CN112662791B - 具有降胆固醇功能的乳酸菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有降胆固醇功能的乳酸菌及其应用，本发明的屎肠球菌132，保藏编号为GDMCC No：61286，含有如SEQ ID NO:1所示的特异性分子靶标；所述副干酪乳杆菌201，保藏编号为GDMCC No：61285，含有如SEQ ID NO:2所示的特异性分子靶标。两菌株在体外胆固醇液体培养基中能降低胆固醇浓度，在动物体内也有很好的降血脂效果。这两株菌具有耐受胃肠液消化、较高的疏水率、自聚集、共聚集和很强的抑菌活性、不溶血、对抗生素敏感等特性，在预防和治疗高胆固醇血症、高血脂以及致病菌防控方面具有较大的应用潜力和价值。

Description

具有降胆固醇功能的乳酸菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及具有降胆固醇功能的乳酸菌及其应用。

背景技术

2002年美国心脏学会指出心血管疾病(CVD)是发达国家最重要的死亡原因，与高胆固醇血症密切相关，高胆固醇血症患者心脏病发作的风险比血脂正常的患者高3倍。世界卫生组织预测，到2030年，心血管病仍是威胁人类死亡的主要原因，将影响世界各地约2360万人。

临床上使用的他汀类药物通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶活性而降低胆固醇的内源性合成，从而降低血清胆固醇水平。临床药物依泽替米贝抑制NPC1L1而降低胆固醇的吸收和转运；此外还有一些中药对血脂的调节也有一定的效果。在目前常用的药物中，他汀类药物在临床上有较好疗效。他汀类药物(statins)是HMG-CoA还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物除具有调节血脂作用外，在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能。延缓动脉粥样硬化(AS)程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。但目前他汀类药物的制造主要依赖化学合成，而合成类药物会有一些不良反应，全身身体不适、发热；腹部不适，嗳气，胃肠胀气，肝炎，胆汁淤积；骨骼肌痛，肌肉疲劳，颈痛，关节肿胀等。

寻求安全有效的功能性食品，如具有人体健康功能的益生菌正日益受到重视。目前，筛选在人体内具有降胆固醇作用的功能益生菌成为研究热点。

乳酸菌是一类具有长久安全食用历史的公认安全(GRAS)的食品级微生物。早在1963年首次研究非洲Samburu部落食用大量由野生乳酸菌和/或双歧杆菌发酵的牛奶后，发现血清胆固醇会降低。为阐明酸奶降胆固醇的具体机制，通过平行、双盲、安慰剂对照、随机等实验设计。研究发现其中每天两次摄入2x10 ⁹CFU植物乳杆菌ECGC 13110402的实验组人群血脂总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油酯三脂(TG)显著下降。近年来，Ya-NiYin等人用人造高脂SD大鼠模型，发现用双歧杆菌L66-5,L75-4,M13-4和FS31-1混合菌液灌胃6周，显著降低血清总胆固醇和肝内甘油三酯，并且明显减轻肝内脂质沉积。Nguyen等人证明，对高胆固醇血症小鼠喂养植物乳杆菌PH04后，发现小鼠血清总胆固醇和甘油三酯显著降低。近年来，越来越多的研究者对益生菌降胆固醇进行研究。肖琳琳从西藏传统发酵乳中分离筛选得到一株在液体培养基中降胆固醇达到51.80％的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，用这株干酪乳杆菌制备的菌悬液灌胃高脂模型小鼠14d后，发现实验组小鼠血清中胆固醇和甘油三指浓度较对照组显著降低(P<0.01)，同时HDL-胆固醇浓度有所增加，动脉硬化指数低于对照组的水平。张芬从婴儿粪便中分离到屎肠球菌(Enterococcusfaecium),能显著降低大鼠血清小鼠血清中胆固醇和甘油三指和低密度脂蛋白水平。目前国内外益生菌降胆固醇提出的机制主要有：(1)益生菌能吸附胆固醇至细胞膜或细胞质中；(2)益生菌将胆固醇吸附到细胞表面；(3)胆固醇和游离胆盐在酸性环境下发生共沉淀；(4)结合胆盐被益生菌的胆盐水解酶水解成了游离胆盐，后者具有较低的溶解度，不易被肠道回收；(5)胆酸被益生菌的荚膜胞外多糖黏附到了细胞表面；(6)益生菌发酵肠道食源性未消化的碳水化合物产生丙酸，后者能够抑制肝脏胆固醇的生物合成，从而导致血清胆固醇水平降低；(7)益生菌通过下调NPC1L1蛋白基因表达来降低小肠细胞对胆固醇的吸收；(8)益生菌抑制胆固醇乳化胶束的形成。国内外集中研究的益生菌降胆固醇集中在几个因素影响：(1)菌株特异性和生长状况；(2)胆盐水解酶的活力影响；(3)胆汁盐的种类和浓度；(4)体外筛选培养的配制；(5)pH值等。比如韦云路等人研究的动物双歧杆菌LPL-RH、长双歧杆菌TTF和植物乳杆菌LPL-1的体外胆固醇去除率分别为23.80％、24.50％、20.90％。何永岩等人研究的5株益生菌从培养基中去除胆固醇都在27.00％以上，粪肠球菌L14-3为35.90％，乳酸乳球菌L14-3为35.90％。BELVISO等人的研究中发现6株植物乳杆菌和2株副干酪乳杆菌完全没有降低培养基中的胆固醇。Lin等人对含有嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的乳酸菌制剂对人血清脂蛋白水平的作用进行了双盲实验，以安慰剂对照研究。有354名志愿者参加，每人每天服用4次包括2种乳酸杆菌(约2×10⁶CFU/药片)的药片和安慰剂。15周后的实验结果显示，尽管两株菌在体外实验中表现出降低胆固醇的特性，但服用安慰剂和乳酸菌制剂的受试者的低密度脂蛋白水平无明显差异。很多研究存在矛盾和这些影响因素密切相关，筛选方法和评价指标难成系统。益生菌在日本食品、饮料、医学等方面已经广泛应用，法国、俄罗斯、德国等地对益生菌研究日渐深入，在发酵乳中添加益生菌，起到一定的保健作用。我国益生菌降胆固醇研究和应用起步较晚，目前国内乳酸菌降胆固醇产品仍然一片空白，真正投入应用并不多。

