CN102382750A - 一种猕猴桃醋和猕猴桃风味醋的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猕猴桃醋的生产方法，它包括如下步骤：（1）原料处理：将猕猴桃清洗、打浆后，加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁；（2）酵母菌的活化与扩培；（3）醋酸菌种子的扩培；（4）酒精发酵；（5）醋酸发酵；（6）陈酿；（7）澄清，灭菌，包装。本发明工艺简单，猕猴桃富含维生素，用猕猴桃酿醋，即可作为高档调味品，又可作为独具口感的饮料，猕猴桃醋酸甜适中，口感独特，还具有良好的保健作用。
Description
技术领域
本发明涉及发酵食品加工领域，尤其涉及一种猕猴桃醋和猕猴桃风味醋的生产方法。
背景技术
猕猴桃是一种落叶藤木果树的果实，又称藤梨、羊桃，不仅风味鲜美，含有丰富的营养成分，而且具有降血脂、抗氧化等多种生理活性。猕猴桃有54个种和21个变种， 共约75个分类群。野生猕猴桃主要分布于秦岭以南和横断山以东地区，以河南伏牛山区、陕西秦巴山区、湖南西部等山区为最多。除个别省份如青海、宁夏、内蒙、新疆等没有发现野生猕猴桃外，其他各省（区）均有。
野生猕猴桃资源丰富，年产量很大，据统计全国野生猕猴桃年总产量约有1亿多公斤，但由于产地交通不便及加工技术的限制，未得到有效的开发利用，产后损失相当严重，造成资源的极大浪费。如鲁山县尧山属于伏牛山系，是野生猕猴桃的主要产区之一，每到成熟季节，满山遍野，但除了少数被当地百姓摘下于景区贩卖，多数被抛弃于山林，造成资源的极大浪费。而且野生猕猴桃不耐长期贮藏，在贮藏期内，由于生命活动的继续，仍导致营养物质的逐渐消耗。若将野生猕猴桃通过深加工制成野生猕猴桃酒、野生猕猴桃醋，可为这些野生猕猴桃资源的深加工和综合利用提供一条有效的途径，并且加工品的保藏时间要比鲜果保藏时间高几倍。
中国专利200510056613.8公开了一种采用沈欧112-7#醋酸菌种发酵猕猴桃酒制成猕猴桃醋母液，之后再将猕猴桃醋母液中添加蜂蜜、蔗糖、味素、乙基麦芽酚等制成猕猴桃醋饮料。中国专利200910022739.1公开了一种猕猴桃果醋饮料及其制备方法，通过将猕猴桃果醋与白砂糖、柠檬酸、蜂蜜醋等调配成醋饮料。目前相关行业采用预先液化糖化完全后再进行酒精发酵的工艺，工艺步骤繁琐，而同时进行液化糖化酒精发酵自然发酵的工艺，生产工艺条件不稳定，不能保证产品质量的稳定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简单的猕猴桃醋和猕猴桃风味醋的生产方法。
本发明的技术方案是：
一种猕猴桃醋的生产方法，它包括如下步骤：
（1）原料处理：将猕猴桃清洗、打浆后，加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁；
（2）酵母菌的活化与扩培：YPD斜面固体培养基，接入酵母菌，28-30℃培养24 h，将活化酵母菌接入150 mL YPD液体培养基，28-30℃培养24 h，得到酵母菌种子；将酵母菌种子摇瓶种子培养，取大试管或锥形瓶一个，装入猕猴桃汁，灭菌冷却后接种YPD斜面培养或液体培养酵母菌种子1-2环，28-30℃培养24 h；再将摇瓶后的酵母菌扩大培养，将猕猴桃汁摇瓶培养的酵母菌接种于装有猕猴桃汁的种子罐，酵母菌接种量为接种后总体积的2%-10％，28-30℃培养24-120 h；
（3）醋酸菌种子的扩培：醋酸菌斜面菌种在斜面培养基上活化后接种于液体培养基培养24h-120h，扩培时再接种于猕猴桃酒醪中培养24h-120h，选出镜检没有杂菌，细胞形态良好的醋酸菌作为醋酸菌种子液；
（4）酒精发酵：调整猕猴桃汁糖度为8%-25%，调pH为3-5.5，接种酵母菌，酵母菌的接种量为接种后总体积的2%-20%，在15-32℃的条件下发酵，糖度低于10g/L，分离新酒，得到酒精发酵液；
（5）醋酸发酵：将醋酸菌种子液接入酒精发酵液，酒精发酵液的体积分数为3.5%-15%，初始酸度6-40g/L，醋酸菌种子液的接种量为接种后总体积的6%-70%，15-36℃通风发酵培养，醋酸含量不再上升，得到醋液；
（6）陈酿：在醋液中加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存；
（7）澄清，灭菌，包装。
