CN117625478A - 一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的戊糖片球菌菌株a21243及其应用 - Google Patents

一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的戊糖片球菌菌株a21243及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的戊糖片球菌菌株A21243及其应用，属于功能微生物技术领域。一种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)菌株A21243，保藏编号为GDMCCNo:63749，能很好适应肠胃环境，能较好的在肠道定植，能抑制线虫脂肪积累，同时以非酒精性脂肪肝模型小鼠为对象进行研究所述菌株A21243可有效减少脂肪堆积，胆汁淤积和改善非酒精性脂肪肝，具有增强葡萄糖耐受和改善胰岛素抵抗能力，可广泛应用开发与代谢相关益生功能产品。本发明提供的菌株A21243为预防和/或治疗非酒精性脂肪肝提供一种天然的、安全的益生菌产品。

Description

一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的戊糖片球菌 菌株A21243及其应用
技术领域
本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的戊糖片球菌菌株A21243及其应用。
背景技术
脂肪积累是指体内脂肪含量过高，导致脂肪细胞内脂肪滴增大和数量增多的现象。脂肪积累通常与肥胖症相关，但也可能与其他疾病有关，如II型糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、肝脏疾病等。线虫的脂肪组织位于其体腔内，被称为“肠脂肪”或“肠脂肪滴”。这些脂肪滴可以通过荧光染料或电子显微镜观察到，并且可以在线虫发育和代谢过程中发生改变。因此线虫脂肪模型可以用于研究脂肪代谢、脂肪储存和脂肪分解等过程。目前研究报道，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)可以通过调节线虫的能量代谢途径，抑制线虫的脂肪积累。例如公开号CN107511230A提供了一种用于抑制线虫脂肪积累的菌株组合及其应用，但是抑制效果不够显著。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。随着肥胖、高脂血症、II型糖尿病和代谢综合征的发病率增加，NAFLD的发病率在世界范围内不断上升，NAFLD现已成为我国常见的慢性肝病之一，严重危害人民健康。
目前NAFLD治疗的研究方向主要有限制能量摄入、增加运动以及药物等方法治疗，但效果均不理想。关于治疗非酒精性脂肪肝的药物多为他汀类药物，具有一定的副作用。一项临床研究表明，口服高效多菌株益生菌治疗的NAFLD患者在肝脏组织学、谷丙转氨酶(ALT)和细胞因子方面有显著改善。乳酸杆菌和双歧杆菌的益生菌组合通过Gpr109a和共生代谢物丁酸盐减轻非酒精性脂肪肝大鼠的全身性肥胖和炎症。另外，Craven等研究发现，对NAFLD患者进行同种异体或自体粪菌移植(fecal microbiotatransplantation，FMT)没有改善其通过HOMA-IR测定的IR或肝脏质子密度脂肪分数(proton density fat fraction，PDFF)测量的IR，但确实有可能降低NAFLD患者的小肠通透性。因此，多项研究表明，通过使用益生菌或通过FMT实现对肠道微生物群的控制可能是预防和治疗NAFLD的有效策略。目前CN108641988A、CN113786419A、CN114164142A、CN115089619A、CN116509906A和CN102889859A等专利报道了不同的乳杆菌菌株具有缓解非酒精性脂肪肝的作用，但上述菌株降血脂效果不够理想，作用机制也不清楚。目前，乳杆菌菌株筛选指标、调节血脂的体内效果和机理尚不明确，而且关于戊糖片球菌改善非酒精性脂肪肝的报道比较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的戊糖片球菌菌株，可有效减少脂肪堆积，且适应肠胃环境，能较好的在肠道定植。
本发明提供了一种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)菌株A21243，保藏编号为GDMCC No:63749。
