CN114854638A - 一株高效表达腺苷脱氨酶缓解结肠炎副干酪乳杆菌 - Google Patents

一株高效表达腺苷脱氨酶缓解结肠炎副干酪乳杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效表达腺苷脱氨酶缓解结肠炎副干酪乳杆菌，属于微生物技术领域。本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223，于2022年3月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62271。本发明提供的副干酪乳杆菌CCFM1223改善结肠炎小鼠粪便松软、便血和体重；抑制结肠组织中促炎因子水平的升高；增加结肠组织中抗氧化酶活性；抑制结肠组织中丙二醛的含量；抑制结肠组织中髓过氧化物酶活力；上调结肠组织中紧密连接蛋白基因的转录水平，可见，本发明的副干酪乳杆菌CCFM1223制备预防和/或治疗结肠炎的产品中具有巨大的应用前景。

Description

一株高效表达腺苷脱氨酶缓解结肠炎副干酪乳杆菌
技术领域
本发明涉及一株高效表达腺苷脱氨酶缓解结肠炎副干酪乳杆菌，属于微生物技术领域。
背景技术
炎症性肠病的特征是胃肠道的非感染性慢性炎症，主要包括克罗恩病(可影响胃肠道从口腔到肛门的任何部分)、溃疡性结肠炎(仅限于结肠粘膜)和不确定的结肠炎，其中溃烂性结肠炎较为普遍。20世纪50年代以来，溃烂性结肠炎的发病率不断升高且发病年龄不断降低严重影响着患者及家人的生活质量。调查发现，溃烂性结肠炎的最高发病率大约为万分之三，而患病率高达千分之五，给社会医疗成本造成极大的负担。近几年来，我国溃烂性结肠炎患者增长速率增加，呈现出男多女少的趋势。目前溃烂性结肠炎尚无完全治愈的治疗方案，因此需深入研究溃烂性结肠炎病理过程与发病机制有望为开发新的干预方法提供帮助。
目前的溃疡性结肠炎治疗主要通过抗炎和免疫调节剂，以使疾病进入缓解期。治疗溃疡性结肠炎常用的药物包括5-氨基水杨酸、美沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶、氢化可的松、氢化波尼松和硫唑嘌呤等。这些药物通过调节相关炎症通途和提高抗氧化酶的活力等方式有效的缓解溃烂性结肠炎。然而，长期服用会产生多种严重的副作用，如腹泻、头痛、发热和易疲劳等，更有甚者严重和潜在威胁生命的感染和肿瘤的风险。因此，有必要发展防治溃烂性结肠炎的新方法。近几年来，许多研究者发现一些特异的益生菌对溃疡性结肠炎具有缓解作用。相对药物来说，益生菌对溃疡性结肠炎的干预具有较小的副作用。因此，筛选出具有抑制促炎因子、修护肠道屏障和提高抗氧化酶活力的益生菌对溃疡性结肠炎进行辅助治疗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)
CCFM1223，于2022年3月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62271。
所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223来源于新生健康婴儿粪便，提取菌株的全基因组DNA用于16S rDNA的扩增，收集扩增后的DNA片段用和测序(由苏州安升达科技有限公司，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，经测序分析，结果显示，该菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223。
本发明的第二个目的是提供一种上述副干酪乳杆菌CCFM1223在制备含有腺苷脱氨酶的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述含有腺苷脱氨酶产品的制备方法为：
(1)将副干酪乳杆菌CCFM1223种子液接入MRS液体培养基中，置于37培养箱下培养18h，制备得到发酵液；
(2)将制备得到的发酵液在6000rpm，4℃条件下离心3min，获得副干酪乳杆菌CCFM1223菌体细胞，将制备得到的菌体细胞添加至含有10mg/mL腺苷的5mL PBS溶液中，在37℃条件下发酵12小时，获得含有腺苷脱氨酶的液体。
本发明的第三个目的是提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有副干酪乳杆菌CCFM1223活细胞，或含有副干酪乳杆菌CCFM1223发酵液，或含有副干酪乳杆菌CCFM1223冻干粉，或含有副干酪乳杆菌CCFM1223灭活的菌体细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌CCFM1223菌株浓度不低于1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为：副干酪乳杆菌CCFM1223接种到MRS培养基中，然后在37℃条件下培养18小时，制备得到培养液，将得到的培养液离心(6000～10000rpm/min，5～20min，0～8℃)，收集菌体，用生理盐水清洗菌体3～5次，添加冻干保护剂，将其重悬液进行真空冷冻干燥，获得菌粉浓度高于1×105CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包括100～130g/L脱脂乳粉、100～140g/L海藻糖、140～180g/L蔗糖。