所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加偏重亚硫酸钾，SO2含量为10-150mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h。
所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁，将猕猴桃浆或猕猴桃汁采用高温瞬时灭菌或在62-65℃的条件下巴氏灭菌20-25min。
所述步骤（5）中在酒精发酵液中拌入谷糠、麸皮或稻壳中的至少一种，再将醋酸菌种子液与谷糠、麸皮或稻壳等比例拌合均匀，接入至用酒精发酵液与谷糠、麸皮或稻壳拌好的醅中，谷糠、麸皮或稻壳的质量与酒精发酵液的质量之比为1:1-3，在20-46℃保温发酵，定时翻醅，醋酸含量不再增加时终止发酵，醋醅中拌入醋醅质量的2%-5%的食盐，压实陈酿。
所述步骤（6）中在醋液中加入食盐和香辛料，食盐的加入量为醋液质量的0.2%-5％，香辛料的加入量为醋液质量的0.1%-5％，加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存。
一种猕猴桃风味醋的生产方法，它包括如下步骤：
（1）原料处理：将猕猴桃清洗、打浆后，搅匀，然后加入果胶酶15-60℃酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁；将小米或大米、高粱、玉米、荞麦、小麦或燕麦中的至少一种加水20-40℃浸泡0.5-10h，水的加入质量为小米或大米、高粱、玉米、荞麦、小麦或燕麦的2-7倍，打浆，调浆，加入α-淀粉酶预液化15min-120min，制成粮食浆；
（2）酵母菌的活化与扩培：YPD斜面固体培养基，接入酵母菌，28-30℃培养24 h，将活化酵母菌接入150 mL YPD液体培养基，28-30℃培养24 h，得到酵母菌种子；将酵母菌种子摇瓶种子培养，取大试管或锥形瓶一个，装入猕猴桃汁，灭菌冷却后接种YPD斜面培养或液体培养酵母菌种子1-2环，28-30℃培养24 h；再将摇瓶后的酵母菌扩大培养，将猕猴桃汁摇瓶培养的酵母菌接种于装有猕猴桃汁的种子罐，酵母菌接种量为接种后总体积的2%-10％，28-30℃培养24-120 h；
（3）醋酸菌种子的扩培：醋酸菌斜面菌种在斜面培养基上活化后接种于液体培养基培养24h-120h，扩培时再接种于猕猴桃酒醪中培养24h-120h，选出镜检没有杂菌，细胞形态良好的醋酸菌作为醋酸菌种子液；
（4）酒精发酵：将粮食浆与猕猴桃浆混合均匀，粮食浆与猕猴桃浆的质量比为0.2-7：1，加入所用粮食质量0.1%-0.5%的糖化酶，接种酵母菌，酵母菌的接种量为接种后总体积的2%-20%，在15-32℃的条件下发酵，糖度低于10g/L，分离新酒，得到酒精发酵液；
（5）醋酸发酵：将醋酸菌种子液接入酒精发酵液，酒精发酵液的体积分数为3.5%-15%，初始酸度6-40g/L，醋酸菌种子液的接种量为接种后总体积的6%-70%，15-36℃通风发酵培养，得到醋液；
（6）陈酿：在醋液中加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存；
（7）澄清，灭菌，包装。
所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为10-150mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h。
所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁，将猕猴桃浆或猕猴桃汁采用高温瞬时灭菌或在62-65℃的条件下巴氏灭菌20-25min。
所述步骤（6）中在醋液中加入食盐和香辛料，食盐的加入量为醋液质量的0.2%-5％，香辛料的加入量为醋液质量的0.1%-5％，加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存。
本发明的有益效果是：本发明所使用的菌种为自行筛选适用于野生猕猴桃醋发酵的菌种。筛选获得适用于野生猕猴桃醋发酵的酵母菌和醋酸菌种，确定相应的发酵工艺路线和发酵工艺条件；本发明所采用的原料为伏牛山系尧山地区所产的野生猕猴桃，表面无毛，无污染，发酵前只需清洗干净，打浆时可以不去皮，酒精发酵可采用带皮渣发酵法，该种发酵法可使皮中的抗氧化性物质溶于酒中；本发明发酵所采用的技术要点不同于其他发酵，区别于目前相关行业采用预先液化糖化完全后再进行酒精发酵和同时进行液化糖化酒精发酵的工艺，本发明中发酵野生猕猴桃风味醋的生产中野生猕猴桃经过酶解，小米等原料先经过粉碎（或打浆）、调浆，预液化一定时间后，再将小米浆和野生猕猴桃浆按比例混匀，加糖化酶和酵母菌进行双边发酵。本发明工艺简单，猕猴桃富含维生素，用猕猴桃酿醋,即可作为高档调味品,又可作为独具口感的饮料，猕猴桃醋酸甜适中,口感独特,还具有良好的保健作用。