本发明提供了一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的益生菌制剂，包括所述戊糖片球菌菌株A21243和辅料。
优选的，所述益生菌制剂包括冻干菌粉或菌液。
本发明提供了一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的药物，包括所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂和药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物的剂型为口服剂或注射剂。
本发明提供了所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝或减脂的药物中的应用。
优选的，所述减脂包括降低以下至少一种指标的含量：胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和减少体内脂肪堆积。
优选的，所述药物具有以下至少一项药效：
逆转非酒精性脂肪肝肝组织的损伤；
抑制肝组织的炎症；
抑制非酒精性脂肪肝中胆固醇的堆积和促进胆汁酸合成。
本发明提供了所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝引起的代谢功能障碍的药物中的应用；
优选的，所述非酒精性脂肪肝引起的代谢功能障碍包括非酒精性脂肪肝引起的葡萄糖量降低、胰岛素抵抗、脂肪酸合成紊乱和胆固醇代谢紊乱。
本发明提供了所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂在制备调整非酒精性脂肪肝中肠道菌群结构的药物中的应用。
本发明提供了一株戊糖片球菌菌株A21243，适应肠胃环境，能较好的在肠道定植，能抑制线虫体内脂肪积累，同时非酒精性脂肪肝模型小鼠实验表明，所述菌株A21243可有效减少脂肪堆积，胆汁淤积和改善非酒精性脂肪肝，具有增强葡萄糖耐受和改善胰岛素抵抗能力，可广泛应用开发与代谢相关益生功能产品。本发明为降脂和治疗非酒精性脂肪肝提供一种天然的、安全的有效菌株。
附图说明
图1为A21243菌株菌落及革兰氏染色；
图2为戊糖片球菌A21243进化树分析结果；
图3为A21243模拟人工胃肠液生长情况结果；
图4为线虫脂肪粒油红O染色结果
图5为小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C测定结果；
图6为小鼠肝脏组织H&E染色分析结果；
图7为小鼠肝脏组织H&E染色NAS评分分析结果；
图8为小鼠血清AST、ALT检测及总胆汁酸检测结果；
图9为小鼠血清、肝脏组织炎症因子检测结果；
图10为小鼠OGTT检测和ITT检测结果；
图11为肝脏胆固醇、胆汁酸及脂肪酸合成相关基因mRNA表达结果；
图12为A21243菌株干预NAFLD后结肠菌群Alpha多样性、Beta多样性分析结果；
图13为A21243菌株干预NAFLD后结肠菌群结肠菌群Phylum丰度分析结果；
图14为A21243菌株干预NAFLD后结肠菌群Genus丰度分析结果；
图15为A21243菌株干预NAFLD后结肠菌群LEfSe分析结果。
生物材料保藏信息
戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)菌株A21243，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，单位简称GDMCC，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间2023年8月24日，保藏编号为GDMCC No:63749。
具体实施方式
本发明提供了一种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)菌株A21243，保藏编号为GDMCC No:63749。
在本发明中，所述菌株A21243分离自广西浦北县百岁长寿老人的粪便。经形态学鉴定，所述菌株A21243的形态生理生化特征如下：革兰氏阳性，兼性厌氧，圆形或椭圆形，直径约为0.5-1μm，菌落呈乳白色，菌落质地较硬，表面平坦或微凹凸，表面光滑，没有毛刺或突起，菌落边缘整齐，没有分叉或毛糙，细胞呈链球菌状，以链状形式排列排列。经16S rRNA鉴定，与戊糖片球菌(P.pentosaceus)的同源性为99.35％。同时经过构建进化树，结果表明戊糖片球菌A21243在进化树上是独立的分支，可能A21243是一种新的戊糖片球菌亚种。
