CN116590181B - 一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌及其应用，所述改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株，保藏编号为CGMCC No.24410。该菌株能够缓解因微塑料污染而引起的机体炎症反应、代谢紊乱和免疫失衡问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌及其应用，具体涉及一种副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株、包含其的培养物、包含其的益生菌剂、及其在制备具有预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的药物中的应用。
背景技术
微塑料，顾名思义，是指微小的塑料颗粒（直径小于5mm的塑料颗粒，包括小于1µm的纳米塑料），例如最常见的微塑料之一纳米聚苯乙烯（Nanopolystyrene，PS），是商业产品开发和较大塑料分解的产物。人类通过各种途径摄取大量的微塑料，它们在人类肝脏、肾脏、肠道甚至胎盘（尤其是直径小于1µm的胎盘）中积累。科研学者提出假设，接触微塑料会引起肠道炎症和肝脏代谢疾病，并且通过相关体内实验验证暴露于微塑料的小鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平显著升高，且其肠道炎症反应和肝损伤较严重，但目前尚不清楚这种损害和炎症是否会导致严重疾病的进一步发展。
研究人员提出通过调控肠道微生态，或许可逆转微塑料污染带来的炎症反应、代谢紊乱和免疫失调等问题。益生菌补充对肠道中环境污染物的吸收具有保护作用，可作为一种有效、安全的膳食补充剂，降低环境污染物的毒害作用。研究表明，肠道有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等可以调节宿主的免疫系统，胃肠道中含有人体70%的免疫细胞，保持免疫警惕，当机体受到外界不良刺激时，肠道菌群可以调节免疫细胞，维持Th1/Th2细胞动态平衡，分泌IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等细胞因子，增强胃肠黏膜屏障作用，维持机体内环境稳态和代谢水平。
因此，如何提供一种可以有效改善由微塑料污染引起的炎症反应、调节机体免疫应答和代谢水平的微生物制剂，解决因微塑料污染给患者带来的不良生活体验，降低微塑料污染所带来的风险，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌及其应用，具体提供一种副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株、包含其的培养物、包含其的益生菌剂、及其在制备具有预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌，所述改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株，保藏编号为CGMCC No.24410，保藏日期为2022年02月21日。
本发明从新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州昌吉市传统发酵乳制品样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌，将其命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株，该菌株能够缓解因微塑料污染而引起的机体炎症反应、代谢紊乱和免疫失衡问题。具体体现在：（1）矫正因微塑料污染引起的Th1/Th2免疫失衡；（2）改善肠道-肝轴紊乱，调节空腹血糖和空腹胰岛素代谢水平，避免糖尿病等代谢疾病的发生；（3）能够显著提高肠道菌群的多样性，维持肠道微生态健康。因此，此副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株能用于制备预防、改善或治疗微塑料污染所致机体炎症反应、代谢紊乱和免疫失衡的药品中。
另外，副干酪乳杆菌是一种益生菌，因此本发明筛选得到的副干酪乳杆菌LC37用于预防、改善或治疗微塑料污染相关性胃肠疾病的药品中时，安全性高；且其不会产生抗药性，可长期用于改善因微塑料污染所带来的不良生理和心理体验。
本发明所涉及的副干酪乳杆菌LC37的筛选步骤如下：
（1）选取分离自新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州昌吉市传统发酵乳制品样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的多株菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40%的甘油进行保藏。
（2）针对保藏的多株单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株耐胃酸和胆盐能力（人工模拟）更优的单菌株，对其进行鉴定。
第二方面，本发明提供一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌的培养物，所述培养物的制备方法包括：将第一方面所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株接种于培养基中在30-40℃（例如30℃、32℃、35℃、36℃、37℃、38℃等）下培养12-30 h（例如15 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、30 h等）。
上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乳糖、酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、L-半胱氨酸。
本发明优选上述培养条件，副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株能够达到生长稳定期，并且具有更加优异的碳源（葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、菊糖等）利用能力。
第三方面，本发明提供一种预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应、机体免疫失衡或肠道-肝脏轴紊乱的益生菌剂，所述益生菌剂包括第一方面所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株。
