CN106544300A - 一种新型发酵果蔬专用乳酸菌组合及发酵剂制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型发酵果蔬专用乳酸菌组合及发酵剂制备，该乳酸菌组合为植物乳杆菌grx15(Lactobacillus plantarum grx15)；发酵乳杆菌grx07(Lactobacillus fermentum grx07)和grx19(Lactobacillus rhamnosus grx19)以1:1:1(v/v)的比例混合。本发明对筛选获得的益生菌进行混合发酵及高密度增殖研究，制备发酵剂，用于发酵果蔬。发现混合乳酸菌经过优化的培养基培养，不仅能显著提高发酵液的活菌数，同时对其生长速率的促进也更加明显。另外，采用食品级材料制备的泡菜种子培养基，廉价易得、食用安全，对人体无害，将其应用于发酵果蔬，能确保纯种发酵产品的快速成熟、风味良好，易于消费者接受。

Description

一种新型发酵果蔬专用乳酸菌组合及发酵剂制备

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种果蔬发酵用高密度增殖培养基的制备方法。

背景技术

人工接种泡菜工业化生产的关键在于乳酸菌直投式发酵剂的制备，而制备的关键又在于高密度培养方法的确定。对于乳酸菌的高密度培养，一般从以下两方面进行考虑：①选择合适的培养基满足乳酸菌的生长需求。②最大限度地降低乳酸抑制效应。这就要求不断优化培养基，使其得到高效利用。

综合近几年菌种的增殖培养研究得出以下几点要求：①培养基营养成分利用率高，可短时间内获得高活性高密度菌种；②易于收集菌体；③成本低廉，易于回收利用。

目前，就国外乳酸菌发酵剂业来说，用于工业生产的培养基主要是水解乳、脱脂乳、乳清基质、乳糖混合培养基以及超滤浓缩乳。国内乳酸菌主要培养基有MRS培养基和脱脂乳培养基。不同乳酸菌对营养条件的要求不同，选择最适乳酸菌生长的培养基是实现高密度发酵的前提。

(1)碳源：凡是能够提供乳酸菌碳素，构成细胞和代谢中碳来源的物质均称为碳源。由于乳酸菌缺乏分解淀粉等大分子碳水化合物的酶系，能够利用的的碳源主要是乳糖等简单糖类。此外碳源对乳酸菌来说还兼有能源的作用，是其需求量最大的营养成分，所以应用比例往往远高于氮源。

(2)氮源：乳酸菌分解蛋白质的能力有限，其增值速度的快慢和培养基中氨基酸的含量密切相关。乳酸菌的最适氮源主要是水解蛋白类产物，还有多种辅酶和核酸的组成成分(如氨基酸类、肽类和B族维生素)，有助于从多方面满足微生物生长需求。

(3)无机盐：无机盐也是微生物生长所不可缺少的营养物质，其主要功能是：①构成细胞的组成成分；②作为酶的组成成分，维持酶的活性；③调节细胞渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等。

(4)生长因子：乳酸菌需要从环境中摄取微量自体不能合成的一些小分子营养物质以满足生长需求，所以其增菌培养基通常在使用有机碳氮源和无机盐的基础上，添加维生素、氨基酸类、嘌呤和嘧啶及其衍生物，或添加番茄汁、胡萝卜汁、平菇汁、真菌浸出液等富含生长因子的基质。

普通液体发酵剂的活菌数一般只有10⁷CFU/mL左右，但直投式发酵剂菌量达到10⁹-10¹²数量级，真正体现了直投式发酵剂的使用量少、效果好的优点。要达到比较高的活菌数量，发酵菌株增殖培养基的选择是很重要的。

MRS培养基是应用最广泛的乳酸菌培养基，但由于其化学成分复杂、不可食用等特点，可能对蔬菜发酵产生消极影响，不利于作为泡菜发酵的种子培养基。因此，对基础培养基进行优选，选择适合菌种扩大，成分相对简单的培养基作为泡菜发酵前的种子培养基，研究生长因子添加对乳酸菌增殖和发酵活力的影响十分有必要。

