CN107475160B - 具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用，通过体外抑制活性、益生特性测定和主成分分析筛选得到一株具有双重降糖靶点且抑制活力较高的植物乳杆菌ST‑2，其CFS提取物对α‑葡萄糖苷酶活性的抑制率为13.442％；对二肽基肽酶‑IV活性的抑制率为21.525％。实验表明ST‑2对于不同来源的α‑葡萄糖苷酶、二肽基肽酶‑IV具有一定抑制活力；还能够显著降低Ⅱ型糖尿病鼠的羰基化血红蛋白值，因此对于延缓糖尿病人餐后碳水化合物的吸收及降低餐后血糖上升具有极大应用价值。把ST‑2制成活菌数高的冻干菌粉，活菌数高达冻干前的89％，另，ST‑2还具有良好的发酵效果。将其应用于乳制品生产或作为食品配料添加至功能性食品中，对于糖尿病、肥胖能够起到良好的预防及干预效果。

Description

具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足(I型)或胰岛素抵抗(II型)引起的一种代谢紊乱性疾病，其特点是慢性高血糖症。目前糖尿病已成为一种主要的疾病，对人类的生活和健康造成了巨大的损害。根据世界卫生组织的数据显示，至2017年，中国糖尿病的患病率已居世界首位，人数约1.1亿，约占中国成年人总数的十分之一。依照现有趋势，到2040年，我国患者将超过1.5亿，糖尿病死亡率将大于艾滋病、结核病和疟疾死亡率的总和。因此针对糖尿病的药物及功能性食品成为了当前研究的热点。
糖尿病人的日常饮食管理对于糖尿病人的血糖控制和生存质量至关重要。控制餐后高血糖对于治疗早期糖尿病具有极其重要的意义,其中控制餐后碳水化合物的吸收是一种降低餐后高血糖的有效治疗方法。食物中的碳水化合物在肠道内主要以单糖的形式被吸收。人体摄入的淀粉等多糖物质被唾液和胰α-淀粉酶降解生成寡糖及二糖后，还需要在肠道粘膜α-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成葡萄糖后才能被吸收。因此，α-葡萄糖苷酶的抑制成为餐后血糖控制以及药物筛选的一个有效靶点。除此以外，人体中还存在着两种内源性肠促胰岛激素：促胰岛素释放多肽(GIP)和胰高血糖素样肽(GLP-1)。它们可以促进胰岛素的分泌，维持血糖平衡。其中GLP-1易被血液中存在二肽基肽酶-IV(DPP-IV)迅速降解。因此，DPP-IV的抑制成为促进胰岛素分泌，维持血糖平衡的一个重要靶点。目前针对这些靶点筛选的抑制剂一般只具有单个靶点的抑制功能，同时具有双重抑制靶点的抑制剂较为少见。
益生菌(probiotics)是一类对人和动物等宿主有益的微生物。益生菌具有多种保健作用：1.能维持微生态平衡和肠管机能；2.有抗菌作用；3.能改善肝功能；4.益生菌能使肠道减少对胆固醇的吸收，并能将一部分胆固醇转变成胆酸盐排出体外；5.增强免疫功能和抗肿瘤病。目前大量研究表明，益生菌具有减少糖尿病发病率的潜力，但是人们对于益生菌作为糖尿病治疗剂的研究还是很少。尤其对于具有双重靶点抑制能力益生菌报道就更为少见。而且益生菌类的制剂在被人或动物食用后，只有在大量活菌顺利抵达、黏附并成功定植于回肠和结肠部位时，才能对宿主发挥益生作用。在这一消化过程中，口腔中的环境，胃部的低pH值环境及胃液中胃蛋白酶等抗菌物质就成为阻碍益生菌进入肠道的第一道天然屏障。因此，菌体细胞对胃肠道环境具有较高的耐受性对于发挥益生作用至关重要。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，该菌具有显著的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，以及体外抑制二肽基肽酶-IV活性的能力，因而对降低血糖，以及提高胰岛素水平具有显著的效果。
本发明还有一个目的是提供一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的应用，通过将筛选出的植物乳杆菌作为食品配料添加至功能性食品中，能够对糖尿病人的日常饮食起到良好的干预效果。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.14572；保藏日期为：2017年8月29日；分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法，主要包括以下步骤：
步骤1、对各菌株分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定，从而筛选出对α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV均具有较高抑制率的菌株；
步骤2、对步骤1筛选出的菌株做16S-rDNA基因测序，以确定菌种；
步骤3、对已确定菌种的菌株进行益生特性测定，并筛选出益生特性最好的菌株，即得所述具有双重降糖靶点的植物乳杆菌；
其中，所述益生特性测定包括：耐酸性试验、耐胆盐试验、对模拟口腔和胃肠道的耐受性、体外模拟益生菌的消化试验和对HT-29细胞的黏附性。
优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述步骤1前，需要对各菌株的细胞代谢物和细胞内容物进行提取，然后用所述细胞代谢物和细胞内容物分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定。
优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述细胞代谢物和细胞内容物的提取方法分别为：
细胞代谢物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，于35-40℃孵育10-15h，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，并在0.2-0.3μm水系微滤膜中过滤，即得所述细胞代谢物；
