CN114774335B - 具有靶向葡萄糖激酶显著降血糖和降血脂功效的长双歧杆菌070103及其应用 - Google Patents
具有靶向葡萄糖激酶显著降血糖和降血脂功效的长双歧杆菌070103及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了具有靶向葡萄糖激酶显著降血糖和降血脂功效的长双歧杆菌070103及其应用。长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）070103，保藏编号为GDMCC NO：62526。本发明所述的长双歧杆菌070103分离于健康人的肠道菌群，用于发酵乳的时候，在体外能对人源肝脏葡萄糖激酶具有激活作用，此外，所述菌株来源于健康人类粪便，对人体无毒副作用，同时全基因组测序分析发现，该菌株无毒力基因，相对于用于治疗糖脂代谢紊乱类的如肥胖、2型糖尿病代谢疾病的传统药物具有一定的优势。该菌株可用于制作益生菌发酵乳，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及发酵乳制品领域，具体涉及具有靶向葡萄糖激酶显著降血糖和降血脂功效的长双歧杆菌070103及其应用。
背景技术
据国际糖尿病联盟 (International Diabetes Federation)2021年发布的数据显示：截至到2021年约有5.37亿成年人患有糖尿病，5.41亿成年人患2型糖尿病的风险增加。而代谢综合征的发生使2型糖尿病的发病率增加了2倍。代谢综合征是由一种聚集代谢危险因素的临床病症，具体表现为中心性肥胖、血脂异常、葡萄糖代谢受损、血压升高和低水平的高密度脂蛋白。同时存在三种及三种以上代谢异常指标及被认定为患有代谢综合征。但随着生活方式的改变，饮食的多元化，高脂高糖饮食引起的糖脂代谢异常及其它的代谢类疾病发生的越来越普遍。
而肠道菌群与宿主饮食、代谢参数密切相关，糖脂的过度摄入对多种组织和器官功能障碍都相关，增加了肠道的通透性，引起肠道菌群失调。益生菌是调节肠道菌群和改善宿主，免疫状态的重要工具，因此针对预防和治疗代谢综合征的具体方法可能也包括益生菌。益生菌被定义为“活的微生物，当摄入足够量，能给宿主带来健康益处”。在这之中，乳酸杆菌和双歧杆菌是被引用最多的属，它们对体重、脂肪、肝脂肪变性和葡萄糖代谢有益。
葡萄糖激酶是糖酵解的第一步限速酶，能在肝脏糖代谢和胰岛素分泌之间进行双向调节血糖水平。有研究表明，葡萄糖激酶能介导胰岛素受体底物2（insulin receptorsubstrate 2，IRS2）的表达改善内质网应激引起的胰岛β细胞凋亡。它作为一个新的药物靶点，少有与益生菌相关的报道。最新的研究表明代谢综合征的发病率可通过改变生活方式尤其是饮食习惯得到预防。发酵乳作为益生菌的一个合适的载体，含有菌株和发酵过程中产生的生物活性化合物。而且可能含有具有潜在抗肥胖、抗代谢综合征的作用长双歧杆菌是双歧杆菌科、长双歧杆菌属，一般被认为安全的菌种，目前已经被国家相关部门纳入可食用菌种目录。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能显著降血糖和降血脂功效的长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）070103，其于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为GDMCC NO：62526。
本发明的第二个目的是提供长双歧杆菌070103在制备发酵乳制品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种长双歧杆菌发酵乳制品，由上述的长双歧杆菌070103发酵制备获得。
本发明的第四个目的是提供一种长双歧杆菌发酵乳制品的制备方法，是将长双歧杆菌070103接种到脱脂乳进行发酵处理。
在本发明的一些实施方式中，所述的脱脂乳是将脱脂乳粉按12%（v/v）与水混匀，然后105℃杀菌处理15min。
在本发明的一些实施方式中，是将长双歧杆菌070103菌液按体积比5%的比例接种到脱脂乳中，37℃发酵48h，制的发酵乳制品。
所述上述发酵处理为厌氧发酵处理。
本发明的第五个目的是提供一种特异识别长双歧杆菌070103的靶标核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第六个目的是提供针对上述靶标核苷酸序列设计的特异性扩增引物，包括正向引物5’-AGCCCTGAAAGAAACAACCAC-3’和反向引物5’-CCTGGTTCGACCAGATGAATA-3’。
本发明的有益效果：
本发明所述的长双歧杆菌070103分离于健康人的肠道菌群，用于发酵乳的时候，在体外能对人源肝脏葡萄糖激酶具有激活作用，此外，所述菌株来源于健康人类粪便，对人体无毒副作用，同时全基因组测序分析发现，该菌株无毒力基因，相对于用于治疗糖脂代谢紊乱类的如肥胖、2型糖尿病代谢疾病的传统药物具有一定的优势。该菌株可用于制作益生菌发酵乳，具有广阔的市场前景。
发明所述的长双歧杆菌070103发酵乳能显著降低高脂高糖饮食诱导的糖脂代谢紊乱小鼠的血糖，血脂，与模型组相比，070103发酵乳干预组小鼠的空腹血糖与胰岛素含量显著降低，血清中低密度脂蛋白胆固醇（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）等含量显著降低，结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的含量显著高于模型组。病理切片的观察结果也表明，长双歧杆菌070103发酵乳干预组小鼠的糖脂代谢紊乱和结肠组织得到显著改善。