本发明提供了一种具有治疗非酒精性脂肪肝功能和/或减脂的益生菌制剂，包括所述戊糖片球菌菌株A21243和辅料。
在本发明中，所述益生菌制剂优选包括冻干菌粉。所述冻干菌粉的制备方法，优选包括以下步骤：
将所述戊糖片球菌菌株A21243活化后接种至MRS液体培养基中厌氧条件下培养，将得到的种子液进行放大培养后收集菌体，所述菌体和冻干保护剂混合后进行冻干处理，得到冻干菌粉。所述厌氧条件下培养优选包括静置培养，所述培养的时间为12h。所述厌氧条件下培养的次数优选包括2次。所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述扩大培养的条件优选为37℃厌氧条件下静置培养20～24h。所述收集菌体的方法优选为离心。所述离心的转速优选为5000rpm；所述离心的时间为5min。所述菌体优选采用生理盐水洗涤后再与冻干保护剂混合。所述冻干保护剂优选为质量浓度12％脱脂奶粉溶液。所述菌体和冻干保护剂的体积比优选为1:1。所述质量浓度12％的脱脂奶粉溶液的配制方法优选为称量12g脱脂奶粉，定容100ml去离子水，115℃高压蒸汽灭菌15min。
在本发明实施例中，线虫实验表明，戊糖片球菌A21243能够显著抑制线虫的脂肪积累，抑制率高达55.53％，是潜在的减脂功能益生菌。
本发明提供了一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的药物，包括所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂和药学上可接受的辅料。
在本发明中，所述药物的剂型优选为口服剂。所述口服剂优选包括粉剂、颗粒剂、片剂、口服液或冲剂。
在本发明中，人工模拟肠液实验和人工模拟胃液实验表明，所述菌株A21243具有良好的强酸强碱耐受性，说明该菌株能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性，适应肠胃环境，能较好的在肠道定植。
本发明提供了所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂在制备减脂或预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
在本发明中，线虫脂肪粒实验表明，喂养A21243的线虫脂肪粒明显减少，抑制率为55.39％。说明菌株A21243能有效降低线虫脂肪积累。
在本发明中，所述减脂优选包括减少体内脂肪堆积和降低以下至少一种指标的含量：胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白。在本发明实施例中，以非酒精性脂肪肝小鼠模型为对象，检测戊糖片球菌菌株A21243给药对血脂的影响，结果表明，所述菌株A21243能够显著降低血脂水平，体内TC降解率达到89％，TG降解率达到60％，HDL-C含量升高了10.29％，LDL-C含量下降了24.79％，且具有显著差异，说明A21243降血脂水平的综合效果较好。
在本发明中，所述药物优选具有以下至少一项药效：逆转非酒精性脂肪肝肝组织的损伤、抑制肝组织的炎症和抑制非酒精性脂肪肝中胆固醇的堆积和促进胆汁酸合成。
在本发明中，与对照组相比，模型组肝窦狭窄，细胞核居边，细胞肿胀，呈气球样变，胞内可见大小不等的脂滴，大量中性粒炎症细胞浸润；与模型组相比，商业菌株干酪乳杆菌Zhang组空泡变小，脂肪变性变少，而戊糖片球菌A21243组肝小叶轮廓略显清晰，细胞核形态基本规则，细胞数目增多，有轻微的细胞核居边，说明A21243能明显改善非酒精性肝病。
在本发明中，所述非酒精性脂肪肝肝组织的损伤以血清ALT、AST和总胆汁酸水平为评价指标，与正常组相比，模型组的AST、ALT和总胆汁酸水平显著升高，分别升高了60.7％，86.2％，与模型组相比，菌株A21243组的AST降低49.6％、ALT降低了46.9％和总胆汁酸水平降低了75.7％，且具有显著差异，同时与商业菌株干酪乳杆菌Zhang组相比，戊糖片球菌A21243能显著降低血清中总胆汁酸水平，且具有显著差异，说明戊糖片球菌A21243能够减少胆汁淤积和肝损伤。
在本发明中，所述非酒精性脂肪肝的炎症以LPS和IL-1β炎症因子的水平为指标，结果表明，菌株A21243能显著降低LPS和IL-1β炎症因子的水平，分别降低了81.3％和76.6％，且具有显著差异。说明戊糖片球菌A21243通过IL-1β等炎症因子信号通路调控非酒精性脂肪肝的炎症。