具体实施方式
实施例1
野生猕猴桃（八成熟），清洗，打浆，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为60mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶40℃酶解2h，灭活，放凉。过滤，滤液巴氏灭菌20-25min。补糖至糖度13%，调pH3.3，接种酵母菌2%，32℃发酵7d，酒液酒精体积分数达6.5%。接种醋酸菌种子液15%，30℃通风发酵7d，酸度达到55g/L。
实施例2
野生猕猴桃（八成熟），清洗，打浆，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为30mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶40℃酶解2h，灭活，放凉。过滤，滤液巴氏灭菌20-25min。调整至糖度10%，接种酵母菌2%，19-32℃发酵5d，酒液酒精体积分数达4%-5%。接种醋酸菌种子液70%，30℃发酵4d，酸度≥35g/L。
实施例3
野生猕猴桃（八成熟），清洗，打浆，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为150mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶室温酶解24h。62-65℃灭菌20-25min。补糖至糖度19%，调pH3.7，接种酵母菌15%，23℃发酵7d，酒液酒精体积分数达10%左右。拌入谷糠、麸皮固态发酵，接种醋酸菌种子，发酵9d，定期翻醅，加盐陈酿，淋醋，酸度≥40g/L。
实施例4
野生猕猴桃（八成熟），清洗，打浆，加入果胶酶40℃酶解2h。小米加水浸泡10h，打浆，调浆（料水比1:5）。小米浆与野生猕猴桃浆按6:1混匀，加入α-淀粉酶0.5%预液化120min。加入糖化酶0.5%，接种酵母菌15%、温度30℃发酵3d，酒液酒精体积分数达4%。接种醋酸菌种子，发酵7d，酸度≥35 g/L。
实施例5
野生猕猴桃（八成熟），清洗，打浆，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为30mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶50℃酶解1h。小米加水浸泡2h，打浆，调浆（料水比1:2），加入α-淀粉酶0.1%预液化90min。小米浆与野生猕猴桃浆按3:1混匀，加入糖化酶0.3%，接种酵母菌7%、温度19-32℃发酵9d，酒液酒精体积分数达8%左右时，拌入谷糠、麸皮固态发酵，接种醋酸菌种子，发酵7-25d，定期翻醅，至酸度不再上升为止，加盐陈酿，淋醋，酸度≥35g/L。
实施例6
一种猕猴桃醋的生产方法，它包括如下步骤：
（1）原料处理：将猕猴桃清洗、打浆后，加偏重亚硫酸钾，SO2含量为10-150mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁，将猕猴桃浆或猕猴桃汁采用高温瞬时灭菌或在62-65℃的条件下巴氏灭菌20-25min；
（2）酵母菌的活化与扩培：YPD斜面固体培养基，接入酵母菌，28-30℃培养24 h，将活化酵母菌接入150 mL YPD液体培养基，28-30℃培养24 h，得到酵母菌种子；将酵母菌种子摇瓶种子培养，取大试管或锥形瓶一个，装入猕猴桃汁，灭菌冷却后接种YPD斜面培养或液体培养酵母菌种子1-2环，28-30℃培养24 h；再将摇瓶后的酵母菌扩大培养，将猕猴桃汁摇瓶培养的酵母菌接种于装有猕猴桃汁的种子罐，酵母菌接种量为接种后总体积的2%-10％，28-30℃培养24-120 h；
（3）醋酸菌种子的扩培：醋酸菌斜面菌种在斜面培养基上活化后接种于液体培养基培养24h-120h，扩培时再接种于猕猴桃酒醪中培养24h-120h，选出镜检没有杂菌，细胞形态良好的醋酸菌作为醋酸菌种子液；
（4）酒精发酵：调整猕猴桃汁糖度为8%-25%，调pH为3-5.5，接种酵母菌，酵母菌的接种量为接种后总体积的2%-20%，在15-32℃的条件下发酵，糖度低于10g/L，分离新酒，得到酒精发酵液；