细胞内容物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，进行超声破碎，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，并在0.2-0.3μm水系微滤膜中过滤，即得所述细胞内容物。
优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.1M，pH值为6.8。
优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，所述超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200W，以破碎3-5s的脉冲破碎10-15min。
优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，步骤1中对α-葡萄糖苷酶的抑制测定主要包括以下步骤：
步骤1-1、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL的p-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷PNPG，20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，于37℃培养8-12min，再加入0.01U/mL的α-葡萄糖苷酶50μL，在37℃反应10-20min，最后加入100μL的0.1M的碳酸钠溶液终止反应，用酶标仪于405nm处测反应液的吸光值；
步骤1-2、用阿卡波糖做阳性对照，浓度为0.1M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照；
步骤1-3、计算相对抑制率，筛选出对α-葡萄糖苷酶的抑制活性较高的菌株。
优选的是，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法中，步骤1中对二肽基肽酶-IV的抑制测定主要包括以下步骤：
步骤2-1、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，45-55μL缓冲液，0.5-1.5μL酶，于37℃避光培养8-12min，再加入45-55μL缓冲液，1-3μL物质，用酶标仪37℃反应1-30min，在405nm处每分钟测一次反应液的吸光值；
步骤2-2、用西格列汀做阳性对照，浓度为0.1M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照；
步骤2-3、计算相对抑制率，筛选出对二肽基肽酶-IV的抑制活性较高的菌株。
一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌在制备降糖功能性食品中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过对实验室保藏的益生菌进行了α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV抑制作用的双重筛选，筛选出同时具有两种抑制特性的益生菌；在此基础上，又充分模拟人体的消化环境对筛选的菌株进行评估，如耐酸性，细胞黏附性，对胆盐、模拟唾液、模拟胃液、模拟肠液的耐受性；最后通过对各项参数的分析筛选出一株具有α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV双重抑制作用的植物乳杆菌，且能保证该植物乳杆菌能很好的在体内生存，因而可用于制备降糖功能性食品的开发，具有很好的市场前景，同时，还兼具益生菌的诸多优点，在延缓餐后血糖的同时，还发挥益生菌功能，增加人体有益菌的摄入。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明所述的益生菌的耐酸性图；
图3为本发明所述的益生菌对胆盐的耐受性图；
图4为本发明所述的益生菌在模拟唾液中的耐受性图；
图5为本发明所述的益生菌在模拟胃液中的耐受性图；
图6为本发明所述的益生菌在模拟肠液中的耐受性图；
图7为本发明所述的益生菌经模拟唾液、胃液、肠液消化后的存活率图；
图8为本发明所述的益生菌对HT-29细胞的黏附性图；
图9为本发明所述的碎石图；
图10为本发明所述的因子载荷图；
图11为本发明所述的因子得分图；
图12为本发明所述的植物乳杆菌ST-2分别对不同来源的a-葡萄糖糖苷酶和二肽激肽酶的抑制作用图；
图13为本发明所述的实验3中小鼠饲喂13周后每组的空腹血糖值图；
图14为本发明所述的实验3中小鼠饲喂13周后每组的糖基化血红蛋白值图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.14572；保藏日期为：2017年8月29日；分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在上述方案中，本发明在实验室益生菌库内筛选出一株具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，在实验室内命名为ST-2，其具有对α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的双重抑制作用，并且对人体内部环境具有良好的耐受能力，因而可用于制备具有降糖功能的食品和辅助降糖用品的开发，具有很好的市场前景。
一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的筛选方法，其中，主要包括以下步骤：
步骤1、对各菌株分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定，从而筛选出对α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV均具有较高抑制率的菌株；
步骤2、对步骤1筛选出的菌株做16S-rDNA基因测序，以确定菌种；