本发明的第四个目的是提供了一种产品，所述产品中含有上述副干酪乳杆菌CCFM1223或其发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有所述副干酪乳杆菌CCFM1223的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有所述副干酪乳杆菌CCFM1223的饮料或零食。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。
本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将副干酪乳杆菌CCFM1223按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含130g/L的脱脂奶粉。
本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、占培养基总质量10％的脱脂乳、占培养基总质量0.5％的葡萄糖、占培养基总质量1.5％的胰蛋白胨以及占培养基总质量0.3％的酵母浸膏。
本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有所述副干酪乳杆菌CCFM1223、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的第五个目的是提供了所述副干酪乳杆菌CCFM1223或上述微生物菌剂在制备缓解或治疗结肠炎产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供了所述副干酪乳杆菌CCFM1223或上述微生物菌剂在制备具有以下(a)～(f)至少一种功能的食品、药品或保健品中的应用：
(a)改善结肠炎小鼠粪便松软、便血和体重；
(b)抑制结肠组织中促炎因子水平的升高；
(c)增加结肠组织中抗氧化酶活性；
(d)抑制结肠组织中丙二醛的含量；
(e)抑制结肠组织中髓过氧化物酶活力；
(f)上调结肠组织中紧密连接蛋白基因的转录水平。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠中促炎因子包括IL-1β,IL-6和TNF-α。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠组织中抗氧化酶包括T-AOC、SOD和GSH。
在本发明的一种实施方式中，所述结肠组织中紧密连接蛋白包括ZO-1,Claudin-1和Occludin。
有益效果
1、本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223，所述副干酪乳杆菌CCFM1223具有高表达腺苷脱氨酶能力。
2、本发明提供的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223具有以下效果：
(1)可缓解DSS处理后的体重下降程度；
(2)可显著降低DSS处理后结肠组织中MPO的活力；
(4)可显著降低DSS处理后结肠组织中IL-1β水平、IL-6水平、TNF-α水平。
(5)可显著升高DSS处理后结肠组织中T-AOC活力、超氧化物歧化酶活力、GSH活力。
(6)可显著性增加DSS处理后结肠组织中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平。
可见，副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223在制备预防和/或治疗结肠炎的产品中具有巨大的应用前景。
3、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的有效成分为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223的产品在治疗过程中不会导致患者产生不良反应。
生物材料保藏
一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223，分类学命名为Lacticaseibacillus paracasei，已于2022年3月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62271，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
附图说明
图1：副干酪乳杆菌CCFM1223的菌落形态图。
图2：副干酪乳杆菌CCFM1223的腺苷脱氨酶mRNA表达量图。
图3：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠体重的影响图。
图4：副干酪乳杆菌CCFM1223对小鼠疾病活动指数DAI指数的影响图。
图5：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠髓过氧化物酶的影响图。
