CN115992059A - 一株产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其缓解溃疡性结肠炎的用途 - Google Patents

一株产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其缓解溃疡性结肠炎的用途 Download PDF

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CN115992059A CN202210799722.2A CN202210799722A CN115992059A CN 115992059 A CN115992059 A CN 115992059A CN 202210799722 A CN202210799722 A CN 202210799722A CN 115992059 A CN115992059 A CN 115992059A
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李向菲
沈丹
陈洪周
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Abstract

本发明公开了一株产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其缓解溃疡性结肠炎的用途，属于微生物技术领域。本发明提供了一株约氏乳杆菌46，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62454；本发明的约氏乳杆菌能够降低溃疡性结肠炎小鼠的血清促炎因子水平，增强抗炎能力；提高结肠超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，升高谷胱甘肽水平，降低丙二醛水平，减轻结肠氧化损伤的程度；增加肠道约氏乳杆菌丰度，调节肠道菌群的组成，促进短链脂肪酸的产生，改善肠道微生态；以及上调紧密连接蛋白的表达，抑制NF‑κB炎症信号通路。本发明的产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌可用于制备发酵食品、功能性食品或药物，具有广泛的应用前景。

Description

一株产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其缓解溃疡性结肠炎的用途
技术领域
本发明涉及一株产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其缓解溃疡性结肠炎的用途，属于微生物技术领域。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种累及结直肠黏膜及黏膜下层的炎症性肠道疾病。近15年来，UC患病人数逐年增多，高达14万余人，且UC发病人群逐渐趋于年轻化。UC主要发病于结肠组织，可从初期的无症状轻度炎症发展为后期的全结肠重度炎症，导致频繁的血便、结肠运动功能障碍、潜在的永久性纤维化和组织损伤，最后，出现需要手术干预的全身症状，严重影响人体健康。目前，治疗UC的传统药物有氨基水杨酸盐、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物药物等；然而，这些药物的疗效有限，可能会引起发烧、过敏、肠胃不适和肾脏损伤等不良反应。因此，寻找食源性的、有效的、副作用小的UC预防性治疗方法十分重要。
日常膳食所包含的低聚糖、多糖等通常与阿魏酸以酯键交联形式结合，而阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterase，FAE)是一种有效地将该结合态水解为游离态的催化剂，释放的低聚糖和多糖具有调节肠道菌群的作用，同时，释放的阿魏酸具有抗炎抗氧化作用。由于机体的肠道菌群负责主要消化工作，那么，菌群中应该具有产FAE的菌种。肠道中乳杆菌和双歧杆菌已被证实是分泌FAE的重要菌群。但目前从肠道菌群中筛选产FAE菌，通过粪菌移植的手段观察其对小鼠肠炎缓解作用的研究尚未有发现。
益生菌作为一种“活的微生物”，因其抗炎作用强、副作用少，具有改善肠道黏膜、维持肠道菌群平衡、抑制致病菌生长等有益功能而被推荐作为UC患者的辅助治疗物。已有研究表明，乳杆菌的摄入能够降低血清中炎症因子的水平，改善氧化损伤，还能增加肠道菌群代谢物短链脂肪酸的含量，改善肠道微生态，从而缓解由葡聚糖硫酸钠(Dextransulfate sodium，DSS)诱导的UC。随着对肠道菌群研究的不断深入，选择肠道菌群来源的益生菌可能是治疗结肠炎的潜在手段，通过肠道菌群来源的益生菌改善UC患者的健康状况，成为治疗及预防UC发生的新方法。
发明内容
本发明提供一株健康小鼠粪便来源的产FAE的约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)46，已于2022年5月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62454。
