CN105132318A - 植物乳杆菌Grx16及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的乳酸菌的分离、筛选及鉴定，具体是一种植物乳杆菌及其应用。从广西巴马长寿人群肠道中分离乳酸菌，在比较耐酸及耐胆盐特性，体外抗氧化能力，对抗生素具敏感性综合比较基础上，通过体外试验筛选出一株具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力最强的菌株，经生理生化试验、API试剂条及16s？rDNA测序分析，将该菌株鉴定为植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus？plantarum？Grx16)。该菌株可用于制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵乳。

Description

植物乳杆菌Grx16及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及具有对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的乳酸菌的分离、筛选方法及鉴定。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的全身代谢疾病，高血糖是则由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有而引起的症状。随着当今世界经济的发展、人类寿命的延长，糖尿病患者的数量也与日俱增，糖尿病已经变成全球性的威胁。药物和胰岛素替代已被广泛用于治疗糖尿病，但药物的副作用可能会导致身体不适等其他病状的产生，即使直接使用胰岛素注射也可引发注射部位肌肉萎缩、视力模糊等副作用，这使得药物治疗在临床应用中受到了很大程度的限制。本研究从广西巴马长寿人群肠道中分离和筛选乳酸菌，筛选出具有体外α-葡萄糖苷酶抑制优秀能力的乳酸菌，从而利用该乳酸菌进行发酵，进而制备出具有调节血糖、促进身体健康功能的保健型发酵食品类，逐渐开创我国功能食品消费的新市场。

发明内容

本发明目的在于提供具有优异体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的益生菌菌株及其应用。

本发明提供了1株植物乳杆菌Grx16(Lactobacillusplantarum.Grx16)，该菌具有优秀体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力，保藏号是CGMCCNO.10921。

本发明经试验证明，该菌株耐人工胃液及胆盐，具有优秀的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力，同时具有较强的还原能力、DPPH自由基清除能力优秀且耐药性较低；并通过生理生化、API试剂条和16SrDNA序列比对分析将该菌株鉴定为植物乳杆菌。

本发明还提供了植物乳杆菌Grx16(Lactobacillusplantarum.Grx16)在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵乳中的应用。

本发明还提供了植物乳杆菌Grx16(Lactobacillusplantarum.Grx16)在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵骆驼乳中的应用。

本发明的植物乳杆菌Grx16(Lactobacillusplantarum.Grx16)具有优秀的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力，并耐人工胃液及胆盐，同时具有较强的还原活性、DPPH自由基清除能力，对多种抗生素敏感，可用于制备发酵乳与功能食品研发，具有很好的市场前景。

附图说明

图1为本发明菌株的形态图。

图2为本发明菌株16SrDNAPCR扩增产物电泳图。泳道M：100+2+3KbDNAmaker；泳道1为：Grx1616SrDNA扩增产物。

植物乳杆菌Grx16(Lactobacillusplantarum.Grx16)，于2015年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum.)保藏号是CGMCCNo.10921。

具体实施方式

本研究采用传统涂布平板法从广西巴马长寿村采集的样品中分离乳酸菌，通过模拟人体胃肠道环境筛选出耐酸耐胆盐能力较强的菌株，并研究其还原活性、DPPH自由基清除能力以及耐药性，最后通过体外试验筛选出对α-葡萄糖苷酶抑制能力最强的菌株。

实施例一：菌株的分离、筛选方法及鉴定。

1、样品采集

采集广西巴马长寿村中长寿人群及其家族人群样品，加入1mL灭菌液体石蜡油密封后，迅速置于冰盒内，分离样品中的乳酸菌。

2、乳酸菌的分离

将采集的样品经梯度稀释后，分别接种于MRS固体培养基、LBS固体培养基和PTYG固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的典型菌落，划线分离得到纯菌落。挑取各平板上的纯菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h后，4℃冰箱冷藏备用或冻干保藏。

3、乳酸菌的生理生化试验

对分离到的乳酸菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态，并进行接触酶、运动性、硝酸盐还原及吲哚等生理生化试验。