乳酸菌降胆固醇方面研究功能相对于其他功能来说，研究方法多面化，不同因素对结果造成很大影响，其体外筛选系统和体内评价尚未完全统一。大部分研究仅对于体外研究，而对全面的益生特性评价、安全性评价和体内功能评价筛选乳酸菌相对较少。目前对于我国乳酸菌菌种资源开发并应用的菌株较少，故筛选功能性乳酸菌并且能对人体血脂有调节作用的乳酸菌还要进一步开发。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有降胆固醇功能的乳酸菌及其应用，本发明的乳酸菌在动物体内有很好的降血脂应用，在人体内降血脂方面具有巨大的潜力。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供用于检测乳酸菌的特异性分子靶标，所述分子靶标为：

(a)如SEQ ID NO:1～2所示的任意一种或几种核苷酸序列；或者，

(b)在(a)中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且与(a)中核苷酸具有90％以上同源性的核苷酸序列。

本发明通过生物信息学分析方法得到屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201的特异序列SEQ ID NO:1～2，序列进行特异验证，确定特异序列为特异分子靶标。

本发明提供检测所述的特异性分子靶标的引物，其中：

针对如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组包括：如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物；

针对如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组包括：如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物。

本发明提供所述乳酸菌的特异性分子靶标的检测方法，包括如下步骤：

S1：使用如权利要求2所述引物组进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察扩增产物是否符合预期。

优选的，所述S1中的PCR扩增体系包括2×PCR Mix、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。

优选的，所述PCR扩增体系为2×PCR Mix 12.5μL,模板DNA，10μmol/L引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL。

优选的，所述S1中的这两株菌的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；68-69℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

本发明提供一种乳酸菌，是(a)或(b)：

(a)屎肠球菌(Enterococcus faecium)132，含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(b)副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)201，含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

优选的，所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)132，于2020年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61286。

优选的，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)201，于2020年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61285。

本发明经过筛选得到两株具有降胆固醇功能的乳酸菌，命名为屎肠球菌(Enterococcus faecium)132、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)201。经试验证明，两株乳酸菌体内外具有较强降胆固醇能力，同时耐受胃肠道消化能力较强、益生特性较好。并且无溶血性、对抗生素敏感；通过16S rDNA序列比对分析，将菌株鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

