CN113234640B - 一株长双歧杆菌mf-269及其应用 - Google Patents

一株长双歧杆菌mf-269及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株长双歧杆菌MF‑269及其应用，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF‑269已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:21587。本发明从人体粪便中首次分离鉴定出了一株长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF‑269，研究发现该菌株可显著减少脂肪细胞，降低内脏脂肪重量，从而有效达到降低小鼠体重的功效，并且还可降低小鼠的胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量，改善肝功能；其来源健康人体，可产小分子酸能力，有胆碱盐水解酶活性和抗生素抗性，无毒无抗原反应，可作为益生菌制成多功能的药物、功能食品或保健食品，具有广泛的市场前景和应用价值。

Description

一株长双歧杆菌MF-269及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株长双歧杆菌MF-269及其应用。
背景技术
双歧杆菌属(Bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状、严格厌氧的细菌属，广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中，双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一。双歧杆菌是在人体肠道中定植的一种重要的肠道有益微生物，其与人体健康和疾病之间存在着密切关系。长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是双歧杆菌属种的一种，取自健康人体肠道，是对人体有益，一般用于食品类的一类双歧杆菌，具有调节人体肠道，改善健康等功效。
肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。它不是指单纯的体重增加，而是体内脂肪组织积蓄过剩的状态。由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重过度增长并引起人体病理、生理改变或潜伏。肥胖会增加心血管疾病风险，影响消化系统、内分泌系统等。而市面上常见的减肥药物存在多种副作用，如导致呕吐腹泻，失眠，导致依赖性等，因此亟需一种无副作用，可有效改善肠道菌群进而可持续达到减重功效不易反弹的药物。
高血脂即高脂血症(hyperlipidemia,HLP)，是指血脂水平过高导致的，血浆中的胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白水平升高，高密度脂蛋白过低的一种全身质代谢异常疾病，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。随着我国经济的迅速发展以及人们生活水平的不断提高，心脑血管疾患日益增多，其中高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，血脂达标被视为防治心血管疾病的核心策略。使血脂达标的主要途径包括生活方式改变和降血脂药物治疗。而引起脂肪代谢紊乱主要原因，大多归因于寄居于人体胃肠道的微生物菌群随人们偏好高脂食物或不合理饮食引起的群落失衡与移位，导致人体持续被动多吸收脂质物质所致。因此基于肠道菌群来治疗和预防高脂血症，是目前的主要研究方向。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一株长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269分离自人体粪便中，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:21587。
本发明的目的之二在于提供了所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269在制备治疗和/或预防高血脂药物、功能食品、保健食品中的应用。
进一步地，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269通过降低胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量，降低血脂。
本发明的目的之三在于提供了所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269在制备减肥药物、功能食品、保健食品中的应用。
进一步地，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269通过降低肝脏重量，降低性腺脂肪和肾周脂肪的含量，达到减肥功效。
本发明的目的之四在于提供了所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269在制备治疗和/或预防脂肪肝药物、功能食品、保健食品中的应用。
进一步地，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物为片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂或溶液剂。