发明内容

本发明目的在于提供一种果蔬发酵用发酵剂的制备方法，通过该方法制备的高密度增殖培养基对混合乳酸菌发酵剂的促生长作用明显，并且适用于果蔬发酵，食用安全，能显著缩短发酵时间。

本发明所述混合乳酸菌发酵剂菌株为：植物乳杆菌grx15(Lactobacillusplantarum grx15)，保藏号是CGMCC NO.7199；发酵乳杆菌grx07(Lactobacillusfermentum grx07)，保藏号是CGMCC NO.8874；鼠李糖乳杆菌grx19(Lactobacillusrhamnosus grx19)，保藏号是CGMCC NO.5519。

本发明所述混合乳酸菌发酵剂的乳酸菌组合由植物乳杆菌grx15、发酵乳杆菌grx07和鼠李糖乳杆菌grx19组成，其混合比例为1:1:1(v/v)。

本发明还公开了一种果蔬发酵专用乳酸菌组合发酵剂，是将上述乳酸菌组合在高密度增殖培养基中30℃-37℃培养20h-30h而制得。

本发明还公开所述果蔬发酵专用乳酸菌组合发酵剂的制备方法：在高密度增殖培养基中接种3％乳酸菌组合，30℃-37℃培养20h-30h；高密度增殖培养基为：在中性蛋白酶(6000U/g)酶解的乳清粉(9％-10％)培养基中分别添加葡萄糖2％-3％、柠檬酸钠0.5％-0.6％、大豆分离蛋白粉0.8％-1.2％、CaCO₃ 0.2％-0.4％以及复合果蔬汁6％-10％。

其中，所述复合果蔬汁优选按质量比是胡萝卜汁：平菇汁：玉米汁＝1:1:1。

本发明进一步公开了果蔬发酵专用乳酸菌组合发酵剂在制备纯种发酵果蔬产品中的应用。

本发明制备的泡菜用高密度增殖培养基活菌数显著高于相同条件下普通MRS液体培养基中活菌数。并且专用发酵剂在优化后的培养基中只经过8h就从结束对数期进入稳定期，说明经过优化的培养基不仅能显著提高发酵液的活菌数，而且能提高其生长速率。

本发明涉及的一株植物乳杆菌grx15，该菌株于2016年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏号：CGMCC NO.7.199。

附图说明

图1为葡萄糖添加量和乳清粉添加量及其交互作用对溶解度影响的响应面曲线和等高线；

图2为柠檬酸钠添加量和乳清粉添加量及其交互作用对溶解度影响的响应面曲线和等高线；

图3为柠檬酸钠添加量和葡萄糖添加量及其交互作用对溶解度影响的响应面曲线和等高线；

图4为混合乳酸菌发酵剂在优化培养基和普通MRS培养基中的生长曲线。

具体实施方式

本研究确定了发酵果蔬用混合乳酸菌组合，且通过单因素试验确定其基础培养基、氮源、碳源、缓冲盐和生长因子。应用Plackett-Burman实验设计，对影响菌株增殖的主要成分进行了评价，筛选关键因子。通过最陡爬坡实验逼近最大相应区域，运用响应面法(RSM)建立了增殖培养基条件多元二次模型，并对模型进行了显著性检验，优化了因子水平。并对比专用发酵剂在优化培养基和普通液体MRS培养基中的生长情况。

1 发酵果蔬专用乳酸菌组合

将菌株按不同比例混合(见表1)接种于莲藕汁进行发酵，接种量3％，温度30℃，发酵24h，测定发酵液活菌数、总酸含量和pH值，结果如表2所示。

表1 不同菌株配比设计

表2 不同菌株组合发酵泡菜的品质评定

根据表2可得，在pH和总酸方面，各组pH均达到4.0以下，1号pH最高为3.85，15号最低达到3.37，其他各组在3.4-3.6之间，差异性不显著。5号、7号、9号、12号、14号和15号总酸含量较高，达到1％以上，其中14号总酸含量最高，达到1.28％，显著高于其他组别(P<0.05)。

