Detta kan bero på att de tillförda laktobacillerna hade skilda egenskaper.

Claims (12)

10 15 20 25 30 35 15 510 813 PATENTKRAV

1. Stam av Lactobacillus användbar som probiotika i livsmedel och naturläkemedel, och vilken är in-vltro resistent mot saltsyra och magsafter och tolererar gallsalter utan att dekonjugera dessa, medan en kraftig assimilering sker, har en stor förmåga att assimilera kolesterol. samt har god överlevnad vid passage genom magsäcken och mag/tarmkanalen, och vilken stam växer optimalt vid cirka 37°C, kännetecknad av att stammen är Lactobacillus paracasei subsp. paracaseí, LlVIG P-17806, vilken utgör en grampositiv, homofermentativ, stavformig bakterie med förmåga att bilda L-mjölksyra, och av att den innehåller tre plasmider med en storlek av 2.2, 4.36 respektive 9.1 Kb.

2. Stam enligt krav 1 eller 2, kännetecknad av att den innehåller 44% GC.

3. Stam enligt krav 1 eller 2, kännetecknad av att den har isolerats från prov från människans gastrointestina mikroflora.

4. Stam enligt krav 1, 2 eller 3, kännnetecknad av att stammen förjäser ribos, adonitol, galaktos, glukos, fruktos, mannos, sorbos, mannitol, sorbitol, N-acetyl-glukosamin, esculin, cellobios, maltos, laktos, sackaros, trehalos, inulin, melezitos, D-turanos och D-tagatos.

5. Stam enligt krav 1, 2, 3 eller 4, kännetecknad av att den tillhandahålls som ett koncentrat i form av fryst eller frystorkat pulver.

6. Stam enligt något av föregående krav för användning i livsmedel och/eller som naturläkemedel, kännetecknad av att stammen Lactobacillus paracasei subsp. paracasei är tillsatt till en mjölkprodukt, en fermenterad mjölkprodukt, en frukt- eller grönsaksdryck såsom grönsaksjuice, citrusfruktjuice, eller juice av annan frukt eller grönsak i en halt av mellan 0,001 % och 5%, företrädesvis mellan 0,01% och 1%.

7. Stam enligt något av kraven 1 - 4 för användning som probiotika i livsmedel och/eller naturläkemedel, kännetecknad av att stammen Lactobacillus paracasel subsp. paracasel enligt uppfinningen är samodlad med yoghurtkulturer eller filkulturer med laktokocker eller andra lakobacillarter, såsom L. ac/'doph/'lus, L. fermentum eller L. rhamnosus.

8. Stam enligt krav 6 eller 7, kännetecknad av att stammen Lactobacillus paracasei subsp. paracasei enligt uppfinningen förekommer i en halt av mellan 1 miljon och 10.000 miljoner levande bakterier per g i den 10 15 20 25 30 510 sis w produkt, i vilken den är tillsatt.

9. Produkt innehållande stammen Lactobacillus paracasei subsp. paracasei enligt något av kraven 1 - 4, kännetecknad av att produkten utgörs av en mjölkprodukt, en fermenterad mjölkprodukt, en grönsaks- eller fruktdryck, eller ett vällingpulver, allt innehållande stammen Lactobacillus paracasei subsp. paracase/'i en halt av 5 x 105 - 5 x 109, vanligen 1 x 105 - 109 levande bakterier, motsvarande 0,0005-0,5% av produkten; eller av ett koncentrerat naturläkemedel ("Medical Food"), där stammen Lactobacillus paracasei subsp. paracasei förekommer i en halt av 1.000- 100.000 miljoner levande bakterier, motsvarande 0,001-100% av produkten.

10. Produkt enligt krav 8 innerhållande angiven halt bakterier, kännetecknad av att den vid livsmedelsprodukter vidare innehåller någon liten andel, t ex 0,001 - 0,1 %, av ett jästextrakt eller andra ämnen som bidrar till att Lactobacillus paracasei subsp. paracasei kan tillväxa eller överleva i produkten, och att den vid naturläkemedel innehåller substanser av betydelse för bakteriens överlevnad ochleller rester av odlingssubstratet.

11. 1 1. Produkt enligt kraven 9 eller 10, kännetecknad av att stammen Lactobacillus paracasei subsp. paracasei tillhandahålls som ett koncentrat i fryst eller frystorkat tillstånd för inblandning i direkt anslutning till konsumtionstillfället i en mjölkprodukt, en fermenterad mjölkprodukt, en grönsaks- eller fruktdryck, i vällingpulver, eller i ett koncentrerat naturläke- medel (s k "Medical Food").

12. Produkt innehållande stam av Lactobacillus paracasei subsp. paracasei enligt något av kraven 1 - 5, kännetecknad av att den används för barn i syfte att lindra atopiska problem; för äldre personer för att korrigera förändrad mikroflora orsakad av normala åldersförändringar eller en förändrad saltsyrasekretion; och för personer i allmänhet för att normalisera tarmfloran, varvid halten klostridie-bakterier sjunker, bifidobakterier ökar och höga halter av koliforma bakterier minskar.