所述约氏乳杆菌46具有如下特性：
(1)菌落特征：呈乳白色，中间扁平，边缘圆润有光泽。
(2)菌体特征：呈革兰氏染色阳性、杆状细菌。
(3)生长特性：在恒温恒湿(37℃，55％)条件下，在MRS培养基中培养18h到达对数期，为最佳培养时间。
(4)耐受性：在人工模拟胃肠液中存活率高，有较强耐受力。
所述约氏乳杆菌46利用以阿魏酸乙酯(Ethyl ferulate，EFA)为唯一碳源的无机盐固体平板，通过稀释涂布法对健康小鼠的粪便进行初筛，根据平板透明圈法，筛选具有产FAE能力的菌株；然后，通过MRS-EFA固体平板，根据发酵液和上清液降解EFA的能力复筛产FAE优势菌；通过HPLC法分析优势菌发酵上清中阿魏酸的含量，确定优势菌产FAE的能力；通过16S序列比对初步对优势菌进行鉴定；进一步通过体外模拟胃肠液试验，分析优势菌是否耐受胃肠液，为后续动物实验做准备。
本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述约氏乳杆菌46活细胞，或含有约氏乳杆菌46发酵液，或含有约氏乳杆菌46冻干粉，或含有约氏乳杆菌46灭活的菌体细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，约氏乳杆菌46的含量至少为：5×109CFU/mL。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌46或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在以下(a)～(e)中至少一种的应用：
(a)在产阿魏酸酯酶中的应用；
(b)在制备含有阿魏酸酯酶的产品中的应用；
(c)在降解阿魏酸乙酯中的应用；
(d)在制备降解阿魏酸乙酯的产品中的应用。
(e)在制备阿魏酸或含有阿魏酸的产品中的应用。
本发明还提供了一种产品，所述产品中，含有所述约氏乳杆菌46，或含有上述微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，约氏乳杆菌46的含量至少为：5×109CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为使用含有所述约氏乳杆菌46的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为含有所述约氏乳杆菌46的饮料或零食。
本发明还提供了一种缓解溃疡性结肠炎症状的药品，所述药品中，含有所述约氏乳杆菌46，或含有上述微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药品中，所述约氏乳杆菌46的含量至少为：5×109CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有所述约氏乳杆菌46、药物载体和/或药用辅料。
本发明还提供了一种阿魏酸酯酶的制备方法，所述方法为，将上述约氏乳杆菌46接种至含有阿魏酸乙酯的反应体系中反应制备得到阿魏酸酯酶。
在本发明的一种实施方式中，所述约氏乳杆菌46的接种量至少为：2％。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，所述约氏乳杆菌46以阿魏酸乙酯为唯一碳源反应制备得到阿魏酸酯酶。
在本发明的一种实施方式中，所述底物阿魏酸乙酯的添加量至少为：每升培养基中含有15mL 10％EFA(W/V)的DMSO溶液。
本发明还提供了一种水解阿魏酸乙酯的方法，所述方法为，将所述约氏乳杆菌46接种至含有阿魏酸乙酯的反应体系中，进行水解。
本发明还提供一种制备阿魏酸的方法，所述方法为，讲所述约氏乳杆菌46接种至含有阿魏酸乙酯的反应体系中，发酵培养后，代谢物包含阿魏酸。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌46或上述微生物制剂在制备缓解溃疡性结肠炎症状的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、饲料或饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药品中含有上述约氏乳杆菌46或含有上述微生物菌剂。
本发明还提供了一种所述产FAE的约氏乳杆菌46在制备具有以下至少一种功能的产品的应用：
(a)降低溃疡性结肠炎哺乳动物血清中促炎因子IL-1β和IL-6水平；
(b)降低溃疡性结肠炎哺乳动物结肠的丙二醛(MDA)水平；
(c)提高溃疡性结肠炎哺乳动物结肠的谷胱甘肽(GSH)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；
(d)促进溃疡性结肠炎哺乳动物肠道短链脂肪酸的产生；