在活菌数方面，各组均高于空白对照1号组。其中5号、7号、9号、14和15活菌数均高于2.5×10⁷CFU/mL，14号活菌数显著高于其他组(P<0.05)。

综合以上因素，确定14号为发酵果蔬专用菌株组合，即grx15：grx07：grx19＝1：1：1。

2 菌株种子培养基的优选

从酶解脱脂乳、乳清蛋白粉(WPC-80)、脱盐乳清粉以及大豆蛋白胨中选出对乳酸菌有明显促进作用的培养基做为乳酸菌增殖培养的初选培养基。培养与测定：把活化的菌种按3％接种量分别接入基础培养基中，37℃恒温静置培养，培养24h后采用平板活菌计数法计数，结果见表2。

表2 乳酸菌在不同培养基中的活菌数

结果发现，酶解脱脂乳培养基对混合乳酸菌的促生长作用最高，显著高于其他组(P<0.05)，酶解乳清培养基次之，又因乳清粉较为廉价，因此综合考虑选择酶解乳清培养基为本试验乳酸菌基础培养基。

3 营养因子的添加对乳酸菌增殖的影响

乳清是生产干酪的副产品，含有乳清蛋白、乳糖、维生素和矿物质等多种营养成分，价格低廉，适合作为工业化原料生产发酵剂。由于乳清的主要成分是乳糖，需根据菌株的营养要求添加碳氮源和生长因子等成分。又因为其pH缓冲能力较弱，所以需加入缓冲盐调节、控制培养液的酸度在一定范围内。

在基础培养基中加入一定量营养物质，调节pH值至6.4左右，分装，115℃灭菌20min，冷却后接入活化好的乳酸菌菌种，30℃发酵24h，平板计数。

3.1 不同氮源对乳酸菌生长的影响

氮源是构成菌体细胞物质和代谢产物的主要成分，对乳酸菌生长有重大影响。用于乳酸菌培养的氮源种类较多，在以1％葡萄糖为固定碳源，以1％不同氮源(大豆分离蛋白粉、酵母粉、玉米肽、水解植物蛋白粉、NaNO₃)配制成不同的碳氮培养基，接种活化后的专用发酵剂，30℃培养24h平板计数。结果如表3所示。

表3 不同氮源对乳酸菌生长的影响

从表3发现，在乳清培养基添加1％大豆分离蛋白粉增菌效果较好，显著高于其他氮源(P<0.05)，且较为廉价，因此选择大豆分离蛋白粉为本研究乳酸菌基础培养基的氮源。

3.2 不同碳源对乳酸菌生长的影响

选择乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、果糖和乳糖为碳源进行单因素实验，以1％大豆分离蛋白粉为固定碳源，以1％不同碳源源配制成不同的碳氮培养基，接种活化后的专用发酵剂，30℃培养24h平板计数，结果如表4。

表4 不同碳源对乳酸菌生长的影响

对比培养基中菌株的活菌数量发现，混合发酵剂对六种碳源的利用情况有明显不同，在添加葡萄糖的培养基中的活菌数显著高于添加其他碳源的培养基(P<0.05)。

3.3 不同缓冲盐对乳酸菌生长的影响

在只添加碳氮源的培养基上，以1％大豆分离蛋白粉氮源为固定氮源。1％葡萄糖为碳源，分别添加0.5％柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸氢二钾不同缓冲盐配置成培养基，接种活化后的专用发酵剂，30℃培养24h取样采用平板分离计数法，结果如表5。

表5 不同缓冲盐对乳酸菌生长的影响

由表5可知，加入不同缓冲盐的培养基中乳酸菌活菌数差异性显著(P<0.05)，其中以柠檬酸钠缓冲盐对专用发酵剂的促生长效果最显著(P<0.05)，最高活菌数达到1.95×10⁹CFU·mL^-1。

3.4 其他营养强化成分的筛选

乳酸菌是一种化能异养型微生物，对营养的要求特殊且复杂。大部分乳酸菌不能利用简单的氮源或碳源合成多种生长必需的物质，而需要从外界吸收氨基酸、维生素等生长因子以此维持正常代谢。