（5）醋酸发酵：将醋酸菌种子液接入酒精发酵液，酒精发酵液的体积分数为3.5%-15%，初始酸度6-40g/L，醋酸菌种子液的接种量为接种后总体积的6%-70%，15-36℃通风发酵培养，醋酸含量不再上升，得到醋液；
步骤（5）中也可以在酒精发酵液中拌入谷糠、麸皮或稻壳中的至少一种，再将醋酸菌种子液与谷糠、麸皮或稻壳等比例拌合均匀，接入至用酒精发酵液与谷糠、麸皮或稻壳拌好的醅中，谷糠、麸皮或稻壳的质量与酒精发酵液的质量之比为1:1-3，在20-46℃保温发酵，定时翻醅，醋酸含量不再增加时终止发酵，醋醅中拌入醋醅质量的2%-5%的食盐，压实陈酿。
（6）陈酿：在醋液中加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，在醋液中加入食盐和香辛料，食盐的加入量为醋液质量的0.2%-5％，香辛料的加入量为醋液质量的0.1%-5％，加热灭菌，低温保存；
（7）澄清，灭菌，包装。
实施例7
一种猕猴桃风味醋的生产方法，它包括如下步骤：
（1）原料处理：将猕猴桃清洗、打浆后，搅匀，然后加入果胶酶15-60℃酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁；将小米或大米、高粱、玉米、荞麦、小麦或燕麦中的至少一种加水20-40℃浸泡0.5-10h，水的加入质量为小米或大米、高粱、玉米、荞麦、小麦或燕麦的2-7倍，打浆，调浆，加入α-淀粉酶预液化15min-120min，制成粮食浆；
（2）酵母菌的活化与扩培：YPD斜面固体培养基，接入酵母菌，28-30℃培养24 h，将活化酵母菌接入150 mL YPD液体培养基，28-30℃培养24 h，得到酵母菌种子；将酵母菌种子摇瓶种子培养，取大试管或锥形瓶一个，装入猕猴桃汁，灭菌冷却后接种YPD斜面培养或液体培养酵母菌种子1-2环，28-30℃培养24 h；再将摇瓶后的酵母菌扩大培养，将猕猴桃汁摇瓶培养的酵母菌接种于装有猕猴桃汁的种子罐，酵母菌接种量为接种后总体积的2%-10％，28-30℃培养24-120 h；
（3）醋酸菌种子的扩培：醋酸菌斜面菌种在斜面培养基上活化后接种于液体培养基培养24h-120h，扩培时再接种于猕猴桃酒醪中培养24h-120h，选出镜检没有杂菌，细胞形态良好的醋酸菌作为醋酸菌种子液；
（4）酒精发酵：将粮食浆与猕猴桃浆混合均匀，粮食浆与猕猴桃浆的质量比为0.2-7：1，加入所用粮食质量0.1%-0.5%的糖化酶，接种酵母菌，酵母菌的接种量为接种后总体积的2%-20%，在15-32℃的条件下发酵，糖度低于10g/L，分离新酒，得到酒精发酵液；
（5）醋酸发酵：将醋酸菌种子液接入酒精发酵液，酒精发酵液的体积分数为3.5%-15%，初始酸度6-40g/L，醋酸菌种子液的接种量为接种后总体积的6%-70%，15-36℃通风发酵培养，得到醋液；
（6）陈酿：在醋液中加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存；
（7）澄清，灭菌，包装。
上述实施例中：
1. 野生猕猴桃发酵菌种的筛选
1.1野生猕猴桃酒酵母菌的筛选
从野生猕猴桃中分离筛选出两株适合野生猕猴桃果酒发酵的菌株M-7、M-210，经鉴定M-7、M-210是酿酒酵母属的酿酒酵母，具有发酵能力好、絮凝能力强、产香较好的性能。
1.1.1 培养基
分离培养基：YPD液体培养基。葡萄糖2g，酵母提取物1g，蛋白胨2g，蒸馏水100mL， 121℃高压灭菌20min。
复筛培养基：野生猕猴桃汁。选八成熟、发软的果实，清洗干净，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为60mg/kg，打浆，然后加入1mL/kg的果胶酶（15万U/mL），在40℃水浴中酶解2h，灭活，放凉。用四层纱布过滤，放置过夜。取上清液巴氏灭菌：62-65℃，30min。
WL琼脂培养基（质量分数）：酵母浸粉0.5，葡萄糖5，溴甲酚绿0.0022，胰蛋白胨0.5，琼脂2，氯化钙0.0125，磷酸二氢钾0.055，氯化铁0.00025，硫酸锰0.00025，氯化钾0.0425，硫酸镁0.0125， pH 6.5，121℃灭菌20 min。
菌种保藏培养基（g/L）：酵母浸粉1.5g，蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，（NH4）2SO41.0g，琼脂20g，蒸馏水配制，121℃，20min灭菌。