进一步地，所述功能食品或保健食品包括：饼干、糕点、饮料、口服液、冲剂、饮料、液体乳类、奶粉。
本发明的目的之五在于提供了一种益生菌菌剂，所述益生菌菌剂包括：将所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269进行培养获得菌液，或将所述菌液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从人体粪便中首次分离鉴定出了一株长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269，研究发现经该菌株干预后，小鼠脂肪细胞显著减少，内脏脂肪含量显著降低，从而有效达到降低小鼠体重的功效。并且经该菌株干预后，小鼠的胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量均显著降低，从而改善了肝功能；同时，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269来源健康人体，具有产小分子酸能力，还具有胆碱盐水解酶活性和抗生素抗性，无毒不会产生抗原反应，因此可作为益生菌，制成兼具降血脂、减肥等多功能的药物、功能食品或保健食品，具有广泛的市场前景和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中益生菌干预前后脂肪细胞的观察结果；
图2为本发明实施例2中长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的胆盐水解酶活性检测结果；
图3为本发明实施例3中ND组，HFD组和益生菌处理组的小鼠肝脏组织的观察结果；
图4为本发明实施例3中ND组，HFD组和益生菌处理组的小鼠脂肪组织的观察结果；
图5为本发明实施例4中长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的基因组图谱；
图6为本发明实施例4中长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的全基因序列在PAIDB数据库的比对结果。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1菌株的分离、鉴定和性能测定
1、16S rDNA鉴定
取5g取自健康人体的粪便样品，加入到50mL无菌水中，震荡混匀后梯度稀释，分别在MRS+溴甲酚紫和MRS+莫匹罗星锂盐选择性培养基平板涂布，置于37℃，厌氧过夜培养，挑取单菌落纯化，然后进行16S rDNA菌种鉴定。
16S rDNA鉴定：提取基因组DNA，采用通用引物：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT
进行16S rDNA片段的PCR扩增，扩增片段提交擎科生物公司测序，测序结果如序列表SEQ ID NO:1所示。经比对，得到一株长双歧杆菌Bifidobacterium longum，将其命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269，并已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国，北京市朝阳区，邮政编码：100101)，保藏编号为：CGMCC No:21587。
2、耐胆酸，胆碱检测
分别配置pH 2.0(胆酸)的MRS培养基，以及含0.3％胆碱盐的MRS培养基，将菌株母液以5％接种量分别接种于MRS培养基、pH 2.0(胆酸)和含0.3％胆碱盐的MRS培养基中，处理2h后平板计数，结果如下表所示：
Figure BDA0003124338140000041
结果显示，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269在pH 2.0胆酸条件下，以及0.3％胆碱盐条件下仍可存活，即该菌株可耐胆酸和胆碱。
3、产小分子酸能力检测
(1)样品处理：取1mL菌株母液，5000r/min，离心10min，留取上清。
(2)色谱柱：7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、VF-WAXms(30m*0.25mm*0.25μm)毛细管色谱柱。
(3)进样方式：顶空进样，恒温炉温度70℃，样品流路温度90℃，传输线温度110℃，样品瓶加压气压160.0kPa，样品瓶恒温时间10min，样品瓶加压时间1min，GC循环时间22min。
(4)GC操作：程序升温，初始温度100℃，以5℃/min升至150℃后，升温至240℃并保持3min；进样口温度230℃，辅助温度240℃，四级杆温度150℃，离子源温度230℃，进样量1μL，进样方式：不分流进样，载气：高纯氮气(>99.999％)，载气流速：2mL/min。
结果如下表所示：
Figure BDA0003124338140000051
结果显示，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269可产生多种小分子酸，如乙酸、丙酸、丁酸等。
4、菌株抗生素抗性检测
双层平板法检测候选菌株对抗生素的抗性。双层平板下层为1.5％的琼脂营养培养基，上层用0.5％的软琼脂培养基，与菌株母液100：1混匀。待平板固化和表面干燥后，放入商品化抗生素药敏片(Tet，Cm，Fz，Amp，Ery，NA，Rif，Gen和Neo)过夜培养，根据抑菌圈大小，观察益生菌对抗生素的抗性，结果如下表所示，其中抑菌圈表明该细菌对抗生素敏感：