在本发明中，以胆固醇7a-羟化酶(CYP7A1)和CYP8B1作为胆汁酸合成的评价标准，结果表明与正常组相比，NAFLD组小鼠肝组织CYP7A1和CYP8B1的mRNA表达明显降低；与NAFLD组相比，A21243组CYP7A1和CYP8B1表达明显升高，且具有显著差异；因此A21243具有促进胆汁酸合成和防止肝脏胆固醇堆积的功能。同时HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)为胆固醇合成的限速酶，SCD1(单不饱和脂肪酸合酶1)为脂肪酸代谢和合成途径的限速酶，DGAT2(甘油酰转移酶2)作为甘油三酯代谢途径的限速酶，结果表明与NAFLD组相比，A21243能显著降低HMGR、SCD1和DGAT2 mRNA的表达水平，说明戊糖片球菌A21243具有调节脂肪酸合成和胆固醇代谢紊乱功能。
在本发明中，所述戊糖片球菌A21243还能调节非酒精性脂肪肝肠道菌群结构。与模型组相比，A21243组的Akkermansia、Staphylococcus和Lactobacillus_murinus丰度增加，Turicibacter、Anaerotruncus、Dubosiella和Faecalibaculum丰度减少。说明戊糖片球菌菌株A21243能够调节NAFLD小鼠的肠道微生物菌群的比例和分布。
在本发明实施例中，所述戊糖片球菌A21243通过抑制胆固醇合成、促进胆汁酸途径、调节脂肪酸合成途径以及调节肠道菌群结构显著治疗非酒精性脂肪肝。
本发明提供了所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝引起的代谢功能障碍的药物中的应用；
在本发明中，所述非酒精性脂肪肝引起的代谢功能障碍优选包括非酒精性脂肪肝引起的葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗、脂肪酸合成紊乱和胆固醇代谢紊乱。在本发明实施例中，与正常组相比，NAFLD组血糖迅速上升且幅度较大，在120min内血糖下降相对缓慢，而且无法恢复正常的血糖水平，说明出现了葡萄糖耐量减退。在注射胰岛素后，NAFLD组血糖下降缓十分缓慢而且无法恢复正常的血糖水平，说明出现胰岛素抵抗，但是相比NAFLD组和商业组，戊糖片球菌A21243能显著增强小鼠的葡萄糖耐受性和降低胰岛素抵抗，改善非酒精性脂肪肝疾病引起的代谢功能障碍。
本发明提供了所述戊糖片球菌菌株A21243或所述益生菌制剂在制备调整非酒精性脂肪肝中肠道菌群结构的药物中的应用。
在本发明中，鉴于所述菌株A21243具有良好的耐酸耐碱特性，且对肠道具有良好的定植力，因此所述药物优选为口服剂。所述药物中，所述菌株A21243的活菌数为(1～100)×109CFU/ml，更优选为1×109CFU/ml。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的戊糖片球菌菌株A21243及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一株戊糖片球菌菌株A21243的分离和鉴定
1.菌株分离和纯化
取来自百岁老人的新鲜粪便样品按照10倍梯度稀释至10-5，分别取10-3、10-4、10-5三管稀释液各0.1ml，采用平板涂布法，将样品稀释液涂布于MRS固体培养基上进行分离。平板于37℃培养48h后，挑取疑似目标菌株的单菌落，划线转移到新的MRS固体平板上，划线纯化2代后，经镜检确认为纯种后，接种到斜面培养基培养24h后，置4℃冰箱保存备用。
MRS固体培养基配制及灭菌方法为：称取蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，牛肉浸粉5.0g，Tween-801.0mL，葡萄糖20.0g，K2HPO42.0 g，酵母浸粉4.0g，MnSO4·4H2O 0.05g，柠檬酸三铵2.0g，MgSO40.2 g，琼脂12.0g，加入800mL的蒸馏水，混匀至溶质完全溶解后调pH值至6.2±0.2，定容至1L，121℃高压灭菌20min后，趁热倒平板，冷却凝固后置于4℃保存备用。
2.菌株鉴定
对分离纯化后得到的乳杆菌进行细菌形态观察和革兰氏染色后细胞形态观察，通过参照《伯杰士细菌学手册》及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》对乳杆菌进行鉴定。
如图1所示，戊糖片球菌A21243菌落呈圆形或椭圆形，直径约为0.5～1μm，菌落呈乳白色，菌落质地较硬，表面平坦或微凹凸，表面光滑，没有毛刺或突起，菌落边缘整齐，没有分叉或毛糙，细胞呈链球菌状，以链状形式排列排列。
3.菌株16S rRNA的测定