本发明提供了所述乳酸菌的培养方法，包括以下步骤：将适量的乳酸菌接种于培养基中，37℃厌氧培养。

优选的，所述培养基为TPY和MRS培养基。

本发明提供所述乳酸菌在制备用于改善和/或预防高脂血症的医药组合物中的应用。

本发明提供所述乳酸菌在制备用于降低血脂或防控致病菌的食品中的应用。

本发明提供一种包含任一所述的乳酸菌的培养物或其加工物。

本发明提供一种医药组合物，包括所述乳酸菌、所述的培养物或其加工物。

本发明还提供一种食品组合物，包括所述乳酸菌、所述的培养物或其加工物。

本发明的有益效果：

本发明提供的乳酸菌来自中国世界长寿乡的本土菌株。在体外能降低胆固醇；所述菌株还具有较好的耐受胃肠道消化能力、较好的安全性，体内具有降血脂的效果，并且减少脂质在肝脏堆积。屎肠球菌132与低剂量洛伐他汀药物相比，可以减少TC在肝脏中堆积，促进TC、TBA排出。屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201体内降甘油三酯指标下降率优于现有文献相关研究，下降率提高近10％。屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201体内降低密度脂蛋白胆固醇指标略高于现有文献相关研究。体外筛选胆固醇降低率优于发酵食品筛选的干酪乳杆菌、植物乳杆菌等。且具备益生菌良好的益生特性和安全性，且体内功能显著，在开发预防和治疗高胆固醇血症、高脂血症等功能食品方面具有较大的应用潜力和价值。

附图说明

图1：屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201 16S rRNA基因系统发育树；其中(A)屎肠球菌132(Enterococcus faecium132)16S rRNA基因系统发育树；(B)副干酪乳杆菌201(Lactobacillus paracasei201)16S rRNA基因系统发育树。

图2：屎肠球菌132(E.faecium132)和副干酪乳杆菌201(L.paracasei201)的体外实验；其中(A)体外降胆固醇活性；(B)模拟肠液实验；(C)自聚集；(D)胆汁盐水解酶活性；(E)共聚集；(F)细胞表面疏水性。

图3：屎肠球菌132(E.faecium132)和副干酪乳杆菌201(L.paracasei201)粪便和肝脏中总胆汁酸(TBA)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的水平。其中，(A)肝脏中TC水平；(B)肝脏TBA水平；(C)肝脏TG水平；(D)粪便中的TC水平；(E)粪便中TBA水平；(F)粪便中的TG水平。数据以三次试验的平均值±标准差表示。(粪便和肝脏中TC、TG、TBA n＝6)。模型组与对照组比较，差异有统计学意义：^#P<0.05，^###P<0.0001。副干酪乳杆菌201组或屎肠球菌132组与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

图4：乳酸菌特异分子靶标验证中PCR扩增程序。

图5：屎肠球菌132的特异靶标验证电泳图。

图6：副干酪乳杆菌201的特异靶标验证电泳图。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例1乳酸菌的分离鉴定

采集中国世界长寿乡地区健康人源粪便作为样本，在无菌环境下，取0.1g左右粪便样本加入10mL TPY液体培养基，震荡混匀后于37℃厌氧条件下富集培养12h，吸取0.5mL菌液做梯度稀释。加入生理盐水制成10^-1至10^-5稀释梯度菌悬液，选取10^-3、10^-4、10^-5三个梯度菌悬液，分别吸取200μL至TPY固体培养基和MRS固体培养基，涂布棒涂抹均匀，37℃厌氧条件下培养48h。挑取平板上的典型菌落，进行划线纯化得到纯菌落，保种并进行细菌DNA提取，PCR扩增引物选择参见表1。反应条件：预变性95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s共35个循环，72℃退火延伸10min。PCR产物进行一代测序，序列比对NCBI数据库，进行同源性分析，选取其中260株乳酸菌进行实验，初步筛选出2株做后续实验。对这两株菌16S rDNA序列进行系统发育树构建和MALDI-TOF MS(BRUKER，Germany)验证。屎肠球菌132的16S rDNA序列如SEQ ID NO.7所示，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)201的16S rDNA序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明筛选到的两株菌屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201的系统发育树如图1所示，经MALDI-TOF MS(BRUKER，Germany)质谱验证结果显示鉴定菌种一致。

屎肠球菌(Enterococcus faecium)132，于2020年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61286。

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)201，于2020年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：61285。

表1引物序列

引物序列	编号
		27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；	SEQ ID NO：9
1492R：5’-CTAC GGC TAC CTT GTT ACG A-3’	SEQ ID NO：10

实施例2降胆固醇乳酸菌的活性

(1)降胆固醇活性测定

胆固醇培养基(CHO)的配制(g/L)：胆固醇0.5g，蔗糖酯0.1g，吐温-801mL，冰乙酸1mL充分搅拌，并于60℃进行超声30min，边加边搅拌加入含有0.2％牛磺脱氧胆酸钠的MRS肉汤中。121℃灭菌20min。