Figure BDA0003124338140000052
结果显示，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269对部分抗生素，包括Cm(氯霉素)、Neo(新霉素)、Gen(庆大霉素)和NA(萘夫西林)不敏感，即对这几种抗生素具有抗性。
5、菌株凝血试验检测
(1)配置KRT缓冲溶液(NaCl 7.5g，KCl 0.383g，MgSO4·7H2O 0.318g，CaCl20.305g，用盐酸调pH 7.4)；
(2)将新鲜羊血红细胞用PBS缓冲溶液清洗一次，3000rpm，5min离心，10％终浓度重悬于KRT缓冲液；
(3)菌株过夜培养物在KRT缓冲液中2倍梯度稀释；
(4)25μL羊血红细胞加入梯度稀释的菌悬液(25μL)，室温放置2h后检测凝聚现象，结果如下表所示：
Figure BDA0003124338140000061
结果显示，一般大肠杆菌经稀释8倍后仍存在凝聚现象，而所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269经稀释6倍后就没有出现凝聚现象了，即说明该菌株不易引起机体的抗原反应，即副作用小，可作为益生菌应用于人体。
6、菌株致病性评价
将拟评价的菌株进行腹腔注射和经口灌胃两种途径染毒动物，评价菌株对动物的致病性。
(1)实验动物：选用C57小鼠，雄性，体重18.0g～22.0g。
(2)腹腔注射：
菌种活化与菌悬液制备：将菌株接种MRS肉汤，37℃，厌氧条件下培养24hr后，转接至MRS琼脂平板，培养24hr后，刮取平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度，用比浊法使菌悬液中菌体细胞的最终浓度为1×108CFU/mL(要求至少107CFU/只)。
将小鼠分组，包括：小鼠菌悬液灭活对照组、小鼠菌悬液组。每组10只小鼠，每只小鼠注射0.2mL，使每只小鼠注射菌量为2×107CFU/只。
动物腹腔注射后每天观察1次，至少观察21d。观察动物出现下列(但不限于)异常的情况：(1)皮肤和毛；(2)眼睛和粘膜；(3)呼吸系统；(4)肢体活动；(5)行为方式；(6)特别注意观察出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象；(7)体重：注射前及注射后每周所有小鼠称量，并测量实验期间死亡的、最终处死的小鼠体重。若小鼠的存活时间超过1d，记录其体重变化；(8)尽可能精确记录小鼠的死亡时间。腹腔注射后的异常特征观察结果如表1所示，注射前后小鼠的体重变化如表2所示。
表1腹腔注射后异常特征观察
Figure BDA0003124338140000071
表2腹腔注射前后小鼠体重变化
Figure BDA0003124338140000072
(3)经口灌胃
菌种活化与菌悬液制备：除制备菌悬液浓度为5.0×108CFU/mL外(要求不小于2.5×108CFU/mL)，其他操作步骤同上。
将小鼠分组，包括：小鼠菌悬液灭活对照组、雄性小鼠菌悬液组，分别以2.0mL/100g·BW的剂量给小鼠灌胃，灌胃前应禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。
经口灌胃后每天观察1次，至少观察21d，观察方法同上。经口灌胃后的异常特征观察结果如表3所示，灌胃前后小鼠的体重变化如表4所示。
表3经口灌胃后异常特征观察
Figure BDA0003124338140000081
表4灌胃前后小鼠体重变化
Figure BDA0003124338140000082
综合表1-4的结果，将所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269菌悬液分别对小鼠实施腹腔注射或灌胃处理3周后，小鼠均未出现身体异常，生长正常，体重也没有异常减轻，即说明该菌株安全性高，无毒无致病性。
实施例2长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的降脂功效
1、脂肪细胞实验
细胞分化诱导：当细胞汇合率为70-80％时，按照
Figure BDA0003124338140000091
CL-173TM产品说明书中提供的与传代培养相关的说明，通过胰蛋白酶消化收获细胞。将细胞接种到前脂肪细胞扩增培养基(90％DMEM，10％小牛血清)中，生长48小时，或直到培养物达到100％融合为止。再孵育48小时后，从每个孔中移出前脂肪细胞扩增培养基，并添加相同体积的分化培养基(90％DMEM，10％胎牛血清FBS，1.0μM地塞米松，0.5mM甲基异丁基黄嘌呤(IBMX)，10μg/mL胰岛素)。同时按1：1000的比例，加入灭活菌液。
在分化培养基中孵育48小时，用脂肪细胞维持培养基(90％DMEM，10％胎牛血清，10μg/mL胰岛素)替换分化培养基，每48小时更换一次脂肪细胞维持培养基。诱导后6到10天之间，通过油红染色观察脂质滴形成。通过试剂盒检测细胞中甘油三酯含量。
(1)油红染色
油红染色液配置：1g油红溶于200mL浓度60％的异丙醇中，混匀后搅拌溶解，配成储存液。4度避光保存。临用时3：2与蒸馏水配置原液，静置一会后过滤。
染色：脂肪细胞以PBS冲洗2次，置于4％甲醛固定20min，弃掉，PBS洗1-2次，油红O染液0.5-1h，60％异丙醇快速漂洗3s，PBS洗2-3遍，显微镜观察，其中红色越多，表明油滴越多。