采用16S rRNA扩增法对所分纯的菌株进行分子鉴定。其16S rRNA序列(TGGTCACCTTAGACGGCTAGCTCCTAAAAGGTTACCCCACCGGA CTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTTAACCTCGCGGTCTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACCTCTAATCTCTTAGACTGTCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCTTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGATTACTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGTAATCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAAGCTTTCACATTAGACTTAAAAGACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTTACCCATCGTTCTTCTTTACACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCG，SEQ ID NO:17)在NCBI(National Centerfor Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)数据库中进行比对，结果发现该菌株的基因序列，在所有相似的序列中，与戊糖片球菌(P.pentosaceus)的同源性为99.35％，因此结合生理生化特征，鉴定菌株是戊糖片球菌，将其命名为A21243。同时对该菌株与目前部分戊糖片球菌进行进化树分析，发现戊糖片球菌A21243在进化树上是独立的分支，说明A21243是一种新的戊糖片球菌亚种。分离百岁长寿老人肠道的戊糖片球菌A21243菌株已于2023年08月24月保藏于广东微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No:63749。
实施例2
戊糖片球菌菌株A21243的耐人工胃肠液试验
1.菌株模拟人工胃液实验
将活化三次的菌液震荡摇匀，取1ml菌悬液于9ml人工胃液(pH＝3.0)中，37℃静置培养3h，分别取培养0h和3h的人工胃液进行平板活菌计数。以0h作为对照，按照公式I计算模拟人工胃液存活率。
模拟人工胃液存活率(％)＝Nt/N0×100％ 公式I
式中，Nt表示培养t h后的活菌数，N0表示0h时的活菌数。
2.菌株模拟人工肠液实验
取培养3h后的人工胃液1ml于9ml人工肠液(pH＝8.0)中，37℃静置培养2h，4h，6h和8h。分别取培养0h，2h，4h，6h，8h和16h的人工肠液进行平板活菌计数。以0h作为对照，按照公式II计算模拟人工肠液存活率。
模拟人工肠液存活率(％)＝Nt/N0*100％ 公式II
式中，Nt表示培养t h后的活菌数，N0表示0h时的活菌数。
结果见表1和图3。
表1 A21243模拟人工胃肠液的耐受性
由表1和图3可知，A21243菌株模拟胃液处理3h时后，菌株存活率高达272.73％，活菌对数值达到8；模拟肠液处理16h后，菌株存活率高达66.41％，活菌对数值还达到7，说明A21243菌株在模拟胃肠液中的存活能力强。综上，说明该菌株能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。
实施例3
戊糖片球菌菌株A21243的减脂效果
1.菌株A21243及线虫培养
将大肠杆菌OP50培养于LB培养基中，过夜培养后取适量涂板于线虫培养基(nematode growth medium，NGM)上，过夜培养。将解冻的线虫离心后接种至有OP50的NGM培养基上，放置于20℃培养箱培养。菌株A21243活化两后接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18～20h。
2.线虫同期化处理
用M9缓冲液悬浮线虫，吸至培养管中，每管线虫加入裂解液(5N NaOH和5％次氯酸钠溶液)，裂解6min，3500r/min离心1min，弃上清液，用M9 buffer反复清洗4次，弃上清液，转移NGM培养基上，20℃恒温过夜培养，即得L1期幼虫；随后用M9 buffer冲洗离心一次后，将线虫接种在有OP50的NGM平板上，20℃培养28～30h即可得到同期化线虫。
3.线虫脂肪粒实验