(e)降低溃疡性结肠炎哺乳动物肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比例；
(f)增加溃疡性结肠炎哺乳动物肠道菌群中约氏乳杆菌、啮齿粪杆菌和缠结优杆菌的丰度。
(g)上调溃疡性结肠炎哺乳动物结肠中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达；
(h)下调溃疡性结肠炎哺乳动物结肠中IKK-β、IκB-α和NF-κB p65的表达；
(i)改善溃疡性结肠炎哺乳动物结肠的组织损伤。
本发明还提供了所述约氏乳杆菌46在制备发酵食品中的应用。
在一种实施方式中，所述应用包括但不限于将所述产FAE的约氏乳杆菌46作为发酵微生物，利用食品原料进行发酵。
有益效果
本发明提供的所述产FAE的约氏乳杆菌46具有以下优势：
(1)所述产FAE的约氏乳杆菌46能够降低溃疡性结肠炎小鼠血清中IL-1β和IL-6水平，减轻炎症；
(2)所述产FAE的约氏乳杆菌46能降低结肠中丙二醛(MDA)的水平，提高结肠中谷胱甘肽(GSH)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，从而增强结肠的抗氧化能力，减轻氧化损伤；
(3)所述产FAE的约氏乳杆菌46能促进小鼠肠道中短链脂肪酸的分泌，降低厚壁菌门和拟杆菌门的比例，增加约氏乳杆菌、啮齿粪杆菌和缠结优杆菌的丰度，调节肠道菌群，改善肠道微生态；
(4)所述产FAE的约氏乳杆菌46能提高溃疡性结肠炎小鼠结肠中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达，降低IKK-β、IκB-α和NF-κB p65的表达，增强肠粘膜屏障，抑制NF-κB炎症信号通路，减轻肠道炎症。
(5)所述产FAE的约氏乳杆菌46能在一定程度上抵抗DSS对结肠组织的损伤，主要表现为结肠组织形态比较完整，且杯状细胞较为丰富。
(6)所述约氏乳杆菌46利用以EFA为唯一碳源的培养基，产生透明圈，因此，约氏乳杆菌46能够水解EFA，本发明的约氏乳杆菌46的发酵上清包含阿魏酸，表明约氏乳杆菌46是一株FAE的菌。
因此，本发明提供的约氏乳杆菌46在制备改善宿主肠道健康的产品(如食品、药品或保健品等)中具有广泛的应用前景。
生物材料保藏
一株约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)46，分类学命名为：Lactobacillusjohnsonii，已于2022年5月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62454，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：约氏乳杆菌46的菌落形态。
图2：约氏乳杆菌46发酵液降解阿魏酸乙酯产生的透明圈。
图3：约氏乳杆菌46干预后对溃疡性结肠炎小鼠血清炎症因子的影响；其中，A为血清IL-1β水平，B为血清IL-6水平。
图4：约氏乳杆菌46干预后对溃疡性结肠炎小鼠结肠中氧化相关因子的影响；其中，A为丙二醛(MDA)活力；B为超氧化物歧化酶(SOD)活力；C为谷胱甘肽(GSH)活力；D为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。
图5：约氏乳杆菌46干预后对溃疡性结肠炎小鼠盲肠内容物短链脂肪酸的影响；其中，A，乙酸；B，异丁酸；C，异戊酸。
图6：约氏乳杆菌46干预后对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群中厚壁菌门/拟杆菌门的比例的影响。
图7：约氏乳杆菌46干预后对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群中不同菌株的丰度的影响，其中A为约氏乳杆菌，B为啮齿粪杆菌，C为缠结优杆菌。
图8：约氏乳杆菌46干预后对溃疡性结肠炎小鼠结肠中炎症因子的表达的影响；其中，A为紧密连接蛋白Claudin-1的表达，B为ZO-1的表达。
图9：约氏乳杆菌46干预后对溃疡性结肠炎小鼠结肠的组织损伤的影响。
其中，用不同的小写字母(a，b，c，d)标记显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的C57BL/6J健康小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司(SCXK(HU)2017-0005)。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
无机盐固体初筛培养基：氯化钙0.5g，氯化钠10g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵1.0g，硫酸镁0.05g，含10％EFA(W/V)的DMSO溶液15mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，一水葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，吐温-80 1mL,三水乙酸钠5.0g，三水磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH为6.2-6.6，121℃灭菌20min。