Bifidobacterium longum 070103于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为GDMCC NO：62526。
附图说明
图1：葡萄糖激酶（G6PDH）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（GK）SDS-PAGE电泳图
图2：各组小鼠体重的变化
图3：各组小鼠空腹血糖（FBG）、口服葡萄糖耐量（OGTT）、血清中胰岛素（INS）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）的变化。
图4：各组小鼠的肝脏、附睾脂肪、棕色脂肪、结肠的病理切片和肝功能指标（ALT和AST）、瘦素（LEP）与结肠紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的含量。
图5：长双歧杆菌070103特异分子靶标验证图
图6：为使用本发明长双歧杆菌070103实时荧光定量PCR标准曲线
图7：长双歧杆菌070103实时荧光定量PCR溶解曲线
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1 乳酸菌的培养、鉴定、保藏及乳酸菌发酵乳的制备
从健康人的食物和粪便中共分离出87株乳酸菌。人类粪便菌株来自课题组前期的分离。在MRS肉汤中接种3% (v/v)的乳酸菌和在添加1‰的无菌的0.1%浓度的维生素K1和5mg/mL氯化血红素的TPY肉汤中接种3% (v/v)的双歧杆菌，37℃恒温厌氧培养至菌的对数期（乳酸菌约16 h，双歧杆菌约40 h）传代活化两次，备用。
采用细菌DNA提取试剂盒（Mabio，CHINA）进行细菌DNA提取，后采用2×PCR mix（Dongshengbio，CHINA）进行PCR扩增。PCR扩增引物采用16S rRNA基因通用引物，上游引物27 F 5’- AGAGTTTGATCCTGGCCTCA -3’和下游引物1492 R：5’- GGTTACCTTGTTACGACTT -3’。在PCR仪器中进行如下反应：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s共35个循环，72 ℃退火延伸10 min和Sanger测序，通过比对NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）鉴定菌株的16S rDNA基因序列。其中本专利所要求保护的菌株16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。（GTGGAGGGTTCGATTCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCAGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTATGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACGCGGCGACGCGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTAAGGTGAGGCTCGTGATTGGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT）
将该序列比对NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov），结果提示其与长双歧杆菌同源性最高，命名为长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）070103，于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为GDMCC NO：62526。
将活化的长双歧杆菌070103在4℃下3500 g 离心5 min，取菌体用生理盐水洗涤两次并再次离心，加入30%的无菌甘油混合均匀，分装到1.5 mL的EP管中。于-80℃进行保存，每次使用前进行活化。
测定活化两次的菌株活菌数，调整菌株浓度为1×109 CFU/mL。然后以体积比5%的接种量接种到灭菌的12%(m/v) 的脱脂乳，于37℃厌氧培养至凝乳为止，取凝乳后的样品于4℃ 4500 g 离心5 min取上清，用1 moL/L的NaOH溶液调节pH至7.2左右，再次在4℃下12000 g 离心10 min，取上清用0.22 μm的微孔滤膜过滤，将滤液保存至-80℃冰箱，用于后续实验。
实施例2：体外筛选具有激活葡萄糖激酶益生菌发酵乳