分别将100条同期化线虫挑入涂有OP50和A21243的平板中，隔天换板；在喂食第7天后，用冷却的M9 buffer洗三次后，将线虫重悬在4％的多聚甲醛中，各样本在室温下轻微摇动1h，3000～4000rpm离心1min，去上清后用M9 buffer洗两次；随后将线虫重悬在60％异丙醇和0.01％Triton X-100的PBS溶液中，孵育15min；待线虫沉降后，去除异丙醇，加入1mL40％油红O染色剂，在25℃摇床孵育动物1-2h；待线虫沉降后去除染料，用M9buffer清洗两次，加入200μLM9 buffer，在倒置荧光显微镜下逐条线虫拍照，并用Image J统计图像数据、用GraphPad Prism 8.2统计脂肪粒降解率数据
结果见图4。经试验，结果显示喂养7d后的线虫经油红O染色后，与喂养OP50的线虫相比，喂养A21243的线虫脂肪粒明显减少，抑制率为55.39％(P＜0.05或P＜0.01)。
实施例4
治疗非酒精性脂肪肝的冻干粉制备及动物实验
1.菌株冻干粉制备
1)菌株A21243发酵培养
挑取活化2次后的实验菌株单菌落至15ml的MRS液体培养基，37℃厌氧条件下静置培养12h，得到种子液1。按3％的接种量将种子液1接种至150ml的MRS液体培养基，37℃厌氧条件下静置培养20～22h，得到种子液2。按3％的接种量将种子液接种至300ml的MRS液体培养基，37℃厌氧条件下静置培养20～24h，得到放大培养后的菌液。收集菌液于冷冻离心机4℃，5000rpm，离心5min，弃上清液。用生理盐水将菌体洗涤2次，4℃，5000rpm，离心5min。称量菌体湿重。
将冻干保护剂和菌体湿重按体积比1：1进行重悬，EP管分装，放置-20℃30min，再放置-80℃处理1h。将分装好的EP管放入冻干瓶中，将冻干瓶放入冷冻干燥机进行冻干，持续冻干30h，最终获得冻干菌粉。利用平板计数法进行技术并将菌粉放置4℃保存备用，使用时用无菌生理盐水重悬。
2.动物实验
取SPF级6-8周龄雌性C57BL/6J为实验鼠24只，适应性喂养1周。适应期间期间保持12h光照循环，温度20～26℃，湿度40％～60％，小鼠随意进食与饮水。适应期结束后，随机分成4组，每组6只，具体分组如下：
正常组：基础础饲料和0.2ml脱脂奶；
模型组(NAFLD组)：高脂(20％)高果糖高胆固醇饲料|和0.2ml脱脂奶；
干酪乳杆菌Zhang组(干酪Zhang组)：高脂(20％)高果糖高胆固醇饲料和0.2ml菌粉(1×109CFU/ml)；
A21243组：高脂(20％)高果糖高胆固醇饲料和0.2ml菌粉(1×109CFU/ml)
NAFLD组、干酪Zhang组和A21243组每日喂高脂高果糖高胆固醇饲料(江苏协同生物定制)，连续灌胃4周。检测血脂出现异常及肝脏出现脂肪变性后，益生菌组开始每天灌胃0.2ml菌粉(1×109CFU/ml)，连续灌胃4周，试验期间小鼠自由饮水进食。试验第7周进行口服葡萄糖耐受测试，第8周进行胰岛素耐受测定并进行解剖，心脏采血，收集肝脏、结肠、回肠组织，结肠内容物及粪便。
实施例5
小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C检测
在实施例4中，解剖小鼠前进行心脏采血，采血前12h禁食。收集的血液4℃凝固2h，4℃，2600转/分离心20分钟，收集血清。血清储存在-20℃备用。采用血清TC、TG、HDL-C和LDL-C检测试剂盒(普利莱)按照说明书进行检测。
图5结果表明，与正常组相比，NAFLD组TC升高了215％、LDL-C含量升高了37.7％，TG含量升高了18.17％和HDL-C含量下降了8.3％。与NAFLD组相比，益生菌组TC、TG显著下降，其中TC降低了89％，TG降低了60％，HDL-C含量升高了10.3％，LDL-C含量下降了24.8％，具有显著差异，说明A21243降血脂水平的综合效果较好。
实施例6
小鼠肝脏H&E染色观察
在实施例2中，解剖时将部分小鼠肝脏组织用4％多聚甲醛固定液固定48h，进行组织石蜡包埋，用石蜡切片机(科迪KD2260)进行切片4～5μm，然后进行H&E染色。用NAS系统对染色的结果进行非酒精性脂肪肝评分，进行组织病理学评估。
图6小鼠肝脏组织H&E染色结果表明，与正常组相比，NAFLD组肝窦狭窄，细胞核居边，细胞肿胀，呈气球样变，胞内可见大小不等的脂滴，大量中性粒炎细胞浸润；与NAFLD组相比，商业菌株干酪乳杆菌Zhang组空泡变小，脂肪变性变少，而戊糖片球菌A21243组肝小叶轮廓略显清晰，细胞核形态基本规则，细胞数目增多，有轻微的细胞核居边，说明A21243能明显改善非酒精性肝病。
图7的NAS评分评估结果进一步说明了A21243治疗非酒精性脂肪肝效果更好，能逆转脂肪变性，且具有显著差异。