本发明所涉及的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。
优选地，在所述益生菌剂中，所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株的活菌数不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g，例如1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、5×108CFU/mL、8×108CFU/mL、1×109CFU/mL、5×109CFU/mL、1×1010CFU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型可以为冻干粉剂，所述冻干粉剂还可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂或颗粒剂等剂型。
优选地，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂乳粉；
所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
进一步优选地，所述益生菌剂还包括长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longumBL21菌株；所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株的保藏编号为CGMCC No.10452，保藏日期为2015年01月27日。
本发明还创造性地发现上述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株能够与长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗因微塑料污染所致炎症反应、机体免疫失衡或肠道-肝脏轴紊乱，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明LC37菌株与BL21菌株在降低因微塑料污染引起炎症反应、机体免疫失衡或肠道-肝脏轴紊乱的症状方面具有协同增效作用。
优选地，所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株与长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株的活菌数比为(3-5):1，例如3:1、3.5:1、4:1、5:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明所涉及的复合益生菌剂中，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。
第四方面，本发明提供根据第一方面所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备预防、改善或治疗由微塑料污染引起的炎症反应的药物中的应用。
第五方面，本发明提供根据第一方面所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备预防、改善或治疗由微塑料污染引起的机体免疫失衡的药物中的应用。
第六方面，本发明提供根据第一方面所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备预防、改善或治疗由微塑料污染引起的肠道-肝脏轴紊乱的药物中的应用。
第七方面，本发明提供根据第一方面所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备改善由微塑料污染引起的机体胰岛素抵抗的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明从新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州昌吉市传统发酵乳制品样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌，将其命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株，该菌株能够缓解因微塑料污染而引起的机体炎症反应、代谢紊乱和免疫失衡问题。具体体现在：（1）矫正因微塑料污染引起的Th1/Th2免疫失衡；（2）改善肠道-肝轴紊乱，调节空腹血糖和空腹胰岛素代谢水平，避免糖尿病等代谢疾病的发生；（3）能够显著提高肠道菌群的多样性，维持肠道微生态健康。因此，此副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株能用于制备预防、改善或治疗微塑料污染所致机体炎症反应、代谢紊乱和免疫失衡的药品中。
本发明还创造性地发现上述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株能够与长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗因微塑料污染所致炎症反应、机体免疫失衡或肠道-肝脏轴紊乱，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明LC37菌株与BL21菌株在降低因微塑料污染引起炎症反应、机体免疫失衡或肠道-肝脏轴紊乱的症状方面具有协同增效作用。
附图说明
图1是各组小鼠的血糖水平的统计结果图；
图2是各组小鼠的胰岛素水平的统计结果图；
图3是各组小鼠的HOMA-IR指数的统计结果图；
图4是各组小鼠的结肠病理切片染色图；
图5是各组小鼠的肝脏病理切片染色图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述涉及的副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24410，保藏日期为2022年02月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的长双歧杆菌为长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10452，2015年01月27日。