MRS-EFA固体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，含10％阿魏酸乙酯(W/V)的DMSO溶液15mL，柠檬酸氢二铵2.0g，吐温-80 1mL,三水乙酸钠5.0g，三水磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，琼脂18.0g，pH为6.2-6.6，121℃灭菌20min。
下述实施例中所涉及的模拟胃液为：
称取适量胃蛋白酶(1:10000)溶于0.85％无菌生理盐水中，调节最终浓度为3g/L，调pH至3.0(2mol/L HCl)，过0.22μm水相膜即可。
下述实施例中所涉及的模拟肠液为：
称取适量胰蛋白酶(1:250)溶于0.85％无菌生理盐水中，调节最终浓度为1g/L，再加入胆汁盐，使其浓度达到0.3％，调pH至8.0(1mol/L NaOH，过0.22μm水相膜即可。
下述实施例中所涉及的2％DSS溶液的配制方法为：DSS，Dextran Sulfate SodiumSalt，葡聚糖硫酸钠盐。量取100mL无菌水，加入2g DSS，混匀后，用0.22μm水相滤膜过滤即可使用。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
存活率(％)的计算：
Figure BDA0003733534000000061
注：其中N1为菌株在模拟胃液/肠液消化后的活菌数量；N0为菌株在消化前的活菌数量。
阿魏酸的测定方法如下：
将约氏乳杆菌46接种至阿魏酸乙酯为唯一碳源的MRS培养基中，37℃培养18h，10000rpm离心5min，收集上清，并用0.22μm水相滤膜过滤后，采用HPLC法测定约氏乳杆菌46发酵上清中阿魏酸含量。HPLC条件：色谱柱：ZORBAX SB-Aq(4.6×250mm，5μm)；流动相：A-0.1％醋酸溶液，B-乙腈；洗脱梯度：0-25min 20-95％乙腈；流速:1.0mL/min；柱温:25℃；检测器和波长:DAD 320nm；溶剂：甲醇；阿魏酸保留时间:10.5min。阿魏酸标曲的制作如表1所示，制得阿魏酸标曲为y＝0.0575x-72.967，R2＝0.9998。
表1阿魏酸标曲的制备方法
Figure BDA0003733534000000062
短链脂肪酸的测定方法如下：
称取50mg盲肠内容物置于2mL离心管中，加入500μL饱和NaCl溶液，均质至无明显的块状物；均质后，加入20μL 10％硫酸酸化，涡旋混匀；加入800μL乙醚，用于短链脂肪酸的萃取，涡旋混匀；涡旋后在4℃条件下，以14000rpm离心15min，取上层乙醚相；再将上清液倒入装有0.25g无水Na2SO4的2mL离心管中进行干燥；静置10min，然后以同样条件离心取上清，用0.22μm有机膜过滤，将滤液装入棕色气相瓶，用GC-MS分析。
GC-MS分析条件：采用Rtx-Wax柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积为1μL，分流比为10:1；进样温度设定为240℃，按如下程序进行升温：起始温度为100℃，按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃，保持3min，离子化温度为220℃；分析采用全扫描模式。
下述实施例中公式2-ΔΔCt如下所示：
△△Ct＝△Ct(试验样品)-△Ct(基准样品)；
△Ct(试验样品)＝Ct(试验样品，目的基因)-Ct(试验样品，内参基因)；
△Ct(基准样品)＝Ct(基准样品，目的基因)-Ct(基准样品，内参基因)；
计算表达水平比率:2-ΔΔCt＝表达量的比值。
实施例1：以阿魏酸乙酯为唯一碳源对产FAE的约氏乳杆菌46的分离与鉴定
1、产FAE的约氏乳杆菌46菌株的分离
具体分离方法：
产FAE的约氏乳杆菌46分离自C57BL/6J健康小鼠的粪便。具体分离方法如下：称取C57BL/6J健康小鼠粪便0.2g，加入0.85％的NaCl溶液2.0mL涡旋振荡均质成粪悬液，按照10-1-10-8梯度稀释粪悬液，再吸取100μL稀释液涂布到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的无机盐固体初筛平板培养基上(氯化钙0.5g，氯化钠10g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵1.0g，硫酸镁0.05g，含10％阿魏酸乙酯(w/v)的二甲亚砜溶液15mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min)，置于37℃恒温恒湿(55％)培养箱倒置培养48h，初步筛选菌落周围出现明显的透明圈的菌株，即产FAE菌。