按2％接种量接入胆固醇培养基(CHO)中，37℃厌氧培养72h，每个菌株接3个平行。取1mL发酵液于4000×g 10min收集上清，用胆固醇测定试剂盒于迈瑞BS 480全自动生化分析仪测定胆固醇含量。

P₀(％)＝(1-C/D)×100％

其中，C：样品胆固醇含量；D：空白对照胆固醇含量。

如图2A所示，屎肠球菌132的体外降胆固醇能力为49.20％，而副干酪乳杆菌201为22.00％。说明这两株菌在体外具有较强的降胆固醇活力。

(2)胆盐水解酶(BSH)活性测定

MRS固体培养基种加0.2％脱氧牛磺胆酸钠、0.37g/L CaCl₂。121℃20min灭菌，倒平板晾干。再将无菌滤纸片均匀放入平板上，每个滤纸片均匀滴加10uL菌液，37℃厌氧培养72h。看其滤纸周围有无沉淀。

如图2D所示，屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201在平板上均有明显的沉淀圈，说明这两株菌具有胆盐水解酶的活性。

实施例3乳酸菌的益生特性评价

(1)耐受人工胃肠液实验

将筛选出的2株菌在MRS中活化培养，培养液经离心(4000×g、10min)收集菌体，用灭菌生理盐水重悬洗涤离心2次，将其菌体悬浮于5mL灭菌生理盐水中制成菌悬液，菌液浓度为3×10⁷CFU。然后，将1mL菌悬液接种于9mL过滤除菌处理的pH 3.0的人工胃液试管中，充分混匀后37℃厌氧培养。并在实验开始0h和保温3h后分别取样，测定其活菌数。然后无菌吸取1mL经3h处理后的含菌人工胃液，接种于9mL过滤除菌的pH 8.0的人工肠液中，继续置37℃恒温箱厌氧培养，在5h后取样测定活菌数。

人工胃液：0.2％NaCl、0.35％胃蛋白酶(Pepsin，sigma)，用1N HCL调整pH值为3.0后，过滤除菌备用。

人工肠液：将下述a液和b液以2:1混合即为人工肠液。

a.胰腺液：NaHCO₃ 1.1％、NaCl 0.2％、胰蛋白酶(Trypsin，sigma)0.1％，调整pH为8.0后，过滤除菌备用。

b.胆液：Bile Salts 1.2％，调整pH为8.0后，过滤除菌备用。

计算公式如下：

P₁(％)＝E/F×100

其中，P₁：存活率％；E：3h或5h活菌数(CFU)；F：0h胃液活菌数(CFU)。

对所筛选菌株进行人工胃肠液模拟实验，结果如图2B所示，经过3h胃液处理后三株菌活菌数均还能达到10⁷CFU，经过胃液后进入肠液5h，屎肠球菌132、副干酪乳杆菌201活菌数分别能达到10⁷、10⁶CFU以上，二者能较好的耐受胃肠液，在胃肠道中有较强的耐受能力。

(2)乳酸菌自聚集

细胞培养时会呈现不同的聚集状态。两株菌分别在MRS肉汤中进行活化培养，4000×g 10min，弃上清后用PBS洗涤2次在相同缓冲液中复苏，调整至OD_600nm＝0.607左右。细菌细胞悬液37℃孵育6小时，间隔2小时取样。

自动聚合的百分比U％＝(1-A_t/A₀)×100

A₀表示0h时的吸光度(OD_600nm)，A_t表示2、4、6h时的吸光度(OD_600nm)。

自聚集越强说明能有潜在的强定植能力。分别测定2、4、6h的自聚集率。如图2C所示，随着时间推移，自聚集率呈现上升趋势，其中屎肠球菌132在6h时达到20％以上，副干酪乳杆菌201达到60％以上。

(3)乳酸菌共聚集

在共聚合试验中，细菌悬浮液制备如上述自动聚合分析方法。将实验室分离株和病原菌株各500μL混合，37℃下无搅拌孵育4h。孵育后监测上述混合物的吸光度(OD_600nm)和对照组(单独培养菌悬液)。共聚合计算为：

C％＝[(A_p+A_i)-2(A_m)/(A_p+A_i)]×100

A_p和A_i为致病菌和分离菌的单独培养OD值；

A_m为二者混合培养的OD值。

如图2E所示，屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201对6种食源性致病菌大肠杆菌(E.coli ATCC 8739)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium ATCC 14028)，阪崎克罗诺杆菌(E.sakazakii ATCC 29544)、金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC 25923)、单增李斯特氏菌(L.monocytogenes ATCC 19117)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus ATCC 14579)均有一定程度的拮抗作用，其中副干酪乳杆菌201的作用较强。说明在肠道中两株乳酸菌能有效的拮抗致病菌。