图6：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中IL-1β水平的影响图。
图7：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中IL-6水平的影响图。
图8：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中TNF-α水平的影响图。
图9：副干酪乳杆菌CCFM1223对炎症小鼠肝组织中T-AOC活力的影响图。
图10：副干酪乳杆菌CCFM1223对炎症小鼠肝组织中SOD活力的影响图。
图11：副干酪乳杆菌CCFM1223对炎症小鼠肝组织中GSH活力的影响图。
图12：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中紧密连接蛋白转录水平的影响图。
具体实施方式
下述实施例中涉及SPF级7周龄雄性C57BL/J小鼠采购于维通利华实验动物有限公司；下述实施例中涉及的ELISA试剂盒采购于南京森贝伽生物科技有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖、多聚甲醛均采购于国药集团化学试剂有限公司。下述实施例中所涉及的副干酪乳杆菌CCFM8631记载于公开号为CN110613738A的中国发明专利申请文本中。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基(g/L)：10g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、10g/L牛肉膏、2g/L C2H3O2Na、酵母粉5g/L、2g/L C6H14N2O7、2.6g/L K2HPO4·3H2O、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.05g/L MnSO4·H2O、吐温80 1mL/L，pH 6.8。
MRS固体培养基(g/L)：在1L的MRS液体培养基添加20g琼脂。
下述实施例中涉及的副干酪乳杆菌悬液的制备方法如下：
将副干酪乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液。将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液。菌液经过离心(6000rpm，4℃，3min)除去培养液，采用生理盐水清洗3～5次，重悬于12.5g/L的脱脂乳溶液中，最终菌浓度为5×109CFU/mL，保存于零下80℃冰箱。
下述实施例疾病活动指数(Disease activity index，DAI)的检测方法：
DAI评分主要参照Murthy的评分系统，主要包括体重变化率、粪便性状和便血情况，DAI评分＝体重变化分值+粪便性状分值+便血分值。每项的评分标准如下表1。
表1疾病活动指数评分标准
Figure BDA0003659636270000051
下述实施例中所涉及的MPO的活力、T-AOC活力、超氧化物歧化酶活力和GSH活力的检测方法如下：
称取一定量结肠组织按照1:9添加无菌生理盐水进行匀浆，离心(12000rpm，4℃，10min)获得上清液，测定其蛋白浓度。根据试剂盒说明书分别测定结肠组织中MPO的活力、T-AOC活力、超氧化物歧化酶活力和GSH活力(南京森贝伽，中国)。
下述实施例中所涉及的IL-1β水平、IL-6水平和TNF-α水平的检测方法如下：
称取一定量结肠组织按照1:9添加蛋白裂解液进行匀浆，离心(12000rpm，4℃，10min)获得上清液，测定其蛋白浓度。根据试剂盒说明书分别测定结肠组织中IL-1β水平、IL-6水平、TNF-α水平(南京森贝伽，中国)。
下述实施例中所涉及的ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平的检测方法如下：
采用Trizol法提取结肠组织中总RNA，并用Nanodrop型核酸定量仪测定其浓度和纯度。采用Takala试剂盒将RNA反转为cDNA，CFX96TM实时系统进行实时定量PCR，检测紧密连接蛋白相关基因表达量，以GAPDH为内参，2-△△Ct计算基因相对表达。
实施例1：副干酪乳杆菌CCFM1223的筛选及鉴定
(1)菌株筛选
以来源于新生健康婴儿粪便为样本，将样本经预处理后，在30％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，称取0.5g样本加到4.5mL 0.85％无菌生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体MRS液体培养基于37℃培养18h，30％甘油保藏，得到菌株。
(2)菌株的鉴定
提取菌株的全基因组DNA用于16S rDNA的扩增，收集扩增后的DNA片段用和测序(由苏州安升达科技有限公司，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，经测序分析，结果显示，该菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223。
(3)所述副干酪乳杆菌CCFM1223具有下述生物学特性