复筛：将初筛得到的产FAE菌接种到MRS液体培养基，传代两次后，稀释涂布(10-1-10-8)到MRS-阿魏酸乙酯固体培养基(蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，含10％阿魏酸乙酯(W/V)的二甲亚砜溶液15mL，柠檬酸氢二铵2.0g，吐温-80 1mL，三水乙酸钠5.0g，三水磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，琼脂18.0g，pH为6.2-6.6，121℃灭菌20min)上，进一步验证是否具有明显的透明圈。重复上次操作三次后，挑选具有明显透明圈的单菌落作为备选菌株。进一步通过HPLC法分析菌的发酵液是否产生阿魏酸，确定产FAE的优势菌株，作为后续实验的目标菌株。
实验结果：
采用无机盐固体初筛培养基，从小鼠粪便中挑选了50株具有产FAE能力的菌株，产生透明圈情况见表2。
表2粪便中菌株产生透明圈的情况
Figure BDA0003733534000000081
注：“+”表示透明圈直径<19mm，“++”表示透明圈直径19～20mm，“+++”表示透明圈直径>20mm。
进一步通过16S rRNA测序，BLAST比对，发现4、12、13、21、34、39、43、48、49和50是同一株菌；1、6、7、14、17和30是同一株菌；20、23、26、28、32、33和44是同一株菌；2、3、5、25和27是同一株菌；8、15、16、22、29、31、35和38是一株菌；9、10、19、36、41、42、45和47是同一株菌；11、18、24、37、40和46是同一株菌。
从50株菌中剔除重复菌株后，通过以阿魏酸乙酯为唯一碳源的无机盐培养基筛选，得出编号为4、14、23、25、31、41和46的7株菌的发酵液和上清液都具有产生透明圈的能力，透明圈大小见表3，表明该菌能分泌FAE，进而分解阿魏酸乙酯。
表3无机盐固体平板上菌的发酵液和上清液产生的透明圈大小
Figure BDA0003733534000000082
然后，通过MRS-EFA固体平板复筛，编号为14、21、41和46的发酵液在平板上呈现透明圈，此外，46号菌的上清液也含有FAE，透明圈大小为17.30±0.15(表4、图2)。这些结果表明，与其他菌株相比，46号菌的发酵液和上清液都包含FAE，产FAE能力最强，可作为后续动物实验的目标菌株。
表4 MRS-EFA固体平板上菌的发酵液和上清液产生的透明圈大小
Figure BDA0003733534000000083
Figure BDA0003733534000000091
进一步，通过HPLC检测约氏乳杆菌46的发酵液中阿魏酸的含量，得出阿魏酸含量为480.13μM，结合透明圈结果，证实约氏乳杆菌46能够产生FAE，将阿魏酸乙酯水解为阿魏酸。
2、产FAE的约氏乳杆菌46菌株的鉴定
(1)DNA的提取：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取1中筛选所得的产FAE菌的基因组DNA，通过仪器Nanodrop测定DNA浓度。
(2)PCR扩增：以提取的产FAE菌的基因组DNA为模板，用16S rRNA的寡核苷酸通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增，PCR反应体系如表5所示。反应条件为94℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，1min30s；step2-4，35×；72℃，8min；4℃，∞。
表5 PCR反应体系
Figure BDA0003733534000000092
将得到的PCR产物送到专业测序公司，其16S序列如SEQ ID NO.1所示，得到的测序结果在NCBI网站上使用BLAST在基因库中进行搜索比对，将鉴定为约氏乳杆菌，命名为约氏乳杆菌46，将菌株在-80℃保存。
实施例2：约氏乳杆菌46对模拟胃肠液具有良好的耐受性
将冷冻保存在-80℃的约氏乳杆菌46接种到MRS液体培养基中，在37℃恒温恒湿培养箱中培养18h，按照上述条件传接2代后，取第三代的培养发酵液，进行模拟胃肠液试验。具体步骤如下：
(1)模拟胃液试验：取5mL步骤(1)得到的发酵液，在4℃10000rpm条件下离心10min，弃上清，沉淀用0.85％无菌生理盐水洗两次后，溶于1mL 0.85％无菌生理盐水中；然后加入9mL模拟胃液，混匀后，置于37℃恒温水浴振荡培养。分别取0h和2h的样品，进行菌落计数，结果如表6所示。
(2)模拟肠液试验：取1mL步骤(1)得到的在胃液中培养2h的菌液，加入9mL模拟肠液，置于37℃恒温水浴振荡培养，分别取3h和5h的样品，进行菌落计数，结果如表6所示。
表6产FAE的约氏乳杆菌46在体外模拟胃肠液中的耐受力
Figure BDA0003733534000000101