人肝葡萄糖激酶（GenBank：AAB97682.1）的氨基酸序列委托金维智公司进行基因合成，克隆到pET-28A载体中，测序并转化到 BL21 大肠杆菌中。通过在37℃扩培4h，再用0.5 mM异丙基 β-D-1-硫代半乳糖苷 (IPTG)在 18°C 下诱导 48 小时过表达带有 His 标签的重组 GK 蛋白。将大肠杆菌BL21细胞在 4 °C 下以 9,000 ×g 离心20分钟，将菌体重悬于裂解缓冲液（1M NaCl、50 mM 磷酸盐缓冲盐水、70 mM咪唑、1 mg/mL溶菌酶，pH = 7.6）中，并储存在 -80°C 。将细胞解冻，使用超声波细胞破碎机在冰上进行超声处理，并在4°C下以15,000 ×g离心30分钟。用0.8 μm滤器过滤上清液，置于5mL HisTrapTM FF 蛋白纯化柱上，用洗脱缓冲液（150 mM NaCl、50 mM 磷酸盐缓冲盐水、200 mM 咪唑，pH = 7.2）洗脱。通过超滤 MWCO 30 KDa浓缩洗脱的蛋白质。通过 SDS-PAGE 检测蛋白质纯度，结果如图1所示。
取出凝乳样品，在4℃下以 4,500 ×g 离心5分钟，获得上清液。用1 moL/L NaOH溶液将pH值调节至7.2，在4℃下以 12,000 ×g离心10分钟，然后通过0.22 μm膜过滤上清液。滤液储存在-80℃。反应体系包括Tris-HCl 100 mmol/L （pH=7.40）、ATP 5 mmol/L、NAD+ 1 mmol/L、DTT 5 mmol/L、MgCl2 2 mmol/L，KCl 25 mmol/L，G6PDH 4.5 mIU/L，葡萄糖激酶2 mIU/L，葡萄糖4 mmol/L以及10 μL发酵乳上清通过在A340nm处测定NADH的生成量计算GK的酶活和发酵乳上清的激活倍数，筛选出具有活化作用的发酵乳用于后续实验。如表1所示，长双歧杆菌070103具有较高的激活葡萄糖激酶的作用。
实施例3 长双歧杆菌基因组及表型的安全性评价
采用Illumina Nextseq 550二代测序及Nanopore MinION三代测序平台对515株乳杆菌进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法同前。二代测序采用AMT Rapid DNA-Seq Kit for Illumina (CISTRO, CHINA)建库，采用High Output v2.5 kit (Illumina,USA)试剂盒测序。三代测序采用Rapid Barcoding Sequencing Kit (Nanopore, UK)建库，后采用R9.4.1芯片(Nanopore, UK)测序。下机数据分别采用Trimmomatic（v0.39）及Filtlong（v0.2.0）软件进行质控，后采用Unicycler（v0.4.8）软件进行组装。组装后乳杆菌的基因组采用Quast（v5.0.2）软件进行基因组质控评估，采用Abricate（v0.8.13）软件查找并注释毒力基因及耐药基因。
经测序获得长双歧杆菌070103基因组完成图，该菌基因组大小为2.3Mb，GC比为59.88%，其基因组含1908个CDS、55个tRNA和2个rRNA，不含质粒。采用prokka软件注释发现070103基因组中含有1966个有功能的编码基因以及667个假想蛋白。采用Abricate软件比对VFDB（Virulence Factor Database）、ARG-Annot（Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation）、CARD（the Comprehensive Antibiotic Research Database）、Resfinder数据库，发现长双歧杆菌070103除了含有莫匹罗星抗性基因外不含有其他任何毒力基因或耐药基因。
实施例4 体内缓解糖脂代谢紊乱的评价
实验动物分组、生理生化指标测定
40只SPF级别雄性C57/BL6J小鼠来源于广东省医学实验动物中心，饲养在屏障环境（温度 23.3℃，相对湿度 50–60%，光/暗每12小时交替）当中，正常饮食和喝水。然后制备鼠李糖乳杆菌LGG和长双歧杆菌070103的发酵乳则是活化并调整两种菌株浓度为1×109CFU/mL，然后以体积比5%的接种量接种到灭菌的12% (m/v) 的脱脂乳，于37℃厌氧培养至凝乳为止。经过适应性喂养2周后，将小鼠分为四组：对照组（control）喂基础日粮和生理盐水，高脂高糖组（HFHS）组饲喂高脂高糖饲料和生理盐水。鼠李糖乳杆菌LGG发酵乳（LGGFM）组饲喂高脂高糖饲料和每天10mL/kg BW鼠李糖乳杆菌发酵乳，长双歧杆菌070103发酵乳组（BLFM）饲喂高脂高糖饲料和每天10mL/kg BW的长双歧杆菌070103发酵乳。基础饲料总热量为3530 Kcal/kg,供能比为蛋白质20.6%、脂肪12%、碳水化合物67.4%。HFHS组总热量为4250Kcal/kg, 供能比为蛋白质16.46%、脂肪45.65%、碳水化合物37.85%。所有组都连续喂养13周，同时每周记录各组小鼠的体重。在实验结束前3天，收集小鼠的粪便用于后续粪便指标的检测。实验方案及所有步骤经广东省科学院微生物研究所实验动物伦理委员会批准，批准号GT-IACUC202104301。
小鼠13周体重变化如图2所示。在整个实验周期内，与Control组相比，HFHS组的小鼠的体重显著增加 (图2A)。但补充了LGGFM和BLFM治疗的小鼠的体重较HFHS呈现降低趋势，其中BLFM能显著降低小鼠的体重（图2B）。使用软件 Graph pad 8.2.1 进行统计分析，使用t检验或单因素方差分析。数值表示为均值±标准差，p < 0.05被认为具有统计学意义。此外，p值的表示为* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001, **** p <0.0001。