下述涉及的MRS液体培养基配方为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乳糖10g、酵母浸膏5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4·3H2O 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、MnSO40.01g、L-半胱氨酸1g，加水至1000 mL。
下述涉及的副干酪乳杆菌LC37菌悬液：将副干酪乳杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心15min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到副干酪乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。
下述涉及的长双歧杆菌BL21悬液：将长双歧杆菌BL21接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心15 min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到长双歧杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。
实施例1
本实施例筛选一株改善微塑料引起的炎症反应的副干酪乳杆菌，步骤如下：
（1）选取分离自新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州昌吉市传统发酵乳制品样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40%的甘油进行保藏。
（2）针对保藏的单菌进行体外生理特性测试，具体为如下：
A. 耐酸和胆盐能力测试：
使用MRS液体培养基、MRS固体培养基和分离培养基（在固体CMRS重加0.5%CaCO3），主要试剂有胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆酸钠和CaCO3等。把MRS培养基的pH调到3.0，121℃下15min灭菌后按2%的接种量接入已活化两代的液体培养扩培物，37℃培养24h，测定其在24h过程中的吸光度的变化∆OD600值；在MRS培养基中添加0.3%的牛胆盐，121℃下15min灭菌后按2%的接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养24h后测定其在24h过程中吸光度的变化∆OD600值，最后选取两个∆OD600值相对大的大约10个菌株做下一步实验。
耐酸性实验：以pH=6.80的PBS缓冲液为基础，再用37%的盐酸将其调至3.0，121℃下15min灭菌后按10%接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。
耐胆盐实验：菌种活化两代后的液体培养物以2%接种量接入含有不同胆盐浓度的MRS培养基中（培养基中分别喊0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、2%胆盐），同时以不含胆盐的MRS培养基为对照，在37℃恒温培养24h后取样测定活菌数，结合上一个实验结果筛选出耐酸耐胆盐的优良菌株。
B. 产酸能力测试：
采用滴定法测定菌株的产酸能力。取甘油管保藏的菌株活化后按2%接种量接种于MRS液体培养基，37℃恒温培养18h，取各菌株的发酵液10mL于50mL无菌水中，滴加2-3滴1g/L的酚酞作为指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行滴定，以溶液出现粉红色且30s后不褪色为滴定终点，每个样品3次平行。以未接种的MRS液体培养基作空白对照，其计算公式为：总酸度/(g·L-1) = (V1-V2)·c·100·V0-1（V1为样品消耗NaOH溶液的体积，mL；V2为空白对照消耗NaOH溶液的体积，mL；V0为稀释液的总体积，mL；c为标准NaOH的浓度，mol/L）。
综合上述筛选实验，选择乳酸产量最多且胃酸胆盐耐受能力最强的一株菌株。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
（1）形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于38℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可得，菌落为透亮饱满的白色圆点。挑选对数生长期的该菌株，进行光学显微镜检测，经涂片和革兰染色后镜检观察到：革兰氏染色为阳性，菌株形态为杆状，无芽孢无鞭毛。
（2）16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，按2%比例接种于装有20mL MRS液体培养基的离心管中，在37℃下培养18h后进行离心分离，8000 rpm下离心15min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为副干酪乳杆菌。
SEQ ID No:1：
ACCATCTTTTGTCACTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCGCTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATCTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCCATGTTGAATCTCGGTGCAAGCACCGATCATCAACGAGAACTCGTTCGACTGCATGTATAGCACGCCGCCCTGCCA
基于实施例2的16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株。
实施例3
本实施例对副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株的培养条件进行优化，步骤如下：
将副干酪乳杆菌LC37接种于MRS液体培养基中，分别于10-50℃的不同温度下培养48 h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。结果如表1所示：
结果显示，副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株在35-38℃，培养18-22h即可达到生长稳定期。