针对乳酸菌生长的营养需求，在泡菜发酵营养液配方上添加其它营养成分。选择维生素C、氨基酸、蔬菜汁等作为营养强化的影响因素，根据菌株生长情况从中选择影响较大的因素或是混合使用。

3.4.1 生长因子的筛选

在确定培养基中的碳氮源种类及缓冲盐种类后，研究了生长因子对乳酸菌活菌数的影响，根据相关报道，选取了多种常用营养物质添加到基础增菌培养基中，经30℃恒温培养24h后取样稀释平板计数，实验结果如表6。

表6 不同生长因子对乳酸菌生长的影响

由表6可看出，不同生长因子对乳酸菌的影响差异较大。相比于其它组处理，碳酸钙对发酵剂的生长有明显的促进作用(P<0.05)，而L-半胱氨酸盐酸盐的增菌效果最不明显。

3.4.2 增菌果蔬基质的筛选

综合考虑乳酸菌的营养需求、材料获得和制备成本，选取了平菇汁、胡萝卜汁、番茄汁和玉米汁等9种果蔬汁作为乳酸菌的增菌汁。将配制好的果蔬汁按5％的量添加到简单的碳氮培养基中，分别将活化的发酵剂接种到各自培养液中30℃培养24h，采取稀释平板计活菌数法比较乳酸菌的生长情况，实验结果如表7。

表7 不同果蔬汁对乳酸菌生长的影响

由表7看出，添加果蔬汁对促进乳酸菌的生长起到了明显作用。特别是添加了胡萝卜汁、平菇汁和玉米汁的培养基对菌株的促生长作用比较强，显著高于其他组(P<0.05)，这可能是由于胡萝卜汁中含有大量的胡萝卜素、维生素以及丰富的矿物质离子等，而平菇汁和玉米汁含氮物质较多，能很好的满足乳酸菌的生长需求，因此选取胡萝卜汁：平菇汁：玉米汁＝1:1:1(v/v)作为混合乳酸菌的增菌果蔬汁做进一步实验。

3.5 响应面法优化混合乳酸菌泡菜种子培养基

3.5.1 PB实验筛选影响菌株增殖重要因素

采用PB实验筛选影响两株菌活菌数的重要因素选用实验次数N＝12的实验设计，对11个因素(6实际因素、5虚拟因素)进行考察，响应值为活菌数量。实验设计与结果见表2，借助实验设计软件Design Expert进行数据分析，结果见下表。

表8 Plackett-Burman设计表及实验结果

表9 Plackett-Burman实验各因素的效应表

由表3-8、表3-9可以看出，6个因素中对响应值影响的显著性顺序为葡萄糖、柠檬酸钠、乳清粉、复合果蔬汁、CaCO₃和大豆分离蛋白粉，而且葡萄糖和柠檬酸钠对菌密度的影响极显著，乳清粉对菌密度的影响显著，因此，后续试验采用葡萄糖、柠檬酸钠、乳清粉3个因素作为主要研究对象，对混合乳酸菌的增菌培养基进一步优化。

3.5.2 最爬坡试验

本研究根据Plackett-Burman实验结果，设计最爬坡实验，结果见表10。

表10 最爬坡实验结果

由表10可知，培养获得的菌体密度从中心点开始到3△之间都显著增加，在0+3△～0+4△开始减少；故以0+3△条件为后续试验的中心点。

3.5.3 Box-Behnken实验设计

根据PB实验结果，筛选出乳清、葡萄糖和柠檬酸钠为重要因子，并通过最爬坡实验趋近最优点的邻近区域后，采用Box-Behnken实验设计，选取自变量为显著因子的水平，响应值为菌液活菌数。实验设计采用软件Design Expert.实验结果见表11，二次多项模型及其各项的方差分析见表12。

表11 BBD实验设计及实验结果

利用Design-Expert 8.0.5软件对结果进行方差分析和多原拟合回归。活菌数Y对乳清粉添加量(A)、葡萄糖添加量(B)和柠檬酸钠添加量(C)三个因素的二次多项式回归模型分析结果为：