(4)乳酸菌发酵上清抑菌活性

按2％接种至MRS肉汤中，37°厌氧培养48h。4℃4000×g 10min取上清，上清0.22μm滤膜过滤，调整病原指示菌的活菌数大约10⁷CFU，均匀涂抹在LB平板上。小心的放置牛津杯在平板上，吸200μL上清液到牛津杯中，在冰箱扩散10h。小心的放置至37℃恒温培养箱，每个实验三次重复。

表2两株乳酸菌发酵上清抑菌实验

从表2中可以看出，屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201对6种食源性致病菌都具有较强的抑菌活性，抑菌圈直径均>20mm，且副干酪乳杆菌201抑菌活性较强。

(5)乳酸菌疏水率测定

将这两株菌在MRS肉汤中进行培养至活力强状态，菌液经4000×g离心后，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.0)清洗两遍后重悬，调整菌液浊度OD_600nm约为0.6。取3mL调整浊度后的菌液，加入1mL的二甲苯，对照组不加二甲苯，涡旋振荡90s，静置5～10min至分层，取下层水相，在600nm下测量G、G₀值并进行记录。实验进行三次。

疏水率H％＝[(G₀-G)/G₀]×100，

其中G₀和G分别是与二甲苯混匀前、后菌液在600nm下测量得到的值。

对所筛选出菌株进行疏水率测定，结果如图2F所示，屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201的疏水率分别为68.9％和81.7％。

实施例4乳酸菌安全性评价

(1)抗生素敏感实验

细菌对抗生素是否敏感事评价细菌安全的一个重要指标。分别选取这6种抗生素，万古霉素(30μg)、氨苄西林(10μg)、红霉素(15μg)、四环素(30μg)、环丙沙星(5μg)、氯霉素(30μg)按照临床和实验室标准协会(CLSI)制定对肠球菌的标准，采用纸片扩散方法来进行抗生素敏感实验。

表3抗生素敏感实验

注：S：敏感；R：耐药。

由表3可以看出，除副干酪乳杆菌201对万古霉素天然耐药。屎肠球菌132对环丙沙星和红霉素耐药，副干酪乳杆菌201对四环素和环丙沙星耐药，对其他抗生素敏感，这两株乳酸菌安全性较高。

(2)溶血实验

在无菌条件下，用接种环接种乳酸菌于绵羊血平板中，37℃培养48h，观察溶血现象。溶血现象会在血平板上形成三种特征：①α溶血：菌落周围会出现草绿色溶血环，这种菌一般具有机会致病性。②β溶血：菌落周围出现较宽的透明溶血环，一般来说致病性强。③γ溶血：菌落周围无溶血环的出现，一般来说菌株无致病性。

金黄色葡萄球菌

25923为阳性对照，各菌落周围均无溶血环的出现，所以屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201均为γ溶血，均不具有溶血活性。

实施例5体内降胆固醇的评价

(1)实验动物分组、生理生化指标测定

5周龄SPF(Specific Pathogen-Free)SD大鼠，来自南方医科大学(中国广州)。将大鼠置于受控环境条件下(温度23±3℃，相对湿度50％-60％，光照/黑暗周期12/12h，实验过程中自由取水和食物)。大鼠在实验前1周开始适应，并被随机分成五组。对照组(Controlgroup)大鼠喂食Co60辐照维持饲粮。模型组(Model group)饲喂高胆固醇饮食(HCD)，洛伐他汀组(Medicine group)饲喂高胆固醇饮食(HCD+0.1mg/(mL/100g)，屎肠球菌132组(E.faecium132 group)和副干酪乳杆菌201组(L.paracasei201 group)分别喂养1×10⁹cfu/(mL/100g)屎肠球菌132+HCD，1×10⁹cfu/(mL/100g)副干酪乳杆菌201+HCD。Co60辐照维持日粮粗蛋白≥180g/kg、粗脂肪≥40g/kg、粗纤维≥50g/kg、粗灰分≤80g/kg、钙10～18g/kg、总磷6～12g/kg、赖氨酸≥8.2g/kg、蛋氨酸+胱氨酸≥5.3g/kg。HCD包括Co60辐照维持饮食、10％猪油、1％胆固醇、0.2％胆盐。在6周内，每周测量一次体重，计算摄食量和饲料利用率。实验设计经广东省微生物研究所实验动物管理与伦理委员会批准，大鼠按照标准指南进行维护。

饲养42天后，从心脏取血并处死，立即切除心脏、肝脏、脾脏、肾脏、附睾脂肪、回肠、结肠，冲洗称重，冷冻于干冰中，-80℃保存直至分析。

血清生化分析采用16h禁食状态下心脏采血。血液经3500rpm，10min，4℃离心取血清。采用迈瑞BS-480全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总胆汁酸(TBA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平。

表4各组大鼠的血脂生化指标

各组与Model组相比的差异，体重增加量，脏器指数n＝6。^ap>0.05,^bp<0.01,^cp<0.001,

^dp<0.0001.