观察结果如图1所示，其中图1-A和1-B为未加益生菌的空白对照组，图1-C和1-D为长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后的结果。结果显示，相较于未加益生菌的空白对照组，经长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后，脂肪细胞数量显著降低，即本发明所述的长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269具有降脂功效。
(2)脂肪细胞中甘油三酯含量检测
按照甘油三酯(TG)测试盒说明书(南京建成A110-1-1)执行。
1)细胞收集：将制备好的细胞悬液取出，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，留细胞沉淀；用磷酸盐缓冲液清洗1-2次，同样1000转/分，离心10分钟，弃上清液，留细胞沉淀；
2)细胞破碎：加入0.2-0.3mL的缓冲液进行匀浆，冰水浴条件下超声破碎(300W，3-5秒/次，间隔30秒，重复3-5次)，制备好的匀浆不离心直接测定。
3)计算公式：酶标仪比色：甘油三酯含量(mmol/gprot)＝(样本OD值-空白OD值)/(校准OD值-空白OD值)×标准品浓度(mmol/L)÷待测样本蛋白浓度(gprot/L，可直接用样本浓度进行计算)，结果如下表所示：
菌株 甘油三酯含量(mmol/L)
对照 0.728342
长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269 0.629122
结果显示，经长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后，脂肪细胞中的甘油三酯含量显著降低，进一步证实了所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269具有优异的降脂功效。
2、胆盐水解酶(BSH)活性检测
取长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的新鲜培养液0.5μL分别滴加接种到MRS培养基和MRS+0.5％TDCA(胆碱盐)中，37℃过夜培养，观察菌落周围沉淀圈的形成，结果如图2所示。结果显示，相较于MRS培养基，添加有TDCA的培养基上出现沉淀圈，即说明该菌株具有胆盐水解酶活性，因此可耐受肠道中的胆盐压力，增强该菌株在肠道内的定殖效果，提高在肠道中的存活率和稳定性，并且还可参与胆汁酸调控以达到降低胆固醇的功效。
实施例3长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的动物实验
1、材料
菌悬液制备：菌株活化转接两次后，在适合培养条件下培养至稳定期，6000rpm/min，离心10min收集菌体并用PBS洗涤重悬。
组别：常规饲料对照组，高脂饲料对照组(常州鼠一鼠二生物科技有限公司)，益生菌处理组，每组5只小鼠。
2、高脂小鼠模型建立
1)实验动物：8周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPF级)，饲养于恒温25±2℃，相对湿度为50±5，昼夜循环12/12h的环境中。
2)正常饮食(ND)适应一周后，按照体重随机分成两组，一组给予普通维持饲料作为空白对照，其余实验小鼠喂养高脂饮食(HFD)8周诱导肥胖。期间每周记录进食量，并称量体重。正式实验前，观察体重变化情况，淘汰体重无明显变化的小鼠，按各组间平均值无差异重新分组。
3)其中常规饲料对照组(ND组)正常饮食；高脂饲料对照组(HFD组)高脂饮食；益生菌处理组为：对上述高脂小鼠模型持续饲喂高脂饲料，并灌胃益生菌(1×108CFU/mL)，灌胃量为200μL；ND组和HFD组则灌胃等体积的PBS缓冲液，每天同样时间灌胃，灌胃喂养期间随意饮食，定期测定小鼠的体重(g)及进食量。
其中，常规饲料对照组(ND组)的体重统计结果如表5所示，高脂饲料对照组(HFD组)的体重统计结果如表6所示，益生菌处理组的体重统计结果如表7所示。
表5 ND组的体重统计结果
Figure BDA0003124338140000111
Figure BDA0003124338140000121
表6 HFD组的体重统计结果
Figure BDA0003124338140000122
表7益生菌处理组的体重统计结果
Figure BDA0003124338140000123
综合表5-7的统计结果，相较于高脂饲料对照组(HFD组)，经长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后，小鼠的体重有不同程度的降低，即说明该菌具有减脂功效，因此可制备成减肥药物、功能食品或保健食品。
3、指标检测
在上述灌胃实验结束后，留取小鼠粪便。动物禁食过夜。处死小鼠，迅速取出血液、脂肪、肝脏。血样以1000-2500rpm/min离心15min，采集血清进行以下分析。所有样品在使用前储存在-80℃。每只小鼠的被精确解剖、称重并收集用于进一步分析(取3份完整样品用作称重)。其中，肝脏重量(g)的测定结果如表8所示，脂肪重量的测定结果如表9所示。
表8肝脏重量测定结果
Figure BDA0003124338140000131
表9脂肪重量测定结果
Figure BDA0003124338140000132
综合表8和表9的检测结果，相较于HFD组，经长双歧杆菌Bifidobacterium longumMF-269干预后，小鼠体内的肝脏重量和脂肪重量都有显著降低，进一步说明该菌株具有优异的降脂功效。