1.1.2 酵母菌的分离筛选
（1）果酒酵母的分离 无菌称量约10g成熟野生猕猴桃，捣碎，放入盛有90mL无菌水三角瓶，振荡均匀，制成菌悬液，吸取50μL放入YPD固体培养基，以无菌刮铲涂抹均匀，28℃培养24-48h。
（2）自然发酵酵母菌的分离 无菌称量约100g新鲜成熟度好的野生猕猴桃，放入无菌的300mL三角瓶，以无菌的研锤破碎后置于28℃培养，每隔24h取发酵液1mL，加入9mL无菌水，梯度稀释，取50μL稀释后菌液放入YPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，28℃培养24-48h。
（3）酿酒酵母的无性繁殖方式筛选 对YPD培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。
（4）WL琼脂培养基筛选酿酒酵母 将分离出来的酵母菌株，接种YPD液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基28℃培养5d后观察。
通过显微镜观察和WL的初步筛选，得到多端出芽、菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起光滑，不透明，奶油状的菌株有136株。菌株都是浅绿色或深绿色，圆形或椭圆形。
1.1.3 酵母菌复筛
1.1.3.1 酵母菌一级复筛
初次筛选菌株分别采用杜氏管发酵法。将分离得到的酵母菌菌株分别接入野生猕猴桃汁中一级复筛，28℃培养48h，每隔12h观察杜氏小管中产气情况和絮凝情况。初步比较酵母菌的发酵能力和絮凝能力，初筛出性状优良的酵母菌株。
有29株产气效果、絮凝能力好的菌株。
1.1.3.2 酵母菌二级复筛
一级复筛的菌种经YPD斜面培养活化后接入YPD液体培养基中，30℃培养24h，然后取8mL接入装有100mL猕猴桃汁的三角瓶中，22℃培养，发酵，数天后采用蒸馏法比较各菌株产酒精能力的大小和CO2失重法比较各菌株发酵能力，每株菌平行3瓶。
以发酵速率和酒精度作为主要指标，综合各个因素，最终选定M-1、M-2、M-7、M-210、M-35这几株作为三级筛选的出发菌株。
1.1.3.3酵母菌三级复筛
二级复筛的菌种YPD斜面培养活化后接入YPD液体培养基中，30℃培养24h，接种量为8%，接种于糖度（质量分数）22%野生猕猴桃汁，23℃发酵，8d以后，测定每瓶发酵液的酒精含量、酸度，经感官评定酒的风味，每株菌平行3瓶。
筛选出两适合做野生猕猴桃果酒发酵的菌株M-7和M-210。通过进一步试验选定M-7作为野生猕猴桃醋酒精发酵阶段用酵母菌。
1.1.4 菌种鉴定
常规鉴定：将试验菌株活化3-4代，镜检合格后，根据《The yeasts: A Taxonomic is study》第三版和《酵母菌的特征与鉴定手册》对供试菌株进行形态学观察及生理生化检测。经鉴定菌株M-7和M-210均为酵母属的酿酒酵母。
对M-7菌种进行了耐受性研究，结果表明M-7对葡萄糖、酒精度、低酸度、NaCl和SO2具有较高耐受性，可作为野生猕猴桃发酵酒精发酵阶段专用菌种或育种的出发菌株。
1.2野生猕猴桃醋发酵用醋酸菌的筛选
从野生猕猴桃、醋醅中分离筛选获得一株产酸高、酒精转酸率高和遗传稳定性好的、适合野生猕猴桃果醋发酵的菌株Y2-15。筛选方法如下：
1.2.1 培养基
（1）基础培养基：1g酵母浸粉，1g葡萄糖，蒸馏水100mL，pH4.5，121℃灭菌20min，使用前加入3%(体积分数)无水乙醇。
（2）分离培养基：1g酵母浸粉，1g葡萄糖，蒸馏水100mL，pH4.5，2g琼脂，分装于三角瓶中，121℃灭菌20min；使用前加入3%的无水乙醇和2%无菌CaCO3碳酸钙（165℃干热灭菌2h）。
（3）斜面菌种保藏培养基：1g酵母浸粉，1g葡萄糖，蒸馏水100mL，pH4.5，2g琼脂，分装于试管中，121℃灭菌20min；灭菌后加入3%的无水乙醇和1%无菌CaCO3，摆成斜面。
（4）醋酸菌产酸培养基Ⅰ：葡萄糖1g，无水乙醇3mL，酵母浸粉1g，定容至100mL，pH4.5。
（5）醋酸菌产酸培养基Ⅱ：酵母浸粉1g，无水乙醇5mL，葡萄糖1g，定容至100mL，pH4.5。
（6）醋酸菌产酸培养基Ⅲ：野生猕猴桃酒，酒精体积分数8%，总糖5g/L，pH5.5。
（7）醋酸菌活化培养基：葡萄糖1g，磷酸二氢钾0.05g，酵母浸粉1g，硫酸镁0.05g，水100mL，121℃灭菌15min，灭菌后加入无水乙醇3mL，pH5.5。