1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，通常呈棒状，不产孢子，不运动的细菌。
2)菌落特征：在MRS固体培养基培养48小时形成肉眼可见的菌落，直接1～5mm的菌落，形态呈现略微凸起，边缘整齐，不透明，乳白色，不产色素(图1)。
实施例2：副干酪乳杆菌CCFM1223腺苷脱氨酶的mRNA表达量
(1)菌株的活化：
分别从甘油管中蘸取副干酪乳杆菌CCFM1223和副干酪乳杆菌CCFM8631的菌液在MRS固体培养基上划线，在37℃恒温培养箱培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱培养24h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。
(2)将步骤(1)得到的菌液按2％(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱培养24h得到发酵液，将得到的发酵液在12000rpm下离心10min后收集菌泥，将菌泥用生理盐水清洗3次后备用，并调整活菌数1×1011CFU/mL。
(3)腺苷脱氨酶的mRNA表达量(图2)的检测
采用Trizol法分别提取步骤(2)得到的副干酪乳杆菌CCFM1223菌体和副干酪乳杆菌CCFM8631菌体中总RNA，并用Nanodrop型核酸定量仪测定其浓度和纯度。采用Takala试剂盒将RNA反转为cDNA，CFX96TM实时系统进行实时定量PCR，检测紧密连接蛋白相关基因表达量，以16S为内参，2-△△Ct计算基因相对表达(引物如表2所示)。
表2：引物
Figure BDA0003659636270000071
结果显示，副干酪乳杆菌CCFM1223的腺苷脱氨酶mRNA表达量是副干酪乳杆菌CCFM8631的腺苷脱氨酶mRNA表达量的3.2倍。
实施例3：副干酪乳杆菌CCFM1223对小鼠体重的影响
取SPF级7周龄雄性C57BL/6J小鼠32只饲养于标准温度和湿度的动物房，严格控制动物房的昼夜的循环标准，给予充足的标准鼠饲料和饮用水。
适应性喂养7天后，随机分为4组，每组8只，4组分别为：空白组、模型组、阳性对照组、CCFM1223组。
在14天的干预实验过程如下：
空白组的小鼠灌胃0.2mL脱脂乳(浓度为12.5g/mL)；在整个实验过程中，均饮用标准饮用水；
模型组的小鼠灌胃0.2mL脱脂乳(浓度为12.5g/mL)；在实验前7天饮用标准饮用水，在第8天在饮用水中添加葡聚糖硫酸钠(DSS)，最终浓度为30g/L；
阳性对照组的小鼠灌胃含有2mg美沙拉秦的0.2mL脱脂乳(浓度为10g/mL)；在实验前7天饮用标准饮用水，在第8天在饮用水中添加葡聚糖硫酸钠(DSS)，最终浓度为30g/LCCFM1223组的小鼠灌胃含有1×109CFU副干酪乳杆菌CCFM1223菌悬液的0.2mL脱脂乳(浓度为12.5g/mL)；在实验前7天饮用标准饮用水，在第8天在饮用水中添加葡聚糖硫酸钠(DSS)，最终浓度为30g/L。
在实验第8天开始，每天早上八点测定小鼠的体重(图3)。
结果表明：饮用含有3％DSS水，模型组的小鼠体重在第五天后明显下降，到达第7天时，小鼠体重下降了16％左右。副干酪乳杆菌CCFM1223干预后，在第5天后也略有下降，但体重下降率明显低于模型组。
实施例4：副干酪乳杆菌CCFM1223对小鼠疾病活动指数DAI指数的影响
动物模型的建立方法同实施例3，实验进行到第8天，每天测量小鼠的体重、观察其粪便的松散程度和采用便隐血(OB)试剂-试纸法测定小鼠粪便，算出实验结束后小鼠疾病活动指数DAI(图4)。
结果表明，空白组小鼠的DAI值始终处于接近0，模型组小鼠的DAI值处于逐渐上升，最终达到10左右。然而，副干酪乳杆菌CCFM1223干预后，小鼠的DAI值虽然也呈上升趋势，但始终低于模型组，接近阳性对照组。说明副干酪乳杆菌CCFM1223在一定程度上具有缓解小鼠体重下降和降低小鼠便血含量。
实施例5：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠髓过氧化物酶的影响
动物模型的建立方法同实施例3，实验结束后，处死小鼠，解剖获得结肠组织，并立即采用液氮冻结。称取一定量结肠组织按照1：9添加无菌生理盐水进行匀浆，离心(12000rpm，4℃，10min)获得上清液，测定其蛋白浓度和MPO活力(图5)。
结果表明：模型组小鼠的结肠组织中髓过氧化物酶显著性增加(MPO活力为：2.1±0.3U/g组织)，然而通过副干酪乳杆菌CCFM1223干预后，小鼠结肠组织中髓过氧化物酶显著性降低(MPO活力为：1.3±0.3U/g组织)，接近空白组小鼠结肠组织中髓过氧化物酶的活力(MPO活力为：0.8±0.2U/g组织)，低于阳性对照组小鼠结肠组织中髓过氧化物酶的活力(MPO活力为：1.5±0.2U/g组织)。
实施例6：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中IL-1β水平的影响
动物模型的建立方法同实施例3，解剖获得结肠组织，并立即采用液氮冻结。称取一定量结肠组织按照1:9添加蛋白裂解液进行匀浆，离心(12000rpm，4℃，10min)获得上清液，测定其蛋白浓度和IL-1β水平(图6)。