在13周末将小鼠禁食过夜，记录空腹体重，进行摘眼球取血，采血后，立即颈椎脱臼处死。解剖摘取小鼠的肝脏、肾脏、脾、肾周脂肪、附睾脂肪、棕色脂肪、回肠和结肠，并用冷的生理盐水进行清洗，放在滤纸上吸干。此外对小鼠的肝脏、肾脏、脾、肾周脂肪、附睾脂肪、棕色脂肪进行称重，用于计算脏器指数（内脏重量/禁食后的体重）和脂肪指数（不同部位脂肪重量/禁食后的体重）。各组小鼠的脏器指数和脂肪指数如表2所示。从表2中看出HFHS组小鼠的肝脏、肾脏、脾脏、肾周脂肪、附睾脂肪系数显著高于Control组，但棕色脂肪重量各组间无显著差异。经过干预后，BLFM组小鼠的肝脏和附睾脂肪显著降低，其余器官组织较HFHS组呈现降低趋势，但没有显著性。而且，BLFM对脂肪系数的降低效果要优于LGGFM。
a 值表示平均值± 标准差，n=10。 连续没有共同字母的均值不同，P < 0.05
在实验进行到第12周末进行口服葡萄糖耐量实验，在测OGTT实验之前，将小鼠过夜禁食，然后称重按照2g/Kg体重灌胃小鼠20%葡萄糖溶液，测定灌胃后0min、30min、60min、90min、120min时的空腹血糖值并计算曲线下面积（AUC）。实验结果如图3B所示，饲喂到12周末的时候进行了口服糖耐量试验。与Control组小鼠比较，HFHS组小鼠空腹血糖、葡萄糖耐量曲线下面积(AUC)显著升高，表明HFHS组小鼠出现严重的葡萄糖耐受不良和血脂异常，补充LGGFM和BLFM的小鼠，其葡萄糖耐量得到明显改善。特别地，* p <0.05，** p <0.01，***p <0.001, **** p <0.0001。
在实验的最后一天，使用血糖仪检测小鼠的空腹血糖。收集到的全血室温下凝固两小时，并在4℃和3500×g离心15min以收集上清。血清保存在-80℃中。血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST和ALT的水平使用BS-480试剂在迈瑞BS-480全自动生化分析仪检测。血清中胰岛素、瘦素的含量均使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定。胰岛素抵抗指数采用HOMA-IR=空腹血糖（mmol/L）× 空腹胰岛素（mIU/mL）/22.5表示。
实验结果如图3所示，与Control组小鼠比较，HFHS组小鼠空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR指数、血清中LDL-C、TG、TC浓度显著升高（图3A、C、D、F-H）。表明HFHS组小鼠出现严重的葡萄糖耐受不良和血脂异常。相比之下，补充LGGFM和BLFM的小鼠，其代谢参数得到明显改善。经LGGFM和BLFM干预后，与HFHS组相比， BLFM组小鼠血清中LDL-C、TC浓度显著降低（图3F、G），HDL-C浓度显著上升（图3E）， TG含量有下降趋势但无显著性（图3H）。此外，OGTT的AUC降低，表明葡萄糖耐受性得到显著改善。ALT和AST是反应肝脏毒性的生物标志物，与Control组相比，HFHS组血清中ALT和AST明显升高。饮食中补充LGGFM和BLFM的小鼠血清中ALT和AST显著降低，并且BLFM降低更明显（图4E和F）。表明补充BLFM能有效改善HFHS引起的肝损伤。其中LGGFM和BLFM改善糖脂代谢指标之间无显著性差异。总的来说，BLFM具有和LGGFM在改善糖脂代谢紊乱上具有相同的效果。特别地，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001, **** p <0.0001。
解剖小鼠后，取小鼠肝脏、附睾脂肪、棕色脂肪、结肠组织，用10%的福尔马林溶液固定并包埋在石蜡中，然后对样本进行切片（3mm厚）并用苏木精和伊红进行染色。在显微镜下观察病理变化，采用ScopeImage 9.0软件，拍摄组织学图像。H&E染色图像如图4所示，高脂高糖饮食不仅导致小鼠出现糖脂代谢紊乱症状，还导致肝脏脂肪变性。HFHF组小鼠的肝脏出现明显的脂质变性，脂质空泡化，而LGGFM和BLFM干预后脂滴的大小和数量明显小于HFHS组（图4A）。此外，通过对小鼠的附睾脂肪和棕色脂肪进行组织病理学分析，在同一倍数下观察，HFHS组小鼠的附睾脂肪和棕色脂肪组织中脂滴大小明显大于Control，经过LGGFM和BLFM干预后小鼠的脂肪组织具有更小的脂滴（图4B和C）。血浆瘦素水平与体脂肪量高度相关，瘦素抵抗则是循环瘦素水平升高以及敏感性降低，从而增强肥胖的易感性。补充LGGFM和BLFM显著降低HFHS饮食引起的小鼠肥胖产生的瘦素抵抗（图4G）。特别地，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001, **** p <0.0001。
此外，对小鼠结肠的组织状态进行观察和检测ZO-1、Claudin-1以评价肠粘膜的完整性。在H&E染色的结肠图4D中在HFHS组中肠绒毛稀疏且腺体减少，表明HFHS会导致小鼠结肠损伤。而LGGFM和BLFM干预后肠绒毛致密且腺体明显增加,与Control相似。取一定重量的结肠样本，按照体重体积比1：9（g/mL）加入生理盐水放进研磨机中（45s，60Hz，2）进行低温研磨，并在4℃和13000xg离心15min收集上清。采用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定结肠组织上清中的ZO-1和Claudin-1的含量。ELISA结果显示HFHS组结肠ZO-1、Claudin-1明显较Control组降低，破坏了肠粘膜屏障的完整性。与HFHS组相比，干预后ZO-1和Claudin-1显著增加。因此BLFM干预显著改善有高脂高糖饮食引起的粘膜通透性增加（图4H和I）。这些结果表明BLFM可以通过调节紧密连接蛋白来恢复被HFHS破坏的肠粘膜屏障完整性。特别地，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001, **** p <0.0001。