步骤3、对已确定菌种的菌株进行益生特性测定，并筛选出益生特性最好的菌株，即得所述具有双重降糖靶点的植物乳杆菌；
其中，所述益生特性测定包括：耐酸性试验、耐胆盐试验、对模拟口腔和胃肠道的耐受性、体外模拟益生菌的消化试验和对HT-29细胞的黏附性。
一个优选方案中，所述步骤1前，需要对各菌株的细胞代谢物和细胞内容物进行提取，然后用所述细胞代谢物和细胞内容物分别进行α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的抑制活性的测定。
一个优选方案中，所述细胞代谢物和细胞内容物的提取方法分别为：
细胞代谢物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，于35-40℃孵育10-15h，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，并在0.2-0.3μm水系微滤膜中过滤，即得所述细胞代谢物。
细胞内容物的提取方法：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，进行超声破碎，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，并在0.2-0.3μm水系微滤膜中过滤，即得所述细胞内容物。
一个优选方案中，所述磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.1M，pH值为6.8。
一个优选方案中，所述超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200W，以破碎3-5s的脉冲破碎10-15min。
一个优选方案中，步骤1中对α-葡萄糖苷酶的抑制测定主要包括以下步骤：
步骤1-1、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL的p-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷PNPG，20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，于37℃培养8-12min，再加入0.01U/mL的α-葡萄糖苷酶50μL，在37℃反应10-20min，最后加入100μL的0.1M的碳酸钠溶液终止反应，用酶标仪于405nm处测反应液的吸光值。
步骤1-2、用阿卡波糖做阳性对照，浓度为0.1M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照。
步骤1-3、计算相对抑制率，筛选出对α-葡萄糖苷酶的抑制活性较高的菌株。
一个优选方案中，步骤1中对二肽基肽酶-IV的抑制测定主要包括以下步骤：
步骤2-1、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，45-55μL缓冲液，0.5-1.5μL酶，于37℃避光培养8-12min，再加入45-55μL缓冲液，1-3μL物质，用酶标仪37℃反应1-30min，在405nm处每分钟测一次反应液的吸光值。
步骤2-2、用西格列汀做阳性对照，浓度为0.1M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照。
步骤2-3、计算相对抑制率，筛选出对二肽基肽酶-IV的抑制活性较高的菌株。
在上述方案中，所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌的具体筛选方法为：
1、菌种的活化及其菌落总数的测定
将冻存于-80℃的77株甘油管乳酸菌接入MRS肉汤培养基中，于37℃恒温培养18h，活化三代后用于后续试验。
将活化好的菌株以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养18h，收集菌液，根据GB4789.2—2010进行菌株菌落总数的测定，将菌液浓度调节为1×109cfu/mL。
2、样品的制备
(1)细胞代谢物CFS(cell-free excretory supernatant)的制备
益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体。将收集到的菌体用无菌浓度为0.1M，pH值6.8的磷酸缓冲盐溶液PBS洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，于35-40℃孵育10-15h，在4℃下12000r/min，离心12-20min，收集上清液，以0.2-0.3μm水系微滤膜过滤得到CFS，-80℃保存。
其中，通过大量试验发现，选择益生菌培养18h后，在4℃下12000r/min，离心15min收集菌体。将收集到的菌体用无菌浓度为0.1M，pH值6.8的磷酸缓冲盐溶液PBS洗涤3次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，于37℃孵育12h，在4℃下12000r/min，离心15min，收集上清液，以0.22μm水系微滤膜过滤得到的CFS其纯度最好。
(2)细胞内容物CFE(cell-free intracellular extract)的制备
益生菌于MRS培养基中37℃静置培养15-20h后，在4℃下12000r/min，离心12-20min收集菌体。将收集到的菌体用无菌浓度为0.1M，pH值6.8的磷酸缓冲盐溶液PBS洗涤2-4次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，进行超声破碎。超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200W，以3-5s(工作3s，停5s)的脉冲破碎10-15min，将超声后得到的液体于4℃，12000r/min，离心12-20min，收集上清液，以0.2-0.3μm水系微滤膜过滤得到CFE，-80℃保存。