实施例7
小鼠肝脏损伤及炎症分析
肝损伤是通过直接肝细胞损伤和炎症发生的。血清ALT、AST和总胆汁酸水平是评价过度肝损伤的重要指标。实施例4实施后收集的血清按照ALT、AST检测试剂盒(南京建成生物研究所)说明书进行检测。ELISA检测(江莱生物ELISA检测试剂盒)炎症因子LPS。检测肝脏组织IL-1βmRNA水平。
图8结果检测结果表明，与正常组相比，NAFLD组的AST、ALT和总胆汁酸水平显著升高，分别升高了60.7％，86.2％，与NAFLD组相比，菌株A21243组的AST降低49.6％、ALT降低了46.9％和总胆汁酸水平降低了75.7％，且具有显著差异，同时与商业菌株组相比，戊糖片球菌A21243能显著降低血清中总胆汁酸水平，且具有显著差异，说明戊糖片球菌A21243能够减少胆汁淤积和肝损伤。图9相关炎症指标结果表明，戊糖片球菌A21243能显著降低LPS和IL-1β炎症因子的水平，分别降低了81.3％和76.6％，且具有显著差异。说明戊糖片球菌A21243通过IL-1β等炎症因子信号通路调控非酒精性脂肪肝小鼠的炎症。
实施例8
戊糖片球菌A21243增强小鼠口服葡萄糖的耐受能力和改善胰岛素抵抗
在实施例4中的第7周进行口服葡萄糖耐受试验(OGTT)。试验前一天禁食过夜，然后按2.5g/kg给予葡萄糖，利用检测试纸和血糖仪(罗氏血糖仪)分别检测0min，30min，60min和120min的血糖水平。第8周进行胰岛素耐受试验(ITT)，试验前2h禁食，按0.75U/kg腹腔注射胰岛素，利用检测试纸和血糖仪(罗氏血糖仪)分别检测0min，30min，60min和120min的血糖水平。
图10结果表明，与正常组相比，NAFLD组血糖迅速上升且幅度较大，在120min内血糖下降相对缓慢，而且无法恢复正常的血糖水平，说明出现了葡萄糖耐量降低。在注射胰岛素后，NAFLD组血糖下降缓十分缓慢而且无法恢复正常的血糖水平，说明出现胰岛素抵抗，但是相比NAFLD组和商业组，戊糖片球菌菌株A21243能显著增强小鼠的葡萄糖耐受性和降低胰岛素抵抗，改善非酒精性脂肪肝疾病引起的代谢功能障碍。
实施例9
戊糖片球菌A21243通过抑制胆固醇合成及促进胆汁酸途径治疗NAFLD
在实施例4中，收集小鼠肝脏组织样本冻存于-80℃。称取100mg肝脏组织，按照组织总RNA试剂盒(苏州优逸兰迪生物科技有限公司)的说明书提取小鼠肝脏组织总RNA。按照逆转录试剂盒(天根)说明书进行cDNA合成。参考文献qPCR引物(doi:10.3389/fnut.2022.1071284.)qPCR引物(表1)，采用Comparative CT(△△CT)法检测目的基因表达。qPCR反应在QuantStudioTM System进行，荧光定量程序为：扩增曲线：94℃30s，94℃15s，58℃30s，进行40个循环；溶解曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s。以管家基因18S为内参，用2-△△Ct法对目的基因进行定量分析。
表1荧光定量引物
胆固醇7a-羟化酶(cholesterol 7-alphahydroxylase，CYP7A1)是胆汁酸合成代谢经典途径的限速酶，体内近50％的胆固醇通过CYP7AI的催化转化为胆汁酸排出体外，其表达水平的高低反映出胆汁酸合成的快慢及机体清除胆固醇的能力。CYP8B1参与胆汁酸的合成，对脂肪的消化和吸收非常重要。CYP8B1基因的突变可能导致各种代谢性疾病，包括胆结石和肝病。
图8结果表明，与正常组相比，NAFLD组小鼠肝组织CYP7A1和CYP8B1的mRNA表达明显降低；与NAFLD组相比，A21243组CYP7A1和CYP8B1表达明显升高，且具有显著差异；因此A21243具有促进胆汁酸合成和防止肝脏胆固醇堆积的功能。
HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)，它是参与胆固醇合成途径中的关键酶，高水平的HMGR表达能够促进胆固醇和甾体激素的合成，从而增加NAFLD的风险。HMGR的抑制可以降低胆固醇的合成，从而降低血液中的胆固醇水平。在非酒精性脂肪肝疾病中，HMGR的表达会随着病情的加重而升高。此外SCD1(单不饱和脂肪酸合酶1)是一种脂肪酸合酶，是脂肪酸代谢和合成途径中的另一种关键酶。在肥胖和代谢综合征等疾病中起着重要的作用。在这些疾病中，SCD1的表达通常会增加，导致体内单不饱和脂肪酸的合成增加，从而促进脂肪酸沉积和胰岛素抵抗。DGAT2(甘油酰转移酶2)主要在肝脏、肠道和脂肪组织中表达，它是甘油三酯代谢途径中的一个关键酶。DGAT2高表达能够促进脂肪酸的合成和沉积，导致肝脏内脂肪沉积过多，可能加速肝脏炎症和纤维化的发生。