结果表明，空白组小鼠结肠组织中IL-1β水平为：4.0±0.2pg/mg蛋白，模型组小鼠结肠组织中IL-1β水平显著性升高(IL-1β水平为：6.3±0.4pg/mg蛋白)，而副干酪乳杆菌CCFM1223干预后小鼠的结肠组织中IL-1β水平显著性下降(IL-1β水平为：5.1±0.5pg/mg蛋白)，且其效果优于阳性对照组干预后小鼠的结肠组织中IL-1β水平(为5.5±0.3pg/mg蛋白)下降程度。说明副干酪乳杆菌CCFM1223能有效抑制DSS诱导IL-1β水平的升高。
实施例7：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中IL-6水平的影响
动物模型的建立方法同实施例3，结肠组织的采样及前处理同实施例6，测定组织匀浆液离心后的上清液中蛋白浓度和IL-6水平(图7)。
结果表明，空白组小鼠结肠组织中IL-6水平为：5.1±0.4pg/mg蛋白，模型组小鼠结肠组织中IL-6水平显著性升高(IL-6水平为：13.2±1.2pg/mg蛋白)，而副干酪乳杆菌CCFM1223干预后小鼠的结肠组织中IL-6水平显著性下降(IL-6水平为：8.3±1.2pg/mg蛋白)，接近于阳性对照组干预后小鼠的结肠组织中IL-6水平(IL-6水平为：7.1±1.9蛋白)。说明副干酪乳杆菌CCFM1223能有效抑制DSS诱导IL-6水平的升高。
实施例8：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中TNF-α水平的影响
动物模型的建立方法同实施例3，结肠组织的采样及前处理同实施例6，测定组织匀浆液离心后的上清液中蛋白浓度和TNF-α水平(图8)。
结果表明，空白组小鼠结肠组织中TNF-α水平为：41.1±2.4pg/mg蛋白，模型组小鼠结肠组织中TNF-α水平显著性升高(TNF-α水平为：84.2±5.4pg/mg蛋白)。
而副干酪乳杆菌CCFM1223干预后小鼠的结肠组织中TNF-α水平显著性下降(TNF-α水平为：46.9±7.3pg/mg蛋白)，接近于阳性对照组干预后小鼠的结肠组织中TNF-α水平(TNF-α水平为：44.2±6.2pg/mg蛋白)。
说明副干酪乳杆菌CCFM1223能有效抑制DSS诱导TNF-α水平的升高。
实施例9：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中T-AOC活力的影响
动物模型的建立方法同实施例3，结肠组织的采样及前处理同实施例5，测定组织匀浆液离心后的上清液中蛋白浓度和总抗氧化能力(T-AOC活力)(图9)。
结果表明：空白组小鼠结肠组织中总抗氧化能力(T-AOC活力)为：2.1±0.4U/mg蛋白，DSS能诱导结肠组织中总抗氧化能力(T-AOC活力)的下降(T-AOC活力为：0.9±0.3U/mg蛋白)，说明DSS处理不仅会导致炎症，同时能有效抑制T-AOC活力。
然而，副干酪乳杆菌CCFM1223干预后小鼠的结肠组织中T-AOC活力显著性的增加(T-AOC活力为：1.6±0.3U/mg蛋白)，接近于阳性对照组干预后小鼠的结肠组织中T-AOC活力(为：1.7±0.6U/mg蛋白)。
说明副干酪乳杆菌CCFM1223有效避免DSS破坏T-AOC活力。
实施例10：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中SOD活力的影响
动物模型的建立方法同实施例3，结肠组织的采样及前处理同实施例5，测定组织匀浆液离心后的上清液中蛋白浓度和超氧化物歧化酶SOD活力(图10)。
结果表明：空白组小鼠结肠组织中SOD活力为：0.33±0.02U/mg蛋白，DSS处理后小鼠结肠组织中SOD活力显著性(SOD活力为：0.15±0.03U/mg蛋白)，低于未经过DSS处理小鼠结肠组织中SOD活力。
然而副干酪乳杆菌CCFM1223干预后结肠组织中SOD活力(SOD活力为：0.25±0.04U/mg蛋白)明显高于模型组小鼠，接近空白组小鼠结肠组织中SOD活力，同时接近于阳性对照组干预后小鼠结肠组织中SOD活力(SOD活力为0.26±0.05U/mg蛋白)。
说明副干酪乳杆菌CCFM1223有效保持小鼠结肠组织中SOD活力。
实施例11：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中GSH活力的影响
动物模型的建立方法同实施例3，结肠组织的采样及前处理同实施例5，测定组织匀浆液离心后的上清液中蛋白浓度和还原型谷胱甘肽GSH活力(图11)。
结果表明：空白组小鼠结肠组织中GSH活力为：0.35±0.02U/mg蛋白，DSS处理后小鼠结肠组织中GSH活力(GSH活力为：0.20±0.09U/mg蛋白)显著性低于未经过DSS处理小鼠结肠组织中GSH活力。
然而副干酪乳杆菌CCFM1223干预后结肠组织中GSH活力(GSH活力为：0.29±0.10U/mg蛋白)明显高于模型组小鼠，接近空白组小鼠结肠组织中GSH活力，同时接近于阳性对照组干预后小鼠结肠组织中GSH活力(GSH活力为0.33±0.04U/mg蛋白)。
说明副干酪乳杆菌CCFM1223有效保持小鼠结肠组织中GSH活力。
实施例12：副干酪乳杆菌CCFM1223对结肠炎小鼠结肠中紧密连接蛋白转录水平的影响