其中，通过大量试验发现，选择益生菌培养18h后，在4℃下12000r/min，离心15min收集菌体。将收集到的菌体用无菌浓度为0.1M，pH值6.8的磷酸缓冲盐溶液PBS洗涤3次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，进行超声破碎。超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200W，以3-5s(工作3s，停5s)的脉冲破碎12min，将超声后得到的液体在4℃下12000r/min，离心15min，收集上清液，以0.22μm水系微滤膜过滤得到的CFE其纯度最好。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
取96孔酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL 20mM的PNPG及20-30μLCFS或CFE，于37℃培养8-12min，再加入0.01U/mL的α-葡萄糖苷酶50μL，37℃反应10-20min，最后加入100μL的0.1M的碳酸钠溶液终止反应，用酶标仪于405nm处测反应液的吸光值。用阿卡波糖做阳性对照，计算公式如下(α-glucosidase inhibitory rate简写为α-GIR)：
Figure GDA0001445163370000081
A：含有酶不含样品，样品用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
B：不含酶不含样品，二者用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
C：含有酶含有样品
D：不含酶含有样品，酶用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
计算得到α-葡萄糖苷酶的抑制活性的筛选结果，如下表1所示：
表1抑制α-葡萄糖苷酶的活性结果
Figure GDA0001445163370000082
Figure GDA0001445163370000091
注：表中ND表示没有检测到抑制作用(dot detected)
结果表明，表1中的13株益生菌的CFS均表现出对α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用，抑制率可以达到2.530％～15.758％。其中，阳性对照组阿卡波糖的抑制率最高，为26.75％。且77株益生菌的CFE对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用。根据表中的抑制率结果，选出菌株GS-3、BB13、ST-2、1.1881进行体内模拟环境的耐受性研究。
4、DPP-IV抑制活性的测定
步骤2-1、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，45-55μL缓冲液，0.5-1.5μL酶，于37℃避光培养8-12min，再加入45-55μL缓冲液，1-3μL物质，用酶标仪37℃反应1-30min，在405nm处每分钟测一次反应液的吸光值；
步骤2-2、用西格列汀做阳性对照，浓度为0.1M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照；
步骤2-3、计算相对抑制率，筛选出对二肽基肽酶-IV的抑制活性较高的菌株。
(2)抑制率的计算公式：
每次测定时都要做空白样本，用样品组的斜率减去空白组的斜率，使用校正后的数值去计算相对抑制率。
％相对抑制率
斜率＝(FLU2-FLU1)/(T2-T1)
Figure GDA0001445163370000092
Slope SM：Sample Inhibitor的斜率
Slope EC：Enzyme Control的斜率
计算得到二肽基肽酶-IV的抑制活性的筛选结果，如下表2所示：
表2抑制二肽基肽酶-IV的结果
Figure GDA0001445163370000093
Figure GDA0001445163370000101
注：表中ND表示没有检测到抑制作用(dot detected)
结果表明，表2中14株益生菌均表现出对二肽基肽酶-IV的活性有抑制作用，抑制率可以达到5.669％-27.113％。其中，阳性对照组西格列汀的抑制率最高，半数抑制率为44.195％；仅菌株1.6970的CFE有DPP-IV抑制作用，且抑制率很高，为17.789％；菌株5、ST-2、1.1881抑制率较高，分别为27.113％、21.525％、14.632％。根据表1和表2中的抑制率结果，选出菌株ST-2、1.1881、BB13三株同时具有两种抑制特性的菌株进行体内模拟环境的耐受性研究。
5、16S-rDNA基因测序
将筛选得到的菌株按4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h。取2mL菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组。用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测分析DNA的纯度及浓度，用细菌16SrDNA扩增通用引物27F和1492R进行PCR扩增，所述通用引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物进行检测。最后将扩增出的产物交北京华大基因研究中心完成测序。
(1)扩增反应体系
Figure GDA0001445163370000111
(2)反应条件
Figure GDA0001445163370000112