实施例5 长双歧杆菌070103的特异性分子靶标挖掘及其验证
长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103的特异性分子靶标挖掘
采用Prokka（v1.11）、Roary（v3.11.2）软件对长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103及NCBI数据库内其他65株长双歧杆菌进行泛基因组分析。获得核心基因组后，采用Gubbins（v2.4.1）软件识别包含碱基取代密度较高的基因。基于泛基因组分析获得的长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103有别于其它长双歧杆菌的特异序列SEQ IDNo.2。根据长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103菌株特有的基因片段序列SEQ IDNO.2设计特异性PCR扩增引物组：5’- AGCCCTGAAAGAAACAACCAC -3’和反向引物：5’-CCTGGTTCGACCAGATGAATA -3’，引物组序列如下表3。
特有的核苷酸序列SEQ ID NO.2为： GTGCCCGGCATCGCCTTGGCCGAAGACCCGATGCCCAACATCCGAGCCCTGAAAGAAACAACCACCTCCGGTCTGATGCTCTCCCCAGGCTTCGGCGGAGGCACCGCGAACATCGAATACCAGTCCCTAACCGGACTGGACCTTGCCTTGTTCGACGATTCGATGCAATCCATGTATCAAGAGCTCGTGCCACACCAGAAGAACCCGTTCTCGTGGAACCAAATCTGGAACGCCGAATACGACAAGACCGGTTCCACCGCATTCCACTCGTACTACAAGAACATGTATCTGCGCGACGCAAACTACAAGAAGTTCGGGTTCAACAAGTTCTACACGCTAGACAGCAAGCCAGCGATCACGCATCAAGACAGAACCGACAATTCTCCGTACGTCAATGATGCGGCTTCCTACCAGAACATCATCGATCAGCTGAACACGGAGGAACACCCTCAGTTCCTGCAGCTCGTCACCATGCAGAATCACATGACCTATGACAACTGGTATTTCAACAACCAGTTTGACCAGGCAAATGTCACAGAAAACCTGAACGATTACGAACGCGGACAAATCAATACCTATGCAAAGGGCGTGAGCATCACCGATCAGGCAACAATCGACTTCCTGAACCAGCTGAATGCCATGGACAAACCCATAACCGTGATTTTCTACGGAGACCACCTGCCCAGTTCCTATCAGACCGCCGCGGAAGACAAGAACAACACACTTGCTCTGCATCAAACCGACTATTCATCTGGTCGAACCAGGCTTCAGCATCGGCCGGAGTCAAGCTGGACGCCAGTGCCACCGCCTACACTTCTCCGAATTACTTCATGGAAATGGCCGCCGAACACATGA
2、长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103特异性分子识别靶标的有效性验证
采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）及琼脂糖电泳验证长双歧杆菌070103的特异性分子靶标序列的有效性。检测模板为细菌的DNA，DNA提取按照美吉DNA提取试剂盒说明书操作。
PCR反应体系配置如下：
以下为PCR反应条件：
PCR结束后取5μl PCR产物进行1.0%琼脂糖电泳。若长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103能在721bp处出现单一特异条带，而其他非目标菌不能在721bp处出现条带，则说明该对靶标具有良好识别长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103的效能。
PCR扩增产物凝胶结果如图5所示，M为DL2000 DNA标准marker，+为目标长双歧杆菌070103， -为阴性对照组（对照组的模板为不含基因组的水溶液）。1-52为非目标长双歧杆菌
如图5所示，除目标菌株长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103的DNA经引物扩增后在721bp处形成的特异性扩增产物外，其余长双歧杆菌和其他种属菌株均未见特异扩增产物形成。结果证明PCR扩增引物是长双歧杆菌Bifidobacterium longum 070103特异性分子靶标。