4、生化分析
(1)血清生化参数
按照南京建成血脂四项试剂盒，测定包括胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)在内的血脂水平。按照ALT，AST试剂盒要求，测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的含量变化，反映肝功能状况。结果如表10-11所示。
表10血脂四项检测结果
Figure BDA0003124338140000133
Figure BDA0003124338140000141
表11 ALT和AST含量测定
Figure BDA0003124338140000142
根据表10和表11的检测结果，相较于HFD组，经长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum MF-269干预后，小鼠的胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量水平均有显著降低，而高密度脂蛋白水平处于相对平衡的状态，说明该益生菌具有优异的降血脂功效；同时丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的含量有不同程度地降低，即说明经长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后，小鼠的肝功能状态相比于HFD组小鼠有所改善。
(2)血糖测定
使用血糖计(LifeScan)测量小鼠尾静脉全血的血糖水平。于处死小鼠前1d，禁食12h，腹腔注射葡萄糖5g kg-1后，剪尾取血，分别测定0min，30min，75min和120min血糖水平，结果如表12所示。
表12血糖测定结果
Figure BDA0003124338140000151
结果显示，经长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后，小鼠的血糖水平有没有明显变化。
(3)组织病理学分析
将肝脏同一部位40mg(0.5cm×0.5cm)，脂肪组织约50mg，固定在4％多聚甲醛中24小时，HE染色。染色后的玻片经倒置显微镜观察并进行图像采集，白色圆圈代表脂肪空泡，圆圈越多代表脂肪肝越严重。
肝脏组织的观察结果结果如图3所示，脂肪组织的观察结果如图4所示，其中A为ND组，B为HFD组，C和D为益生菌处理组。结果显示，相较于ND组，HFD组的肝脏组织中脂肪空泡多，并且脂肪细胞大且排列杂乱无序，说明脂肪肝严重，相较于HFD组，经益生菌经长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后，小鼠肝脏组织中的脂肪空泡显著减少，同时脂肪细胞变小且排列整齐，说明该菌株对于脂肪肝具有一定的缓解治疗作用，因此可将其制成治疗和/或预防脂肪肝的药物、功能食品或保健食品。
(4)炎症因子检测
取各组小鼠的血清，利用CBA小鼠炎症多因子试剂盒检测IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-12六种不同的炎症因子含量。具体步骤按照试剂盒说明书(CBA#560485)执行。首先按照实际用量将六种不同的微球充分涡旋混合，每个实验管加入30ul混合微球，再加入25ul PE标记的细胞因子检测抗体，室温避光孵育3小时。上机前，每管用清洗液清洗，200g离心5min，倒掉上清，再加入300ul洗涤液重悬细胞。样品准备好后，用流式细胞仪检测，分析结果，各炎症因子含量的检测结果平均值如表13所示。
表13炎症因子检测结果
Figure BDA0003124338140000161
Figure BDA0003124338140000171
结果显示，经长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269干预后，小鼠的炎症因子含量无明显异常。
综上所述，本发明从人体粪便中首次分离筛选出了一株长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269，经验证其具有优异的降血脂减脂功效，治疗或缓解脂肪肝，将其制成药物或保健食品，用于高血脂等疾病的治疗和预防，具有广阔的应用价值。
实施例4长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的基因组分析
将所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269再次纯化，提取DNA后送至安诺优达基因科技(北京)有限公司进行全基因组重测序；DNA样品被接收后，对样品进行检测，经电泳检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为350bp的片段。处理完成后的DNA片段，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备；文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至2ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段(insert size)进行检测，insert size符合预期后使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量；库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina Novaseq测序。