35个循环，最后72℃延伸10min，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳所得结果如图1所示，从左至右依次为ST-2、BB13和1.1881。(Marker条带组成自下而上分别为：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp，电泳方向从上向下)得到菌株的鉴定结果如下表3所示。
表3菌株鉴定结果
Figure GDA0001445163370000113
结果表明，筛选得到的3株菌株分别属于干酪乳杆菌和植物乳杆菌。
6、益生特性的测定
(1)益生菌的耐酸性试验
将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH值分别为2.0，3.0，7.0的MRS肉汤培养基中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃孵育3h，收集菌液，根据GB4789.2-2010进行活菌计数。耐受性的计算公式如下：
Survival rate(％)＝(logN1/log N0)×100
N1：经过耐受处理条件下的活菌数
N0：pH＝6.4(正常)MRS肉汤培养基中的活菌数
如图2所示，结果表明菌株编号为ST-2、1.1881和BB13的菌株在pH3.0的酸性条件下培养3h后，均表现出了很高的存活率，分别为96.75％、108.69％、96.93％，存活率均大于95％，其中1.1881的存活率大于100％。在pH2.0的条件下，ST-2、BB13存活率很高，达到了70％，其中菌株ST-2的存活率最高，达到了75.97％，而菌株1.1881在pH2.0的条件下存活率很低，仅为6.19％，对酸极为敏感。
(2)益生菌对胆盐的耐受性
将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH8.0、含2％胆盐的无菌去离子水中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃孵育24h，收集菌液，根据GB4789.2-2010进行活菌计数。计算公式同6(1)。
如图3所示，结果表明菌株编号为ST-2、1.1881和BB13的菌株在含2％胆盐的去离子水中培养24h后，生长状况良好，且存活率很高，分别为80.65％、49.09％、77.14％，其中菌株ST-2、BB13的存活率较高，能达到75％以上，编号1.1881的菌株存活最低，但存活率基本上还能达到50％。总体上这3株菌对胆盐菌有很好的耐受性。
(3)益生菌在人工模拟唾液、胃液、肠液中的生长测定
参考Versantvoort等的方法配制模拟消化液，充分模拟人体口腔，胃肠道中的消化环境。
将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体分别重悬于人工模拟的唾液(pH 7.0)、胃液(pH 2.0)、肠液(pH 8.0)中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃各环境分别孵育5min、3h、24h，收集菌液，根据GB4789.2-2010进行活菌计数。计算公式同6(1)。
如图4所示，结果表明菌株编号为ST-2、1.1881和BB13的菌株在模拟唾液中的生长状况良好。以pH＝7.0的MRS肉汤培养基中的活菌数为对照时，存活率均达到了94％以上；以pH＝6.4(正常)的MRS肉汤培养基中的活菌数为对照时，存活率均达到了97％以上，菌株ST-2的存活率超过了100％。
如图5所示，结果表明菌株编号为ST-2、1.1881、BB13的菌株在模拟胃液中生长情况不一，其中，菌株ST-2存活率较高，为76.65％；菌株1.1881、BB13的存活率较低，分别为47.32％和52.49％，基本能达到50％左右。
如图6所示，结果表明菌株编号为ST-2、1.1881和BB13的菌株在模拟肠液中的生长状况良好，其中菌株1.1881、BB13的存活率均大于90％，菌株ST-2的存活率较低，为74.68％。
(4)体外模拟益生菌的消化试验
将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH7.0的模拟唾液中，调节菌液浓度至为1×109cfu/mL，于37℃孵育5min，4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体；将收集到的菌体继续重悬于pH2.0的模拟胃液中，于37℃孵育3h，4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体；最后再将收集的菌体重悬于pH8.0的模拟肠液中，于37℃孵育24h，收集菌液，根据GB4789.2-2010进行活菌计数。计算公式同6(1)。
如图7所示，结果表明菌株编号为ST-2、1.1881和BB13的菌株在经过模拟唾液、胃液、肠液消化后生长状况良好，存活率分别为90.13％、88.62％、88.27％，基本达到了90％左右。
(5)益生菌对HT-29细胞的黏附性
5-1、cFDA-SE对益生菌的荧光标记
用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)配制1mmol/L cFDA-SE的贮备液(称5.0mg cFDA-SE溶解于8.969mL的DMSO试剂中)，0.22μm水系微滤膜过滤除菌，-20℃储存备用。
将筛选得到的益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养18h，在4℃的条件下3000×g离心5min，弃上清液，收集菌体。将收集到的菌体用无菌PBS洗3次，重悬于PBS溶液中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。加入cFDA-SE贮液(1mmol/L)至终浓度为20μmol/L，于37℃避光静置20min，4℃离心(5000×g，10min)，弃上清液，收集菌体。再用PBS洗3次，将菌体重悬于PBS溶液中，于488nm的激发波长下进行流式细胞检测，分析cFDA-SE的标记率，如下表4所示。