动物模型的建立方法同实施例3，实验接触后，处死小鼠，解剖获得结肠组织，并立即采用液氮冻结。采用Trizol法提取结肠组织中总RNA，并用Nanodrop型核酸定量仪测定其浓度和纯度。采用Takala试剂盒将RNA反转为cDNA，CFX96TM实时系统进行实时定量PCR，检测紧密连接蛋白相关基因表达量，以GAPDH为内参，2-△△Ct计算基因相对表达(引物如表3所示)。
表3RT-qPCR引物序列
Figure BDA0003659636270000101
Figure BDA0003659636270000111
紧密连接蛋白是结肠的重要组成成分，结肠的病变及发展与结肠组织中紧密连接蛋白的含量呈现正相关。
如图12所示，与空白组(ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平分别为：1.7±0.2、2.8±0.5、1.9±0.4)相比，模型组小鼠结肠组织中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平显著下降(ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平分别为：1.1±0.2、0.9±0.3、1.0±0.2)，表明DSS处理后会引起ZO-1、Claudin-1和Occludin含量减少。
然而，灌胃副干酪乳杆菌CCFM1223组的小鼠结肠组织中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平显著性增加(ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平分别为：1.5±0.1、2.4±0.4、1.5±0.4)，接近于阳性对照组干预后小鼠结肠组织中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平(ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相对转录水平分别为：1.5±0.2、2.3±0.3、1.5±0.3)。
表明灌胃副干酪乳杆菌CCFM1223能够缓解DSS诱导结肠炎小鼠的结肠组织中紧密连接蛋白表达减少。
实施例13：副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223的应用
(1)菌株的活化：从甘油管中蘸取副干酪乳杆菌CCFM1223的菌液在MRS固体培养基上划线，在37℃恒温培养箱培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱培养24h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。
(2)将步骤(1)得到的菌液按2％的接种量接种到MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱培养24h得到发酵液，将得到的发酵液在12000rpm下离心10min后收集菌泥，将菌泥用生理盐水清洗3次后备用，并调整活菌数1×1011CFU/mL。
(3)冻干保护剂的主要包含：11％谷氨酸钠、14％脱脂乳和9.0％海藻糖和余量的水混合后得到冻干保护剂。
(4)向步骤(2)中得到的菌泥中添加上述配置好的冻干保护剂，其中冻干保护剂的重量为菌泥重量的3倍，混合均匀后进行真空冷冻干燥，获得副干酪乳杆菌CCFM1223菌粉。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株高效表达腺苷脱氨酶缓解结肠炎副干酪乳杆菌
<130> BAA220616A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttagacggc tcgctcccta aaagggttac gccaccggct tcgggtgtta caaactctca 60
tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggcg tgctgatccg 120
cgattactag cgattccgac ttcgtgtagg cgagttgcag cctacagtcc gaactgagaa 180
tggctttaag agattagctt gacctcgcgg tctcgcaact cgttgtacca tccattgtag 240
cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc 300
ggtttgtcac cggcagtctt actagagtgc ccaactaaat gctggcaact agtcataagg 360
gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc 420
accacctgtc attttgcccc cgaaggggaa acctgatctc tcaggtgatc aaaagatgtc 480
aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc 540
gggcccccgt caattccttt gagtttcaac cttgcggtcg tactccccag gcggaatgct 600