脏器指数(％)＝(器官重量/体重)×100

对照组(Control group)、模型组(Model group)、洛伐他汀组(Medicine group)、屎肠球菌132组(E.faecium132 group)、副干酪乳杆菌201(L.paracasei201 group)

由表4可以看出，模型组体重增加量、肝脏指数和附睾脂肪指数生理指标均高于对照组，说明造模成功。经过屎肠球菌132、副干酪乳杆菌201干预后，与模型组相比，体重增加量、肝脏指数和附睾脂肪指数生理指标均显著降低，具有统计学意义。说明屎肠球菌132、副干酪乳杆菌201能减缓由高脂饮食引起的肥胖。

表5各组大鼠的血脂生化指标

各组与Model组相比的差异，血液生化指数n＝6。^ap>0.05,^bp<0.01,^cp<0.001,^dp<0.0001.

对照组(Control group)、模型组(Model group)、洛伐他汀组(Medicine group)、屎肠球菌132组(E.faecium132 group)、副干酪乳杆菌201(L.paracasei201 group)

由表5可以看出，模型组和对照组的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆汁酸(TBA)、谷丙转氨酶(AST)、谷草乙酸转氨酶(ALT)值均有显著差异(P<0.05)。与模型组相比，洛伐他汀组、屎肠球菌132组、副干酪乳杆菌201组TG、LDL-C、AST、ALT水平均显著降低(P<0.05)。洛伐他汀组、屎肠球菌132组、副干酪乳杆菌201组的TC水平呈下降趋势，但无统计学意义。与模型组比较，洛伐他汀组、屎肠球菌132组、副干酪乳杆菌201组HDL-C、TBA水平无显著性差异。通过血脂生化指标分析，本发明屎肠球菌132、副干酪乳杆菌201在动物体内有很好的降血脂应用，说明这两株菌在人体内降血脂方面具有巨大的潜力，但具体机制有待进一步探索。

(2)粪便、肝脏中TC、TG、TBA测定

按每0.2g的组织加入5mL氯仿：甲醇(2:1，v/v)混合液，振荡混匀，37℃保温30min，离心(8000r/min，10min，4℃)，小心收集氯仿层液体到新的离心管中，加3mL生理盐水，离心(8000r/min，10min，4℃)。再重复一次上述步骤后，收集底层氯仿层液体，用氮吹仪吹干，0.8mL加入异丙醇：TritonX-100(9:1，v/v)混合液复溶，漩涡震荡2min，加1.2mL蒸馏水，再漩涡震荡2min，使之充分溶解，所得溶液为提取的肝组织总脂。采用迈瑞BS-480全自动生化分析仪测定肝脏中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总胆汁酸(TBA)。

取0.1g冻干粪便样品，与2.5mL乙醇混合，于80℃提取2次，每次历时1h，将两次提取液合并，于50℃在氮气保护下吹干，残渣用2mL乙醇溶解。采用迈瑞BS-480全自动生化分析仪测定粪便中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总胆汁酸(TBA)。

实验结果如图3所示。在肝脏中，模型组的TC、TG值明显高于对照组(P<0.05)。与模型组相比，洛伐他汀组和屎肠球菌132组肝脏TC水平明显降低(P<0.05)(图3A)。与模型组相比，屎肠球菌132组、副干酪乳杆菌201组肝脏TBA水平呈升高趋势(图3B)。与模型组相比，屎肠球菌132组、副干酪乳杆菌201组肝脏TG水平呈下降趋势，但无统计学意义(图3C)。与模型组相比，屎肠球菌132组、副干酪乳杆菌201组粪便中TBA含量显著增加(P<0.05)(图3E)。与模型组比较，洛伐他汀组和组副干酪乳杆菌201组粪便TC、TG有升高趋势，差异无统计学意义(图3D、F)，但屎肠球菌132组有统计学意义。屎肠球菌132组、副干酪乳杆菌201组均能促进大鼠体内胆汁酸的排泄，减少胆固醇在肝脏中堆积，且屎肠球菌132组优于副干酪乳杆菌201组。