根据API细菌鉴定标准利用API 50CHL培养基（基础培养基，由48种可发酵碳水化合物的API 50CH试验条组成）和API 50CH试验条对检测菌株LC37进行糖发酵反应判读检测其碳源利用能力。该方法原理是利用需测定的菌株制成悬液接种在每个试验条小管里，经过培养，能够被利用的碳源管会因其发酵产酸，pH下降，从而使指示剂变色。
最后结果得到，副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株可利用碳源葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、菊糖等多种糖源。
实施例4
本实施例验证副干酪乳杆菌LC37菌株的耐胃酸、胆盐能力，步骤如下：
（1）制备人工胃液、胆盐：
以质量分数计，人工胃液中含有0.20%的NaCl以及0.30%的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
10%牛胆盐：称取10.0g牛胆盐（沃凯，国药集团化学试剂有限公司，中国上海）至100mL无菌水中，0.22um滤膜过滤除菌。
含0.1%胆盐MRS培养基：按说明书配制MRS培养基（北京索莱宝科技有限公司），高压蒸汽灭菌（121℃，15min）后，加入适量10%牛胆盐溶液至终浓度为0.1%。
（2）耐胃酸能力测试：
取1.0 mL副干酪乳杆菌LC37菌悬液（浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度），分别与9.0 mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理3 h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率（%）=N1/N0×100%，
其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表2。
（3）耐胆盐能力测试：
取1.0 mL副干酪乳杆菌LC37菌悬液（浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度），与9.0 mL含0.1%牛胆盐MRS培养基混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理3 h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率（%）=N1/N0×100%，
其中，N1：胆盐处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表3。
本发明所述的副干酪乳杆菌LC37具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达80.3%；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达92.5%；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达94.7%。良好的胃酸和胆盐耐受能力为其在胃肠道定植，维持胃肠道黏膜屏障稳态以及制备预防、改善或治疗微塑料污染引起炎症反应的产品创造了条件。
实施例5
本实施例探究副干酪乳杆菌LC37对微塑料污染小鼠模型的影响：
以及对小鼠肠道-肝脏轴紊乱的调控，以及对小鼠空腹血糖和胰岛素水平的调控，以及对小鼠的肠道菌群进行分析：
选取8周龄ICR小鼠（平均体重20±2g）购自上海斯莱克实验动物中心，已获得上海实验动物研究中心动物伦理委员会（伦理号：2022032001）的伦理批准。所有动物均安置在特定的无病原体屏障条件下，于独立的笼子里适应性喂养一周。动物实验严格遵循美国国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》。
（1）微塑料污染小鼠模型建立：
根据现有技术常用方法（参照文献Luo T, Wang C, Pan Z, Jin C, Fu Z, JinY. Maternal Polystyrene Microplastic Exposure during Gestation and LactationAltered Metabolic Homeostasis in the Dams and Their F1 and F2Offspring.Environ Sci Technol. 2019 Sep 17;53(18):10978-10992.），使用聚苯乙烯微塑料（平均直径为1μm；Microspheres-Nanospheres，美国）诱导微塑料污染小鼠模型。
（2）小鼠分组及处理方式：
将48只大鼠随机分为6组（每组8只）：正常对照组（CTL）、未经治疗的微塑料PS污染模型组（PS）、经副干酪乳杆菌LC37治疗的微塑料污染小鼠组（LC37）、经长双歧杆菌BL21治疗的微塑料污染小鼠组（BL21）、经副干酪乳杆菌LC37和长双歧杆菌BL21治疗的微塑料污染小鼠组（LC37+BL21，活菌数比例3:1）、经副干酪乳杆菌ATCC25302和长双歧杆菌BL21治疗的微塑料污染小鼠组（ATCC25302+BL21，活菌数比例3:1）。
各组处理方式如下：
CTL：生理盐水（10 mL/kg，经检测过的不含微塑料的水）处理；
PS：聚苯乙烯（5μm PS 1000 μg/L）处理；
LC37：聚苯乙烯（5μm PS 1000 μg/L）+ LC37（5×108 CFU/天）处理；
BL21：聚苯乙烯（5μm PS 1000 μg/L）+ BL21（5×108 CFU/天）处理；
LC37+BL21：聚苯乙烯（5μm PS 1000 μg/L）+LC37+BL21（共5×108 CFU/天）处理；
ATCC25302+BL21：聚苯乙烯（5μm PS 1000 μg/L）+ATCC25302+BL21（共5×108 CFU/天）处理。
除CTL小鼠外，其他组均经口给予微塑料污染水，每日1次。
（3）试验内容：
（3.1）对小鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平的调控：
在给药开始第15天，小鼠尾部椎体采血，采用Accu-Check Performa试纸(Roche)测定血糖含量，空腹12小时后，测量一次空腹血糖。血清胰岛素水平的测定采用ELISA方法，使用试剂盒购于武汉纯度生物。胰岛素抵抗指数也称为HOMA-IR指数，可以用空腹血糖和空腹胰岛素数值评估机体胰岛素抵抗的数学模型，HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5，其中空腹血糖单位是mmol/L，空腹胰岛素的单位是微U/mL，系数22.5是矫正因子（参考文献：Kanauchi M. A new index of insulin sensitivity obtained from the oral glucosetolerance test applicable to advanced type 2 diabetes.Diabetes Care. 2002Oct;25(10):1891-2.）。