Y＝2.46-0.076A+0.13B+0.42C-0.51AB-0.34AC-0.40B C-0.40A²-0.43B²-0.57C²

表12二次多项模型及各项的方差分析

由表12可知，模型显著(P＝0.0275<0.05)，失拟项P＝0.9462>0.05，不显著，说明该模型与实际情况拟合程度良好，能充分表明各因素之间的关系。

由回归模型系数检验性结果可知，模型的一次项C显著；二次项C²显著；交互项AB显著。因此，对活菌数的影响依次为C>A>B，即柠檬酸钠添加量>乳清粉添加量>葡萄糖添加量。

3.5.4 响应曲面优化与分析

图1～图3响应曲面显示了在发酵过程中乳清粉、葡萄糖和柠檬酸钠添加量及其交互作用对溶解度的影响。柠檬酸钠添加量的一次项系数较大，且F值较大而P值较小，说明柠檬酸钠添加量是菌株生长制因素，较小的波动会引起活菌数较大的变化。

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用明显，而圆形则与之相反，因此乳清粉添加量和葡萄糖添加量的交互作用均著。而且交互作用呈钟形，表明拟合面有极大值存在。乳清粉添加量和柠檬酸钠添加量、乳葡萄糖和柠檬酸钠添加量的交互作用次之。

随着乳清粉的浓度升高，活菌数提高，乳清粉浓度超过一定范围，活菌数降低，葡萄糖含量也是如此，因此，将乳清粉浓度和葡萄糖的浓度分别控制在10％～11％和1.9g/L～2.1g/L时可达到本实验最大值(结合图1)；

活菌数随着柠檬酸钠和乳清粉浓度的提高先上升后下降，所以柠檬酸钠浓度和乳清粉的浓度分别控制在0.50％～0.60％和9％～10％之间可得到活菌数的最大值(结合图2)；

随着葡萄糖的浓度升高，活菌数提高，但是超过一定范围，活菌数降低，柠檬酸钠含量也是如此，因此，将乳清粉浓度和葡萄糖的浓度分别控制在0.50％～0.55％和1.8g/L～2.1g/L时可达到本实验最大值(结合图3)；

不同因素交互作用对活菌数的影响不同，但总体而言，活菌数都是随各因素变化呈先上升后下降趋势，只有在合理范围内才能获得最高活菌数。

为检验响应面曲线法所得结果的可靠性，进一步确定最佳条件，在模型浓度范围内选择为基础，按照模型使用快速上升法进行优化，可得最佳配方组合为：乳清粉添加量9.21％，葡萄糖添加量为2.10％，柠檬酸钠添加量为0.54％，根据之前实验确定大豆分离蛋白粉添加1％、CaCO₃添加0.3％以及复合果蔬汁添加8％，由此制成的培养基中发酵剂活菌数为2.58×10⁹CFU/mL。

3.6 验证试验

专用发酵剂经MRS液体培养基活化，培养24h后按3％的接种量接入优化泡菜种子培养基。发酵条件为：30℃恒温静置培养24h后平板计数，结果如表13。

表13 乳酸菌在不同培养基中的活菌数

由表13可知，混合乳酸菌在泡菜用种子培养基中的活菌数明显高于用MRS培养，并且此培养基廉价易得，安全性高，适合用于泡菜发酵。

4.发酵果蔬专用乳酸菌组合的生长曲线

混合乳酸菌经活化后按3％的接种量接入优化泡菜种子培养基和MRS液体培养基活化。用生长曲线测定仪测定其在两种培养基中30℃下培养48h的生长情况，以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，做出乳酸菌的生长曲线，混合乳酸菌在优化后的培养基培养6h后进入生长对数期，14h左右就进入了稳定期，即菌株只经过8h就从结束对数期进入稳定期，说明经过优化的培养基不仅能显著提高发酵液的活菌数，而且能提高其生长速率。具体见附图4。

实施例1

在10升去离子水中分别添加乳清粉0.92kg、葡萄糖0.2kg、柠檬酸钠0.054kg，大豆分离蛋白粉0.1kg、CaCO₃ 0.03kg以及复合果蔬汁0.8升，115℃灭菌20min，冷却后按3％(w/w)接种量接种专用发酵剂组合(植物乳杆菌grx15：发酵乳杆菌grx07：grx19＝1:1:1)，30℃培养24h。