表4流式细胞仪检测cFDA-SE对益生菌的标记率
Figure GDA0001445163370000141
结果表明，cFDA-SE对这3株菌的标记率都很高，标记率均大于85％，其中菌株1.1881的标记率最高，为89.60％。
5-2、HT-29细胞的培养
将HT-29细胞进行复苏后，按照1∶3的比例进行传代，传至新的培养瓶中，观察细胞生长状态。每1-2d换液一次，待细胞汇合度长至90％左右，吸弃培养液，用PBS洗3次，加入1mL 0.25％胰酶，于37℃，5％CO2恒温培养箱中消化2min，吸弃胰酶，加入培养液终止消化，进行细胞计数，调整细胞数至1×105cells/mL，进行铺板，观察细胞生长状态，待培养板中细胞汇合度长至90％-100％时即可进行细菌黏附试验。
5-3、益生菌对HT-29细胞的黏附性试验
将在24孔板中培养好的HT-29细胞，用PBS洗3次，分别加入500μL的PBS，cFDA-SE标记的益生菌菌悬液；对照组为空白孔+500μL cFDA-SE标记的益生菌菌悬液。于37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，用无菌PBS洗3次，每孔加入350μL 0.25％胰酶，于CO2培养箱中消化10min，待细胞与培养板底部完全脱落，加入150μL细胞培养液终止消化，混匀，取出100μL悬液转入96孔板中，用锡箔纸包好，测其荧光强度。荧光检测条件：激发波长为485nm，发射波长为530nm。黏附率的计算公式如下：
细胞黏附率％＝(A-A0)/(A1-A0)×100％
式中：A：HT-29细胞+cFDA-SE标记的细菌菌悬液；
A0：HT-29细胞+PBS；
A1：cFDA-SE标记的细菌菌悬液。
如图8所示，结果表明菌株编号为ST-2、1.1881和BB13的菌株对HT-29细胞的黏附率各不相同。黏附率范围为1.93％-16.34％，其中菌株ST-2和1.1881的黏附率明显高于菌株BB13，分别为16.34％和12.31％，而菌株BB13的黏附率很低，未达到2.0％。
(6)、主成分分析
筛选出同时具有α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV抑制活性的菌株，对筛选菌株的α-葡萄糖苷酶抑制活性，二肽基肽酶-IV抑制活性，耐酸性，胆盐耐受性，细胞黏附性及模拟胃肠液的耐受性等指标用SPSS17.0软件进行主成分分析，筛选出可以很好地在体内发挥降糖作用的菌株。
如图9所示，结果表明图中一共有9个特征值，其中有2个特征值的数值大于1，故可以将分析的特性指标简化为2个主成分，并将2个主成分通过总方差进行分析，如下表5所示。
表5解释的总方差
Figure GDA0001445163370000151
结果表明，第1主成分的方差贡献率为64.332％，第2主成分的方差贡献率为35.668％。第一主成分和第二主成分的累计贡献率达到了100％。说明进行分析的9个特性可以简化为两个主成分，可以解释所有特性的100％。
对2个主成分进行成分矩阵分析，结果如下表6所示。
表6成分矩阵
Figure GDA0001445163370000152
如图10所示，结果表明第1主成分可以解释6个特性：其成分载荷分别为二肽基肽酶-IV抑制率0.999、模拟唾液耐受性0.987、模拟肠液液的耐受性0.952、细胞黏附性0.916、胃肠道转运性0.894、模拟胃液的耐受性0.865；第2主成分主要解释3个特性：耐酸性0.974、胆盐的耐受性0.965，α-葡萄糖苷酶抑制率0.911。
对2个主成分进行因子得分分析，结果如下表7所示。
表7因子得分表
Figure GDA0001445163370000161
如图11所示，结果表明菌株ST-2的综合得分最高，为84.04，明显高于其他两种菌株，菌株1.1881的综合得分最低。因此，ST-2可作为潜在的降糖益生菌株。
综上，得到植物乳杆菌ST-2的特性汇总，如下表8所示：
表8植物乳杆菌ST-2特性汇总
Figure GDA0001445163370000162
一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌在制备降糖功能性食品中的应用。
在上述方案中，本发明在实验室益生菌库内筛选出一株具有对α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的双重抑制作用的菌种，并且对人体内部环境具有良好的耐受能力，因而可用于制备具有降糖功能的食品和降糖辅助用品的开发，能对糖尿病起到良好的控制和治疗效果，具有很好的市场前景。
实验数据1
将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中进行大批量发酵，于37℃培养18h，取出少量培养好的菌液进行镜检，确定无杂菌污染后，再将培养好的菌液于4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。以10％脱脂乳，1.0％L-谷氨酸作为保护剂，将保护剂与细胞悬浮液的菌体按1∶2的比例混合，进行冻干。根据GB4789.2—2010对冻干号的菌粉进行活菌计数。结果表明，菌株ST-2冻干后活菌数为1.416×108cfu/mg，存活率达89％。为益生菌粉的生产奠定了良好的基础。
实验数据2
对不同来源的α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV利用本发明所述的干酪乳杆菌ST-2进行抑制实验，具体结果如图12所示。
其中，所用α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV的提取方法和测定方法具体如下：
小鼠肠道中酶的提取
清洁级雄性Balb/c小鼠，禁食12h后断头处死，取小肠上段30cm，用无菌的4℃PBS冲洗小肠后，剪碎，置于玻璃匀浆器中，加入约4倍体积的PBS在冰浴下进行研磨、匀浆，倒至离心管，4℃，4000r/min，离心20min，取其上清进行分装，并在-20℃储存。