（3.2）对小鼠血清细胞因子水平的调控：
给药连续4周后，对小鼠进行安乐死，并收集血清组织、组织（肝脏、结肠）和粪便样本，并于-80℃保存备用。血清IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-12p70、TGF-β和RORγt水平采用购自武汉纯度生物科技有限公司的酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。所有的实验步骤都严格按照试剂盒的说明书进行。
（3.3）对小鼠肠道-肝脏轴紊乱的调控：
组织病理学检查：结肠组织固定，脱水，然后石蜡包埋，将石蜡包埋的结肠组织切成5mum切片，用过碘酸-雪夫（PAS）染色评价结肠组织病理学变化。取小鼠肝脏，直接固定于4%多聚甲醛固定液中进行组织学分析。固定后将肝组织切成4μm厚切片，石蜡包埋，每个肝组织标本切成多个部分。用苏木精-伊红（HE）染色进行组织学分析。
（4）试验结果：
（4.1）对小鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平的调控：
各组小鼠的空腹血糖水平、空腹胰岛素水平和HOMA-IR指数统计结果如图1-3所示：
由图1-3可知：对比CTL组和PS组小鼠可知，微塑料污染会在一定程度上影响机体的代谢水平，如空腹血糖水平和胰岛素水平。而在益生菌LC37干预后，小鼠的代谢指标有所恢复，尤其是复合益生菌LC37+BL21的组合。可能在益生菌作用下，病理小鼠的肠道菌群得到了一定的调节，从而影响肠肝轴，维持机体代谢水平的稳态。
（4.2）对小鼠血清细胞因子水平的调控：
各组小鼠的多种血清细胞因子水平的平均值统计结果如表4所示：
在免疫反应中IL-4被认为是Th2细胞的标志性细胞因子，IL-12p70是促进细胞介导免疫的主要Th1驱动细胞因子。由表4数据可知：与CTL组小鼠对比，PS组小鼠的IL-4细胞因子水平增强，同时其IL-12p70、IFN-γ水平明显降低，二者呈现负相关，可能是因微塑料污染诱导下引发了模型小鼠体内发生了2型免疫反应，呈现免疫病理现象。与CTL组相比，PS组小鼠的RORγt水平降低，这是诱导免疫紊乱的原因之一。而在益生菌LC37干预后，小鼠的细胞因子水平有所恢复，尤其是复合益生菌LC37+BL21的组合。
（4.3）对小鼠肠道-肝脏轴紊乱的调控：
各组小鼠的结肠病理切片染色图如图4所示，CTL组小鼠肠道组织结构整体正常，组织黏膜层细胞排列规则，而PS小鼠黏液层出现了极为显著的破坏，黏蛋白显著的降低，杯状细胞几乎消失殆尽；对比PS组，益生菌LC37干预后结肠肠壁杯状细胞的数量显著增加，改善了黏蛋白的分布，一定程度上改善了小鼠结肠炎黏液层的受损状况，且当LC37和BL21组合时，具有比单一菌剂LC37或BL21或者其他菌株复配方式显著优异的效果，隐窝结构明显，结肠基本可以恢复正常。
各组小鼠的肝脏病理切片染色图如图5所示，CTL组小鼠细胞排列致密，核的形态较为良好，大多分布在细胞中央；而PS小鼠肝脏细胞排列紊乱，无法判别完整的细胞壁结构，胞核固缩浓染，有较多的炎性细胞浸润；对比PS组，益生菌LC37干预后，肝细胞排列紊乱程度减轻，细胞空泡也逐渐减少，且当LC37和BL21组合时，具有比单一菌剂LC37或BL21或者其他菌株复配方式显著优异的效果，肝脏基本可以恢复正常。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LC37菌株，保藏编号为CGMCC No.24410，保藏日期为2022年02月21日。
2.一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌的培养物，其特征在于，所述培养物的制备方法包括：将权利要求1所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiLC37菌株接种于培养基中在30-40℃下培养12-30 h。
3.一种预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂包括权利要求1所述的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株。
4.根据权利要求3所述的预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株的活菌数不低于1×108 CFU/mL或1×108 CFU/g。
5.根据权利要求3所述的预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
6.根据权利要求3所述的预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
7.根据权利要求6所述的预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的益生菌剂，其特征在于，所述保护剂包括脱脂乳粉；
所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求3所述的预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）BL21菌株；所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株的保藏编号为CGMCC No.10452，保藏日期为2015年01月27日。
9.根据权利要求8所述的预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的益生菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC37菌株与长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株的活菌数比为(3-5):1。
10.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei LC37菌株或权利要求2所述的培养物或权利要求3-9中任一项所述的益生菌剂在制备具有预防、改善或治疗微塑料污染引起的炎症反应的药物中的应用。
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