结果表明，所述约氏乳杆菌46在模拟胃肠液中有较强的耐受力。
实施例3：约氏乳杆菌46降低血清中IL-1β和IL-6的水平
具体步骤如下：
1、DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎小鼠实验
准备32只6-8周龄，20±2g的雄性C57BL/6J小鼠，适应性培养一周后，随机分成四组，分别为空白对照组、UC模型组、柳氮磺胺吡啶组(溃疡性结肠炎药物组)和产FAE的约氏乳杆菌46干预组(L.johnsonii 46)。
空白对照组和UC模型组小鼠每天灌胃0.4mL 0.85％无菌生理盐水，柳氮磺胺吡啶组小鼠每天灌胃0.4mL 50mg/kg bw柳氮磺胺嘧啶，L.johnsonii 46组小鼠每天给予0.4mL5×109CFU/mL的约氏乳杆菌46菌悬液。
所述约氏乳杆菌46菌悬液的制备方法为：取出-80℃保存的L.johnsonii 46，以2％接种量接种到MRS液体培养基中，置于37℃恒温恒湿培养箱中培养18h；然后，以四区划线法在MRS固体平板上划线(图1)，置于37℃倒置培养48-72h，观察单菌落形态；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h，然后，以2％的接种量传代2次进行活化。第2代菌的发酵液在4℃，8000rpm条件下，离心10min，弃上清，收集沉淀。将沉淀用0.85％无菌生理盐水重悬，在4℃，8000rpm条件下离心10min，弃上清，达到洗涤菌体的目的，重复两次。最后，根据菌体生长曲线，将菌体用0.85％无菌生理盐水重悬至5×109CFU/mL，作为动物实验小鼠的灌胃样品，现配现用。
从第1天至第14天，所有组小鼠均饮用无菌水；从第15天到第21天，除空白对照组之外，其余组均饮用2％DSS溶液，每两天更换一次。实验分组及处理方法见表7：
表7实验动物组别与处理方法
Figure BDA0003733534000000102
Figure BDA0003733534000000111
在处理小鼠前一天收集小鼠的粪便，并冻存于-80℃。在第22天，小鼠通过乙醚麻醉后处死。
2、约氏乳杆菌46对溃疡性结肠炎小鼠的血清中IL-1β和IL-6水平的影响
在小鼠处死前进行眼球采血，血样静置15min后，在4℃和3000rpm条件下离心10min，收集血清，采用ELISA试剂盒检测血清中IL-1β和IL-6水平，产FAE的约氏乳杆菌46对血清中IL-1β和IL-6水平的影响如图3A～B所示。
结果显示，与UC模型组(IL-1β和IL-6浓度分别为：24.15±2.24pg/mL、23.83±2.78pg/mL)相比，产FAE的约氏乳杆菌46(IL-1β和IL-6浓度分别为：17.40±4.96pg/mL、12.31±2.37pg/mL)使UC小鼠的血清中IL-1β和IL-6浓度分别降低了27.95％和48.34％，并接近对照组(IL-1β和IL-6浓度分别为：14.80±2.50pg/mL、8.81±3.45pg/mL)，其降低促炎因子的作用与药物柳氮磺胺吡啶相近，可减轻UC小鼠的炎症。
其中，灌胃约氏乳杆菌46后对于溃疡性结肠炎小鼠的血清中IL-6的影响要优于灌胃药物组。
实施例4：约氏乳杆菌46缓解由炎症引起的丙二醛(MDA)水平升高，谷胱甘肽(GSH)水平的降低，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力降低
实验动物分组及处理方法同实施例3步骤1，实验结束后，将小鼠的结肠组织取出后，处死小鼠，并剔除小鼠结肠组织中的脂肪和结肠内容物，用冰冷的生理盐水漂洗，吸干，称取适量结肠组织，制成10％结肠匀浆，4℃，12000rpm离心10min，取上清，-80℃冻存，检测各组小鼠结肠组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量，各个因子的抗氧化的检测按照试剂盒(南京建成)的方法进行，结果如图4A～D所示。
结果显示，与对照组相比，UC模型组小鼠丙二醛(MDA)水平较高(含量为：0.73±0.11μmol/gprot)，谷胱甘肽(GSH)水平(含量为：7.18±2.25μmol/gprot)较低，超氧化物歧化酶(SOD)(含量为：2.02±0.32U/mgprot)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(含量为：11.43±2.16μmol/gprot)活力较低，说明溃疡性结肠炎症使得小鼠结肠氧化损伤加重，抗氧化应激能力下降。
而采用约氏乳杆菌46干预后，与模型组相比，约氏乳杆菌46组的小鼠丙二醛(MDA)水平(含量为：0.49±0.04μmol/gprot)降低了32.88％；谷胱甘肽(GSH)水平(含量为：11.78±1.48μmol/gprot)升高了29.70％；超氧化物歧化酶(SOD)活力(含量为：2.62±0.30U/mgprot)升高了29.70％；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力(含量为：15.04±1.23μmol/gprot)升高了31.58％。