所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的基因组图谱如图5所示，并将该菌株的全基因组序列与已有的数据库进行比对，其中在毒力/致病岛数据库(PAIDB)的比对结果如图6所示，在毒力基因数据库(VFDB)的比对结果如表14所示。
表14 VFDB数据库比对结果
Figure BDA0003124338140000181
Figure BDA0003124338140000191
Figure BDA0003124338140000201
Figure BDA0003124338140000211
http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi？JobID＝Dec_2-1925497037
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 美益添生物医药（武汉）有限公司
<120> 一株长双歧杆菌MF-269及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 899
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum MF-269)
<400> 1
gagtgggcgg gtgcttacca tgcagtcgaa cgggatccat caggctttgc ttggtggtga 60
gagtggcgaa cgggtgagta atgcgtgacc gacctgcccc atacaccgga atagctcctg 120
gaaacgggtg gtaatgccgg atgctccagt tgatcgcatg gtcttctggg aaagctttcg 180
cggtatggga tggggtcgcg tcctatcagc ttgacggcgg ggtaacggcc caccgtggct 240
tcgacgggta gccggcctga gagggcgacc ggccacattg ggactgagat acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac 360
gccgcgtgag ggatggaggc cttcgggttg taaacctctt ttatcgggga gcaagcgaga 420
gtgagtttac ccgttgaata agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480
agggtgcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagggc tcgtaggcgg ttcgtcgcgt 540
ccggtgtgaa agtccatcgc ttaacggtgg atccgcgccg ggtacgggcg ggcttgagtg 600
cggtagggga gactggaatt cccggtgtaa cggtggaatg tgtagatatc gggaagaaca 660
ccaatggcga aggcaggtct ctgggccgtt actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag 720
cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg gtggatgctg gatgtggggc 780
ccgttccacg ggttccgtgt cggagctaac gcgttaagca tcccgcctgg ggagtacggc 840
cgcaaggcta aaactcaaag aaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgcgga 899

Claims (5)

1.一株长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269在制备治疗和/或预防高血脂药物、脂肪肝药物以及制备减肥药物中的应用，其特征在于，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的保藏编号为：CGMCC No:21587。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长双歧杆菌BifidobacteriumlongumMF-269通过降低胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量，降低血脂；所述长双歧杆菌Bifidobacterium longumMF-269通过降低肝脏重量，降低性腺脂肪和肾周脂肪的含量，达到减肥功效。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂或溶液剂。
5.一种益生菌菌剂，其特征在于，所述益生菌菌剂包括：将如权利要求1中所述的长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269进行培养获得菌液，或包含所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum MF-269的干粉菌剂。
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