实施例6乳酸菌特异分子靶标验证

(1)不同种特异性新分子靶标的挖掘

首先对屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201进行全基因测序，并利用GenBank数据库进行生物信息学分析，筛选得到屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。其中，序列SEQ ID NO.1为屎肠球菌132特异性基因片段，SEQ ID NO.2为副干酪乳杆菌201株特异性基因片段。

(2)引物有效性检测

根据(1)中的序列SEQ ID NO.1～NO.2设计特异性PCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表6。

表6特异序列PCR检测引物组

步骤S1 DNA模板制备：将屎肠球菌132和副干酪乳杆菌201分别在MRS液体培养基中增菌培养，使用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

步骤S2 PCR扩增：PCR扩增体系如下：

其中：当模板DNA为屎肠球菌132时，引物为引物组1中的引物；当模板DNA为副干酪乳杆菌201时，引物为引物组2中的引物。PCR扩增程序如图4所示。其中，使用引物组1时，退火温度为69℃；使用引物组2时，退火温度为68℃。

步骤S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳，观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如其他菌株模板没有出现扩增单一条带，说明对应靶标是菌株特异性分子靶标。

取47株其他屎肠球菌株，89株非目标肠球菌以及75株非肠球菌，按照实施例6的方法进行屎肠球菌132特异靶标PCR检测。取18株其他副干酪乳杆菌株，69株非目标乳杆菌以及90株非乳杆菌，按照实施例6的方法进行副干酪乳杆菌201特异靶标PCR检测。其中，步骤S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；步骤S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组中的引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表7、8所示，表中，检测结果栏目中“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图5所示，“+”表示目标条带，M为2000Maker，C为空白对照。

表7屎肠球菌检测特异性评价试验结果

由图5中可以看出，均只有目标菌株出现扩增条带，非目标肠球菌和非肠球菌均不含有目的条带，说明本方法中仅目标菌株含有特异性分子靶标。

表8副干酪乳杆菌检测特异性评价试验结果

由图6中可以看出，均只有目标菌株出现扩增条带，非目标乳杆菌和非乳杆菌均不含有目的条带，说明本方法中仅目标菌株含有特异性分子靶标。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

广东环凯生物科技有限公司

广东科环生物科技有限公司

<120> 具有降胆固醇功能的乳酸菌及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 448

<212> DNA

<213> 屎肠球菌(Enterococcus faecium)

<400> 1

cgggggtatc ggtacatagc ttgtcaaatt ggcgacaagg aaaaagttac cctaatcaaa 60

gtaacctgat gaagttaaga gactattctt tatcgttgct ttcgattcgt ggattgcaat 120

cagaggtgag agaatgtgct gttagctttt tcagagaagt agaaattact cttagggata 180

tgccaaggat tggtgaaaag gagaagaaaa tattaaatga tcaccatagt aatcaaaagg 240

ccttaagcat attggtgaga atgcttgatt tcaatcaaat tgatacctat ttaaatactg 300

acactatgca aggattcagg attgataaac agaataagat tgatagaaaa actcaacgaa 360

attataagaa aacattctct gaaaatctta ataggttgat taattttatt gatgaaggct 420

ctgattatga aagagaggac atcgcgga 448

<210> 2

<211> 397

<212> DNA

<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)

<400> 2

aacccctgga gagcttttcg attttgtgcc ttttgatttg actttttcta ttgctcaaga 60

gggcattaga tcctcaggat tgggagaaga gggtgatagt atagacgaag tgatcataca 120

aaaggccgac atggatgctt ttttaaaaag aagctcgata aatgaagctg taggaagaaa 180

tgaaaaaaca tttgatctga ccgtaagaat aactgatgat gtaacaatac ccacaaaagg 240

agggtctacg tctgatagct ccgttacaga taatgggccg gttaatatac cgattgaagt 300

cctcttggga cattctgatg acaccaaaac ttttgagagt gagcatgatg aatttaataa 360

aatgtggatg gatgagctca cgccagcatt tagagca 397

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggggtatc ggtacatagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgcgatgt cctctctttc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

aacccctgga gagcttttcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

tgctctaaat gctggcgtga 20

<210> 7

<211> 1422

<212> DNA

<213> 屎肠球菌(Enterococcus faecium)