1.2.2 醋酸菌分离方法
1.2.2.1 菌种初步分离
（1） 直接分离 取10g混匀醋醅样品放入装有玻璃珠和90mL无菌水的300mL三角瓶中，振荡10min，得到10-1的稀释液，梯度稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度样品的稀释液0.1mL涂布在平板分离培养基上，每一稀释度涂布三个平板，30℃培养48h，挑取透明圈明显而且大，菌落丰厚的单菌落划线于平板分离培养基上，直到分离为单菌落以后挑取至斜面保藏培养基中，30℃培养24h后保藏于4℃冰箱备用。
（2） 增殖培养分离 称取10g醋醅或自然发酵产酸的野生猕猴桃浆放入盛有100mL醋酸菌液体基础培养基的300mL三角瓶中，30℃，120r/min培养；每天取出增殖液，梯度稀释，取10-5、10-6、10-7浓度的稀释液0.2mL，用无菌涂布棒涂布于分离培养基平板上。30℃培养48h后，挑选透明圈大，菌落丰厚，且占生长优势的单菌落，多次划线培养，直到确定为单菌落时，30℃培养24h后保藏于4℃冰箱中，备用。
从醋醅中分离筛选到醋酸菌120株，从自然发酵的野生猕猴桃等水果中分离筛选到23株。
1.2.2.2 革兰氏染色
将划线分离到的菌株连续活化2~3次后，革兰氏染色，以枯草芽孢杆菌作阳性对照、大肠杆菌作阴性对照，确定菌株。
1.2.2.3 产醋酸定性试验
将上述斜面菌株活化2~3次，分别接种于装有25mL产酸试验培养液的100mL的三角瓶中，30℃摇床培养，培养4d、6d时各取出一瓶，3000r/min离心15min，除去菌体，使用20%氢氧化钠调至pH7.0左右，在火焰上加热至沸腾，加入10%氯化铁溶液2~3滴，产生红褐色沉淀者为醋酸菌。
从醋醅中分离筛选到的120株菌，其中106株形成明显的红褐色沉淀而且革兰氏染色为阴性，初步确定为醋酸菌。从自然发酵产酸的野生猕猴桃等水果中分离筛选出的23株菌，其中有18株产生红褐色沉淀而且革兰氏染色为阴性，初步确定为醋酸菌。
1.2.2.4 初筛
把初步分离纯化得到的醋酸菌菌株，在碳酸钙平板上进一步培养、分离，根据各个菌株的透明圈直径与菌落直径之比（HC）值的大小进行筛选，将HC值大的单菌落菌株挑选出来，进行下一步复筛试验。共得到33株比较好的菌株。
1.2.2.5 复筛
（1）一次复筛 初筛菌株分别接种产酸培养基I上，每株一瓶，120 r/min，30℃振荡培养48 h后，5d后测定其酸度并培养。筛选获得酒精转酸率大于60%的醋酸菌11株。
（2）二次复筛 一次复筛的菌株分别接种产酸培养基II上，每株三瓶，120 r/min，30℃振荡培养，5d后测定其酸度并培养。酒精转酸率最高的是Y2-15，为80%，其它酒精转酸率高于70%的有Y2-9，Y2-4，Y2-10、Y2-12。综合菌株的产酸量、产酸速率和酒精转酸率等因素，选择Y2-15、Y2-12、Y2-9进行下一步的复筛。
（3） 三次复筛 二次复筛的菌株分别接种醋酸菌产酸培养基Ⅲ上，每株三瓶，120 r/min，30℃振荡培养48 h后，5d后测定其酸度并培养。并将其分别传代培养，连续传4代，测定每代菌株发酵培养后的酸度大小，筛选出产醋酸高且产量稳定的菌株。每一代菌株的培养方法：挑取一定量活化好的18h~24h的斜面菌苔接种于种子培养基中，30℃、150r/min振荡培养24h后，以10％的接种量，将种子培养基接于产酸培养基Ⅲ中，30℃、150r/min振荡培养6d，测定产酸量，见表1。Y2-15比较稳定，产酸高，采用Y2-15发酵后获得的野生猕猴桃醋风味好，可用于野生猕猴桃醋的发酵。
表1 传代稳定性产酸实验结果
| 编号 | 第1代酸度（g/L） | 第2代酸度（g/L） | 第3代酸度（g/L） | 第4代酸度（g/L） | 第5代酸度（g/L） |
| Y2-9 | 67.98 | 60.06 | 54.12 | 48.18 | 41.58 |
| Y2-12 | 61.38 | 65.34 | 64.68 | 58.74 | 60.06 |
| Y2-15 | 64.68 | 64.02 | 64.68 | 65.34 | 66.66 |
1.2.2.6 醋酸菌的鉴定
通过观察菌落形态、菌株形态特性及醋酸菌菌株的生理生化特征试验，鉴定Y2-15是醋酸杆菌属（Acetobacter属）。
2. 操作要点