证明产FAE的约氏乳杆菌46干预能够改善由溃疡性结肠炎症引起的结肠氧化损伤，提高其抗氧化活性，趋近于正常对照组和柳氮磺胺吡啶组。
实施例5：产FAE的约氏乳杆菌46能促进小鼠肠道短链脂肪酸的产生
实验动物分组及处理方法同实施例3步骤1，实验结束后，收集各组小鼠的盲肠内容物后处死小鼠，将各组小鼠的盲肠内容物用于短链脂肪酸的测定，结果如图5A～C所示。
结果显示，与对照组相比，UC模型组小鼠的短链脂肪酸(乙酸、异丁酸和异戊酸)含量较低(分别为：0.626±0.125μmol/g、0.004±0.000μmol/g、0.037±0.011μmol/g)，这说明溃疡性结肠炎症会影响小鼠的肠道菌群代谢物含量，使得短链脂肪酸减少，而产FAE的约氏乳杆菌46能够促进短链脂肪酸的产生(乙酸、异丁酸和异戊酸含量分别为：0.852±0.027μmol/g、0.004±0.000μmol/g、0.060±0.014μmol/g)，改善肠道微环境，另外柳氮磺胺吡啶的这种效果不大(乙酸、异丁酸和异戊酸含量分别为：0.579±0.112μmol/g、0.003±0.000μmol/g、0.058±0.005μmol/g)。
实施例6：产FAE的约氏乳杆菌46能降低溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比例、能增加溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群中约氏乳杆菌、啮齿粪杆菌和缠结优杆菌的丰度
实验动物分组及处理方法同实施例3，步骤1，实验结束后，收集各组小鼠的粪便后处死小鼠，将小鼠粪便送至专业公司进行高通量测序，结果如图6～图7所示。
结果显示：
(1)关于溃疡性结肠炎的小鼠肠道微生物环境厚壁菌门与拟杆菌门的比例：
如图6所示，溃疡性结肠炎的发生往往伴随着肠道微生物环境的紊乱。UC模型组小鼠厚壁菌门与拟杆菌门的比例较对照组小鼠高，这说明溃疡性结肠炎症会引起小鼠肠道菌群结构的改变，增加厚壁菌门与拟杆菌门的比例，而产FAE的约氏乳杆菌46干预能调节肠道菌群的结构，并降低厚壁菌门与拟杆菌门的比例，趋近于对照组和柳氮磺胺吡啶组。
(2)关于溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群中约氏乳杆菌、啮齿粪杆菌和缠结优杆菌的丰度：
有研究表明，约氏乳杆菌可增加肠道益生菌，改善肠道的屏障功能，进而提高机体的免疫反应；啮齿粪杆菌则在小鼠身上具有抗癌作用。
如图7A～C所示，与对照组相比，UC模型组约氏乳杆菌、啮齿粪杆菌和缠结优杆菌的丰度较低，说明在溃疡性结肠炎小鼠中会引起约氏乳杆菌、啮齿粪杆菌和缠结优杆菌的减少，而产FAE的约氏乳杆菌46干预能增加肠道中约氏乳杆菌、啮齿粪杆菌和缠结优杆菌的丰度，柳氮磺胺吡啶组对约氏乳杆菌和啮齿粪杆菌的作用则不大。
实施例7：约氏乳杆菌46能增加溃疡性结肠炎小鼠结肠中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达
实验动物分组及处理方法同实施例3步骤1，实验结束后，将小鼠的结肠组织取出后，处死小鼠，并剔除小鼠结肠组织中的脂肪和结肠内容物，用冰冷的生理盐水漂洗，吸干，称取适量结肠组织，制成10％结肠匀浆，4℃，12000rpm离心10min，取上清，-80℃冻存，用于RT-qPCR的检测溃疡性结肠炎小鼠结肠中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1。
按照试剂盒说明书进行RNA的提取、RNA逆转录成cDNA以及荧光定量。GAPDH作为内参基因，利用公式2-ΔΔCt计算目的基因Claudin-1和ZO-1的相对表达量。所用引物序列见表8，结果如图8A～B所示。
表8：RT-qPCR特异性引物序列
Figure BDA0003733534000000131
结果显示，与UC模型组相比(Claudin-1和ZO-1含量分别为0.08±0.01、0.23±0.04)，产FAE的约氏乳杆菌46能够显著上调溃疡性结肠炎小鼠结肠中Claudin-1和ZO-1的表达(Claudin-1和ZO-1含量分别为0.50±0.16、1.42±0.22)。
紧密连接蛋白对于维持肠黏膜屏障的机械完整性至关重要，产FAE的约氏乳杆菌46能够提高紧密连接蛋白的表达，从而增强肠粘膜屏障。
实施例8：约氏乳杆菌46能抑制溃疡性结肠炎小鼠结肠中IKK-β、IκB-α和NF-κBp65的表达
实验动物分组及处理方法同实施例3步骤1，实验结束后，将小鼠的结肠组织取出后，处死小鼠，并剔除小鼠结肠组织中的脂肪和结肠内容物，用冰冷的生理盐水漂洗，吸干，称取适量结肠组织，制成10％结肠匀浆，4℃，12000rpm离心10min，取上清，-80℃冻存，用于RT-qPCR的检测溃疡性结肠炎小鼠结肠中IKK-β、IκB-α和NF-κB p65。