在90升凉开水中添加葡萄糖3kg，接种专用发酵剂10升，30℃发酵3d，制备发酵液。待发酵液pH降至4时将其倒入发酵罐，添加5kg盐，投入100kg清水切分的藕片，添加生姜2kg、大蒜3kg、辣椒2kg、香料0.5kg，混匀后在坛口水封，室温下发酵。当泡菜水pH达3.5左右，盐水，菜盐浓度一致时泡菜成熟。出坛调味。调味后包装成约500g的小袋。然后真空密封。采用巴氏灭菌法，在85℃水浴中加热15min，取出后迅速用冷水冷却，即得到发酵莲藕片成品。

实施例2

按最佳配方制备高密度增殖培养基：在10升去离子水中分别添加乳清粉1kg、葡萄糖0.3kg、柠檬酸钠0.06kg，大豆分离蛋白粉0.12kg、CaCO₃ 0.04kg以及复合果蔬汁1升，115℃灭菌20min，冷却后按3％(w/w)接种量接种专用发酵剂组合(植物乳杆菌grx15：发酵乳杆菌grx07：grx19＝1:1:1)，30℃培养24h。

在90升凉开水中添加白砂糖3kg、盐5kg、生姜2kg、大蒜3kg、辣椒2kg、香料0.5kg，混匀后装入发酵罐，投入100kg清水切分的藕片(5mm)，接种果蔬专用发酵剂10升，水封。30℃发酵7d，当泡菜水pH达3.5左右，盐水，菜盐浓度一致时泡菜成熟。出坛调味，调味后包装成约500g的小袋，真空密封。采用巴氏灭菌法，在85℃水浴中加热15min，取出后迅速用冷水冷却，即得到发酵莲藕片成品。

实施例3

在10升去离子水中分别添加乳清粉0.9kg、葡萄糖0.2kg、柠檬酸钠0.05kg，大豆分离蛋白粉0.08kg、CaCO₃ 0.02kg以及复合果蔬汁0.6升，115℃灭菌20min，冷却后按3％(w/w)接种量接种专用发酵剂组合(植物乳杆菌grx15：发酵乳杆菌grx07：grx19＝1:1:1)，30℃培养24h。

在90升凉开水中添加白砂糖2kg、盐6kg、生姜3kg、大蒜2kg、辣椒3kg、香料1kg，混匀后装入发酵罐，投入100kg清水洗净的莲藕段，接种果蔬专用发酵剂10升，水封。室温下发酵，当泡菜水pH达3.5左右，盐水，菜盐浓度一致时泡菜成熟。出坛调味，然后真空密封。采用巴氏灭菌法，在85℃水浴中加热15min，取出后迅速用冷水冷却，即得到发酵莲藕段成品。

Claims (5)

1.一种果蔬发酵专用乳酸菌组合，其特征在于，乳酸菌组合为植物乳杆菌grx15(Lactobacillus plantarum grx15)；发酵乳杆菌grx07(Lactobacillus fermentumgrx07)和grx19(Lactobacillus rhamnosus grx19)以1:1:1(v/v)的比例混合作为发酵剂组合。

2.一种果蔬发酵专用乳酸菌组合发酵剂，其特征在于，是将权利要求1所述乳酸菌组合在高密度增殖培养基中30℃-37℃培养20h-30h而制得。

3.一种果蔬发酵专用乳酸菌组合发酵剂的制备方法，其特征在于，在高密度增殖培养基中接种3％乳酸菌组合，30℃-37℃培养20h-30h；高密度增殖培养基为：在中性蛋白酶酶解的乳清粉培养基中添加葡萄糖2％-3％、柠檬酸钠0.5％-0.6％、大豆分离蛋白粉0.8％-1.2％、CaCO₃ 0.2％-0.4％以及复合果蔬汁6％-10％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述复合果蔬汁按质量比是胡萝卜汁：平菇汁：玉米汁＝1:1:1。

5.权利要求2所述的果蔬发酵专用乳酸菌组合发酵剂在制备纯种发酵果蔬产品中的应用。