小鼠肠道提取酶的蛋白含量的测定
根据BCA试剂盒的说明书测得小鼠肠道提取酶的蛋白含量为12.90mg/mL。
小鼠肠道提取酶中α-葡萄糖苷酶活性的测定
(1)标准曲线的制作
分别配制浓度为0U/mL，0.025U/mL，0.050U/mL，0.075U/mL，0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶于离心管中。
0U/mL为0.01M的PBS(pH＝6.8，含20％的牛血清蛋白)
取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG，25μL 0.1M PBS(pH6.8)，恒温金属浴37℃10min，加入上述配好的α-葡萄糖苷酶各50μL，37℃反应15min，加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复三次。以OD值大小表示PNP的生成量，以α-葡萄糖苷酶的浓度为横坐标作出标准曲线。
(2)酶活性的测定
取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG，25μL 0.1M PBS(pH6.8)，恒温金属浴37℃培养10min，加入α-葡萄糖苷酶50μL(小鼠肠道)，37℃反应15min，加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复3次。
结果表明，小鼠肠道提取酶中的α-葡萄糖苷酶活力为0.57U/mL。
小鼠肠道提取酶中二肽基肽酶-IV活性的测定
取酶标板，25μL 1.5mM Gly-Pro-pNA，25μL CFS(用0.1M pH 6.8PBS做空白对照)，恒温金属浴37℃培养10min，加入二肽基肽酶-IV 50μL(小鼠肠道)，37℃反应60min，加入100μL 1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复3次。
结果表明，小鼠肠道酶与底物有颜色反应，说明其中含有二肽基肽酶-IV，具体测定结果如下表9所示：
底物 酶/PBS 吸光值
Gly-Pro-pNA PBS 0.1486±0.0026
Gly-Pro-pNA 小鼠肠道提取酶 0.2066±0.0164
猪小肠中酶的提取
取新鲜猪小肠黏膜，用PBS(0.1M pH＝6.8)冲洗干净，沿纵轴切开，用载玻片刮取其黏膜层基质，添加同等体积的PBS(0.1M pH＝6.8)用组织研磨机进行研磨，研磨条件：60HZ，40s。于4℃，14000g离心20min，收集上清并保存在-80℃。
猪小肠提取酶的蛋白含量的测定
根据BCA试剂盒的说明书测得猪小肠提取酶的蛋白含量为21.352mg/mL。
猪小肠提取酶中α-葡萄糖苷酶活性的测定
(1)标准曲线的制作
分别配制浓度为0U/mL，0.025U/mL，0.050U/mL，0.075U/mL，0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶于离心管中。
0U/mL为0.01M的PBS(pH＝6.8，含20％的牛血清蛋白)
取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG，25μL 0.1M PBS(pH6.8)，恒温金属浴37℃10min，加入上述配好的α-葡萄糖苷酶各50μL，37℃反应15min，加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复三次。以OD值大小表示PNP的生成量，以α-葡萄糖苷酶的浓度为横坐标作出标准曲线。
(2)酶活性的测定
取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG，25μL 0.1M PBS(pH6.8)，恒温金属浴37℃培养10min，加入α-葡萄糖苷酶50μL(猪小肠)，37℃反应15min，加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复3次。
结果表明，猪小肠提取酶稀释30倍后，其中α-葡萄糖苷酶的酶活力为0.039U/mL。
猪小肠提取酶中二肽基肽酶-IV活性的测定
取酶标板，25μL 1.5mM Gly-Pro-pNA，25μL CFS(用0.1M pH 6.8PBS做空白对照)，恒温金属浴37℃培养10min，加入二肽基肽酶-IV 50μL(猪小肠)，37℃反应60min，加入100μL 1M的醋酸钠缓冲液终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复3次。
结果表明，猪小肠提取酶在稀释30倍后与底物有颜色反应，说明其中含有二肽基肽酶-IV，具体测定结果如下表10所示：
底物 酶/PBS 吸光值
Gly-Pro-pNA PBS 0.0920±0.0131
Gly-Pro-pNA 猪小肠提取酶 0.4753±0.0091
Caco-2细胞中酶的提取
将培养至21d的Caco-2细胞的培养板置于冰上，细胞用PBS清洗2次，加入lysis缓冲液(100KIU/mL aprotinin和Triton X-100的PBS溶液)培养5min，将细胞轻轻吹打并移入离心管中进行离心2次：第一次4℃，1000g离心10min，去除细胞残留物；第二次4℃，20000g离心30min，取上清并保存于-80℃。
Caco-2细胞中提取酶的蛋白含量的测定
根据BCA试剂盒的说明书测得Caco-2细胞中提取酶的蛋白含量为1.256mg/mL。
Caco-2细胞提取酶中α-葡萄糖苷酶活性的测定
(1)标准曲线的制作
分别配制浓度为0U/mL，0.025U/mL，0.050U/mL，0.075U/mL，0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶于离心管中。
0U/mL为0.01M的PBS(pH＝6.8，含20％的牛血清蛋白)