所用菌株及检测结果如下表4所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
实施例6基于靶标长双歧杆菌0070103的实时荧光定量PCR测定
对经10倍稀释的不同拷贝数的DNA进行实时荧光定量测定，长双歧杆菌0070103进行实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μl，其中包括：2×SYBR qPCR SuperMix Plus 10μL，正向引物和反向引物如表5所示各0.6μL、DNA模板1μL和无菌双蒸水7.8μL。长双歧杆菌0070103进行实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性20s，60℃退火60s，2-3步共45个循环。得到长双歧杆菌0070103的扩增的荧光阈值（Cq值），以拷贝数为横坐标，Cq值为纵坐标制作标准曲线。检测结果如图6所示，标准曲线的相关系数R2>0.99，同时溶解曲线如图7所示呈单峰，表明扩增条件及引物特异性适宜，该方法可用于长双歧杆菌0070103的定量测定。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明技术方案的实质和范围，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东环凯生物科技有限公司
广东科环生物科技有限公司
<120> 具有靶向葡萄糖激酶显著降血糖和降血脂功效的长双歧杆菌070103及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1523
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌070103(Bifidobacterium longum)
<400> 1
gtggagggtt cgattctggc tcaggatgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc 60
gaacgggatc catcaggctt tgcttggtgg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg 120
accgacctgc cccatacacc ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatgc cggatgctcc 180
agttgatcgc atggtcttct gggaaagctt tcgcggtatg ggatggggtc gcgtcctatc 240
agcttgacgg cggggtaacg gcccaccgtg gcttcgacgg gtagccggcc tgagagggcg 300
accggccaca ttgggactga gatacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 360
attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgga ggccttcggg 420
ttgtaaacct cttttatcgg ggagcaagcg agagtgagtt tacccgttga ataagcaccg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttatc cggaattatt 540
gggcgtaaag ggctcgtagg cggttcgtcg cgtccggtgt gaaagtccat cgcttaacgg 600
tggatccgcg ccgggtacgg gcgggcttga gtgcggtagg ggagactgga attcccggtg 660
taacggtgga atgtgtagat atcgggaaga acaccaatgg cgaaggcagg tctctgggcc 720
gttactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780
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aacgcgttaa gcatcccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aagaaattga 900
cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta 960
cctgggcttg acatgttccc gacggtcgta gagatacggc ttcccttcgg ggcgggttca 1020
caggtggtgc atggtcgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc tcgccccgtg ttgccagcgg attatgccgg gaactcacgg gggaccgccg 1140
gggttaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcagatcatc atgcccctta cgtccagggc 1200
ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaacg ggatgcgacg cggcgacgcg gagcggatcc 1260
ctgaaaaccg gtctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa ggcggagtcg 1320
ctagtaatcg cgaatcagca acgtcgcggt gaatgcgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcaagtc atgaaagtgg gcagcacccg aagccggtgg cctaacccct tgtgggatgg 1440
agccgtctaa ggtgaggctc gtgattggga ctaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa 1500
ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1523
<210> 2
<211> 855
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌070103(Bifidobacterium longum)
<400> 2
gtgcccggca tcgccttggc cgaagacccg atgcccaaca tccgagccct gaaagaaaca 60
accacctccg gtctgatgct ctccccaggc ttcggcggag gcaccgcgaa catcgaatac 120
cagtccctaa ccggactgga ccttgccttg ttcgacgatt cgatgcaatc catgtatcaa 180
gagctcgtgc cacaccagaa gaacccgttc tcgtggaacc aaatctggaa cgccgaatac 240
gacaagaccg gttccaccgc attccactcg tactacaaga acatgtatct gcgcgacgca 300
aactacaaga agttcgggtt caacaagttc tacacgctag acagcaagcc agcgatcacg 360
catcaagaca gaaccgacaa ttctccgtac gtcaatgatg cggcttccta ccagaacatc 420
atcgatcagc tgaacacgga ggaacaccct cagttcctgc agctcgtcac catgcagaat 480
cacatgacct atgacaactg gtatttcaac aaccagtttg accaggcaaa tgtcacagaa 540
aacctgaacg attacgaacg cggacaaatc aatacctatg caaagggcgt gagcatcacc 600
gatcaggcaa caatcgactt cctgaaccag ctgaatgcca tggacaaacc cataaccgtg 660
attttctacg gagaccacct gcccagttcc tatcagaccg ccgcggaaga caagaacaac 720
acacttgctc tgcatcaaac cgactattca tctggtcgaa ccaggcttca gcatcggccg 780
gagtcaagct ggacgccagt gccaccgcct acacttctcc gaattacttc atggaaatgg 840
ccgccgaaca catga 855
Claims (9)
1.长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）070103，保藏编号为GDMCC NO：62526。
2.权利要求1所述的长双歧杆菌070103在制备发酵乳制品中的应用。
3.一种长双歧杆菌发酵乳制品，其特征在于，由权利要求1所述的长双歧杆菌070103发酵制备获得。
4.一种长双歧杆菌发酵乳制品的制备方法，其特征在于，是将权利要求1所述的长双歧杆菌070103接种到脱脂乳进行发酵处理。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的脱脂乳是将脱脂乳粉与水混匀，灭菌制得。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，是将长双歧杆菌070103菌液按体积比5%的比例接种到脱脂乳中发酵制得。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵处理为厌氧发酵处理。
8. 靶标核苷酸序列在特异识别权利要求1所述的长双歧杆菌070103中的应用，所述的靶标核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.长双歧杆菌070103的特异性扩增引物在特异识别权利要求1所述的长双歧杆菌070103中的应用，其特征在于，所述的长双歧杆菌070103的特异性扩增引物包括正向引物5’-AGCCCTGAAAGAAACAACCAC-3’和反向引物5’-CCTGGTTCGACCAGATGAATA-3’。
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