（1）原料处理：野生猕猴桃（八成熟），清洗，打浆，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为0-150mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶15-60℃酶解1-24h，根据需要果浆或滤液采用高温瞬时灭菌或62-65℃巴氏灭菌20-25min。
小米或大米、高粱、玉米、荞麦、小麦、燕麦等中的至少一种原料，加水20-40℃浸泡0.5-10h，打浆，调浆，加入α-淀粉酶预液化15min-120min，制成粮食浆。
（2）酵母菌的扩培：YPD斜面固体培养基，接入酵母M-7，28-30℃培养24 h。将活化酵母菌接入150 mL YPD液体培养基，28-30℃培养24 h。
摇瓶种子培养：取大试管或锥形瓶一个，装入澄清的猕猴桃汁，灭菌冷却后接种YPD斜面培养或液体培养酵母菌种子1-2环，28-30℃培养24 h。
扩大培养：将猕猴桃汁摇瓶培养的酵母菌接种于装有猕猴桃汁的种子罐，酵母菌接种量为猕猴桃汁体积的2%-10％，28-30℃培养24-120 h；根据生产需要酵母菌种子可进行多次扩培。
（3）醋酸菌种子的扩培
醋酸菌Y2-15斜面菌种在斜面培养基上活化后接种于液体培养基培养24-120h。扩培时再接种于野生猕猴桃酒醪中培养24-120h，镜检没有杂菌，细胞形态良好，既可以作为种子液。
（4）酒精发酵
野生猕猴桃醋：根据发酵要求酸度调整野生猕猴桃汁糖度。按公式 
添加糖量。式中：X一应加糖量(g)；B一发酵后要求达到的醋酸含量(以醋酸计，g/100 mL)；A一猕猴桃汁初始总糖含量(以葡萄糖计，g/100 mL)；V一猕猴桃汁的体积(mL)。
酵母菌种子液接种于调整好糖度的野生猕猴桃浆或汁中，15-32℃发酵，等糖度低于10g/L时，分离新酒，转入醋酸发酵。
野生猕猴桃风味醋：将粮食浆：野生猕猴桃浆=0.2-7：1混合均匀，加入占所用粮食质量0.1%-0.5%的糖化酶，接入2%-20%酵母菌种子液进行发酵。
（5）醋酸发酵
将醋酸菌种子液接入酒精发酵液，酒精体积分数3.5%-15%，初始酸度6-40g/L，接种量6%-70%，15-36℃通风发酵培养到醋酸含量不再上升为止。
采用固态发酵法时，将酒液与固态填充料按酒液：（谷糠+麸皮+稻壳）=3-1:1的比例拌合均匀。接入醋酸菌种子，20-46℃保温发酵，定时翻醅。醋酸含量不再上升时，醋醅中拌入醋醅质量2%-5％的食盐进行陈酿。
（6）陈酿
醋酸发酵完毕，在醋液中加入0.2%-5％的食盐，0.1%-5％香辛料，加入糖0.5%-15%等，加热灭菌，低温保存。
（7）澄清
野生猕猴桃醋、野生猕猴桃风味醋过滤，澄清，灭菌，包装。
Claims (9)
1. 一种猕猴桃醋的生产方法，其特征在于，它包括如下步骤：
（1）原料处理：将猕猴桃清洗、打浆后，加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁；
（2）酵母菌的活化与扩培：YPD斜面固体培养基，接入酵母菌，28-30℃培养24 h，将活化酵母菌接入150 mL YPD液体培养基，28-30℃培养24 h，得到酵母菌种子；将酵母菌种子摇瓶种子培养，取大试管或锥形瓶一个，装入猕猴桃汁，灭菌冷却后接种YPD斜面培养或液体培养酵母菌种子1-2环，28-30℃培养24 h；再将摇瓶后的酵母菌扩大培养，将猕猴桃汁摇瓶培养的酵母菌接种于装有猕猴桃汁的种子罐，酵母菌接种量为接种后总体积的2%-10％，28-30℃培养24-120 h；
（3）醋酸菌种子的扩培：醋酸菌斜面菌种在斜面培养基上活化后接种于液体培养基培养24h-120h，扩培时再接种于猕猴桃酒醪中培养24h-120h，选出镜检没有杂菌，细胞形态良好的醋酸菌作为醋酸菌种子液；
（4）酒精发酵：调整猕猴桃汁糖度为8%-25%，调pH为3-5.5，接种酵母菌，酵母菌的接种量为接种后总体积的2%-20%，在15-32℃的条件下发酵，糖度低于10g/L，分离新酒，得到酒精发酵液；
（5）醋酸发酵：将醋酸菌种子液接入酒精发酵液，酒精发酵液的体积分数为3.5%-15%，初始酸度6-40g/L，醋酸菌种子液的接种量为接种后总体积的6%-70%，15-36℃通风发酵培养，醋酸含量不再上升，得到醋液；
（6）陈酿：在醋液中加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存；
（7）澄清，灭菌，包装。
2. 根据权利要求1所述的猕猴桃醋的生产方法，其特征在于：所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加偏重亚硫酸钾，SO2含量为10-150mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h。