结果表明，从采集的样品中分离获得197株菌株，通过生理生化试验发现180株菌革兰氏染色为阳性，形状为杆状、短杆状或球状，在15℃及45℃环境下均能生长，接触酶、运动性、硝酸盐还原、吲哚、产H₂S及明胶液化试验均为阴性，所以将180株菌初步鉴定为乳酸菌。

4、乳酸菌凝乳性的筛选

将180株试验菌株活化后接种于脱脂乳中，37℃静置48h，并观察凝乳状况，所有菌株的凝乳情况见表1。

表1试验乳酸菌发酵24h凝乳情况

注：++为凝固，且凝乳质地均匀细致，凝乳时间较短，凝块结实，无乳清析出；+为凝固，但凝块不结实，凝乳时间较长，乳清析出较多.

结果显示，180株乳酸菌中，有136株在48h内凝乳，并且各菌株的凝乳时间有较大的差异。因此将筛选出的136株乳酸菌用于进一步筛选试验。

5、乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定

将活化好的乳酸菌制成菌悬液，取1.0mL的菌悬液接种至9.0mL的pH3.0人工胃液中，37℃培养，分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)。

存活率(％)＝3h的活菌数/0h的活菌数×100％

将活化好的乳酸菌按3％的接种量分别接种至含0.00％(即空白)、0.10％、0.30％及0.50％胆盐的MRS培养基中，37℃培养，分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)。

存活率(％)＝3h的活菌数/0h的活菌数×100％

乳酸菌的活菌浓度必须达到10⁶cfu/mL才能在肠道中发挥生理功能，所以乳酸菌在进入人体消化道后，需要具有同时能够耐受较低的pH以及较高浓度的胆盐能力。而分离的乳酸菌需要在人体内存活，则需要测试在模拟人体肠液和胃液的人工肠液、胃液中的存活率，筛选出的136株凝乳性能较好的乳酸菌中25株乳酸菌对人工胃液、人工胆盐和人工肠液的耐受率处于较高的水平，部分结果见表2。

表2乳酸菌的耐酸耐胆盐能力

结果表明，25株菌株在pH为3.0的人工胃液中均有一定的耐受性，且存活率均大于70％，其中菌株Y6、R10、R4、M4存活率大于70.0％。菌株对胆盐均有一定的耐受性，存活率在36.0％-50.0％之间，而菌株Y1、R4、G5、G6、S8存活率均大于47.0％。而对人工肠液耐受能力较好的菌株有R7、Y1、Y4、Y6、D12等，而在人工肠液中25株菌株存活率均大于45％。

6、乳酸菌体外抗氧化能力的测定

取发酵液上清2mL，加入2mLDPPH·无水乙醇溶液(0.2mmol/L)，摇匀，避光反应30min，6000r/min离心10min，取上清液于517nm处测定吸光度值Ai；以等体积无水乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液为Aj，以等体积空白溶剂代替样品溶液为Ac，并以等体积蒸馏水和乙醇混合液调零，测定菌株的DPPH·自由基清除率。

取发酵液上清0.5mL与0.5mLPBS缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)混合，再加入0.5mL铁氰化钾(1％)混匀后于50℃水浴20min，迅速冷却后加入0.5mL三氯乙酸(10％)，3000r/min离心10min，取上清液1mL，加入1mL蒸馏水和1mLFeCl₃(0.1％)，混匀，反应10min，在700nm处测吸光度。25株乳酸菌体外抗氧化能力见表3。

表3菌株抗氧化能力测定结果

结果表明，25株乳酸菌发酵液对DPPH自由基菌具有一定清除能力，清除率在25％～82％之间，且这25株菌株发酵液均具有一定还原能力，还原能力在0.7～2.8之间，根据72株益生菌的自由基清除能力和还原能力范围，选择羟自由基清除率大于50％，DPPH自由基清除率大于60％，A700nm值大于1.7的菌株，共有12株，对其益生特性进行进一步研究。