图11结果显示，与正常组相比，NAFLD组小鼠肝组织HMGR、SCD1和DGAT2 mRNA的表达水平显著升高。但是与NAFLD组相比，菌株A21243能显著降低HMGR、SCD1和DGAT2 mRNA的表达水平，说明戊糖片球菌菌株A21243具有调节脂肪酸合成和胆固醇代谢紊乱功能。
实施例10
戊糖片球菌A21243治疗非酒精性脂肪肝肠道菌群分析
在实施例4中，通过16S rRNA的Miseq测序分析戊糖片球菌A21243治疗非酒精性脂肪肝前后对结肠内容物肠道菌群多样性的影响。在Alpha多样性中(图12)，A21243组的Chao1指数、Pielou’s指数、Shannon指数和Simpson指数低于NAFLD组但无显著差异，说明戊糖片球菌A21243干预后可能降低了肠道微生物菌群多样性。经Bray-curitis距离的PCoA结果分析表明(图12)，A21243组与NAFLD组之间在分布上明显分离，说明戊糖片球菌菌株A21243干预改变了NAFLD小鼠的肠道微生物菌群结构。
Phylum丰度差异结果显示(图13)，与NAFLD组相比，A21243组的厚壁菌门减少，疣微菌门丰度显著增加。与正常组相比，NAFLD组，A21243组拟杆菌门丰度降低，疣微菌门丰度增加，B/F比值显著减少。
Genus丰度差异结果显示(图14)，在结肠中，与模型组相比，A21243的Akkermansia菌、Enterorhabdusj和Faeclibaculum丰度显著增加，Bifidobacteium显著降低。
LEfSe分析显示(图15)，与模型组相比，A21243组的Akkermansia、Staphylococcus和Lactobacillus_murinus丰度增加，Turicibacter、Anaerotruncus、Dubosiella和Faecalibaculum丰度减少。说明戊糖片球菌A21243干预改变了NAFLD小鼠的肠道微生物菌群的比例和分布。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)菌株A21243，其特征在于，保藏编号为GDMCC No:63749。
2.一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的益生菌制剂，其特征在于，包括权利要求1所述戊糖片球菌菌株A21243和辅料。
3.根据权利要求2所述益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂包括冻干菌粉或菌液。
4.一种具有治疗非酒精性脂肪肝和/或减脂功能的药物，其特征在于，包括权利要求1所述戊糖片球菌菌株A21243或权利要求2所述益生菌制剂和药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述药物，其特征在于，所述药物的剂型为口服剂或注射剂。
6.权利要求1所述戊糖片球菌菌株A21243或权利要求2所述益生菌制剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝或减脂的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述减脂包括减少体内脂肪堆积和降低以下至少一种指标的含量：胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白。
8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物具有以下至少一项药效：
逆转非酒精性脂肪肝肝组织的损伤；
抑制肝组织的炎症；
抑制非酒精性脂肪肝中胆固醇的堆积和促进胆汁酸合成。
9.权利要求1所述戊糖片球菌菌株A21243或权利要求2所述益生菌制剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝引起的代谢功能障碍的药物中的应用；
优选的，所述非酒精性脂肪肝引起的代谢功能障碍包括非酒精性脂肪肝引起的葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗、脂肪酸合成紊乱和胆固醇代谢紊乱。
10.权利要求1所述戊糖片球菌菌株A21243或权利要求2所述益生菌制剂在制备调整非酒精性脂肪肝中肠道菌群结构的药物中的应用。
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