<400> 7

cggctggctc caaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac 60

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta 120

gcgattccgg cttcatgcag gcgagttgca gcctgcaatc cgaactgaga gaagctttaa 180

gagattagct tagcctcgcg acttcgcaac tcgttgtact tcccattgta gcacgtgtgt 240

agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300

ccggcagtct tgctagagtg cccaactgaa tgatggcaac taacaataag ggttgcgctc 360

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420

cactttgccc ccgaagggga agctctatct ctagagtggt caaaggatgt caagacctgg 480

taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600

agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gagcctcagc gtcagttaca 720

gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cctccatata tctacgcatt tcaccgctac 780

acatggaatt ccactctcct cttctgcact caagtctccc agtttccaat gaccctcccc 840

ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 900

ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960

gtggctttct ggttagatac cgtcaaggga tgaacagtta ctctcatcct tgttcttctc 1020

taacaacaga gttttacgat ccgaaaacct tcttcactca cgcggcgttg ctcggtcaga 1080

ctttcgtcca ttgccgaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1140

cagtcccaat gtggccgatc accctctcag gtcggctatg catcgtggcc ttggtgagcc 1200

gttacctcac caactagcta atgcaccgcg ggtccatcca tcagcgacac ccgaaagcgc 1260

ctttcaaatc aaaaccatgc ggtttcgatt gttatacggt attagcacct gtttccaagt 1320

gttatcccct tctgatgggc aggttaccca cgtgttactc acccgttcgc cactcttctt 1380

tttccggtgg agcaagctcc ggtggaaaaa gaagcgtacg ac 1422

<210> 8

<211> 1430

<212> DNA

<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)

<400> 8

ctcgctccct aaaagggtta cgccaccggc ttcgggtgtt acaaactctc atggtgtgac 60

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta 120

gcgattccga cttcgtgtag gcgagttgca gcctacagtc cgaactgaga atggctttaa 180

gagattagct tgacctcgcg gtctcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 240

agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300

ccggcagtct tactagagtg cccaactaaa tgctggcaac tagtcataag ggttgcgctc 360

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420

cattttgccc ccgaagggga aacctgatct ctcaggtgat caaaagatgt caagacctgg 480

taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 600

agctgcggca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacctagc attcatcgtt tacggcatgg 660

actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagcctcagc gtcagttaca 720

gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt tcaccgctac 780

acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcgcttcctc 840

ggttaagccg agggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 900

ataaatccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960

gtggctttct ggttggatac cgtcacgccg acaacagtta ctctgccgac cattcttctc 1020

caacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga 1080

cttgcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1140

cagtcccaat gtggccgatc aacctctcag ttcggctacg tatcatcgcc ttggtgagcc 1200

attacctcac caactagcta atacgccgcg ggtccatcca aaagcgatag cttacgccat 1260

ctttcagcca agaaccatgc ggttcttgga tctatgcggt attagcatct gtttccaaat 1320

gttatccccc acttaagggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc cactcgttcc 1380

atgttgaatc tcggtgcaag caccgatcat caacgagaac tcgttcgact 1430

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 9

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 10

ctacggctac cttgttacga 20

Claims (12)

1.一种屎肠球菌，其特征在于，所述屎肠球菌命名为屎肠球菌（Enterococcus faecium）132，含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；于2020年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：61286。

2.一种副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）201，含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；于2020年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：61285。

3.检测特异性分子靶标的引物在制备如权利要求1所述的屎肠球菌的检测试剂中的用途，其特征在于，所述分子靶标为：如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其中，检测如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列的特异性分子靶标的引物用于制备如权利要求1所述的屎肠球菌的检测试剂。

4.检测特异性分子靶标的引物在制备如权利要求2所述的副干酪乳杆菌的检测试剂中的用途，其特征在于，所述分子靶标为：如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，检测如SEQID NO:2所示的核苷酸序列的特异性分子靶标的引物用于制备如权利要求2所述的副干酪乳杆菌的检测试剂。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，针对检测如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组包括：如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，针对如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组包括：如SEQ ID NO:5所示的上游引物和如SEQ ID NO:6所示的下游引物。

7.权利要求1所述的屎肠球菌的特异性分子靶标的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：使用如权利要求5所述的针对检测如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察扩增产物是否符合预期。

8.权利要求2所述的副干酪乳杆菌的特异性分子靶标的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：使用如权利要求6所述的针对检测如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察扩增产物是否符合预期。

9.权利要求1所述的屎肠球菌或权利要求2所述的副干酪乳杆菌在制备用于改善和/或预防高脂血症的医药组合物中的应用。

10.一种医药组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的屎肠球菌或权利要求2所述的副干酪乳杆菌。

11.一种医药组合物，其特征在于，包括含有权利要求1所述的屎肠球菌或权利要求2所述的副干酪乳杆菌的培养物。

12.一种医药组合物，其特征在于，包括含有权利要求1所述的屎肠球菌或权利要求2所述的副干酪乳杆菌的加工物。

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