7、乳酸菌抗生素敏感试验

使用药敏纸片法检测菌株对抗生素的敏感性，抗生素及纸片浓度见表4。

吸取1.0mL菌悬液加入到15.0mL灭菌并融化后的MRS固体培养基中(40-50℃)，于漩涡振荡混合器上混和均匀后迅速倾注到100mm×H20mm无菌平皿中，摇匀，待平板凝固后贴放标准药物纸片，在37℃恒温培养箱中倒置培养，48h后测量并记录抑菌圈直径，根据CLSI制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》(2010版)判定乳酸菌对抗生素的耐药性，结果见表4。

表4乳酸菌的耐药性

注:R为耐药，M为中度敏感，S为敏感。

结果显示，12株乳酸菌对阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素均有耐药性，对哌拉西林、庆大霉素、呋喃妥因、万古霉素、苯唑西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、新霉素、红霉素表现出不同的耐药性。由于实验菌株是从较少服用抗生素的长寿人群中获得，所以对抗生素的药敏性较强。因此筛选耐药性较低的M11、B3、G9、R9、grx16、D12、D11、G5、R10、M4进行下一步体外降血糖能力测定。

8、乳酸菌α-葡萄糖苷酶抑制能力筛选

从12株乳酸菌筛选药敏性较高的10株菌株，测定其对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，筛选出对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力较高的6株乳酸菌，其抑制率分布如表5所示。

表5抑制率分布表

结果显示，菌种Grx16、G9、D12、M11、R9、R10对α-葡萄糖苷酶有较高的抑制活性，且菌株Grx16、M11、G9的抑制率分别达到89.47％、84.21％、84.96％。获得一株对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最强的菌株Grx16，可利用其研制具有降血糖功效的发酵乳。

9、乳酸菌的鉴定

经过筛选获得具有度α-葡萄糖苷酶最强抑制能力，且具有耐酸耐胆盐能力、体外抗氧化能力以及对多种抗生素敏感，因此对该菌株进行鉴定。

(2)革兰氏染色试验

本发明菌株Grx16形状为短杆状，如图1。

(2)糖发酵试验

对照《伯杰氏细菌鉴定手册》，对筛选出的菌株进行糖发酵初步鉴定，结果如表6。

表6菌株糖发酵试验结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

(3)API鉴定

筛选获得的乳酸菌利用API50CHL系列鉴定试验条进行鉴定，所有操作按照说明书中的操作方法进行，结果如表7所示。

表7API50CHL系统鉴定结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

将API鉴定产生的生化图谱提交数据库进行在线比对，可以得出此株乳酸菌的菌种名称及鉴定率，结果见表8。

表8API比对结果

(4)菌株16SrDNA测序鉴定

以菌株Grx16基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用通用的16SrDNA引物进行PCR扩增，扩增结果见图4。电泳检测扩增产物后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序得到的序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析，结果见表9。

表916SrDNA比对结果

结合生理生化试验、API试剂条鉴定及16SrDNA测序鉴定，将本发明菌株grx16定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum.)。

实施例二、含本发明菌株发酵乳的制作方法原料乳经标准化后，加入6％的糖，预热至60-65℃，12-20Mpa压力均质，95℃/5min热处理后，冷却至42-45℃，按3％接种量接种4株菌株混合发酵，37℃发酵至凝乳，然后置于4℃贮藏。

实施例三、含本发明菌株发酵骆驼乳的制作方法原料乳经标准化后2，20Mpa压力均质，65℃/30min热处理后，冷却至42-45℃，按4％接种量接种4株菌株混合发酵，37℃发酵pH至4.4-4.6，然后置于4℃贮藏。

Claims (4)

1.植物乳杆菌Grx16(LactobacillusplantarumGrx16)，其保藏号是CGMCCNO.10921。

2.权利要求1所述植物乳杆菌Grx16在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵乳中的应用。

3.权利要求1所述植物乳杆菌Grx16在制备具有辅助降血糖能力的功能性发酵骆驼乳中的应用。

4.权利要求1所述植物乳杆菌Grx16具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用。