按照试剂盒说明书进行RNA的提取、RNA逆转录成cDNA以及荧光定量。GAPDH作为内参基因，利用公式2-ΔΔCt计算目的基因IKK-β、IκB-α和NF-κB p65的相对表达量。所用引物序列见表9所示。
表9 RT-qPCR特异性引物序列
Figure BDA0003733534000000141
结果显示，与UC模型组相比(IKK-β、IκB-α和NF-κB p65分别为：0.33±0.06、1.83±0.09、0.65±0.03)，约氏乳杆菌46能够下调溃疡性结肠炎小鼠结肠中IKK-β、IκB-α和NF-κBp65的表达(分别为：0.19±0.05、1.39±0.22、0.51±0.08)。
这说明，产FAE的约氏乳杆菌46可通过抑制经典的NF-κB炎症信号通路来改善肠道炎症。
实施例9：产FAE的约氏乳杆菌46能改善小鼠结肠的组织损伤
实验动物分组及处理方法同实施例3步骤1，实验结束后，将小鼠的结肠组织取出后，处死小鼠，采用HE染色直观地呈现结肠组织受损情况，结果如图9所示。
结果显示，通过结肠组织HE染色结果，判断结肠组织损伤程度。
对照组结肠外观形态完整，杯状细胞较为丰富，隐窝深度均匀；
相比之下，UC模型组切片结果显示结肠组织重度异常，出现严重的肠腺、隐窝和杯状细胞丢失和衰竭，粘膜糜烂和水肿。
与UC模型组相比，约氏乳杆菌46干预后的小鼠的结肠组织的HE染色显示，结肠组织有一定的损伤，但是形态比较完整，且杯状细胞较为丰富，能一定程度上改善小鼠结肠组织的损伤程度。
实施例10：产FAE的约氏乳杆菌46的应用
1、含有约氏乳杆菌46的酸奶的制备
制备全脂/脱脂乳培养基，接着进行高温瞬时灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再以2％的接种量接种约氏乳杆菌46，37℃培养24h后，搅拌均匀，置于4℃冷藏保存，即得到含有本发明约氏乳杆菌46活菌的酸奶。
2、含有约氏乳杆菌46的发酵食品的制备
利用本发明能够使用约氏乳杆菌46发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品和半固态食品。发酵食品包括乳制品(酸奶、奶酪、乳酸菌饮品)、面制品(馒头、膨化食品)、果蔬制品(发酵水果汁、发酵蔬菜、泡菜)等。
也可将约氏乳杆菌46按照一定比例加入食品中，增强食品的功能活性。所述约氏乳杆菌46能够耐胃酸、耐胆盐、水解酯化物的酯键，促进活性成分的释放，改善肠道菌群和肠道微生态，缓解结肠组织损伤，减轻结肠炎症状。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)46，已于2022年5月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62454。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的约氏乳杆菌46活细胞，或含有约氏乳杆菌46发酵液，或含有约氏乳杆菌46冻干粉，或含有约氏乳杆菌46灭活的菌体细胞。
3.权利要求1所述的约氏乳杆菌46或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在以下(a)～(e)中至少一种的应用：
(a)在产阿魏酸酯酶中的应用；
(b)在制备含有阿魏酸酯酶的产品中的应用；
(c)在降解阿魏酸乙酯中的应用；
(d)在制备降解阿魏酸乙酯的产品中的应用；
(e)在制备阿魏酸或含有阿魏酸的产品中的应用。
4.一种食品或保健品，其特征在于，所述食品或保健品中含有权利要求1所述的约氏乳杆菌46，或含有权利要求2或3所述的微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的食品或保健品，其特征在于，所述食品或保健品中，约氏乳杆菌46的含量至少为：5×109CFU/mL。
6.如权利要求4或5所述的食品或保健品，其特征在于，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有所述约氏乳杆菌46的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有所述约氏乳杆菌46的饮料或零食。
7.一种缓解溃疡性结肠炎症状的药品，其特征在于，所述药品中含有权利要求1所述的约氏乳杆菌46或含有权利要求2或3所述的微生物菌剂。
8.如权利要求7所述的药品，其特征在于，所述药品含有所述约氏乳杆菌46、药物载体和/或药用辅料。
9.一种水解阿魏酸乙酯制备阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的约氏乳杆菌46接种至含有阿魏酸乙酯的反应体系中，进行水解制备得到阿魏酸酯酶。
10.权利要求1所述的约氏乳杆菌46或权利要求2或3所述的微生物制剂在制备缓解溃疡性结肠炎症状的药品、饲料或饲料添加剂中的应用。
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