3. 根据权利要求1所述的猕猴桃醋的生产方法，其特征在于：所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁，将猕猴桃浆或猕猴桃汁采用高温瞬时灭菌或在62-65℃的条件下巴氏灭菌20-25min。
4. 根据权利要求1所述的猕猴桃醋的生产方法，其特征在于：所述步骤（5）中在酒精发酵液中拌入谷糠、麸皮或稻壳中的至少一种，再将醋酸菌种子液与谷糠、麸皮或稻壳等比例拌合均匀，接入至用酒精发酵液与谷糠、麸皮或稻壳拌好的醅中，谷糠、麸皮或稻壳的质量与酒精发酵液的质量之比为1:1-3，在20-46℃保温发酵，定时翻醅，醋酸含量不再增加时终止发酵，醋醅中拌入醋醅质量的2%-5%的食盐，压实陈酿。
5. 根据权利要求1所述的猕猴桃醋的生产方法，其特征在于：所述步骤（6）中在醋液中加入食盐和香辛料，食盐的加入量为醋液质量的0.2%-5％，香辛料的加入量为醋液质量的0.1%-5％，加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存。
6. 一种猕猴桃风味醋的生产方法，其特征在于，它包括如下步骤：
（1）原料处理：将猕猴桃清洗、打浆后，搅匀，然后加入果胶酶15-60℃酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁；将小米或大米、高粱、玉米、荞麦、小麦或燕麦中的至少一种加水20-40℃浸泡0.5-10h，水的加入质量为小米或大米、高粱、玉米、荞麦、小麦或燕麦的2-7倍，打浆，调浆，加入α-淀粉酶预液化15min-120min，制成粮食浆；
（2）酵母菌的活化与扩培：YPD斜面固体培养基，接入酵母菌，28-30℃培养24 h，将活化酵母菌接入150 mL YPD液体培养基，28-30℃培养24 h，得到酵母菌种子；将酵母菌种子摇瓶种子培养，取大试管或锥形瓶一个，装入猕猴桃汁，灭菌冷却后接种YPD斜面培养或液体培养酵母菌种子1-2环，28-30℃培养24 h；再将摇瓶后的酵母菌扩大培养，将猕猴桃汁摇瓶培养的酵母菌接种于装有猕猴桃汁的种子罐，酵母菌接种量为接种后总体积的2%-10％，28-30℃培养24-120 h；
（3）醋酸菌种子的扩培：醋酸菌斜面菌种在斜面培养基上活化后接种于液体培养基培养24h-120h，扩培时再接种于猕猴桃酒醪中培养24h-120h，选出镜检没有杂菌，细胞形态良好的醋酸菌作为醋酸菌种子液；
（4）酒精发酵：将粮食浆与猕猴桃浆混合均匀，粮食浆与猕猴桃浆的质量比为0.2-7：1，加入所用粮食质量0.1%-0.5%的糖化酶，接种酵母菌，酵母菌的接种量为接种后总体积的2%-20%，在15-32℃的条件下发酵，糖度低于10g/L，分离新酒，得到酒精发酵液；
（5）醋酸发酵：将醋酸菌种子液接入酒精发酵液，酒精发酵液的体积分数为3.5%-15%，初始酸度6-40g/L，醋酸菌种子液的接种量为接种后总体积的6%-70%，15-36℃通风发酵培养，得到醋液；
（6）陈酿：在醋液中加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存；
（7）澄清，灭菌，包装。
7. 根据权利要求6所述的猕猴桃醋的生产方法，其特征在于：所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加偏重亚硫酸钾，使SO2含量为10-150mg/kg，搅匀，然后加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h。
8. 根据权利要求6所述的猕猴桃醋的生产方法，其特征在于：所述步骤（1）中将猕猴桃清洗、打浆后，加入果胶酶，在15-60℃的条件下酶解1-24h，得到猕猴桃浆，将猕猴桃浆过滤后得到猕猴桃汁，将猕猴桃浆或猕猴桃汁采用高温瞬时灭菌或在62-65℃的条件下巴氏灭菌20-25min。
9. 根据权利要求6所述的猕猴桃醋的生产方法，其特征在于：所述步骤（6）中在醋液中加入食盐和香辛料，食盐的加入量为醋液质量的0.2%-5％，香辛料的加入量为醋液质量的0.1%-5％，加入糖，糖的加入量为醋液质量的0.5%-15%，加热灭菌，低温保存。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120321 |