taatgcgtta gctgcggcac tgaagggcgg aaaccctcca acacctagca ttcatcgttt 660
acggcatgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctacc catgctttcg agcctcagcg 720
tcagttacag accagacagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattt 780
caccgctaca catggagttc cactgtcctc ttctgcactc aagtttccca gtttccgatg 840
cgcttcctcg gttaagccga gggctttcac atcagactta aaaaaccgcc tgcgctcgct 900
ttacgcccaa taaatccgga taacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg 960
tagttagccg tggctttctg gttggatacc gtcacgccga caacagttac tctgccgacc 1020
attcttctcc aacaacagag ttttacgacc cgaaagcctt cttcactcac gcggcgttgc 1080
tccatcagac ttgcgtccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtttgg 1140
gccgtgtctc agtcccaatg tggccgatca acctctcagt tcggctacgt atcatcgcct 1200
tggtgagcca ttacctcacc aactagctaa tacgccgcgg gtccatccaa aagcgatagc 1260
ttacgccatc tttcagccaa gaaccatgcg gttcttggat ctatgcggta ttagcatctg 1320
tttccaaatg ttatccccca cttaagggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc 1380
actcgttcca tgttgaatct cggtgcaagc accgatcatc aacgagaact cgttcgactt 1440
gcatgtatag 1450

Claims (10)

1.一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1223，于2022年3月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62271。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1223在制备含有腺苷脱氨酶的产品中的应用。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有副干酪乳杆菌CCFM1223活细胞，或含有副干酪乳杆菌CCFM1223发酵液，或含有副干酪乳杆菌CCFM1223冻干粉，或含有副干酪乳杆菌CCFM1223灭活的菌体细胞。
4.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，副干酪乳杆菌CCFM1223菌株浓度不低于1×106CFU/mL。
5.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1223或其发酵液。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或保健品。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有所述副干酪乳杆菌CCFM1223的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有所述副干酪乳杆菌CCFM1223的饮料或零食。
8.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述药品含有所述副干酪乳杆菌CCFM1223、药物载体和/或药用辅料。
9.权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1223或权利要求3或4所述的微生物菌剂在制备缓解和/或治疗结肠炎产品中的应用。
10.权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1223或权利要求3或4所述的微生物菌剂在制备具有以下(a)～(f)至少一种功能的食品、药品或保健品中的应用：
(a)改善结肠炎小鼠粪便松软、便血和体重；
(b)抑制结肠组织中促炎因子水平的升高；
(c)增加结肠组织中抗氧化酶活性；
(d)抑制结肠组织中丙二醛的含量；
(e)抑制结肠组织中髓过氧化物酶活力；
(f)上调结肠组织中紧密连接蛋白基因的转录水平。
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