取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG，25μL 0.1M PBS(pH6.8)，恒温金属浴37℃10min，加入上述配好的α-葡萄糖苷酶各50μL，37℃反应15min，加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复三次。以OD值大小表示PNP的生成量，以α-葡萄糖苷酶的浓度为横坐标作出标准曲线。
(2)酶活性的测定
取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG，25μL 0.1M PBS(pH6.8)，恒温金属浴37℃培养10min，加入α-葡萄糖苷酶50μL(Caco-2细胞)，37℃反应15min，加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值。重复3次。
结果表明，Caco-2细胞提取酶中α-葡萄糖苷酶的酶活力为0.023U/mL。
Caco-2细胞提取酶中二肽基肽酶-IV活性的测定
取酶标板，25μL 1.5mM Gly-Pro-p-nitroanilide，25μL CFS(用0.1M pH 6.8PBS做空白对照)，恒温金属浴37℃培养10min，加入二肽基肽酶-IV 50μL(Caco-2细胞)，37℃反应60min，加入100μL 1M的醋酸钠缓冲液终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值，重复3次。
结果表明，Caco-2细胞中提取酶与底物有颜色反应，说明其中含有二肽基肽酶-IV，具体测定结果如下表11所示：
底物 酶/PBS 吸光值
Gly-Pro-pNA PBS 0.1336±0.0388
Gly-Pro-pNA Caco-2细胞提取酶 0.7566±0.1902
实验数据3
体内预防糖尿病试验采用高脂饲料喂养加注射链脲霉素(STZ)造成的Ⅱ型糖尿病模型。
Balb/c小鼠，雄性，周龄4-5周，购自北京维通利华有限公司，合格证号：SCXK(京)2013－0001。饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房,许可证号：SYXK(京)2013-0023，室温22±2℃，相对湿度60％RH。定时12小时光照和12小时黑暗，自由饮水取食，并定期更换垫料，定时清洗鼠笼。
40只按体重随机分为4组：正常组、模型组、阳性药物组及益生菌饲喂组(除正常组，均饲以高脂饲料，每组10只)。预防性灌胃给药两周后造模，提前一天禁食不禁水12小时，腹腔注射100mg/kg链脲霉素(STZ，SIGMA)，隔3天重复注射一次。正常组饲喂基础饲料(粗蛋白含量19.2％，粗脂肪含量4.6％，粗纤维4.0％，粗灰分6.3％，水分8.8％，无氮提取物55.9％)；模型组和阳性药物组(磷酸西格列汀片(捷诺维))试验组以高脂饲料饲喂(粗蛋白含量17.5％，粗脂肪含量17.9％，粗纤维3.1％，粗灰分4.5％，水分8.5％，无氮提取物48.5％)；试验组每天灌胃乳酸菌1×1010CFU/鼠。在给STZ诱导造模后一周，各组小鼠禁食不禁水12h，以血糖仪测定尾静脉血糖值，为空腹血糖值。模型组空腹血糖值为11.3mmoL/L，正常组血糖值为3.7mmoL/L。模型组的血糖组超过正常组血糖值的50％以上，即为二型糖尿病造模成功。造模成功后，阳性药物组每天灌胃10mg/kg，益生菌组每天灌胃250μL益生菌样直至13周实验结束。空腹取血，测定空腹血糖值如图13及糖基化血红蛋白值如图14。13周后，模型组空腹血糖值为12.74mmoL/L，阳性药物组空腹血糖值为8.084mmoL/L，益生菌组空腹血糖值为10.12mmoL/L。相比于模型组，益生菌组的空腹血糖值下降，未达到显著性差异；与阳性药物组(磷酸西格列汀片(捷诺维))的空腹血糖值相比，益生菌ST-2组降血糖效果也没有明显差异。表明益生菌ST-2的调节糖效果与阳性药物的降血糖效果无明显差异，具有一定的降血糖效果。
本实验还进一步考察了对糖基化血红蛋白的影响。糖基化血红蛋白是糖尿病评价指标中的金指标，被用来评价长期血糖调节的治疗效果。结果表明：相比于模型组，ST-2益生菌组的糖基化血红蛋白值有显著降低(P小于0.05)，与阳性药物组的糖基化血红蛋白无显著性差异。表明益生菌对Ⅱ型糖尿病具有一定的降血糖作用。
实施例1
将所述植物乳杆菌接种到牛乳、羊乳或骆驼乳中进行发酵，发酵步骤如下：
接种前，将牛乳、羊乳或骆驼乳加热至75℃，保持10s进行消毒处理。待牛乳、羊乳或骆驼乳冷却到40℃左右，接入所述植物乳杆菌，搅拌均匀至起泡。在温度40℃左右，进行密封发酵8-10h，即得适于糖尿病人食用的发酵牛乳、发酵羊乳或发酵骆驼乳。
实施例2
将所述菌粉投入到豆乳或花生乳中进行发酵，发酵步骤如下：
接种前，将豆乳或花生乳加热至65℃，保持30min进行消毒处理。待豆乳或花生乳冷却到40℃左右，接入所述植物乳杆菌，搅拌均匀至起泡。在温度40℃左右，进行密封发酵8-10h，即得适于糖尿病人食用的发酵豆乳或发酵花生乳。
实施例3
将所述菌粉投入到青蔬或果汁中进行发酵，发酵步骤如下：接种前，将青蔬或果汁加热至65℃，保持30min进行消毒处理。待青蔬或果汁冷却到40℃左右，接入所述植物乳杆菌，搅拌均匀至起泡。在温度40℃左右，进行密封发酵8-10h，即得适于糖尿病人食用的发酵青蔬或果汁。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (2)

1.一种具有双重降糖靶点的植物乳杆菌，其中，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.14572；保藏日期为：2017年8月29日；分类命名为：植物乳杆菌（ Lactobacillus plantarum ） ST-2。
2.一种如权利要求1所述的具有双重降糖靶点的植物乳杆菌在制备降糖功能性食品中的应用。
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